Abstract
Sinaptik iletim son derece hızlı bir süreçtir. Aksiyon potansiyeli bırakma yüz zarında bulunan voltaj-kapılı kalsiyum kanalları (VGCCs) aracılığıyla, presinaptik terminale Ca 2 akını tahrik, vezikül füzyon ve nörotransmitter salınımı için tetikleyici olduğunu. Sinaptik iletim süratine önemli aksiyon potansiyeli, VGCCs gelişi ve nörotransmitter bırakma makineler arasındaki mekansal ve zamansal senkron olduğunu. Doğrudan ca bireysel presinaptik terminallerin serbest yüz zardan 2+ akımları kaydetmek için yeteneği presinaptik Ca 2 + ve nörotransmitter salınımı arasındaki ilişkinin kesin bir anlayış için şarttır. Elektrofizyolojik kayıt için presinaptik bırakma yüz zarına erişim çoğu hazırlıkları ve presinaptik Ca mevcut değildir 2+ giriş görüntüleme teknikleri ve makroskopik akım MeasureMe kullanılarak karakterize edilmiştirNTS - Ca 2 + girişi görselleştirmek için yeterli zamansal çözünürlüğe sahip değilsiniz teknikleri. Doğrudan tek presinaptik terminallerinde VGCCs vasıflandırılması merkezi sinapslara mümkün olmamıştır ve bu güne kadar başarılı bir şekilde sadece civciv kılcal gangliyon çanak tipi sinaps ve sıçan kaliksler elde edilmiştir. Biz başarıyla postsinaptik yapıların yoksun fonksiyonel presinaptik terminalleri ile izole reticulospinal aksonlarını verir omuriliğin bir akut ayrışmış hazırlık geliştirerek taşemen omurilik dev reticulospinal sinaps bu sorunu ele alınmıştır. Biz floresan etiket ve bireysel presinaptik terminalleri belirlemek ve kayıt için onları hedef olabilir. Bu hazırlık kullanarak, immünohistokimya ve elektrofizyoloji yaklaşımlar kullanılarak tek tek presinaptik terminallerin serbest yüzünde doğrudan VGCCs tanımlanmıştır. Ca 2 + akımları bırakma yüz zar o doğrudan kaydedilmiştirm bağımsız presinaptik terminalleri, birinci tür kayıt merkezi sinapslarda gerçekleştirilecektir.
Introduction
Sinaptik iletim son derece hızlı ve hassas bir işlemdir. Presinaptik terminalin etki potansiyeli istilası salma Yan membran, presinaptik Ca 2 + artışım vezikül füzyon ve nöro-ileticinin salıverilmesine 1 için tetikleyici olarak görev bulunan VGCCs açılmasına yol açar. Bu adımların hepsi mikrosaniye 2 yüzlerce içinde meydana gelmektedir ve dolayısıyla vesikül füzyon makine 3 VGCCs sıkı uzamsal bağlanmasını gerektirir. Presinaptik Ca 2 + akıları başlıca Ca 2 + duyarlı boyalar kullanarak 4 yaklaşımlar görüntüleme ile karakterize edilmiştir. Presinaptik nöronların Ca 2 + modüle eden bir araya getiren Ca +2 tamponları dolaylı olarak presinaptik sinir iletiminin kalsiyum ve 3 arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ayrıca, Ca 2 + 5 uncaging veya macroscopi kaydederek presinaptik serbest Ca 2 + konsantrasyonunu modüleCa c 2 + akımları vezikül füzyon ve / veya salınımının önlemler ile birlikte kullanılmıştır; Bu kapasite ölçümleri gibi 6 veya postsinaptik tepkiler aynı soruyu ele 2. Sinaptik vezikül füzyon ve nörotransmitter salınımını tetikleyerek 2+ akımlar Ancak, serbest yüzüne 2+ akımları doğrudan Ca karakterize, membran depolarizasyon Ca çevrilir presinaptik membranın özel bölümünde, Ca kesin bir ölçü elde ayrılmaz olduğunu 2+ sinaptik vezikül füzyon gereksinimi. Buna ek olarak, bununla doğrudan aksiyon potansiyelinin zamanla arasındaki zamanlama ilişkisinin tam aydınlatılması vezikül füzyon ve serbest doğru eş zamanlı ölçümleri ile karşılaştırın bağlanmış, tek tek presinaptik terminallerinde Ca 2 + akımları karakterize etmek için, presinaptik Ca2 + akımı, vezikül füzyon ve bırakın. Salma Yan membran erişimpostsinaptik dendritler tarafından appozisyon kapatmak nedeniyle presinaptik terminalleri çoğunda mevcut değildir. Bireysel presinaptik terminallerde akımının doğrudan ölçümler önlediğinden Bu erişilememesi VGCCs karakterizasyonu önemli bir engel olmuştur. Bireysel presinaptik terminallerde presinaptik Ca 2 + akımları doğrudan karakterizasyonu bugüne kadar merkezi sinapsların mümkün olmamıştır ve sadece iki kalisyel tipi presinaptik terminallerde elde edilmiştir; civciv siliyer ganglion 7-10 ve sıçan kalikslerin 11,12 çanak tipi sinaps. Taşemen omurilik 13 dev reticulospinal sinaps da dahil olmak üzere diğer tüm presinaptik terminallerde, presinaptik salınmasını yüz zara erişim eksikliği gibi Ca2 + akıları presinaptik incelemek için Ca 2 + görüntüleme gibi doğrudan olmayan yaklaşımlar kullanılmasını gerektirmiştir.
Dorsolomber ventral bir yönlenmesine işaret eder taşemen omurilik Şekil 1. taşemen dev reticulospinal sinaps.: (A) kesiti. Reticulospinal aksonlar yeşil Asteriks ile işaretlenir. Postsinaptik nöronun 13 üzerine (yeşil oklarla işaretli) presinaptik reticulospinal akson passant kişileri en çok yapmak gösteren taşemen omurilikte reticulospinal sinaps (b) 3-D rekonstrüksiyonu. Postsinaptik nöron Alexa Fluor 568 hidrazitle (kırmızı) ile dolu olan ise presinaptik terminalleri, Alexa Fluor 488 hydrazide birleşmiş falloidin (yeşil) ile işaretlenmiş edilmiştir.
Nöron üzerine passant sinaptik bağlantıları tr omurilik Rostral-kaudal eksen Şekil 1a kordon paralel form birden ventral bölgesinde bulunan Lamprey dev reticulospinal akson,Spinal ventral boynuz 14 Şekil 1b 13. Makroskopik tam hücreli Ca 2 + akımları sağlıklı omurilik 13,15 olarak reticulospinal aksonlarından kaydedildi. Ancak, Ca doğrudan ölçümde önceki kör girişimleri hücre bağlı yama kelepçe tekniği kullanılarak sağlam taşemen omurilikte reticulospinal akson 2+ akımlar nedeniyle karşıt süreçler postsinaptik nedeniyle presinaptik bırakma yüz membran ulaşamama 13 başarısız kanıtlanmış Şekil 1b. Zar daha önce serbest yüz, sinaps mekanik pertürbasyon önceden 12 kayıt veya mekanik ayrılma 16, ikiye katlanmış bir enzim tedaviye sinaptik sonrası nöronu 11 çıkarılmasıyla ulaşılabilir hale getirilmiştir. Omurilik karmaşık organizasyonu göz önüne alındığında, postsinaptik nöron tespit ve mekanik bunu geri veya th perturb son derece zor olduğunu kanıtlayacake sinaps. Dolayısıyla, biz mekanik ayrılma ardından enzimatik tedavi 17 kullanmaya karar verdi.
Bu yaklaşımı kullanarak, böylelikle bireysel presinaptik terminallere sınırsız erişim sağlayan, herhangi bir postsinaptik süreçlerin yoksun fonksiyonel presinaptik terminalleri ile canlı izole reticulospinal aksonlarını verir taşemen omuriliğin bir akut ayrışmış hazırlık geliştirdik. Standart bir ters mikroskop ve flüoresan görüntüleme ile bağlantılı olarak, hücre-ile bir kayıt için, Ca 2 + akımları Şekil 4C ve Şekil 4d izole bir kayıt çözeltisi içeren bir yama pipet ile tanımlama, ve bireysel floresan tanımlanan presinaptik terminalleri hedef sağlıyor ekli gerilim kelepçe tekniği. Ca 2 + akımları tek tek presinaptik terminalleri Şekil 4f presinaptik bırakma yüz membran doğrudan kaydedildi. Bu, bir significaBu merkezi sinapslara gerçekleştirilebilir ilk bu tür kayıt olduğu nt sinaptik iletim alanında atılım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Poli-D-lisin hidrobromit hazırlanması 1.
- 0.1 M borat tamponda (pH 8.5) içerisinde 1 mg / mL poli-D-lisin hidrobromit hazırlayın.
- -20 ° C'de kısım ve mağaza.
Lameller 2. Poli-lizin Kaplama
Not: Bir laminer akış odasında tüm temizlik ve kaplama işlemleri yapınız.
- 2 saat süre ile, 1 N hidroklorik asit (HCl) içeren bir Petri tabağına yerleştirin lamelleri.
- Aspire tüm HCI ve% 70 Etanol (EtOH) 2-3x ile durulayın.
- 1 saat süre ile% 70 EtOH içinde bırakın.
- Aspire 70% EtOH ve% 100 EtOH 2-3x ile durulayın.
- 2 saat boyunca% 100 EtOH içinde bırakın. Tüm EtOH aspire.
- Bir kaç saniye için filtre kağıdı ve kuru hava ile kurutun.
- Yer göre O / N 1 mg / ml poli-lizin çözeltisi.
- Durulayın Millipore su 4-5x ile ertesi gün lamelleri.
- Hava kuru poli-lisin temiz bir Petri kabı cam silindirler üzerinde lamelleri kaplı.
- Immunohistochemistr içiny, 35 x 10 mm Petri kabı, kapaklar kullanılması. 0.3 cm'lik bir kalınlığa kabına ve 30 ° CO / G ayarlamak için olanak sağlar: Sylgard hazırlanması (polydimethylsilioxane PDMS) PDMS (1 ağırlık elastomer ve sertleştirme maddesi 10) dökülerek yemekler dizildi. Bu kurduğunda, PDMS içine doğru daralmış 1 cm 2 cm kesti. Lamelleri için yukarıda belirtildiği gibi aynı adımları takip poli-lisin ile temiz ve ceket daraltma.
- Mağaza poli-lizin kaplı lamelleri ve yemekleri kullanıma kadar (2 haftaya kadar, ama her 3-4 gün periyodik olarak hazırlayarak iyi yapıştırıcı sonuçları elde) laminer akış odasının içine kapalı.
- Titreşimli doku dilimleme makinesi omuriliği pin, bir PDMS blok hazırlayın. Elastomer A, karıştırın ve Elastomer B, 1: 1 kadardır. 100 x 15 mm Petri kabı içine dökün ve 30 ° C sıcaklıkta O / N ayarlama imkanı verir. Pmds dikdörtgen bir parça kesin ve epoksi yapıştırıcı kullanarak dilimleme taban plakasına tutkal. Tutkal yerde PDMS sabitleme ayarlamak için izin ve düz elde etmek için yüzeyden birden çok ince kesitler dilimYüzey üzerinde doku yıkmaya.
Lamprey Omurilik 3. Akut Ayrılma İzole Reticulospinal Aksonlar Verim için
- (100 mg / L, MS-222) tricaine metansülfonat ile ammoecoete veya yetişkin lamprey (Petromyzon mannus) anestezisi. Lamprey ihtiva eden, bir kapakla kapatılmış bir plastik kap içerisine suya ekleyin anestetik kurban edilmesi.
- 130 NaCl, CaCI2, 1.8 MgCl2, 4 HEPES, 4 dekstroz (pH 7.6, osmolarite 270 mOsm) 2.1 KCI, 2.6 ve kaldırma gövde: soğuk (4 ° C) (mM cinsinden) aşağıdaki bileşime sahip bir Ringer çözeltisi içinde lamprey başını kesmek duvar kasları omurilik dorsal yüzeyini ortaya çıkarmak.
- Ince pensler kullanılarak bir omurilik dorsal yüzeyinden meninksler Primitiva çıkarın. Bu aşamada, ventral meninksler Primitiva çıkarmayın.
- 1 cm uzunluğunda parçalar halinde omurilik kesti.
- PDMS taban pla dilimleme kaplı üzerine, dorsal yüzü yukarı bakacak, ince böcek pimleri kullanarak bir omurilik parça Pinbuz soğukluğunda Ringer çözeltisi ihtiva eden titreşimli bir doku bölmesi dilimleyici te (2,12 bakınız).
- Rostral ve kuyruğu ile, bozulmamış arka sütun parçasının arkasındaki ayrılma süreci Şekil 2a ve Şekil 2b sırasında kolları olarak hizmet etmek üzere sona bırakarak bıçak rostro-kaudal ekseni boyunca kesit alınarak omurilik dorsal kolonun bir merkezi bölümü çıkarın. Dilimleme ve altta yatan reticulospinal akson kolon hasarsız Şekil 2b bırakarak sadece dorsal sütun kaldıran bir derinlik ayarını izin düşük hız ayarını kullanın.
- 1 mg / mL proteaz (Sterptomyces griseus dan Tip XIV) ve Ringer çözeltisi içinde (Clostridium histolyticum'dan Tip IA) hazırlanan bir 1 mg / ml kollajenaz bir karışım içinde 45 dakika boyunca oda sıcaklığında dilimlenmiş omurilik parçaları inkübe (EI Manira ve Bussieres'e uyarlanmıştır , 1997 17).
- Bir PDMS ince iğneler kullanılarak Pin enzim-tedavi omurilik adet Petri conta kaplıadencilik soğuk (4 ° C) Ringer çözeltisi.
- Ince forseps ile ventral meninksler Primitiva çıkarın.
- Omurilik Şekil 2d'de olduğu gibi reticulospinal akson merkez sütunu terk eden dilimlenmiş sırt bölümünün orta noktasında bir neşter ile omurilik yan yolları kesin.
- Lens üzerinde daldırma bir damla yağ koyun.
- Kayıt odasının Şekil 3 yuvasına poli-lizin kaplı lamel (Şekil 3a, üst parça, kırmızı dikdörtgen) yerleştirin ve bir mühür kolaylaştırmak için, Şekil 3a kırmızı ve mavi dikdörtgen arasındaki (tüm kenarlara boşluk vakum gres sürün. Vida yerine üst. kayıt teçhizat içerlek odasına yerleştirin.
- Pasteur pipeti kullanarak kayıt odasına Ringer çözeltisi ekleyin.
- Termoelektrik soğutma cihaz giriş hortumuna antifriz solüsyonu içeren basınç şişenin çıkış hortumunu bağlayın. OUTP bağlayınDış soğutma gömleği giriş ucuna ve hazne Şekil 3b'ye çıkış ucunda etmek üzere, termoelektrik bir soğutma cihazının ut boru.
- Kayıt bölümü içinde bir seferde omuriliğin bir parça yerleştirilir ve hafifçe aksonlar izole Şekil 2e ve 2f Şekil kadar Teflon kaplı forseps kullanılarak her zaman lamel boyunca onu korumak omurilik ayırın.
- Kayıt bölmesi Şekil 3b'de dış soğutma gömleği sayesinde, termoelektrik soğutma cihazı vasıtasıyla, (yer değiştirme ile) antifriz solüsyonu basınçlı (şişe içine itilir azot gazı) geçirilerek 10 ° C'ye kadar kayıt Çözelti oda sıcaklığına getirin.
- Aksonlar, 10 ° C'de 1 saat sonrası ayrılma kurtarmak için izin verin.
Sağlanan elektrofizyoloji deneyler için odasını kayıt Şekil 3. şematik. Boyutları inç vardır. Basepiece Şeması (A) 'da gösterilen kırmızı dikdörtgen basepiece içindeki lamel oluğa lamel konumlandırılmasını gösterir. Yüksek vakum yağ uygulanır, burada (a) basepiece şemada gösterilen kırmızı ve mavi dikdörtgen arasındaki bölgesidir. (B) toplanmış kayıt odasını göstermektedir.
FM 1-43 4. Etiketleme ve Presinaptik Terminalleri tanımlanması
- V içine FM 1-43 dahil ederek, presinaptik terminalleri Etiketyüksek K +, depolarizasyon sırasında sinaptik ekso-endositoz sırasında esicles. (30 mM KCI içeren 5 ml Ringer çözeltisi içinde) 5 uM FM 1-43 ile hazırlanmasını serpmek.
- 1 mg hazırlanmasını serpmek / ml Advasep-7 (5 mi Ringer çözeltisi içinde), fazla FM boya) 18 kaldırın.
- 15 dakika bir REMANT boya ve Advasep boşaltılmasında için Ringer solüsyonu ile hazırlanmasını serpmek.
- Standart protokoller kullanılarak fluoresans görüntüsü dijital CCD kamera ve görüntü toplama yazılımı micro-yapı ile birlikte bir ters flüoresan mikroskop 100 x yağ batırma objektifi (NA 1.25), Image.
- Şekil 4c ve Şekil 4d kayıt için hedef floresan etiketli presinaptik terminalleri tanımlayın.
İzole Reticulospinal Aksonlar 5. İmmünhistokimya
- Iki değerlikli iyon (Ca 2 + ve Mg 2 +), ücretsiz çanak iç satırının (Protokol bölüm 2.10.) DoldurunRinger çözeltisi.
- P-87 mikropipet çektirmenin yama pipetler Üretiyor. (Bir silikon boruya 0.89 mm emme ucuna bağlanmış bir mikro pipet ile iç çap kullanarak) bir yama pipet (1.5 mm dış çaplı cam) ve vakum kullanılarak poli-lisin içerlek bir ucunda dikiş yapıştırıcı küçük bir miktar.
- Protokol Bölüm 3, Şekil 2'de belirtildiği gibi. Aynı prosedür kullanılarak dağılımlarını yürütmek yüzeyine güçlü bir şekilde yapışması forseps ile yavaşça dikiş yapışkan ve basın omuriliğin bir ucunu. Içerlek diğer ucundaki dikiş tutkal bir damla koyun ve yavaşça aksonlar ayrışmış kadar omurilik germek ve dikiş tutkal üzerinde hafifçe sürükleyerek serbest omurilik ucunu yapışır. Nazik forseps ile bastırarak yerine sabitleyin.
- Değişim iki değerlikli perfüzyon düzenli Ringer solüsyonu ile Ringer solüsyonu boşaltın.
- Aksonlar 20 dakika sonrası dissoc kurtarmak için izin verin10 ° C'de iation.
- 20 dakika boyunca {fosfat tamponlu salin (PBS, (mM olarak) NaCl 137, KCl 2.7 Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, pH 7.4) içinde hazırlanan}% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde çözülmüş aksonlar düzeltildi. 0.2 uM bir şırınga filtreden geçirilerek kullanımdan önce PFA çözüm filtre.
- 10 dakika boyunca (PBS içinde), 0.1 M glisin perfüze PFA yıkayın.
- 10 dakika boyunca% 0.1 (PBS) Triton X inkübe edin.
- 20 dakika boyunca PBS ile perfüze edilmesi aşamalarını kapsamaktadır yıkayın.
- 4 ° C 'de 6 saat boyunca (PBS içinde),% 5 yağsız süt ile bloke edin.
- Ilgi VGCC primer antikor ekleyin (PBS içerisinde 1: 200 seyreltme) ve 4 ° C'de 20 saat boyunca inkübe edilir.
- 20 dakika boyunca PBS ile perfüze edilmesi aşamalarını kapsamaktadır yıkayın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca (PBS içinde),% 5 yağsız süt ile bloke edin.
- Sekonder antikor ekleyin (PBS içerisinde 1: 400 seyreltme) ile, 4 ° C'de 2 saat boyunca karanlıkta inkübe edilir.
- 20 dakika boyunca PBS ile perfüze ile yıkayın.
- % 1 sığır serum ile bloke Albu'ya20 dakika boyunca (PBS içinde) Min.
- Alexa Fluor 488 falloidinle ekleyin (bir çalışma yoğunluğuna ul / 5 adet, metanol 200 birim / ml elde stoku).
- 20 dakika boyunca PBS ile perfüze ile yıkayın.
- Konfokal mikroskop 100X su daldırma lens kullanarak görüntü.
6. Elektrofizyolojik Kayıt
- P-87 mikropipet çektirmenin alüminosilikatlı cam yama pipetler (pipet direnci 2-5 M?) Üretiyor. Pipet tüm presinaptik terminali çapını kapsar şekilde tasarım yama pipet.
- PDMS 23 içine 50-60 psi basınç altına yama pipet batırarak kaplama PDMS yama pipetler (yama pipet arka ucuna bir azot gazı silindirine bağlanmış bulunan bir silikon boru, 0.89 mm iç çap, ekleyiniz) ve bir ısı ile kurutun silah. Alternatif olarak, bir bileşik mikroskop altında mümkün ucu kadar yakın kaplama uygulanarak PDMS ile elle ceket pipet.
- Bir MICR kullanarak yangın lehçe yama pipetleroforge (bileşik mikroskop sahneye takılan özel bir inşa platin filaman).
- Floresan mikroskobu ile etiketlenmiş presinaptik terminalleri gösteren izole aksonlar tanımlayın.
- Dolgu kayıt çözümü, bir şırınga kullanılarak Patch-pipetinin içine (Ca 2 + akımları izole etmek için tasarlandı yük taşıyıcı madde olarak, 10 mM CaCl2, 90 mM ya da BaCl 2, HEPES pH 7.6, 270 mOsm ozmolarite tamponlu).
- Motorlu bir manipülatör MP225 kullanarak yukarıda banyo pipet tutucu yerleştirin ve yama pipet takın. Yavaşça bir flüoresan tespit presinaptik yüzüne karşı banyosuna yerleştirin ve yama pipet indirin.
- Iletişim membran ile yapılır kadar yavaşça yama pipet Advance. Bu noktada, pipet tutucuya tutturulmuş bir boru yoluyla yumuşak ağız emme ile gigaohm sızdırmazlık sağlarlar.
- Bir A kullanmak, tek kanallı Ca 2 + akımları kayıt için gerekli son derece düşük arka plan gürültü düzeyleri elde etmek içinkayıtlar için bir soğutulmuş headstage ile xopatch 200B. 5 kHz Bessel filtresi kullanılarak 20-50 kHz ve filtresinde örnek verileri. Bir Axograph X kullanarak veri toplama yürütmek
- Uyarıcı olarak 10 mV artışlarla standart bir aşamalı bir protokol kullanın. Ca 2 + kanallarının maksimal aktivasyonunu sağlamak için, önceki aşamalı bir protokol, protokol ön darbe birleştirir. Kaçak akımlar sonrası analizi çıkarma için adım protokolü içine 10 mV sızıntı adımı birleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu ayrılma protokol verim sağlıklı ve fonksiyonel izole reticulospinal postsinaptik çıkıntılar Şekil2fde yoksun aksonları, ama yine de uyarılmış sinaptik vezikül ekzo-ve endositoz Şekil 4c ve 4d Şekil girebilen işlevsel presinaptik terminalleri muhafaza eder. Reticulospinal akson izole edilmiş bölgeleri bölümleri açık reticulospinal akson membran Şekil2fde serbest erişim sağlayan diğer herhangi bir nöronal işlemin açık olması için ışık mikroskobu ile tespit edilebilir. Aksonlar ayrışma sonrası yapısal bütünlüğünü korumak. İzole aksonlar tüm hücre konfigürasyonunda yamalı ve Alexa Fluor 488 hidrazitle ile doldurulmuştur. Akson ve herhangi bir kaçak boya içinde düzgün bir şekilde dağılmış olan boya akson Şekil 4a gözlenmiştir.
/ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil izole reticulospinal akson 4. Temsilcisi kayıtları. Tam hücre yama yapılandırmada bir pipet ile Alexa Fluor 488 hidrazit ile doldurulur: (a) izole edilmiş reticulospinal akson. Pipet pozisyon beyaz bir ok ile gösterilir. (B) i. Izole reticulospinal akson ateş Temsilcisi aksiyon potansiyeli. , ii. Sağlam omurilikte bir reticulospinal akson ateş Temsilcisi aksiyon potansiyeli. Siyah ok stimülasyon zaman noktasını gösterir. (C) ve (d) FM 1-43 ile presinaptik terminallerin noktasal etiketleme gösteren ve hücre bağlı yama kayıt için yama pipet ile bireysel presinaptik terminal hedef izole reticulospinal akson İki görüntüler. Beyaz ok yama pipet işaret ederken yeşil oklar bireysel presinaptik terminalleri işaretleyebilirsiniz. (E) Ölü reticulospinal akson indiscr gösteren izoleakson boyunca FM 1-43 arasında iminate kuruluş. 4f. Ca 2 + akımlarının hücre bağlı kayıt gösteren temsili bir örneği (10 mM [Ca2 +] yama pipet, kayıt çözelti içinde harici) birden fazla Ca 2 + kanallarının açılmasını gösteren presinaptik salınmasını yüz zardan. Katı hattı kesik çizgiler kanal açıklıkları için Gauss doruklarına işaret ederken 0, kanalın kapalı durumunu gösterir kutladı.
Akut ayrışmış aksonlar elektriksel özelliklerini korurlar. Dinlenme membran potansiyelinin (RMP) bir mikro-elektrot ile ilişkisiz akson impaling veya akım kelepçe modunda bütün hücre konfigürasyonunda akson yama ile ölçülebilir. Benzer RMP -57,94 ± 1.63 mV (n = 17 akson) bir ortalama ile, her iki yöntemde de kaydedilir. Buna ek olarak, aksonlar aksiyon potansiyelleri yangına uyarılabilir ayrışmış hareket potansiyeli benzer olma şekli ve zaman süresi ile, Şekil 4bsağlam omurilikte bir reticulospinal akson ateş birine.
Vesiküi füzyon ve geri dönüşüm ayrışmış akson devam etmektedir. Geri Dönüşüm vezikül kümeleri yüksek potasyum (30 mM KCI) stimülasyon 19 sırasında Stiril boya FM 1-43 ile etiketlenmiş olabilir. Boya açıklık üzerine, presinaptik terminalleri ayrı noktalı etiketleme sağlıklı omurilik 13 reticulospinal aksonlar benzer bir dağılımı ile, Şekil 4c ve 4d Şekil gözlenebilir. Sağlıksız aksonlar akson Şekil 4e boyunca gelişigüzel FM boya girişini göstermek gibi FM 1-43 boyama, sağlıklı ve sağlıksız akson arasında net bir ayrım sağlar. Açıkça bireysel presinaptik terminalleri tanımlamak için yeteneği Şekil 4c ve Şekil 4d kayıt için bir yama pipet ile onları hedef için bize izin verir. Bu yeteneğini kullanarak, biz bırakma yüz metre doğrudan Ca 2 + akımları kaydettikTek presinaptik terminalleri Şekil 4f zarı böylesine.
Akut izole reticulospinal akson hazırlık da tek presinaptik terminallerin imünohistokimya için sağlam omuriliğe göre farklı avantajlar sunuyor. Herhangi bir arka plan otofloresanm eksikliği ve postsinaptik yapıları ya da glial lekelere olmaması kesin tanımlanmış presinaptik terminallerinde antikor etiketlemesi tanımlanması (Şekil 5b, i) verir. Bu Alexa-488 birleşmiş falloidin (Şekil 5a, ii) ve bir presinaptik işaretleyici ile birlikte (Şekil 5b, ii), presinaptik aktin 20, imünohistokimyasal açıkça ispat edilebilir presinaptik terminallere etiketleme lokalizasyonunu hangi etiketlerin (Şekil 5a, III). Bu yaklaşım, t gösteren, farklı alt tipler arasında VGCC immünohistokimyasal karakterizasyonu gerçekleştirmek için konfokal mikroskobu ile bağlantılı olarak kullanılmaktadırpresinaptik terminalleri Şekil 5a varisi özel lokalizasyon.
Izole reticulospinal akson Şekil 5. immün. (A) Bireysel presinaptik terminallerde Ar-tipi (CaV2.3) kalsiyum kanal immünohistokimyasal karakterizasyonu. i. (- Tavşan ana bilgisayar) bir poliklonal antikor alanları primer II ve R-tipi kalsiyum kanalı III arasında hücre içi düğümünde bir epitop etiketlemek için kullanıldı. İkincil antikor Alexa Fluor 633 hidrazid konjuge keçi anti-tavşan IgG idi. , ii. Presinaptik aktin Alexa Fluor 488 Phalloidin etiketleme tarafından tespit Presinaptik terminaller. iii. R-tipi antikor etiketleme (kırmızı) ve birleştirilmiş bindirme gösterilen Alexa-488 Phalloidin (yeşil) arasındaki ko. (B) i. Anti R tipi kalsiyum kanalı ile ön-enkübasyon, antikorunKontrol antijen kalsiyum kanallarının herhangi bir etiketleme sağlamaz. , ii. Ayrık noktasal etiketleme gösteren aynı akson için presinaptik terminallerin Alexa Fluor 488 Phalloidin etiketleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim ayrışma protokol postsinaptik projeksiyonlar Şekil2fde yoksun izole reticulospinal aksonlarını veren tarafından önemli, ama yine de fonksiyonel presinaptik terminalleri Şekil 4c ve Şekil 4d muhafaza edilmektedir. Presinaptik terminale karşı süreçler postsinaptik yokluğu daha önce, merkezi sinapsların mümkün ve başarılı bir şekilde sadece iki kalisyel-tipi presinaptik terminallerde elde değil tek presinaptik terminallerde presinaptik bırakma yüz zarına doğrudan kayıt erişime izin; civciv siliyer ganglion 7-10 ve sıçan kalikslerin 11,12 çanak tipi sinaps. Elektron mikroskopik düzeyde basit, tek aktif bölgeleri 21 sunmak için gösterilmiştir Bağımsız presinaptik terminalleri, FM 1-43 ile etiketleme geri dönüşüm kese kümeleri ile tanımlanır ve kayıt Şekil 4c, ve Şekil 4d için hedeflenebilir. Ca
Fonksiyonel presinaptik terminalleri ile izole reticulospinal aksonlar elde edilmesi için anahtarın eleştiriye ait bir dizi yatmaktadırark ardışık adım. Omurilik Şekil 1a dorsolomber medial bölgede başlıca bulunan dev aksonlar akut ayrışmasını engelleyen doku titreşimli bir doku dilimleme makinesi Şekil 2a ilk kaldırılacak vardı. Bu daha kolay mekanik mümkün olan en az kuvvet kullanarak omurilik ayırmak için yapar. Dorsal sütunun dilimleme bıçağın kesme işlemi engelleyecektir kalan sırt meninksler Primitiva yana dorsal meninksler Primitiva tam çıkarılmasını gerektirir. Bu dilimleme zamanında omurilik ventral meninksler Primitiva bırakarak omurilik şeklini korumaya yardımcı olur ve daha iyi bir dilimleme yardımcı bulabilirsiniz. Dilimleme işlemi sırasında omurilikte gerilim sürdürülmesi aksonlar zarar verecek bıçak altında doku herhangi yatay hareketini veya çarpan engeller. 1 cm uzunluğunda omurilik adet doku gerilir ve w gerilimi muhafaza altına sokulamayacak gibi dilimleme için iyi bir uzunluğu sağlarhile dilimleme. Izlemek için bir diğer kritik faktör dilim derinliği; çok sığ bir dilim omuriliğin çok derin bir dilim zararlar ise reticulospinal aksonlar iyi ayrılmasını önler. İyi bir dilim derinlik dorsal kolon gözle hasarsız ventral reticulospinal sütunu terk çıkarılır.Yardımcı biridir. Dilimin derinliği hayvanlar arasında omurilik kalınlık değişkenlik olsa verilen dilimleme işlemi sırasında teraziye gerekir. Bu dilimlenmemiş rostral sağlar ve kaudal ayrılma süreci Şekil 2e sırasında doku kavrama kolları olarak hizmet biter dorsal kolonun kaldırma iyi omurilik parçası Şekil 2b orta bölümünde gerçekleştirilir.
Dorsal sütun ayrılmasından kolajenaz karışımı ile dilimlenmiş omurilik adet muamele edilmesi (kollajenaz tip Ia Clostridium histolyticum'dan) ve proteaz (Proteaz Tip XIV, Sterptomyces griseus dan) enzimler (1 M sonrag / ml Ringer çözeltisi içinde) bağ dokusunu sindirimi yardımcı olur ve nazik bir ayrışmasını kolaylaştırır. Oda sıcaklığında bir 30-45 dakika sindirim ayrılması için idealdir. Taşemen omurilik tam enzimatik ayrışma önce kolajenaz (2 mg / ml, 30 dakika) ve proteaz ardışık muamelesi sonucunda ifa edilmiştir (2 mg / ml, 45 dakika), spinal nöronların 17 izole eder. Proteaz ve kollajenaz bir kokteyl ile tedaviye karşı ardışık tedaviler reticulospinal aksonlarını ayırmasına daha iyi sonuçlar vermemiştir. Ayrıca ayrışma farklı enzim konsantrasyonları ile denenmiştir. Enzim konsantrasyonu daha yüksek, 2 mg / 45 dakika veya daha uzun bir süre mi sindirim katı kıvamını ve zayıf dağılımlarını kaybetme omurilik sonuçlandı. Daha küçük nöronların verimleri gerekli olduğunda, daha yüksek enzim konsantrasyonları ve uzun süreli tedavi süreleri omurilik tam ayrışması da yardımcı olabilir. Reticulospinal aksonlar, aksine, genişletilmiş bir şekilli varcture ve 45 dakika daha fazla ters tedavi edildi. Daha dağılımlarını omurilikteki bazı gerginlik için destek verdi İstinat.
Bir sonraki adım, önemli reticulospinal aksonlar kapsayan bölgeye son ayrılma kuvveti izole etmek için dilimlenmiş bölgenin orta noktasında, enzim ile muamele edilmiş omurilik parçasının yanal yolları kesmektir. Kesimler onlara zarar görmemiş Şekil 2d terk reticulospinal akson merkezi ventro-mediyal kolonuna ventral boynuz gri maddenin yanal kenarına kadar uzanmalıdır. Yanal yolları kesme mekanik ayrıştırma sırasında oluşacak omurilik ayrılmasını itilir ve daha yumuşak bir doku ayrılmasını kolaylaştıran bir odak noktası sağlar. Omurilik Sürekli gerilim, kesme işlemi sırasında gereklidir ve germe ve omurilik parçasının kaudal ve rostral uçları bağlama yoluyla elde edilebilir. Bu neşter bıçak altında doku deformasyonu önlerve aksonlarda sonucu hasar.
Ayrışma son aşama mekanik bir germe gücünün uygulanması ve yavaşça kavrama doku forseps kullanılarak 2e rostro-kaudal ekseni boyunca, Şekil doku germe edilir. Bu adım daha sonra kaydetmek için ayrılmış olan aksonların yapışmasını sağlamak için poli-lisin kaplı lamelleri boyunca gerçekleştirilir. Uzun uzun aksonlar reticulospinal için daha fazla bir yapışma elde etmek amacıyla, yüksek bir molekül ağırlığına kullanmıştır (> 300,000) poli-D-lisin hidrobromit, kaplamak, lamelleri petri-parçalar bağlantı noktalarına daha fazla sayıda içerir. Omurilik biter ve akut izole reticulospinal aksonlar için poli-lizin kaplı yüzeyi yeterli yapışma sağlar. Bu dağılımlarını engelleyen düzenli paslanmaz çelik forseps sıkıca yapışır, çünkü teflon kaplı forseps kavrama omurilik gereklidir. Dokusu yavaş yavaş gerilir ve yavaşça sp dışarı aksonlar çekerek gerekirinal kablosu. Aksonlar yerleşmek almak için en iyi yolu, omurilik forseps ile biter Rostral ve kaudal omurilik üzerine doğru basıncı sağlayarak ayrışma sürecinde her zaman cam lamel boyunca biter muhafaza etmektir.
Akson bir kısmının ayrışma derecesine bağlı olarak omurilik sonuna en az bir ucunda içinde kalır beri aksonlar iyi kısmen izole olarak sınıflandırılır. Yalıtım mekanik olarak omuriliğin bir ucundan tamamen ayrı aksonların kadar omuriliğin iki ucunu ayırarak gerçekleştirilebilir. Bu durumda, akson bir bölümü, geri kalan kısım, omurilik iç üzerinden izole edilir iken çıktığı omurilik ucu içinde kalır. Akson terminali açık ucu akson sağlığına bağlı bir membran mühürleme işlemi tarafından mühürler. Yalıtım da aksonlar omurilik, b üzerinden ortaya şekilde gerçekleştirilebilirŞekil 2e kaudal ve izole edilen reticulospinal aksonlar vasıtasıyla bağlı kalır omurilik rostral uçlarını ut. Bu noktada, yavaşça basıncının salınması gerilim altında aksonlar dinlenmek ve halka üzerinden postsinaptik çıkıntıların yoksun akson izole bölgelerin elde sağlar. Hem ayırma teknikleri fonksiyonel aksonlar elde edildi. Lamprey için fizyolojik sıcaklık, 10 ° C'dir ve bu nedenle hazırlanması aksonlar akut ayrılma kurtarmak için izin vermek için 1 saat boyunca 10 ° C 'de geri bırakılır. Elektrofizyolojik kayıtlar için, ayrışma özel bir bölme Şekil içine yerleştirilen bir poli-lisin kaplı lamel üzerinde gerçekleştirilmiştir 3. Taşemen omurilikler genellikle geçirilerek, 10 ° C de muhafaza ederek, Ringer çözeltisi, perfüze edilmesi ile 10 ± 2 ° C 'de muhafaza edilmiştir termoelektrik bir soğutma aygıtı. İstisnai düşük arka plan gürültü tek kanal Ca çözmek için gerekli Yüksek K + (30 mM KCI) FM boya içine dahil edilir (bölüm 4.1), böylece aksonlar depolarize için kullanılırekzo-sinaptik endositoz sırasında veziküllerin. Bu akson pozisyonda küçük sürüklenme akson çekilmeye neden elektrot olarak uzun süre boyunca izole edilmiş bir akson mikroelektrot sokulmasını tutmak güçtür. Bu zor bir mikroelektrot ile uzun süre aksonlar uyarmak için yapar. Büyük akson çapı (20-50 mikron) zor bir tungsten stimülasyon elektrot kullanarak uyarmak için yapar. Bu nedenle yüksek K + aksonlar depolarize için kullanılmıştır. Reticulospinal aksonların presinaptik terminalleri 1-2 um arasında bir çapa sahiptir. Ca 2 + akımları presinaptik terminallerde bırakma yüz zarında lokalize olmuş ve doğru bir presinaptik terminale hedef bu nedenle çok önemlidir. Dolayısıyla, bu kayıtları elde etmek için önemli bir gereklilik mikron aralıklarla yama pipet pozisyon hareketini manipüle mümkün ediliyor. Ca Presinaptik bırakma yüz membranlarda 2+ akımlar demonstrat oylandıkalisyel sinapsların ed 0.5 pA az, genlik son derece küçük olması. Ca Tek kanallı kayıtları 2+ akımları dolayısıyla son derece düşük arka plan gürültü seviyeleri gerektirir. Düşük ısıl gürültü bir Axopatch 200B amplifikatör ve soğutulmuş bir headstage ile elde edilmiştir. Ayrıca, gürültü kirlenmesine kaynakları sistematik olarak tanımlanmış ve ortadan kaldırılması gerekir. Patch pipetler cam son derece düşük kirleri ve yüksek bir dirence sahiptir itibaren düşük gürültü sağlamak için alüminosilikat cam, imal edildi. Pipetler pipet ucu çapı bu sayede tam olarak presinaptik kapsayan presinaptik çapından daha büyük olacak şekilde oluşturulan, boyutları açık FM 1-43 etiketleme ile gözlenebilir. Bu tüm bırakma yüz zarından kayıt sağlanmalıdır. Kapasitif gürültü mümkün olduğu kadar yakın ucu PDMS ile kaplanması pipet azaltılmıştır. Presinaptik membranlarda gigaohm contalar başına uzun stabil değildiriods ve kayıtları, her 2 dakika maksimum sürer. Bu düşük başarı oranı başarılı kayıtları elde etmek için girişimleri çok sayıda gerektirir beri elde etmek için kayıtlar son derece zor hale getirir. Kayıt çözeltiler, voltaj kontrollü, Na + ve K + kanallarının ve Ca gibi presinaptik terminali zar içinde bilinen diğer tüm akımların + kanalları 2 + ile aktive edilen K engellenir, böylece Ca 2 + akımları kayıt sağlayan, tasarlanmış olması gerekir. Bu hazırlık ile poli-lisin yapışkan yüzeyini kullanarak bazı sınırlamalar vardır. Bir herhangi bir titreşim hazırlık kesintiye nedeniyle hazırlık içeren odasının fiziksel konumunu taşımak için yetersizliğidir. Yapışkan yüzeyinden diğer kısıtlılığı% 4 paraformaldehitte kuluçkaya zaman rostral ve kaudal spinal kord uç parçaları yapışma kaybetmek gibi, immünhistokimya deneyler sırasında ortaya çıkarılmıştır. Biz alternatif yapıştırıcı COA denediböyle Cep-Tak gibi BASLANGIC ve benzer sorunlar karşılaştı. Bu sorunları çözmek için, biz omurilik kolları tutturmak için sıvı dikiş yapıştırıcı kullandı. Dikiş tutkalın kullanımı ile ilgili özelliklerini Chen ve Featherstone 22 önceki bir jove makalede ele alınmıştır. Tutkal iki değerlikli iyonların olmadan çözümleri daha yavaş bir hızda setleri ve biz bu özelliği yararlandı ve Ca 2 + ve Mg 2 + Ringer çözeltisi içinde dağılımlarını gerçekleştirdi. Bu ayrışma sürecinde doku manipülasyonu için ek süre ile sağladı. Biz ayrışmayı (Protokol bölüm 5.2) gerçekleştirmeden önce ayrışma yüzeyinde belirli hedef alan üzerine tutkal uygulamak için yama pipet bağlı bir boru aracılığıyla yama pipetler ve ağız emme kullanarak Chen ve Featherstone 22 benzer bir yaklaşımı benimsemiştir. Tek fark, spinal c varlık, daha önce tarif edildiği gibi yapıldı aritmetikord uçları hafifçe önceden yerleştirilen tutkal (Protokol bölüm 5.3) üzerinden kolu ucunu sürükleyerek ayrışma sürecinde asıldı. Perfüzyon ve preparattan ayrışma tamamlandıktan sonra, iki değerlikli iyon serbest Ringer çözeltisi Ca +2 ve Mg içeren Ringer çözeltisi ile değiştirildi +2 iyonlarının önce termoelektrik soğutucu plaka üzerinde 20-30 dakika boyunca 10 ° C'de geri bırakıldı immünohistokimya aşamalarına devam. Bu tekniğin kilit çıkarımı tamamen araştırma yıllardır rağmen çözülmüş değil nörotransmitter salınımı için Ca 2 + gereksiniminin kesin bir anlayış. Presinaptik geçici bir yükselme [Ca 2 +] tüm sinapsların salınımını tetikleyen önemli olarak kurulmuştur. Bununla birlikte, bir fikir birliği Ca 2 + etki yolluk salıverilmesinin katkı Ca 2 + kanallarının sayısı yoksundurSE. Bireysel presinaptik terminalleri serbest yüzü membran Ca 2 + akımları ve kapasitans ölçümleri eş zamanlı ölçümü bu soruya kesin bir cevap verecektir. Ayrıca, sinaptik gecikme kesin bir ölçü sağlayan, presinaptik Ca 2 + girişi ve vezikül füzyon arasındaki zamanlama ilişkinin aydınlatılmasını sağlayacak. Bireysel presinaptik terminallerde bırakma yüz zara sınırsız erişilebilirlik nörotransmiter bırakma sürecinin çeşitli bileşenleri incelemek farklı deneysel yaklaşımlar bir dizi uygulamak için yeteneği sağlar. Bu tür yaklaşımların örnekleri sinaptik vezikül füzyon incelemek için kuantum noktalar kullanarak tek kese görüntüleme içerir. Vesiküi füzyon olaylar da doğrudan vezikül füzyon olayları yatan membran kapasitans değişiklikleri ölçerek presinaptik terminallerde karakterize edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S.
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V.
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K.
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
