Summary
이 프로토콜은 시험 관내에서 근육 세포의 수축력을 측정하기위한 유연한 배양 표면과 같은 실리콘 마이크로 캔틸레버의 사용을 설명한다. 셀룰러 수축 측정 기록하고, 시험 관내에서 수축력을 측정하는 비 침습적이고 확장 가능한 시스템을 제공하고, 힘의 판독 값으로 변환 할 수 외팔보 굽힘을 야기.
Abstract
더 많은 예측과 관련된 생물학적 시험 관내 분석법의 개발은 시드 세포의 기능 평가를 용이 다목적 세포 배양 시스템의 발전에 입각한다. 이를 위해 마이크로 캔틸레버 벤딩 기술은 기판의 수축에 의한 평가를 통해, 뼈, 심장, 및 평활근 세포를 포함한 세포 유형의 범위의 수축 기능을 측정 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 다중화 된 캔틸레버 어레이의 적용은 약물의 효능과 독성 질환 표현형 및 진행뿐만 아니라, 신경 근육 및 기타 세포 - 세포 상호 작용을 평가하기위한 높은 처리량 프로토콜 중등도 개발 수단을 제공한다. 이 논문은이 목적을 위해 신뢰할 수있는 캔틸레버 어레이를 제조하기위한 상세하고, 이들 표면에 성공적으로 세포 배양에 필요한 방법을 제공한다. 또한 설명은 기능적 항문을 수행하는 데 필요한 단계를 제공한다수축성 세포 유형의 ysis는 신규 한 레이저 및 광 검출기 시스템을 사용하여 이러한 배열에서 유지. 하이라이트 정밀도 및이 시스템을 사용하여 가능 수축력의 분석 재현성을 제공하는 자연 대표 데이터뿐만 아니라, 연구의 넓은 범위는 이러한 기술이 적용될 수있다. 이 시스템의 성공은 널리 채택 수단 조사관 티슈 성능 질환 개발 및 신규 한 치료 적 처치에 대한 응답의 더 정확한 예측 선도, 시험관 내에서 신속, 저비용으로 기능 연구를 수행하기 위해 제공 할 수있다.
Protocol
1 캔틸레버 칩 제작
설명 제조 단계의 일러스트에 대한 자세한 내용은 그림 1에 나와 있습니다.
- 오븐에서 실리콘 - 온 - 절연체 (SOI) 웨이퍼를 배치하고이를 탈수 20 분 동안 125 ° C에서 굽는다.
- 플라즈마를 이용하여 탈수 한 SOI 웨이퍼의 무늬 층 상에 산화 규소 1.5 μm의 두께 층을 증착은 화학 기상 증착 (PECVD)을 첨단 공구.
- 장치 층이 위를 향하도록 스핀 코터 척에 웨이퍼를 놓습니다. , 웨이퍼 중심 확인 1000 RPM / sec로 가속에 60 초간 3000 rpm에서 웨이퍼의 중심과 스핀에 P20 프라이머 2 ㎖를 분배. P20 프라이머 장치 층에 포토 레지스트의 접착을 촉진시킨다.
- 웨이퍼 스핀 코터의 척에있는 동안, O 1,000 RPM / sec로 가속에서 60 초 동안 3000 rpm에서 S1818의 웨이퍼의 중심에 포토 레지스트 스핀 2 ㎖를 분배포토 레지스트의 1.5 μm의 두께 층을 btain.
- 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓고 1 분 동안 115 ° C에서 소프트 베이크를 수행합니다.
- 디바이스 층 상에 포토 레지스트 마스크로부터 캔틸레버 패턴을 전사하기 위해 포토 리소그래피 콘택트 마스크 얼 라이너를 사용하여 하드 콘택트 UV 노광을 수행한다. 125 엠제이 / S1818 포토 레지스트 cm (2)의 노광 에너지 값에 기초한 노출 시간을 계산한다.
- 부드럽게 앞뒤로 흔들어 섞으면 웨이퍼를 1 분간 726 MIF 포토 레지스트 현상액에 웨이퍼를 침지하여 포토 레지스트를 개발한다.
- 탈 이온화 (DI) 물과 웨이퍼를 씻어 바람직 스핀 세척 건조기 (SRD) 도구를 사용하여, 그것을 건조.
- 아세톤에 적신 면봉을 사용하여 (가장자리에서 5mm까지) 웨이퍼의 가장자리에서 포토 레지스트를 제거합니다.
- 포토 레지스트면이 위를 향하도록, 깊은 반응성 이온 에칭 (DRIE) 도구에서 웨이퍼를로드하고, 데비을 통해 패턴 화 된 실리콘 층을 에칭 조리법을 실행CE 층. 에칭 정지로서 매립 산화막 기능하므로 완전한 에칭을 보장 할 필요가있을 것으로 예상되는 것보다 100 % 이상의 사이클 50 %로 에칭을 수행한다.
- 포토 레지스트를 제거하기 위해 20 분 동안 뜨거운 레지스트 욕 용액에 웨이퍼를 배치했다. DI 워터와 웨이퍼를 씻어 빠른 덤프 - 린서 (QDR)에 웨이퍼를 전송합니다. 포토 레지스트 스트립을 따라 헹구고 웨이퍼를 건조 SRD 도구에서 웨이퍼를로드합니다. 예상대로 캔틸레버 패턴이 나타날 수 있도록 현미경으로 웨이퍼를 검사한다.
- PECVD 도구를 사용하여 웨이퍼의 장치 층에 언 도핑 실리콘 산화물의 1 μm의 두께 층을 증착. 상기 처리 단계 동안 캔틸레버 보호 층 등이 산화물 층 기능한다.
- 웨이퍼의 뒷면의 처리를 시작하도록 대향 핸들 층과 스핀 코터의 척에 웨이퍼를 배치했다. 확인 웨이퍼는 3,000 rpm에서 P20의 웨이퍼의 중심에 프라이머, 스핀 2 ㎖를 분배, 중앙1000 RPM / 초 가속에 60 초 동안.
- 웨이퍼 스핀 코터의 척에있는 동안의 6.5 μm의 두께의 층을 얻기 위해 1,000 RPM / sec로 가속에서 45 초 동안 2000 rpm에서 웨이퍼의 중심과 스핀 상 SPR220-4.5 포토 레지스트 2 ㎖를 분배 포토 레지스트.
- 2 분 동안 115 ° C에서 소프트 베이크을 수행하기 위해 근접 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓습니다.
- 앞 / 뒷면 정렬 가능한 포토 리소그래피 콘택트 노광 장치를 사용하여, 전방 측 캔틸레버 패턴이면 윈도우 마스크를 정렬 및 처리 층 상에 포토 레지스트를이면 윈도우 마스크로부터 패턴을 전사하기 위해 하드 콘택트 UV 노광을 수행한다. 480 엠제이 / SPR220-4.5 감광액 cm (2)의 노광 에너지 값에 기초하여 계산 된 노출 시간을 사용한다.
- UV 노광 후, 웨이퍼는 다음 처리 단계 이전에 30 분 동안 어두운 영역에 남아하자.
- 웨이퍼에 침지하여 포토 레지스트를 개발2 분 동안 726 MIF 포토 레지스트 개발 부드럽게 앞뒤로 웨이퍼를 떨고있다.
- 탈 이온화 (DI) 물과 웨이퍼를 씻어 바람직 스핀 세척 건조기 (SRD) 도구를 사용하여, 그것을 건조.
- 12 시간 동안 90 ° C의 오븐에서 웨이퍼를 놓습니다.
- 불소 가스와 RIE 시스템 및 산화물을 에칭하기위한 레시피를 이용하여 상기 웨이퍼의이면에 산화 실리콘 층을 에칭. 웨이퍼의이면에 패터닝 된 산화물은 추가 처리를위한 에칭 마스크로서 작용한다. 노광 창에 실리콘 산화물이 완전히 에칭되도록하여 현미경으로 웨이퍼를 검사한다.
- 아세톤에 담근 클린 룸 면봉을 사용하여 (가장자리에서 5mm까지) 웨이퍼의 가장자리에 포토 레지스트를 제거합니다.
- DRIE와 도구의 웨이퍼를 적재 및 에칭 정지 같이 매립 산화물 층 (500)으로 기능하는 μM의 깊이로 패터닝 처리 층을 에칭 레시피를 실행. 의 과열을 방지하기 위해, 복수의 런에이 에칭 분할실리콘의 에칭에 모순이 발생 웨이퍼. 이 에칭 단계는 완전히 캔틸레버 아래의 실리콘을 제거한다.
- 캔틸레버 아래의 매몰 산화물 층과 상기 캔틸레버의 위에 보호 산화물 층을 제거하기 위해, 25 % 희석 HF 에칭 제를 사용하는 습식 에칭 단계를 수행한다.
참고 :이 단계는 실리콘 캔틸레버의 바닥면을 해제하고 또한 레이저로 캔틸레버를 조사 할 수있는 액세스를 제공하기 위해 아래 창을 엽니 다. - DI 물 화장실의 시리즈와 함께 조심스럽게 건조 질소를 이용하여 웨이퍼를 헹군다. 캔틸레버가 기지만을 지원하기 때문에, 직접 칸틸 레버에 DI 물 또는 불활성 가스의 강제 스프레이를 사용하지 않는다.
- 핸들 층 에칭 단계 동안 생성 쪼개짐 라인을 따라 웨이퍼로부터 개개의 칩을 쪼갠다.
2 세포 배양
- 이전에 게시 된 방법 17에 따라 13F 된 커버를 준비합니다.
참고 : 만약 13F 코브rslips는 사용할 수 없으며, 95 ° 이상의 접촉각이 소수성으로 모든 표면이 사용될 수있다. - 캔틸레버 칩 및 70 % 에탄올 용액 중의 13F 커버 슬립을 소독하고 흐름 후드에서 공기 건조하도록 허용.
- 표준 12 웰 플레이트 내부 13F 된 커버의 상단에 각각의 캔틸레버 칩을 놓습니다.
- 외투 세포 유형에 대해 최적화 생체 고분자 또는 표면 변형에 캔틸레버는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 사용된다.
- 원하는 농도의 특정 성장 배지에서 세포를 다시 일시.
참고 :이 프로토콜은 캔틸레버 창을 통해 떨어지는 원하는 캔틸레버 표면에 부착하지 세포의 상당수가 발생합니다. 세포 제제 따라서 커버 슬립 표준 제제에 비해 3-4 배 더 집중해야한다. 예를 들어, 쥐 골격근 위성 세포의 파종은 일반적 500-700 셀 / 평방 mm 15,16의 시딩 밀도를 이용하여 수행된다및 / 평방 mm 2000 세포에서 캔틸레버 기판에 사용됩니다. 최적화 실험은 적절한 파종 밀도를 확인하기 위해 새로운 셀 소스로 수행되어야한다. - 매체의 기포가 완전히 캔틸레버 창 커버 보장 캔틸레버 칩 표면에 세포 현탁액 200 μl를 피펫. 매체가 창을 통해 심지 및 캔틸레버의 상단에 고정 기포를 형성하지 않으면 13F의 커버 슬립을 장착하고 도금을 다시 시도.
- 인큐베이터에 칩을 함유하는 접시를 전송하고 세포가 적어도 1 시간 (바람직하게는 2 ~ 3 시간)에 대해 부착 할 수있다.
- 이 도금 기간이 지나면 성장 배지 1 ㎖와 문화를 13F coverslip에없이 깨끗하고 잘에 칩을 전송하고, 상단까지 멸균 집게를 사용합니다.
- 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
- 커버 슬립에 체외 유지 보수를 위해 자신의 표준 프로토콜에 따라 세포를 유지한다. 골격근 세포,세포가 합류가 필요합니다이되면 매체 조성물의 스위치는 myotube 형성을 유도한다.
캔틸레버 변형 분석을위한 하드웨어 및 소프트웨어의 3 설치
- 수직 전기 생리학 현미경의 무대로 가열 된 배양 접시를 놓습니다.
- 가열 현미경 단계로 세포가 현재 (+ 10 mM의 HEPES)에 현탁 된 공급 매체의 3 ML을 추가합니다.
- 15mm의 이격 거리에서 가열 된 배양 접시의 안쪽에 스테인리스 전극을 장착하고, 펄스 발생기에 가변 강도, 주파수 및 파형의 필드 자극 펄스를 생성 할 수있는 그들을 연결 시스템들 자극을 생성 할 수 있도록 적절한 때 세포의.
- , 현미경 테이블의 밑면에, XY 병진 스테이지 상에 장착 헬륨 - 네온 레이저를 볼트와, 레이저 빔이 30 ° 각도로 상대 금지로 가열 된 배양 접시의 바닥을 통해 향하도록하여 조정할캔틸레버의 평면 전자.
- , 현미경 스테이지의 밑면에, XY 병진 스테이지 상에 장착 사분면 광 검출기 모듈을 볼트와 4 사분면의 중앙 반사 레이저 빔 토지.도 2를하도록 위치를 조정하여 설정할 하드웨어의 개요를 제공한다 설명 된 프로토콜을 구현하는 데 필요한.
- 캔틸레버에 걸쳐 스캔 선형 액추에이터를 제어하는 소프트웨어 프로그램을 작성합니다. 도 3에서 제공하는 흐름도를 참조하여 소프트웨어 프로그램을 작성한다.이 시스템을 사용하기 위해 프로그램 된 그래픽 인터페이스는도 4에 제공된다.
4 녹음 캔틸레버 편향 데이터
- 캔틸레버 분석 하드웨어 및 관련 소프트웨어를 켭니다.
- 중간에 가열 단계 서미스터를 삽입하고 37 ° C를 읽을 때까지 기다립니다.
- cantileve와 함께 무대에 캔틸레버 칩을 삽입스테이지의 오른손쪽으로 향한 RS.
- 현미경 광원을 켜십시오.
- 캔틸레버 가정하면 스테이지의 오른쪽, 캔틸레버 (1)에 배향되어보기로 캔틸레버의 가장자리를 가져오고 캔틸레버 1 NOTE의 팁에 레이저 빔을 위치 시키도록, 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어를 사용하는 현미경 초점 배열의 왼쪽 상단에 위치 하나이며, 숫자는 왼쪽 아래에서 아래로 16까지 실행합니다. 캔틸레버 (17)는 우측 상단 위치에 있고, 오른쪽 아래 (도 5a)에서 (32)에 실행된다.
- 눌러 레코딩 소프트웨어의 "놀이".
- 신호가 광 검출기를 제어하는 스텝퍼 모터를 조정함으로써, x 및 y의 범위에 모두 "0"을 읽을 수 있도록 광 검출기를 배치.
- 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어에서 설정 캔틸레버 한 위치 (그림 4).
- . 단계 4.7를 반복 캔틸레버 (16)의 끝 부분에 레이저를 이동하고 cantilev 설정ER 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어 (16)에 위치.
- 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어의 단계 4.7. 및 설정 캔틸레버 (32)의 위치를 반복 캔틸레버 (32)의 끝 부분에 레이저를 이동합니다.
- 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어의 단계 4.7. 및 설정 캔틸레버 (17)의 위치를 반복 캔틸레버 (17)의 끝 부분에 레이저를 이동합니다.
- 현미경 광원 및 실험실에서 오버 헤드 빛을 끄십시오.
- 레코딩 소프트웨어 눌러 "레코드".
- 1 Hz의 주파수에서 40 밀리 초, 5 V 펄스에 대한 펄스 발생기 하드웨어를 설정하고 기기 전원을 켭니다.
NOTE : 선택적으로,이 시점에서 특정 셀 소스에 대한 최적의 자극 프로토콜을 사용, 명시된 설정 인간 및 설치류 세포 12,13,15,16 소스를 사용하여 수집 된 데이터에 기초하여 가이드 라인이다. - 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어를 사용하여, 각각에 5 초 동안 정지, 캔틸레버 어레이 (32)를 가로 질러 스캔 할 하드웨어 설정전자.
- 캔틸레버 (32)의 스캔이 완료되면, 다음 기록 소프트웨어를 중단하고 데이터 파일을 불러 자극기를 끄.
- 수축 활동의 증거에 대한 각각의 캔틸레버에서 기록 추적을 검사합니다. 긍정적 인 반응과 함께 각 캔틸레버를 기록해 둡니다. 편향 기준선 위에 적어도 0.1 V이면 수축 피크로서 정의된다.
- 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어에 스캔 프로토콜에서 모든 응답하지 캔틸레버를 제거합니다.
- 활성 캔틸레버이어서 세포의 자발적인 수축 활성의 판독을 얻기 위해 자극없이 재검사 될 수있다.
- 배양 된 세포의 기능의 출력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 중간에 치료 학적 화합물을 첨가 한 다음, 함께 또는 넓은 전기장 자극없이 검사를 실행.
- 장기간 전기적 및 CONTR의 주사 레벨 셀을 자극하여 피로 평가를 수행 actility는 특정 임계 값 아래로 떨어 피크 힘 걸리는 시간을 측정합니다.
- 운동 신경이 근육과 공동 문화 유지된다 실험에서 신경 근육 신경 자극과 운동 신경 - myotube 캔틸레버의 공동 문화의 치료를 통해 접합 형성 (예 : 글루탐산) 또는 시냅스 억제제를 측정 (예를 들어, D-tubocurarine) 및 스캔 자발적인 활동의 증가와 감소는 각각 16.
- 계획된 실험의 요구에 의해 결정으로 특정 검사를 수행합니다.
캔틸레버 편향 데이터의 분석 (5)
- 사용 스토니 방정식 15 전지 층 또는 myotube (파스칼 단위), 및 (나노 뉴튼) 셀룰러 수축력의 직접 측정에서 응력의 판독에 (볼트) 것의 캔틸레버 편향 데이터를 변환 (아래에 설명) 개질 :
광고 / 51,866 / 51866eq1.jpg "/> 식 1
식 (2) - δ = 캔틸레버 팁 편향 및 응력 myotube 의해 제조하는 경우, σ C 균일 후막보기 캔틸레버, C 검출부의 전체 폭을 가정 myotube 의해 생성 = 응력 = 사진에 레이저 위치 전압 관련 시스템 특정 계수 검출기, θ = 캔틸레버의 평면에 레이저 및 검출기 상대적인 각도, E 실리콘은 실리콘의 탄성률 = t시는 캔틸레버의 두께 = t F = myotube 두께, V의 Si =의 독 송비 규소, L = 캔틸레버 길이 검출기 캔틸레버 선단으로부터 레이저의 P = 경로 길이, w
- 균일 한 필름이 myotube이다 가정 myotube에 힘 스토니의 적용에 사용 된 응력으로부터 힘의 계산 및 추정 셀 단면적을 동일시하여, 3을 수학 식 이어지는 막의 힘 같다 식.
식 (3) - 기능 데이터 수집 후, 면역 세포 화학 분석을 위해 캔틸레버 칩을 수정하거나 표준 기술을 사용하여 단백질 또는 DNA 분석을위한 세포를 사용한다.
- 선택적으로 나중 포인트에서 기능적 성능을 재평가하기 위해 인큐베이터 대신 분자 분석을위한 준비에 세포를 반환.
식 (2) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
캔틸레버에 수축성 세포의 성공적인 배양은 표준 세포 배양 기술 (도 5)를 이용하여, 비교적 간단한 절차이다. 수축 세포를지지 캔틸레버 백분율 세포 유형에 따라 달라질 것은 검사 및 특정 배양 기술이 채용되고있다. 쥐의 뒷다리에서 파생 된 기본 배아 세포를 사용하여 수축 활동이 조사 캔틸레버의 12 %에서 검출되었다 (N = 4). 설명 된 레이저와 광 검출기 시스템을 사용 수축력 분석 시드 세포의 기능 성숙에 관한 정확한 실시간 데이터를 제공한다. 도 7에 도시 된 바와 같이 표준 전기 생리 소프트웨어의 사용 범위는, 이러한 반 이완 피크 포스, 포스 피크 시간, 및 시간 등의 중요한 기능적 특성의 계산을 용이하게, 원시 데이터를 분석하는데 사용될 수있다. 후속 데이터 수집 처리 문화권 치료 화합물 수 있습니다와 약물 중독이없는 기능적 특성의 비교함으로써 화합물의 활성과 생체 반응의 후속 예측의 평가를 가능하게한다. 더욱이, 확장 된 자극 프로토콜 따라서이 시스템 (도 8)로부터 얻어지는 데이터의 생리적 수준을 확대 배양 된 세포에서의 피로 속도를 평가하는 수단을 제공한다.
캔틸레버 배양 시험관 신경근 시냅스 형성 (도 9)의 평가를 허용하도록. 이러한 배양에서 자발적인 수축 활성의 요금의 비율에 비교되는, 골격근 myotubes 16 배양 시스템에서의 운동 뉴런을 포함하도록 수정 될 수있다 같은 글루타메이트와 같은 신경 세포 고유의 자극제와 치료에 대한 반응의 수축. 수축 비율에서 관찰 된 글루타메이트에 의한 증가는 아세틸 콜린의 방출 이후 미오로 이어지는 배양 신경 세포의 활성화를 제안튜브 활성화. 글루타메이트에 의한 활동의 중단으로 이어지는 등의 아세틸 콜린 수용체 차단제의 D-tubocurarine 같은 시냅스 억제제와 치료는 이러한 문화 16 기능적 신경 근육 시냅스의 존재에 대한 추가 증거를 제공합니다.
그림 도식 자세히 캔틸레버 제조 공정 흐름. 흐름도에 나와있는 번호는 제목의 방법 섹션에서 프로토콜 단계에 상관 관계 "캔틸레버 칩 제조." 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 하드웨어캔틸레버에 세포 수축을 평가하는 데 사용되는 레이저 / 광 검출기 시스템의 세부 사항. 캔틸레버 평가에 사용되는 개질 전기 생리 현미경의 (A)의 사진. 레이저 (I) 및 광 검출기 (II)는 XY의 번역 단계에서 무대 아래에 장착되어있다. 투명 배양 접시는 스테이지의 밑면을 통해 칸틸 레버 어레이에 레이저 통로를 허용 단계 (ⅲ)에 장착된다. (B) 도식 "하향식"현미경 스테이지의 사시도. XY 스테이지는 병진 배열의 각 캔틸레버를 심문하는 레이저의 이동을 용이하게, X 및 Y 평면 (적색 화살표) 모두 레이저와 광 검출기의 이동을 허용한다. 캔틸레버 칩 (III)는 레이저 (I)의 사진을 닫습니다 (C). 제대로 시스템이 작동하려면 순서로 무대의 오른쪽으로 향하도록 캔틸레버와 함께 무대에 배치되어야한다광 검출기 (II)는 현미경 스테이지 아래에 장착. 레이저는 캔틸레버 칩 (θ)의 평면에 30 ° 각도로 위치한다. (D) 배양 접시의 사진을 닫습니다. 전기 자극은 실버 전극의 쌍을 이용하여인가된다 넓은 필드는 15mm 간격으로 위치 (ⅳ). 접시의 밑면에 부착 된 발열체 (V)는 분석에서 37 ° C의 문화를 유지하는 데 사용됩니다. 온도 제어 동적 및 매체 (도시하지 않음)에 배치 서미스터 (thermistor)에 의해 조절된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
제어 소프트웨어를 기본 논리의 그림 3 플로우 차트. 사용자 입력 및 스캐닝 동작을 제어하는 루프 메인 루프 : 레이저와 광 검출기의 두 소프트웨어는 스캐닝 모션 제어 루프. 메인 루프에서 높은 처리량 데이터 수집에 대한 중간의 두 번째 루프의 활성화에 의해 따랐다 설치가 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
소프트웨어도 4의 그래픽 사용자 인터페이스는 캔틸레버 평가 동안 레이저 및 광 검출기의 위치를 제어하는 데 사용. (A) 버튼 수동 그에에 소프트웨어를 허용 수동 4 코너 캔틸레버의 위치를 설정하기위한 제어. (B)를 X 및 Y 평면 모두에서 레이저 및 광 검출기의 위치를 제어하는 (1, 16, 17, 32)으로배열의 나머지 캔틸레버의 위치를 추정. (C) 컨트롤은 사용자가에 포함 외팔보를 선택할 수 있도록 각 스캔합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 시스템에 사용하기위한 사용자 정의 내장 캔틸레버 칩 (5) 이미지를 그림과 유사한 표면에 유지 세포의 대표 이미지. 하나의 사용자 정의 내장 캔틸레버 칩의 (A)의 사진. 각 칩은 오른쪽 상단에있는 이미지와 캔틸레버 (32)의 왼쪽 아래에 위치 (16) 캔틸레버 1의 2 열로 배열 된 32 캔틸레버가 포함되어 있습니다. 캔틸레버 칩은 15 X 15mm 2. 일차 래트 골격근 세포 (B) 위상차 이미지 캔틸레버에 재배의. 각 캔틸레버 두께 750 100 μm의 폭 긴 μm의, 4 μm의. (C) 캔틸레버에서 유지 관리 기본 쥐 myotube의 면역 세포 화학 염색이다. 균체 미오신 헤비 체인 용 항체 프로브를 사용하여 염색 하였다. 수축 기계의 성숙을 나타내는 배양 섬유의 가로 무늬 모양을합니다. 캔틸레버 가장자리 인위적 규모의 표시를 제공하기 위해이 이미지를 강조하고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
캔틸레버에 myotubes에 의해 생성 된 힘을 유도하기위한 스토니 방정식에 사용 된 용어를 설명하는 그림 6 회로도. myotube, C에 의해 생성 δ = 캔틸레버 팁 편향과 스트레스검출기 = 광 검출기에 레이저 위치 전압 관한 시스템 관련 계수, θ = 캔틸레버의 평면에 레이저 및 검출기 상대적인 각도, E 실리콘은 실리콘의 탄성률 = t시는의 두께 = 외팔보, t f를 = myotube 두께, V시 = 실리콘 독의 비율, L = 캔틸레버 길이 및 검출기에 캔틸레버 끝에서 레이저의 P = 경로 길이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 주제 원시 데이터 및 설명 캔틸레버 시스템을 이용하여 수축 형태의 분석. (A) 캔틸레버에 차 쥐 myotubes의 넓은 필드 전기 자극에서 원시 데이터 트레이스의 예. 캔틸레버의 길이 방향 변형률 나타내는 상위 트레이스 = x 축에서 (볼트) 레이저 편향. 캔틸레버 걸쳐 비틀림 변형을 나타내는 중간 트레이스 = y 축에서 (볼트) 레이저 편향. 하부 트레이스 =이 시스템 myotube 수축을 유도하는 데 전기 펄스의 시간적인 위치의 표시. (B) 표준 전기 생리학 소프트웨어를 사용하여, 그것이 최대 힘 (PF)을 측정 할 수 있고, 시간은 반으로 힘 (TTP) 및 시간을 피크 주 쥐의 골격근 myotubes에서 수집 된 원시 데이터에서 휴식 (2 RT). (C) 한 부씩 수축 데이터 (N = 11). 수정 스토니 방정식의 응용 프로그램은 볼트의 원시 데이터 판독에서 캔틸레버 스트레스의 계산을 할 수 있습니다. 이 데이터에서 (뉴턴)의 힘을 직접 계산도 생성 할 수 있습니다. w 다시 인쇄 간행 된 자료i 번째 권한 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 캔틸레버 배양에서 골격 근육 피로의 분석을 보여주는 제 대표 데이터. (볼트)에 원시 데이터는 myotube의 (나노 뉴턴의) 힘과 재 플롯의 측정으로 변환됩니다. 데이터는 0 분 (블랙 추적)과 지속적인 자극의 120 분 (회색 추적) 후 1 Hz에서 폭 넓은 분야 전기 펄스에 대한 응답으로 캔틸레버에 myotube 수축의 크기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
와 신경 근육 차단제 첨가하지 않은 운동 신경 자극의 기능적 효과를 보여 캔틸레버에 유지되는 골격 근육 운동 신경 공동 문화의 분석 그림 9 대표 흔적. (볼트)에 원시 데이터는 myotube의 측정으로 변환됩니다 의 힘 (나노 뉴턴에) 다시 꾸몄다. 신경 자극없이 배양 myotubes에 의해 자발적 수축 (A) 측정. 200 μM 글루타메이트의 추가를 통해 신경 자극 다음 myotube 수축 (B) 측정. (C) 측정 글루타민산 12.5 μM D-tubocurarine 처리 다음 myotube 수축. 허가 16 재 인쇄 간행 된 자료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음 표는 캔틸레버 평가를 수행하는 데 필요한 기술 검증 실험에서 세포를 배양하는 데 사용되는 특정 시약뿐만 아니라 장비를 열거한다. 사용 문화 시약이 필요하지 않습니다 및이 시스템을 쉽게 체외에서 수축 세포를 보유하고있는 모든 실험실의 배양 프로토콜과 통합되어야 함을 유의하시기 바랍니다. 제공되는 나열된 시약은 연구자들은 설명 된 특정 실험 결과를 반복 할 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
셀룰러 수축 증거 마이크로 캔틸레버를 분석하는데 중요한 단계는 현미경 스테이지 내의 캔틸레버 칩의 배치 및 배열 코너 캔틸레버 팁과 레이저와 광 검출기의 후속 정렬이다. 이 정확하게 수행하지 않은 경우, 소프트웨어는 잠재적으로 데이터를 수집하는 동안 위음성의 축적으로 이어지는 배열 잔존 캔틸레버의 위치를 추정 할 수 없습니다. 운영자는 캔틸레버 칩이 레이저의 위치를 교정하기 전에 배양 접시의 바닥과 높이 누워 될 수 있도록주의를 기울여야한다. 칩 접시 각도 앉는 경우, 편향된 레이저 빔의 경로를 변경하고 데이터 수집을 혼동한다.
기능 공기 테이블은 데이터를 수집하는 동안 배경 진동을 상쇄하기 위해 사용되어야합니다. 이 연구 홍보에 사용되는 캔틸레버의 얇은 두께 (약 4 μm의)ovides 높은 수축 활성에 대한 민감도,하지만 진동 감도를 증가하는 부작용이있다. 운영자는 배경 판독을 줄이기 위해, 데이터 기록시 가능한 한 적게 하드웨어 주위에 이동주의를 기울여야한다. 무대에서 캔틸레버 칩을 배치 할 때 마지막으로, 잘 문화에 자극 실버 전극과 접촉하지 않는 칩을 보장하기 위해주의를 기울입니다. 칩을 터치 전극과 넓은 필드 자극의 적용은 현재의 경로를 변경하고 부정적인 효과적으로 배양 세포를 자극 할 수있는 시스템의 능력에 영향을 미칠 것입니다.
골격근 myotubes 구동력 출력의 더 정확한 판독을 얻기 위하여, 높은 기능적 일단 해석이 완료 배양 된 세포의 면역 염색을 수행 할 것을 권장한다. 나열된 방정식 힘을 계산하기 위해 myotube의 단면적 (CSA)의 입력을 요구한다. 추정 값 P에 기초하여 사용할 수 있지만revious 데이터, 일방 myotube 의해 가해지는 힘의보다 정확한 추정을 제공하는 공 초점 영상 기술을 이용하여 myotube CSA의 정확한 측정. 해당 셀의 물리 특성 것의 수축 데이터를 관련하여 다수의 캔틸레버 걸쳐 정규화 결과에 귀중한 실험 조건 (15) 사이, 및 약물 치료 또는 질병 전체 조직 반응의 정확한 예측을 생성하므로 중요하다. 스토니 방정식 조사 myotubes 그렇게 노력 만이 가정을 준수 세포로부터 얻은 데이터를 포함하도록 만들어 져야한다 캔틸레버의 전체 길이에 걸쳐 가정한다. 이것이 가능하지 않으면, 유한 요소 분석은 이전에 발표 된 15 myotubes에서 작은 힘의 정확한 측정을 제공하는데 사용될 수있다. 이 분석 방법은 훨씬 더 노동 집약적, 따라서 더 높은 처리량 응용 프로그램에 병이 적합하지만, 최적화 된 경우에 필요할 수 있습니다스토니의 가정에 따르는 세포 배양은 얻을 수 없다.
이미 언급 한 바와 같이, 문화 매개 변수는 표준 coverslip에 준비에서 전송 될 수 있습니다. 그러나, 약물 검사 응용 프로그램에서이 시스템의 사용을 위해 혈청이없는 배지 조성물 및 비 생물학적 기판을 이용하여 고려하는 것이 좋습니다. 인해 동물 혈청 미정 특성상 신규 한 치료제의 효과는 배양 배지에 이러한 첨가제의 포함에 의해 혼동 될 수있다. 혈청이없는 미디어 제제는 설치류와 인간의 골격 근육 문화 18 ~ 21 화합물의 평가를 수행하기위한 통제 된, 잘 정의 된 환경을 제공 모두 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 캔틸레버에 생물학적 코팅 (콜라겐, 라미닌, 등)의 사용은 비 생물학적 기재인가함으로써 회피된다 세포 제제로 변동을 소개한다. 배양 표면 상에 실란 자기 조립 단일 층의 증착은 예를 도시 한tensively 여러 세포 유형 16,18,20,22-31의 준수 및 개발을 지원하고, 안정적이고 반복 가능한 방식으로 완벽하게 정의 된 표면을 생성하는 방법을 나타냅니다.
인해 포유 동물 시스템에서 본 수축성 세포의 범위로, 시험 관내 분석을위한이 모델의 애플리케이션은 비교적 넓다. 골격근 세포를 사용하여 최적화되지만, 시스템은 실시간으로 이러한 셀의 신규 한 치료제를 투여 반응의 신속한 평가를 수행 할 수있는 수단을 제공 할뿐만 아니라, 근육 세포 및 심근 세포를 부드럽게 잠재적으로 적용 가능하다. 현재 캔틸레버 칩 (32)의 캔틸레버 (도 5a)의 배열로 구성되어 있지만, 쉽게 많은을 포함하도록 변경 될 수있다. 이러한 배열을 분석하여 임의의 관찰이 크게 차이가 통계적 전력을 증가, 배양 물로부터 단일 데이터 포인트의 상당수를 생성한다. 그림 8, 세포 배양에 입증이 시스템이 배양 모델에 분포하는 모터 뉴런의 체외. 또한 세포의 지구력 수준에 대한 약물 효과의 평가를 허용 연속 확장 필드 자극에 응답하여, 시간이 지남에 따라 피로를 겪게 또한 근육의 측정을 통한 시냅스 형성의 평가를 허용 신경 자극에 응답하여 수축 (그림 9). 멀티 플렉스 분석에서 기준 기능적 파라미터의 측정 (도 7)는 체외 배양의 표준 분자 생물학적 평가 위에 분명한 장점을 가지고 있지만, 신경 근육 기능 및 시드 세포의 내구 능력을 평가하는 능력을 크게 약물 스크리닝을위한이 모델의 적용 가능성을 증가 질병 모델링 응용 프로그램. 설명 된 기술은 연구자에게 체외에서 질병 건강하고 근육 세포 모두 신속, 저비용으로 기능 평가를 수행하는 수단을 제공한다. 배양 시스템의 기능성 및 H원시 데이터의 분석에서 얻을 수있는 기능 세부 고등학교의 수준은, 새로운 병리학 및 화학 문제에 대한 생체 조직의 답변보다 정확한 예측을 생성해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 연구는 건강 허가 번호 R01NS050452 및 R01EB009429의 국립 연구소에 의해 투자되었다. 캔틸레버 칩의 제조는 코넬 대학교 (Cornell University)에있는 나노 제조 시설에서 공동 작업자에 의해 외부에서 수행 하였다. 캔틸레버의 제조 공정에서 사용되는 모든 설비는이 설비에 위치했다. 캔틸레버 마이크로 제조 그들의 도움 맨디 에슈와 Jean-마티유 보호 해주는 특별 감사. 캔틸레버 기능의 비디오 애니메이션 UCF의 합성 현실 연구실에서 찰스 휴즈, 알렉스 Zelenin 에릭 임페리얼에 의해 생성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
