Akut Dissociation av Lamprey Reticulospinal Axoner att Aktivera Inspelning från Release Face Membran av individuella funktionella Presynaptiska Terminals

Summary

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Abstract

Synaptic transmission är en mycket snabb process. Aktionspotential driven inflöde av Ca2 ⁺ i den presynaptiska terminalen, via spänningskänsliga kalciumkanaler (VGCCs) belägna i frigör ansiktet membranet, är den utlösande faktorn för vesikelfusion och neurotransmittorfrisättning. Avgörande för den snabba synaptisk transmission är den rumsliga och tidsmässiga synkronisering mellan ankomsten av aktionspotentialen, VGCCs och neurotransmittorfrisättning maskiner. Möjligheten att spela in direkt Ca ^{2 +} strömmar från släppytan membranet enskilda presynaptiska terminaler är absolut nödvändigt för en exakt förståelse av förhållandet mellan presynaptiska Ca2 ⁺ och neurotransmittorfrisättning. Tillgång till presynaptiska frisättningen ansiktet membran för elektrofysiologiska inspelning är inte tillgänglig i de flesta preparat och presynaptiska Ca2 ⁺ inträde har karakteriserats med hjälp av avbildningstekniker och makroskopisk ström MeasureMents – tekniker som inte har tillräcklig tidsupplösning för att visualisera Ca2 ⁺ inträde. Den karakterisering av VGCCs direkt vid enstaka presynaptiska terminaler har inte varit möjligt i centrala synapser och har hittills med framgång uppnås först på blomfoder-typ synaps av chick ciliära ganglion och i rått calyces. Vi har lyckats ta itu med detta problem i jätte reticulospinal synapsen av nejonöga ryggmärgen genom att utveckla en akut dissocierade beredning av ryggmärgen som ger isolerade reticulospinal axoner med funktionella presynaptiska terminaler saknar postsynaptiska strukturer. Vi kan fluorescent märka och identifiera enskilda presynaptiska terminaler och rikta dem för inspelning. Med hjälp av detta preparat har vi tecknas VGCCs direkt på släppsidan av enskilda presynaptiska terminaler med immunohistokemi och elektrofysiologiska metoder. Ca2 ⁺ strömmar har registrerats direkt på släppytan membran of enskilda presynaptiska terminaler, för att den första inspelningen utföras vid centrala synapser.

Introduction

Synaptic transmission är en extremt snabb och exakt process. Åtgärd potentiell invasion av presynaptiska terminalen leder till öppnande av VGCCs ligger i släpp ansiktet membranet, den ökning av presynaptiska Ca ^{2 +} fungerar som utlösare för vesikelfusion och neurotransmittorfrisättning ^1. Alla dessa åtgärder sker inom hundra mikrosekunder ^2, och därmed kräver snäva rumsliga koppling av VGCCs till vesikelfusion maskiner ^3. Presynaptiska Ca2 ⁺ flussmedel har främst karakteriseras genom avbildning med hjälp av Ca2 ⁺ känsliga färgämnen ^4. Inbegripet Ca2 ⁺ buffertar som modulerar Ca ^{2 +} i presynaptiska neuroner har använts för att indirekt karakterisera sambandet mellan presynaptiska kalcium och neurotransmissionen ^3. Dessutom modulera presynaptiska fria Ca2 ⁺ koncentration genom uncaging Ca ^{2 + 5} eller spelar macroscopic Ca2 ⁺ strömmar har använts i samband med åtgärder för vesikelfusion och / eller utsläpp; såsom kapacitansmätningar ⁶ eller postsynaptiska svar ^två att ta upp samma fråga. Men karakterisera Ca2 ⁺ strömmar direkt på släppytan, den specialiserade delen av presynaptiska membranet där membrandepolarisering översätts till Ca2 ⁺ strömmar utlöser synaptiska vesikler fusion och frisättningen av neurotransmittorer, är väsentlig för att erhålla ett exakt mått på Ca2 ⁺ krav på synaptiska vesikler fusion. Dessutom möjlighet att direkt karaktärisera Ca2 ⁺ strömmar vid enskilda presynaptiska terminaler, i kombination med noggranna samtidiga mätningar av vesikelfusion och frisättning möjliggör en exakt belysning av tidsförhållandet mellan tidsförloppet av aktionspotentialen, presynaptisk Ca ^{2 +} ström, vesikelfusion och släpp. Tillgång till släppytan membranetär inte tillgänglig i de flesta presynaptiska terminaler pga att stänga apposition de postsynaptiska dendriter. Denna otillgänglighet har varit ett stort hinder i karakterisering av VGCCs eftersom det hindrar direkta mätningar av ström vid enskilda presynaptiska terminaler. Direkt karakterisering av presynaptiska Ca2 ⁺ strömmar vid enskilda presynaptiska terminaler har hittills inte varit möjligt i centrala synapser och har endast gjorts i två calyceal typ presynaptiska terminaler; blomfoder-typ synaps av chick ciliära ganglion ^7-10 och rått calyces ^11,12. I alla andra presynaptiska terminaler inklusive den gigantiska reticulospinal synaps i nejonöga ryggmärgen ^13, har bristande tillgång till det presynaptiska frisättningen ansiktet membran nödvändig att använda indirekta metoder såsom Ca ^{2 +} avbildning studera presynaptiska Ca2 ⁺ flussmedel.

<img alt="Figur 1" fo: content-width = "5in" src = "/ filer / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
Figur 1 Nejonöga jätte reticulospinal synaps. (A) Tvärsnitt av nejonögon ryggmärgen indikerar dorso-ventral riktning. Reticulospinal axoner är märkta med grön asterix. (B) 3-D rekonstruktion av reticulospinal synaps i nejonöga ryggmärgen visar presynaptisk reticulospinal axon gör många en passant kontakter (markerade med gröna pilar) på den postsynaptiska neuronen ^13. Presynaptiska terminaler har märkts med Alexa Fluor 488 hydrazid konjugerad phalloidin (grön), medan den postsynaptiska neuron har fyllts med Alexa Fluor 568 hydrazid (röd).

Nejonöga jätte reticulospinal axoner, som ligger i den ventrala regionen av ryggmärgen parallellt med rostral-caudal axeln Figur 1a, formulär multipel en passant synaptiska kontakter på nervceller ispinal ventrala hornet ¹⁴ Figur 1b ^13. Makroskopisk hel-cells Ca2 ⁺ strömmar har registrerats från reticulospinal axoner i det intakta ryggmärgen ^13,15. Men tidigare blinda försök till direkt mätning av Ca2 ⁺ strömmar i reticulospinal axoner i den intakta nejonöga ryggmärgen med cell-anslutna patch clamp teknik har visat sig misslyckade ¹³ på grund av bristande tillgång till det presynaptiska frisättningen ansiktet membran på grund av de motsatta postsynaptiska processerna Figur 1b. Frisättningen ansikte membran har tidigare gjorts åtkomlig genom avlägsnande av den postsynaptiska neuronen ^11, mekanisk störning av synapsen före inspelning ¹² eller enzymbehandling i kombination med mekanisk dissociation ^16. Med tanke på den komplexa organisationen av ryggmärgen, skulle det visa sig vara mycket svårt att identifiera den postsynaptiska neuron och dra tillbaka det mekaniskt eller störa the synapsen. Därför beslutade vi att använda enzymbehandling ¹⁷ följt av mekanisk dissociation.

Genom att använda denna metod, har vi utvecklat en akut dissocierade beredning av nejonöga ryggmärgen som ger livskraftiga isolerade reticulospinal axoner med funktionella presynaptiska terminaler saknar postsynaptiska processer, vilket ger obegränsad tillgång till enskilda presynaptiska terminaler. I samband med en standard inverterat mikroskop och fluorescens avbildning, gör det möjligt för oss att identifiera och rikta enskilda fluorescerande identifierade presynaptiska terminaler, med en patch pipett innehållande en inspelningslösning som isolerar Ca2 ⁺ strömmar Figur 4c och 4d figur, för inspelning med hjälp cell- bifogade spänning-clamp. Ca ^{2 +} strömmar har registrerats direkt vid presynaptiska frisättningen ansiktet membran av enskilda presynaptiska terminaler Figur 4f. Detta är en significant genombrott inom området för synaptisk transmission, eftersom det är den första inspelningen som skall genomföras vid centrala synapser.

Protocol

1. Framställning av poly-D-lysin Hydrobromide Bered en mg / ml poly-D-lysin-hydrobromid i 0,1 M boratbuffert (pH 8,5). Fördela och förvara vid -20 ° C. 2 Poly-lysin Beläggning av Täck OBS: Utför alla städning och beläggningssteg i ett laminärt flöde kammare. Placera täckglas i en petriskål med en N Saltsyra (HCl) för 2 tim. Aspirera all HCl och skölj med 70% etanol (EtOH) 2-3x. Lämna i 70% …

Representative Results

Denna dissociation protokoll avkastning friska och funktionella isolerade reticulospinal axoner saknar postsynaptiska projektioner figur 2f, men som ändå behåller funktionella presynaptiska terminaler kan framkallade synaptiska vesikler exo-och endocytos Figur 4c och 4d figur. Delar av de isolerade regionerna i de reticulospinal axoner tydligt kan identifieras under ljusmikroskop för att vara fri från alla andra neuronala processer som möjliggör obegränsad…

Discussion

Vår dissociation protokollet är viktig genom att ge isolerade reticulospinal axoner saknar postsynaptiska projektioner figur 2f, men som ändå behåller funktionell presynaptiska terminaler Figur 4c och 4d figur. Frånvaron av postsynaptiska processer motsätter den presynaptiska terminalen möjliggör direkt inspelning tillgång till presynaptiska frisättningen ansiktet membran vid enstaka presynaptiska terminaler, som tidigare inte möjligt i centrala synapser och…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
0.2 µm syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22×60 mm coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade Nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100×15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35×10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodiesR-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Preesure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	1.4046E+10
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon