Abstract
Synaptisk overføring er en svært rask prosess. Aksjonspotensialet drevet tilførsel av Ca2 + inn i presynaptiske terminalen, gjennom spenningsstyrte kalsiumkanaler (VGCCs) plassert i utløser flens membran, er utløseren for vesikkelfusjon og nevrotransmitter-frigjøring. Avgjørende for hurtighet av synaptisk transmisjon er romlig og tidsmessig synkronitet mellom ankomsten av aksjonspotensialet, VGCCs og neurotransmitterfrigjørelse maskiner. Muligheten til å direkte spille Ca 2 + strøm fra utgivelsen flens membran av individuelle presynaptiske terminaler er avgjørende for en presis forståelse av forholdet mellom presynaptiske Ca 2 + og neurotransmitterfrigivning. Tilgang til den presynaptiske utgivelsen ansiktet membran for elektrofysiologisk registrering er ikke tilgjengelig i de fleste forberedelser og presynaptisk Ca 2 + oppføring har blitt karakterisert ved hjelp av bildeteknikker og makroskopisk dagens måling avNTS - teknikker som ikke har tilstrekkelig tidsoppløsning for å visualisere Ca 2 + oppføring. Karakterisering av VGCCs direkte på enkelt presynaptiske terminaler har ikke vært mulig i sentrale synapser og har så langt blitt oppnådd bare i beger-type synapse av dama stråle ganglion og i rotte calyces. Vi har nå løst dette problemet i den gigantiske reticulospinal synapse av niøye ryggmargen ved å utvikle en akutt dissociated utarbeidelse av ryggmargen som gir isolerte reticulospinal axoner med funksjonelle presynaptiske terminaler blottet for postsynaptiske strukturer. Vi kan fluorescently merke og identifisere individuelle presynaptiske terminaler og målrette dem for innspilling. Ved hjelp av dette preparatet har vi preget VGCCs direkte på utgivelsen ansiktet av individuelle presynaptiske terminaler ved hjelp av immunhistokjemi og elektrofysiologiske metoder. Ca 2 + strøm er ført direkte på utgivelsen flens membran of individuelle presynaptiske terminaler, første slikt opptak kan utføres ved sentrale synapser.
Introduction
Synaptisk transmisjon er en ekstremt rask og nøyaktig prosess. Aksjonspotensial invasjon av den presynaptiske terminalen fører til åpning av VGCCs ligger i utgivelsen flens membran, den resulterende økningen i presynaptiske Ca 2 + fungerer som trigger for vesikkelfusjon og neurotransmitterfrigivning en. Alle disse trinn forekommer innen flere hundre mikrosekunder 2, og dermed krever stramme romlig kopling av VGCCs til vesikkel fusjons maskiner 3. Presynaptiske Ca 2 + flukser er først og fremst preget gjennom avbildning tilnærminger ved hjelp av Ca 2 + sensitive fargestoffer fire. Innlemming av Ca 2 + buffere som modulerer Ca 2 + i presynaptiske nerveceller har blitt brukt for å karakterisere indirekte forholdet mellom presynaptisk kalsium og neurotransmisjon 3. I tillegg moduler den presynaptiske gratis Ca 2 + konsentrasjon av uncaging Ca 2 + 5 eller opptak macroscopic Ca 2 + strømmer har vært brukt i forbindelse med målinger av vesikkel fusjon og / eller frigivelse; som for eksempel måling av kapasitans 6 eller postsynaptiske svar 2 for å løse det samme spørsmålet. Men karakter Ca 2 + strøm direkte på utgivelsen ansiktet, den spesialiserte delen av den presynaptiske membran der membran depolarisering er oversatt til Ca 2 + strøm utløsende synaptisk vesikkelfusjon og neurotransmitterfrigivning, er integrert til å få en nøyaktig måling av Ca 2 + Kravet for synaptisk vesikkel fusjon. I tillegg er evnen til direkte å karakterisere Ca 2 + strømmer mot de enkelte presynaptiske terminaler, kombinert med nøyaktige samtidige målinger av vesikkelfusjon og frigjøring tillater en nøyaktig forklaring av tidsforholdet mellom tidsforløpet av aksjonspotensialet, presynaptisk Ca 2 + strøm vesikkelfusjon og slipp. Tilgang til utgivelsen flens membraner ikke tilgjengelig i de fleste av presynaptiske terminaler grunn til å lukke apposition av de postsynaptiske dendritter. Denne utilgjengelighet har vært en stor hindring i karakterisering av VGCCs siden det hindrer direkte målinger av strøm på individuelle presynaptiske terminaler. Direkte karakterisering av presynaptiske Ca 2 + strøm på individuelle presynaptiske terminaler har så langt ikke vært mulig i sentrale synapser og har bare blitt oppnådd i to calyceal typen presynaptiske terminaler; calyx-type synapse av chick stråle ganglion 7-10 og rotte calyces 11,12. I alle andre presynaptiske terminaler inkludert gigantiske reticulospinal synapse i niøye ryggmarg 13, har mangelen på tilgang til den presynaptiske utgivelsen ansiktet membran nødvendiggjort bruk av indirekte tilnærminger som Ca 2 + bildebehandling å studere presynaptiske Ca 2 + flukser.
Figur 1. Lamprey giganten reticulospinal synapse. (A) Tverrsnitt av niøye ryggmarg indikerer dorso-ventral orientering. Reticulospinal axoner er markert med grønn asterix. (B) 3-D rekonstruksjon av reticulospinal synapse i niøye ryggmargen viser presynaptisk reticulospinal axon gjør mange en passant kontakter (markert med grønne piler) på den postsynaptiske nevron 13. Presynaptiske terminalene har blitt merket med Alexa Fluor 488 hydrazid konjugert phalloidin (grønn), mens den postsynaptiske nevron har vært fylt med Alexa Fluor 568 hydrazid (rød).
Niøye gigantiske reticulospinal axoner, som ligger i den ventrale delen av ryggmargen parallelt med rostral-caudal aksen Figur 1a, skjema multiple en passant synaptiske kontakter på nevronene ispinal ventral horn 14 Figur 1b 13. Makroskopisk hel-celle Ca 2 + strøm har blitt registrert fra reticulospinal axoner i intakt ryggmargen 13,15. Men tidligere blinde forsøk på direkte måling av Ca 2 + strøm i reticulospinal axoner i intakt niøye ryggmargen ved hjelp av celle-festet patch clamp teknikken har vist seg mislykket 13 på grunn av mangel på tilgang til den presynaptiske utgivelsen ansikt membran på grunn av de motstridende postsynaptiske prosesser Figur 1b. Frigjørings flens membran har tidligere blitt gjort tilgjengelig ved fjernelse av den postsynaptiske nevroner 11, mekanisk forstyrrelse av synapsen før opptak 12 eller enzymatisk behandling kombinert med mekanisk dissosiasjon 16.. Gitt den komplekse organiseringen av ryggmargen, ville det vise seg svært vanskelig å identifisere den postsynaptiske nevron og trekke den mekanisk eller forurolige the synapse. Derfor bestemte vi oss for å bruke enzymatisk behandling 17 etterfulgt av mekanisk dissosiasjon.
Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi utviklet en akutt dissociated utarbeidelsen av niøye ryggmargen som gir levedyktige isolerte reticulospinal axoner med funksjonelle presynaptiske terminaler blottet for enhver postsynaptiske prosesser, og dermed gi ubegrenset tilgang til individuelle presynaptiske terminaler. I forbindelse med en standard invertert mikroskop og fluorescens bildebehandling, det gjør oss i stand til å identifisere og målrette individuelle fluorescently-identifisert presynaptiske terminaler, med en patch pipette inneholder en opptaksløsning som isolerer Ca 2 + strøm Figur 4c og figur 4D, for opptak ved hjelp av celle- festet spenningsklemmeteknikken. Ca 2 + strøm er ført direkte på den presynaptiske utgivelsen ansiktet membran av individuelle presynaptiske terminaler Figur 4f. Dette er en significant gjennombrudd innen synaptisk transmisjon siden den er den første opptaks å bli utført ved sentrale synapser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Poly-D-lysin Hydrobromide
- Forbered 1 mg / ml poly-D-lysin-hydrobromid i 0,1 M boratbuffer (pH 8,5).
- Delmengde og oppbevar ved -20 ° C.
2. Poly-lysin Coating av Dekk
Merk: Utfør alle rengjøring og belegg trinn i en laminær kammer.
- Plasser Dekk i en petriskål inneholdende 1 N saltsyre (HCl) i 2 timer.
- Aspirer all HCl og skyll med 70% etanol (EtOH) 2-3 x.
- La i 70% EtOH i 1 time.
- Aspirer alt 70% EtOH og skyll med 100% EtOH 2-3x.
- La i 100% EtOH i 2 timer. Suge all EtOH.
- Tørk med filterpapir og lufttørke i noen sekunder.
- Plass O / N i 1 mg / ml poly-lysin løsning.
- Skyll Dekk neste dag med Millipore vann 4-5 ganger.
- Lufttørk poly-lysin belagt Dekk på glass valser i en ren petriskål.
- For immunohistochemistry, bruker 35 x 10 mm petriskål lokk. Forbered Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) foret retter ved å helle PDMS (elastomer og herder 10: 1 etter vekt) i formen til en tykkelse på 0,3 cm og tillater å sette ved 30 ° CO / N. Når dette har satt, kuttet en 2 cm med 1 cm innfelt i PDMS. Rene og smør det innfelte med poly-lysin følge samme fremgangsmåte som nevnt ovenfor for dekkglass.
- Lagre poly-lysin belagt Dekk og retter dekket inne i laminær kammeret inntil bruk (opptil 2 uker, men oppnå beste limet resultater ved å forberede jevne hver 3-4 dager).
- Forbered en PDMS blokk, til pin ryggmargen i den vibrerende vev slicer. Bland Elastomer A og B Elastomer 1: 1 etter vekt. Hell over i en 100 x 15 mm petriskål og tillater å sette O / N ved 30 ° C. Skjær et rektangulært stykke av pmds og lim den til slicing bunnplaten ved hjelp av epoxy lim. Tillate limet å sette innfesting av PDMS på plass og skjære flere tynne seksjoner av overflaten for å skaffe en flatoverflaten til pin vevet på.
3. Akutt dissosiasjon av Lamprey Spinal Cord å gi Isolerte Reticulospinal Axoner
- Bedøve en ammoecoete eller voksen niøye (Petromyzon marinus) med Tricaine Methansulfonatsaltet (MS-222, 100 mg / L). Legg bedøvelse i vannet, i en plastkopp som dekkes av et lokk, som inneholder lamprett ofres.
- Decapitate lamprett i kaldt (4 ° C) Ringers løsning med følgende sammensetning (i mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1,8 MgCl2, 4 HEPES, 4 dekstrose (pH 7,6, osmolariteten 270 mOsm) og fjerne organ veggen muskler for å avsløre dorsalflate ryggmargen.
- Fjern Meninx primitiva fra framsiden av ryggmargen ved hjelp av fin pinsett. Ikke fjern ventral Meninx primitiva på dette stadiet.
- Skjær ryggmargen i 1 cm lange biter.
- Feste en ryggmarg stykke hjelp av gode insekt pins, ryggsiden opp, på en PDMS foret slicing basen plate (se 2.12) i en vibrerende vev høvelen kammer inneholdende is-kald Ringers løsning.
- Fjern en sentral del av rygg kolonnen i ryggmargen ved å skjære langs Rostro-kaudal aksen med bladet, etterlater intakte ryggkolonne seksjoner på rostral og hale slutter å fungere som håndterer under dissosiasjon prosessen Figur 2a og figur 2b. Bruk tregeste hastighetsinnstilling som tillater slicing og en dybde innstilling som fjerner bare rygg kolonnen forlater den underliggende reticulospinal axon kolonne uskadet Figur 2b.
- Inkuber skiver ryggmargs stykker ved RT i 45 minutter i en blanding av 1 mg / ml protease (Type XIV fra Streptomyces griseus) og 1 mg / ml kollagenase fremstilt (type IA fra Clostridium histolyticum) i Ringers løsning (tilpasset fra El Manira & Bussières 1997 17).
- Pin enzymbehandlet ryggmargs brikker bruker fin pins i en PDMS foret petriskål Containing kald (4 ° C) Ringers løsning.
- Fjern ventral Meninx primitiva med fin pinsett.
- Skjær side områder med ryggmargen med en skalpell blad på midtpunktet av skiver rygg delen forlater den sentrale kolonne av reticulospinal axoner intakte i ryggmargen figur 2d.
- Plasser en dråpe immersjonsolje på linsen.
- Plasser poly-lysin belagt dekkglass (figur 3a, overdel, rød firkant) i sporet av opptaket kammer Figur 3 og bruke vakuum fett på alle kanter (mellomrom mellom røde og blå rektangler i figur 3a, for å lette en sel. Skrue toppen på plass. Plasser kammeret i innfelt på opptaksinnretningen.
- Legg Ringers oppløsning inn i opptakskammeret ved hjelp av en Pasteur-pipette.
- Koble utstrømningen rør på trykkflaske inneholdende frostvæsken til det termoelektriske kjøleenhet-inngang slangen. Koble outpUT slange av termoelektrisk kjøling enhet til inngangsenden av den ytre kjølekappe og utgangsenden til reservoaret figur 3b.
- Plasser en del av ryggmargen på et tidspunkt i opptakskammeret og forsiktig skille ryggmarg opprettholde den langs dekkglasset til enhver tid ved hjelp av teflon tang før axoner isoleres figur 2e og 2f fig.
- Bring opptak løsning temperaturen til 10 ° C ved å føre den trykksatte (nitrogengass presses inn i flasken) frostvæsken (ved forskyvning), via den termoelektriske kjøleenheten, gjennom den ytre kjølekappe for opptakskammeret figur 3b.
- Tillat axoner å gjenopprette i 1 time etter dissosiasjon ved 10 ° C.
Figur 3. Skjematisk av opptak kammer for elektrofysiologiske eksperimenter. Dimensjoner tilbys er i inches. Red rektangel vist i basepiece diagram (a) viser plassering av dekkglass i dekk sporet i basepiece. Regionen mellom rødt og blått rektangel, vist i basepiece diagram (a) er der høyvakuum fett påføres. (B) viser den sammensatte opptakskammeret.
4. Merking og identifisering av presynaptiske terminaler med FM 1-43
- Etikett presynaptiske terminaler, ved å innlemme FM 1-43 inn vesicles under synaptic exo-endocytose under høy K + depolarisering. Perfuse preparat med 5 uM FM 1-43 (i 5 ml Ringers-oppløsning inneholdende 30 mM KCl).
- Perfuse preparat med 1 mg / ml Advasep-7 (i 5 ml Ringers oppløsning) for å fjerne overskudd av fargestoff FM) 18.
- Perfuse forberedelse med Ringer løsning for 15 min til utvasking noen remant fargestoff og Advasep.
- Et bilde med 100 x oljeneddyppingsobjektivet linse (NA 1.25) på en invertert fluorescensmikroskop, i forbindelse med et digitalt CCD-kamera og bildeinnlastingen micro programvare, ved anvendelse av standard fluorescens avbildningsprotokoller.
- Identifiser fluorescensmerkede presynaptiske terminaler til mål for opptak Figur 4c og Figur 4d.
5. Immunhistokjemi av isolerte Reticulospinal Axoner
- Fyll fatet innfelt (Protokoll avsnitt 2.10.) Med toverdig-ion (Ca 2 + og Mg 2 +) gratisRingers løsning.
- Dikte patch pipetter i en P-87 mikropipette avtrekker. Plasser en liten mengde av sutur lim på den ene enden av poly-lysin innfelt anvendelse av et plaster pipette (1,5 mm ytre diameter glass) og innsugning (ved hjelp av en silikonslanger 0,89 mm indre diameter med en mikropipette stykke som er festet til sugemunnstykket).
- Gjennomføre dissociations bruker samme prosedyre som nevnt i protokollen § 3 Figur 2. Plasser den ene enden av ryggmargen på sutur lim og trykk forsiktig med pinsett til å følge det sterkt til overflaten. Plasser en annen dråpe sutur lim på den andre enden av det innsatte og forsiktig strekke ryggmargen til axoner er dissosiert og følge den frie ryggmargen slutten ved å dra den forsiktig over sutur lim. Fikse på plass ved forsiktig å trykke ned med pinsett.
- Utveksling toverdig frigjøre Ringer løsning med vanlig Ringer løsning ved perfusjon.
- Tillat axoner å gjenopprette for 20 min innlegg dissociation ved 10 ° C.
- Løs dissosierte aksoner i 4% paraformaldehyd (PFA) {fremstilt i fosfatbuffer saltvann (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na HPO 2 4 10, KH PO 2 4 1.8, pH 7.4)} i 20 min. Filter PFA-løsning før bruk ved å passere gjennom et 0,2 uM sprøytefilter.
- Vask PFA ved perfusert 0,1 M glycin (i PBS) i 10 min.
- Inkuber i 0,1% Triton-X (i PBS) i 10 min.
- Vask ved perfusert PBS i 20 min.
- Blokker med 5% ikke-fettmelk (i PBS) i 6 timer ved 4 ° C.
- Legg i primære antistoff til VGCC av interesse (1: 200 fortynning i PBS) og inkuberes i 20 timer ved 4 ° C.
- Vask ved perfusert PBS i 20 min.
- Blokker med 5% ikke-fettmelk (i PBS) i 10 min ved 4 ° C.
- Legg i sekundært antistoff (1: 400 fortynning i PBS) og inkuberes i mørket i 2 timer ved 4 ° C.
- Vask ved perfusert med PBS i 20 min.
- Blokker med 1% Bovine Serum Albumin (i PBS) i 20 min.
- Legg i Alexa Fluor 488 phalloidin (5 enheter / mL arbeidskonsentrasjon; lager utarbeidet i metanol 200 enheter / ml).
- Vask ved perfusert med PBS i 20 min.
- Bildet ved hjelp 100X vann nedsenking objektiv på konfokal mikroskop.
6. elektrofysiologisk registrering
- Dikte aluminosilikat glass patch pipetter (pipette motstand 2-5 mÊ) i en P-87 mikropipette avtrekker. Design patch pipette slik at pipettespissen omfatter hele presynaptiske terminalen diameter.
- PDMS belegge patch pipetter ved dypping plasteret pipette etter 50-60 psi trykk i PDMS 23 (feste en silikonslange, 0,89 mm indre diameter, som er koblet til en nitrogengassflasken, til den bakre enden av plasteret pipette) og tørkes ved hjelp av en varme pistol. Alternativt manuelt belegge pipette med PDMS, påføring av belegg som nær spissen som mulig, under et sammensatt mikroskop.
- Brann polsk patch pipetter ved hjelp av en microforge (en tilpasset bygget platina filament montert på scenen av et sammensatt mikroskop).
- Identifisere isolerte axoner demonstrerer merket presynaptiske terminaler ved fluorescens mikroskopi.
- Fyll opptaksløsning (laget for å isolere Ca 2 + strømninger, 10 mM CaCl 2 eller 90 mM bacl 2 som ladningsbærere, HEPES-bufret pH 7,6, osmolariteten 270 mOsm) i lappen pipetten ved hjelp av en sprøyte.
- Sett patch pipette inn pipetten holderen og posisjon over badekaret ved hjelp av en motorisert manipulator MP225. Senk plasteret pipette inn i badet og posisjon mot ansiktet til en fluorescensmerket identifisert presynaptiske terminal.
- Advance lappen pipette sakte fram i kontakt med membranen. På dette punktet, for å oppnå en gigaohm tetning ved forsiktig munnen suge gjennom en slange festet til pipetten holderen.
- For å oppnå de ekstremt lave bakgrunnsstøy som kreves for opptak av enkeltkanal Ca 2 + strøm, bruke en Axopatch 200B med en avkjølt heads for innspillingene. Eksempeldata på 20-50 kHz og filter ved hjelp av en 5 kHz Bessel filter. Gjennomføre datainnsamling ved hjelp av en Axograph X.
- Bruk en standard skritt protokollen, i trinn på 10 mV som stimulans. Innarbeide en pre-puls i protokollen, forut for trinnet protokollen, for å sikre maksimal aktivering av Ca 2 +-kanaler. Innlemme en 10 mV lekkasje skritt inn i trinnet protokoll for post-analyse subtraksjon av lekkasjestrømmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne dissosiasjon protokoll Rentene sunne og funksjonelle isolerte reticulospinal axoner blottet for postsynaptiske anslag Figur 2f, men som likevel beholde funksjonelle presynaptiske terminaler som kan fremkalt synaptisk vesikkel exo-og endocytose Figur 4c og Figur 4d. Deler av de isolerte regioner av reticulospinal axoner klart kan identifiseres i henhold lysmikroskopi å være klar over eventuelle andre nevrale prosesser tillate ubegrenset tilgang til reticulospinal axon membran Figur 2f. Axoner beholde strukturell integritet etter dissosiasjon. Isolerte axoner ble lappet i hele cellekonfigurasjon og fylt med Alexa Fluor 488 hydrazid. Fargestoffet fordeles ensartet i det axon og ingen fargestoff lekkasje ble observert fra axon figur 4a.
/ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. Representative opptak fra en isolert reticulospinal axon. (A) Isolert reticulospinal axon fylt med Alexa Fluor 488 hydrazid med en patch pipette i hele cellekonfigurasjon. Pipette posisjon vises med en hvit pil. (B) i. Representant aksjonspotensial sparken i en isolert reticulospinal axon. ii. Representant aksjonspotensial sparken i en reticulospinal axon i intakt ryggmargen. Svarte pilen indikerer tidspunkt for stimulering. (C) og (d) To bilder av en isolert reticulospinal axon som viser punktformet merking av presynaptiske terminaler med FM 1-43 og målretting av et individ presynaptiske terminalen med patch pipette for celle-festet plasteret opptak. Grønne pilene merke de presynaptiske terminalene mens hvit pil markerer patch pipette. (E) Døde isolert reticulospinal axon viser indiscriminate inkorporering av FM 1-43 hele axon. 4f. Representativt eksempel som viser celle-tilknyttet opptak av Ca 2 + strømmer (10 mM [Ca2 +] eksternt i innspillings løsning i plasteret pipette) fra presynaptiske frigjøring flens membran demonstrere åpning av flere Ca 2 +-kanaler. Heltrukken linje markerte 0 indikerer lukket tilstand av kanalen, mens stiplede linjer angir den gaussiske toppene for kanalåpninger.
Akutt dissosiert axoner beholde elektriske egenskaper. Hvilende membranpotensial (RMP), kan måles ved spidder disassociated axon med en microelectrode eller ved å lappe axon i hele cellekonfigurasjonen i strømklemmen modus. Lignende RMPs føres i begge metodene, med et gjennomsnitt på -57,94 ± 1.63 mV (n = 17 axoner). I tillegg dissosiert axoner kan bli stimulert til å avfyre aksjonspotensialer Figur 4b, med form og tidsforløpet av aksjonspotensialet blir sammenligntil én sparken i en reticulospinal axon i intakt ryggmargen.
Vesikkelfusjon og gjenvinning vedvare i dissosiert axoner. Gjenvinning vesikkel klynger kan være merket med styryl fargestoff FM 1-43 under høyt kalium (30 mM KCl) stimulering 19. Ved fargestoff clearance, kan tydelig punktformet merking av presynaptiske terminaler observeres Figur 4c og figur 4D, med en fordeling som ligner på reticulospinal axoner i intakt ryggmarg 13. FM 1-43 flekker gir et klart skille mellom sunn og usunn axoner som usunn axoner viser kritikkløs FM fargestoff oppføring hele axon Figur 4e. Evnen til å identifisere individuelle presynaptiske terminaler tillater oss å målrette dem med en patch pipette for opptak Figur 4c og Figur 4d. Utnytte denne evnen har vi spilt Ca 2 + strøm direkte fra utgivelsen ansiktet membrane av single presynaptiske terminaler Figur 4f.
Den akutt isolert reticulospinal axon forberedelse tilbyr også klare fordeler i forhold til intakt ryggmargen for immunhistokjemi av single presynaptiske terminaler. Mangelen på en hvilken som helst bakgrunns autofluorescens og fravær av farging på postsynaptiske strukturer eller gliaceller gir mulighet for entydig identifisering av antistoff merking identifisert i presynaptiske terminaler (figur 5b, i). Sammen med en presynaptisk markør som Alexa-488 konjugert phalloidin (figur 5a, ii) og (figur 5b, ii), hvilke etiketter presynaptisk aktin 20, lokalisering av immunhistokjemisk merking til presynaptiske terminaler kan tydelig demonstrert (figur 5a, iii). Denne fremgangsmåten har blitt brukt i forbindelse med konfokal mikroskopi for å utføre immunhistokjemisk karakterisering av de forskjellige VGCC subtyper viser tarving bestemt lokalisering til presynaptiske terminaler Figur 5a.
Figur 5. Immunostaining av en isolert reticulospinal axon. (A) Immunhistokjemisk karakterisering av R-type (CaV2.3) kalsium kanal på individuelle presynaptiske terminaler. jeg. Et polyklonalt primære antistoff ble brukt til å merke en epitop i den intracellulære løkke mellom områdene II og III av R-type kalsiumkanal (host - kanin). Sekundært antistoff ble Alexa Fluor 633 hydrazid konjugert geite-anti-kanin IgG. ii. Presynaptiske terminaler identifisert av Alexa Fluor 488 phalloidin merking av presynaptisk aktin. iii. Colocalization mellom R-type antistoff merking (rød) og Alexa-488 phalloidin (grønn) vist i et fusjonert overlegg. (B) i. Preinkubasjon med anti R-type kalsiumkanal-antistoff medkontroll antigen ikke gir noen spesifikk merking av kalsiumkanaler. ii. Alexa Fluor 488 phalloidin merking av presynaptiske terminaler for samme axon viser diskrete punktformet merking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår dissosiasjon protokollen er betydelig ved å gi etter isolerte reticulospinal axoner blottet for postsynaptiske anslag Figur 2f, men som likevel beholde funksjonell presynaptiske terminaler Figur 4c og Figur 4d. Fraværet av postsynaptiske prosesser motstående den presynaptiske terminalen tillater direkte opptak tilgang til den presynaptiske frigjøring flens membran ved enkle presynaptiske terminaler, som tidligere ikke mulig i sentrale synapser og hell oppnådd i bare to calyceal-type presynaptiske terminaler; calyx-type synapse av chick stråle ganglion 7-10 og rotte calyces 11,12. Individuelle presynaptiske terminaler, som ved elektron hhv nivå har vist seg å presentere enkle, single aktive soner 21, kan identifiseres ved resirkulering merking vesikkel klynger med FM 1-43 og målrettet for opptak Figur 4c og Figur 4d. Ca
Nøkkelen til å oppnå isolerte reticulospinal axoner med funksjonelle presynaptiske terminaler ligger i en rekke kritikeral sekvensielle trinn. Tissue hindrer akutt dissosiasjon av de gigantiske axoner ligger hovedsakelig i dorso-mediale delen av ryggmargen Figur 1a måtte fjernes først i en vibrerende vev slicer Figur 2a. Dette gjør det lettere å mekanisk dissosiere ryggmargen ved hjelp av minst mulig kraft. Kutting av rygg kolonnen krever fullstendig fjerning av rygg Meninx primitiva siden eventuelle gjenværende rygg Meninx primitiva ville vanskelig skjæringen av bladet. Vi finner at forlate den ventrale Meninx primitiva på ryggmargen på tidspunktet for kutting bidrar til å opprettholde formen på ryggmargen og bistår i bedre kutting. Å opprettholde strekk i ryggmargen under skjæreprosessen hindrer enhver sidebevegelse eller anslags av vevet under det blad som ville skade axoner. 1 cm lange ryggmargs stykker gir en god lengde for å ha klippet som vevet kan strekkes og låste ned opprettholde spenningen waler slicing. En annen kritisk faktor for å overvåke er dybden av stykket; for grunt et stykke forhindrer god separasjon av ryggmargen, mens for dypt en skive skader reticulospinal axoner. Et godt stykke dybden er en hvor den dorsale kolonnen fjernes synlig forlater den ventrale reticulospinal kolonnen uskadet. Dybden av skiven må måles under skjæreprosessen gitt det er variasjon i ryggmargen tykkelse mellom dyrene. Fjerningen av den dorsale kolonnen blir best utført i den midtre delen av ryggmargen stykke Figur 2b som gjør det mulig for den unsliced rostral og kaudale ender for å tjene som håndtak for å gripe vev under dissosiasjon prosessen figur 2e.
Etter fjerning av den dorsale kolonnen, behandle skiver ryggmargs stykker med en blanding av kollagenase (Collagenase Type IA fra Clostridium histolyticum) og protease (protease type XIV fra Streptomyces griseus) enzymer (1 mg / ml i Ringer løsning) hjelper fordøye bindevev og muliggjør en mildere dissosiasjon. En 30-45 min fordøyelsen ved RT er ideell for dissosiasjon. Fullstendig enzymatisk dissosiasjon av lamprett ryggmarg har tidligere blitt utført med sekvensielle behandlinger av kollagenase (2 mg / ml, 30 min) og protease (2 mg / ml, 45 min) for å isolere spinale nerveceller 17. Sekvensielle behandlinger versus behandling med en cocktail av protease og kollagenase ikke gi bedre resultater i dissociating reticulospinal axoner. Vi har også eksperimentert med forskjellige konsentrasjoner av dissosiasjon enzymer. Enzymkonsentrasjoner høyere enn 2 mg / ml eller fordøyelses ganger lengre enn 45 min resulterte i ryggmargen mister sin konsistens og fattige dissociations. De høyere enzymkonsentrasjoner og forlenget behandlingsperioder kan hjelpe i fullstendig dissosiasjon av ryggmargen når avkastning av mindre nevroner er påkrevd. Reticulospinal axoner, i kontrast, har en utvidet sliter menncture og behandlinger større enn 45 min var mot sin hensikt. Beholde litt spenning i ryggmargen hjulpet bedre dissociations.
Den neste viktige trinn er å kutte de laterale områder av den enzymbehandlede ryggmargs stykker ved midtpunktet av de skiver regionen for å isolere det endelige dissosiasjon kraft til regionen som omfatter reticulospinal axoner. Kuttene skal strekke seg fra den laterale kanten av ventral horn grå materie til den sentrale ventro-medial kolonne av reticulospinal axoner forlate dem uskadet figur 2d. Skjære laterale traktene gir et brennpunkt ved hvilken tvungen separasjon av ryggmargen vil forekomme ved mekanisk dissosiasjon og muliggjør en jevnere separasjon av vevet. Varig strekk i ryggmargen er nødvendig under skjæreprosessen, og kan oppnås ved å strekke og feste de kaudale og rostral endene av ryggmargen stykke. Dette forhindrer vev deformasjon under skalpell bladog påfølgende skade på axoner.
Det siste trinnet i dissosiasjon søker mekaniske spenninger og forsiktig strekke vevet langs Rostro-kaudal aksen figur 2e bruker pinsett til å gripe vev. Dette trinnet blir utført i løpet av poly-lysin-belagte dekkglass for å tillate adhesjon av de separerte axoner for etterfølgende opptak. For å oppnå bedre adhesjon for de lange utvidede reticulospinal axoner, er det brukt en høy molekylvekt (> 300.000) poly-D-lysin-hydrobromid, noe som gir større antall av festepunkter, for å belegge dekkglass og petriskål innfellinger. Poly-lysin belagt overflate gir tilstrekkelig feste for ryggmargen slutter og akutt isolerte reticulospinal axoner. Teflon tang er nødvendig å gripe ryggmargen fordi det holder fast til vanlig rustfritt stål pinsett hindrer dissociations. Vevet må strekkes langsomt og forsiktig dra axoner ut av spInal ledningen. Den beste måten å få axoner å slå seg ned er å opprettholde ryggmargen ender langs glass dekkglass til enhver tid under dissosiasjon prosessen ved å opprettholde trykket nedover på rostral og haleryggmargen slutter med pinsett.
De aksoner er best klassifisert som delvis isolert siden noen del av axon forblir inne i det minste en ende av ryggmargen ende avhengig av den grad av dissosiasjon. Isolasjoner kan utføres ved mekanisk å skille de to endene av ryggmargen før aksonene fullstendig atskilt fra en ende av ryggmargen. I dette tilfellet en del av axon forblir inne i ryggmargen ende fra hvilken den kommer ut, mens den gjenværende del er isolert av ryggmargen indre. Terminalen åpne enden av axoner tetter opp med en membran resealing prosess avhengig av helsen til axon. Isolasjoner kan også utføres slik at de axoner komme ut fra ryggmargen, bUT hale og rostral endene av ryggmargen forbli tilkoblet ved hjelp av de isolerte reticulospinal axoner figur 2e. På dette punktet, forsiktig slippe trykket gjør at axoner under spenning for å slappe av og sløyfe ut gir isolerte regioner av axoner blottet for postsynaptiske anslag. Begge dissosiasjon teknikker gi funksjonelle axoner. Den fysiologiske temperatur for lamprett er 10 ° C, og derav ved fremstilling tillates å komme seg ved 10 ° C i 1 time for å tillate axoner å utvinne fra den akutte dissosiasjon. For elektrofysiologiske opptak ble dissosiasjon utført på en poly-lysin-belagte dekkglass settes inn i et tilpasset kammer Figur 3. Niøye ryggmargen er generelt opprettholdt ved 10 ± 2 ° C ved perfusert Ringers oppløsning, som var foravkjølt til 10 ° C ved å passere gjennom en termoelektrisk kjøleenhet. Meget lave bakgrunnsstøy er nødvendig for å løse enkelt kanal Ca Høy K + (30 mM KCl) blir brukt til å depolarize axoner (avsnitt 4.1), slik at FM-fargestoff er innlemmetblemmer under synaptic exo-endocytose. Det er vanskelig å holde på innsetting av en microelectrode i isolerte axoner etter lengre perioder som den minste driv i axon stilling bevirker at elektroden for å trekke seg tilbake fra axon. Dette gjør det vanskelig å stimulere axoner for lengre periode ved hjelp av en microelectrode. Den store axon diameter (20-50 mikrometer) gjør det vanskelig å stimulere ved hjelp av en wolframstimuleringselektrode. Derav høy K + ble brukt til å depolarize axoner. De presynaptiske terminaler i de reticulospinal aksoner har en diameter på 1-2 um. Ca 2 + strøm er lokalisert til utgivelsen flens membran ved presynaptiske terminaler og det er derfor viktig å nøyaktig målrette den presynaptiske terminalen. Derfor er en viktig forutsetning for å oppnå disse opptakene å være i stand til å manipulere bevegelsen av plasteret pipette stilling i trinn mikrometer. Ca 2 + strøm på presynaptisk utslipp ansikt membraner har blitt demonstrereed i calyceal synapser å være svært små i styrke, mindre enn 0,5 pA. Enkeltkanal opptak av Ca 2 + strømmer dermed krever ekstremt lave bakgrunnsstøy. Lav termisk støy ble oppnådd med en Axopatch 200B forsterker og en avkjølt heads. Videre kontaminerende støykilder må være systematisk identifisert og fjernet. Patch pipetter ble fabrikkert, fra aluminosilikat glass for å sikre lav støy siden glasset har ekstremt lave urenheter og høy motstandsdyktighet. Pipettene er laget slik at diameteren pipettespissen var større enn diameteren av det presynaptiske terminalen derved helt omfatter den presynaptiske terminalen, kan dimensjonene som observeres tydelig av FM 1-43 merking. Dette sikret opptak fra hele utgivelsen ansiktet membran. Den kapasitive støy ble redusert ved å belegge pipette med PDMS så nær spissen som mulig. De gigaohm selene i presynaptiske terminalen membraner er ikke stabil for lang periods og opptak vanligvis vare maksimalt 2 min. Dette gjør opptakene ekstremt vanskelig å oppnå, siden den lave suksessrate nødvendiggjør et stort antall forsøk på å få vellykkede opptak. Opptaksløsninger må være utformet slik at alle andre kjente strømmer i den presynaptiske membran terminal slik som spenningsstyrte Na + og K +-kanaler og Ca 2 +-aktivert K +-kanaler er blokkert, slik at opptak av Ca 2 + strømninger. Det er noen begrensninger ved bruk av poly-lysin selvklebende overflate med dette preparatet. Den ene er den manglende evne til å bevege den fysiske plasseringen av kammeret som inneholder preparatet fordi eventuelle vibrasjoner forstyrret blandingen. En annen begrensning av limet overflaten ble avdekket under immunhistokjemi eksperimenter, som rostral og caudal ryggmargsendestykkene mister vedheft når inkubert i 4% paraformaldehyde. Vi har prøvd alternativ lim coaTings som Cell-Tak og støtt lignende problemer. For å løse disse problemene, brukte vi flytende sutur lim for å feste ryggmargen håndtak. Detaljene om bruk av sutur limet har vært diskutert i en tidligere Jove artikkel av Chen og Featherstone 22. Limet går ned ved en lavere hastighet i løsninger uten divalente ioner og vi tok fordel av at eiendom og utført dissociations i Ringers løsning uten Ca 2 + og Mg 2 +. Dette ga ytterligere tid for manipulering av vevet i løpet av dissosiasjon prosessen. Vi har vedtatt en lignende tilnærming til Chen og Featherstone 22 ved hjelp av patch pipetter og munn sug gjennom en slange koblet til patch pipette for å bruke lim på den spesifikke målområdet på dissosiasjon overflaten før du utfører dissosiasjon (Protokoll punkt 5.2). De dissociations ble utført som beskrevet tidligere, med den eneste forskjellen er at rygg-cOrd ender ble festet under dissosiasjon prosessen ved å forsiktig dra i håndtaket ende over tidligere plassert lim (Protokoll pkt 5.3). Når dissosiasjonen var fullført, det divalente ion fri Ringer-oppløsningen ble byttet med Ringer-oppløsning inneholdende Ca 2 + og Mg 2 +-ioner ved perfusjon og preparatet ble tillatt å komme seg ved 10 ° C i 20-30 min på en termoelektrisk kjøleplaten før går videre til etterfølgende trinn i immunhistokjemi. Nøkkelen implikasjon av denne teknikken er en presis forståelse av Ca 2 + kravet til nevrotransmitter-frigjøring, som ikke har blitt fullstendig løst tross for tiår med forskning. En forbigående økning i presynaptiske [Ca 2 +] har blitt etablert som avgjørende for å utløse utgivelsen i alle synapser. Imidlertid er konsensus fortsatt mangler på antallet Ca 2 +-kanaler som bidrar til Ca 2 + domene gating RELEASE. Samtidig måling av Ca 2 + strøm og kapasitans målinger ved utgivelsen flens membran av individuelle presynaptiske terminaler ville gi et entydig svar på dette spørsmålet. Videre vil det muliggjøre klarlegging av timingen forholdet mellom presynaptisk Ca 2 + oppføring og vesikkelfusjon, slik at en nøyaktig måling av synaptiske forsinkelse. Den frie tilgang til utløser flens membran på individuelle presynaptiske terminaler gir evnen til å anvende en rekke forskjellige eksperimentelle tilnærminger for å studere forskjellige komponenter av neurotransmitterfrigjørelse prosessen. Eksempler på slike tilnærminger inkluderer enkelt vesikkel avbildning ved hjelp kvanteprikker å studere synaptiske vesikkelfusjon. Vesikkelfusjon hendelser kan også være direkte preget ved presynaptiske terminaler ved å måle membran kapasitans endringer som ligger til grunn vesikkelfusjon hendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S.
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V.
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K.
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
