Abstract
Synaptic transmission är en mycket snabb process. Aktionspotential driven inflöde av Ca2 + i den presynaptiska terminalen, via spänningskänsliga kalciumkanaler (VGCCs) belägna i frigör ansiktet membranet, är den utlösande faktorn för vesikelfusion och neurotransmittorfrisättning. Avgörande för den snabba synaptisk transmission är den rumsliga och tidsmässiga synkronisering mellan ankomsten av aktionspotentialen, VGCCs och neurotransmittorfrisättning maskiner. Möjligheten att spela in direkt Ca 2 + strömmar från släppytan membranet enskilda presynaptiska terminaler är absolut nödvändigt för en exakt förståelse av förhållandet mellan presynaptiska Ca2 + och neurotransmittorfrisättning. Tillgång till presynaptiska frisättningen ansiktet membran för elektrofysiologiska inspelning är inte tillgänglig i de flesta preparat och presynaptiska Ca2 + inträde har karakteriserats med hjälp av avbildningstekniker och makroskopisk ström MeasureMents - tekniker som inte har tillräcklig tidsupplösning för att visualisera Ca2 + inträde. Den karakterisering av VGCCs direkt vid enstaka presynaptiska terminaler har inte varit möjligt i centrala synapser och har hittills med framgång uppnås först på blomfoder-typ synaps av chick ciliära ganglion och i rått calyces. Vi har lyckats ta itu med detta problem i jätte reticulospinal synapsen av nejonöga ryggmärgen genom att utveckla en akut dissocierade beredning av ryggmärgen som ger isolerade reticulospinal axoner med funktionella presynaptiska terminaler saknar postsynaptiska strukturer. Vi kan fluorescent märka och identifiera enskilda presynaptiska terminaler och rikta dem för inspelning. Med hjälp av detta preparat har vi tecknas VGCCs direkt på släppsidan av enskilda presynaptiska terminaler med immunohistokemi och elektrofysiologiska metoder. Ca2 + strömmar har registrerats direkt på släppytan membran of enskilda presynaptiska terminaler, för att den första inspelningen utföras vid centrala synapser.
Introduction
Synaptic transmission är en extremt snabb och exakt process. Åtgärd potentiell invasion av presynaptiska terminalen leder till öppnande av VGCCs ligger i släpp ansiktet membranet, den ökning av presynaptiska Ca 2 + fungerar som utlösare för vesikelfusion och neurotransmittorfrisättning 1. Alla dessa åtgärder sker inom hundra mikrosekunder 2, och därmed kräver snäva rumsliga koppling av VGCCs till vesikelfusion maskiner 3. Presynaptiska Ca2 + flussmedel har främst karakteriseras genom avbildning med hjälp av Ca2 + känsliga färgämnen 4. Inbegripet Ca2 + buffertar som modulerar Ca 2 + i presynaptiska neuroner har använts för att indirekt karakterisera sambandet mellan presynaptiska kalcium och neurotransmissionen 3. Dessutom modulera presynaptiska fria Ca2 + koncentration genom uncaging Ca 2 + 5 eller spelar macroscopic Ca2 + strömmar har använts i samband med åtgärder för vesikelfusion och / eller utsläpp; såsom kapacitansmätningar 6 eller postsynaptiska svar två att ta upp samma fråga. Men karakterisera Ca2 + strömmar direkt på släppytan, den specialiserade delen av presynaptiska membranet där membrandepolarisering översätts till Ca2 + strömmar utlöser synaptiska vesikler fusion och frisättningen av neurotransmittorer, är väsentlig för att erhålla ett exakt mått på Ca2 + krav på synaptiska vesikler fusion. Dessutom möjlighet att direkt karaktärisera Ca2 + strömmar vid enskilda presynaptiska terminaler, i kombination med noggranna samtidiga mätningar av vesikelfusion och frisättning möjliggör en exakt belysning av tidsförhållandet mellan tidsförloppet av aktionspotentialen, presynaptisk Ca 2 + ström, vesikelfusion och släpp. Tillgång till släppytan membranetär inte tillgänglig i de flesta presynaptiska terminaler pga att stänga apposition de postsynaptiska dendriter. Denna otillgänglighet har varit ett stort hinder i karakterisering av VGCCs eftersom det hindrar direkta mätningar av ström vid enskilda presynaptiska terminaler. Direkt karakterisering av presynaptiska Ca2 + strömmar vid enskilda presynaptiska terminaler har hittills inte varit möjligt i centrala synapser och har endast gjorts i två calyceal typ presynaptiska terminaler; blomfoder-typ synaps av chick ciliära ganglion 7-10 och rått calyces 11,12. I alla andra presynaptiska terminaler inklusive den gigantiska reticulospinal synaps i nejonöga ryggmärgen 13, har bristande tillgång till det presynaptiska frisättningen ansiktet membran nödvändig att använda indirekta metoder såsom Ca 2 + avbildning studera presynaptiska Ca2 + flussmedel.
Figur 1 Nejonöga jätte reticulospinal synaps. (A) Tvärsnitt av nejonögon ryggmärgen indikerar dorso-ventral riktning. Reticulospinal axoner är märkta med grön asterix. (B) 3-D rekonstruktion av reticulospinal synaps i nejonöga ryggmärgen visar presynaptisk reticulospinal axon gör många en passant kontakter (markerade med gröna pilar) på den postsynaptiska neuronen 13. Presynaptiska terminaler har märkts med Alexa Fluor 488 hydrazid konjugerad phalloidin (grön), medan den postsynaptiska neuron har fyllts med Alexa Fluor 568 hydrazid (röd).
Nejonöga jätte reticulospinal axoner, som ligger i den ventrala regionen av ryggmärgen parallellt med rostral-caudal axeln Figur 1a, formulär multipel en passant synaptiska kontakter på nervceller ispinal ventrala hornet 14 Figur 1b 13. Makroskopisk hel-cells Ca2 + strömmar har registrerats från reticulospinal axoner i det intakta ryggmärgen 13,15. Men tidigare blinda försök till direkt mätning av Ca2 + strömmar i reticulospinal axoner i den intakta nejonöga ryggmärgen med cell-anslutna patch clamp teknik har visat sig misslyckade 13 på grund av bristande tillgång till det presynaptiska frisättningen ansiktet membran på grund av de motsatta postsynaptiska processerna Figur 1b. Frisättningen ansikte membran har tidigare gjorts åtkomlig genom avlägsnande av den postsynaptiska neuronen 11, mekanisk störning av synapsen före inspelning 12 eller enzymbehandling i kombination med mekanisk dissociation 16. Med tanke på den komplexa organisationen av ryggmärgen, skulle det visa sig vara mycket svårt att identifiera den postsynaptiska neuron och dra tillbaka det mekaniskt eller störa the synapsen. Därför beslutade vi att använda enzymbehandling 17 följt av mekanisk dissociation.
Genom att använda denna metod, har vi utvecklat en akut dissocierade beredning av nejonöga ryggmärgen som ger livskraftiga isolerade reticulospinal axoner med funktionella presynaptiska terminaler saknar postsynaptiska processer, vilket ger obegränsad tillgång till enskilda presynaptiska terminaler. I samband med en standard inverterat mikroskop och fluorescens avbildning, gör det möjligt för oss att identifiera och rikta enskilda fluorescerande identifierade presynaptiska terminaler, med en patch pipett innehållande en inspelningslösning som isolerar Ca2 + strömmar Figur 4c och 4d figur, för inspelning med hjälp cell- bifogade spänning-clamp. Ca 2 + strömmar har registrerats direkt vid presynaptiska frisättningen ansiktet membran av enskilda presynaptiska terminaler Figur 4f. Detta är en significant genombrott inom området för synaptisk transmission, eftersom det är den första inspelningen som skall genomföras vid centrala synapser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av poly-D-lysin Hydrobromide
- Bered en mg / ml poly-D-lysin-hydrobromid i 0,1 M boratbuffert (pH 8,5).
- Fördela och förvara vid -20 ° C.
2 Poly-lysin Beläggning av Täck
OBS: Utför alla städning och beläggningssteg i ett laminärt flöde kammare.
- Placera täckglas i en petriskål med en N Saltsyra (HCl) för 2 tim.
- Aspirera all HCl och skölj med 70% etanol (EtOH) 2-3x.
- Lämna i 70% EtOH under 1 tim.
- Aspirera all 70% EtOH och skölj med 100% EtOH 2-3x.
- Lämna i 100% EtOH under 2 timmar. Aspirera all EtOH.
- Torka med filterpapper och lufttorka i några sekunder.
- Placera O / N på 1 mg / ml poly-lysin lösning.
- Skölj täck nästa dag med Millipore vatten 4-5x.
- Lufttorka poly-lysin belagda täckglas på glasrullar i en ren petriskål.
- För immunohistochemistry, använder 35 x 10 mm petriskål lock. Förbered sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) kantas rätter genom att hälla PDMS (elastomer och härdare 10: 1 i vikt) i skålen till en tjocklek på 0,3 cm och låt inställd på 30 ° CO / N. När detta har ställts in, klippa en 2 cm med 1 cm infälld i PDMS. Rengör och belägga infällda med poly-lysin att följa samma steg som nämnts ovan för täckglas.
- Lagra poly-lysin belagda täck och rätter som omfattas inuti laminärt flöde kammaren fram till användning (upp till 2 veckor, men att uppnå bästa vidhäftningsresultat genom att förbereda periodvis var 3-4 dagar).
- Förbered en PDMS-block, till stift ryggmärgen i vibrerande vävnad slicer. Mix Elastomer A och Elastomer B 1: 1 viktprocent. Häll i en 100 x 15 mm petriskål och tillåta att ställa O / N vid 30 ° C. Skär en rektangulär bit av PMDS och limma den till skivning grundplattan med epoxilim. Låt limmet att ställa om fastställande av PDMS på plats och skiva flera tunna snitt från ytan för att få en plattyta till stift vävnaden på.
3 Akut Dissociation av Lamprey Spinal Cord att ge Isolerade Reticulospinal Axoner
- Bedöva en ammoecoete eller en vuxen nejonöga (Petromyzon marinus) med tricaine metansulfonat (MS-222, 100 mg / L). Lägg bedövningsmedel i vattnet, i en plastkopp som täcks av ett lock, som innehåller nejonöga offras.
- Halshugg nejonöga i kall (4 ° C) Ringers lösning med följande sammansättning (i mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl2, 1,8 MgCl2, 4 HEPES, 4 dextros (pH 7,6, osmolalitet 270 mOsm) och avlägsna kroppen vägg muskler att avslöja ryggsida ryggmärgen.
- Avlägsna Meninx Primitiva från den dorsala ytan av ryggmärgen med fin pincett. Ta inte bort ventral Meninx Primitiva på detta stadium.
- Skär ryggmärgen i 1 cm långa bitar.
- Fästa en ryggmärgsstycke med fina insekt stift, ryggsidan uppåt, på en PDMS fodrade skiva bas plate (se 2.12) i en vibrerande vävnad slicer kammare som innehåller iskall Ringers lösning.
- Ta bort en mittsektion av den dorsala kolonnen av ryggmärgen genom skärning längs rostro-kaudala axel med bladet och lämnar efter intakta dorsala kolonn avsnitten på den rostrala och kaudala ändarna för att tjäna som handtag under dissociation process Figur 2a och figur 2b. Använd lägsta hastighet inställning som tillåter skivning och en djupinställning som bara tar bort den dorsala kolumnen lämnar underliggande reticulospinal axon kolumnen oskadade Figur 2b.
- Inkubera skivade ryggmärgs bitar vid RT under 45 min i en cocktail av 1 mg / ml proteas (typ XIV från Streptomyces griseus) och 1 mg / ml kollagenas framställes (typ lA från Clostridium histolyticum) i Ringers lösning (anpassad från El Manira & Bussières , 1997 17).
- Pin enzymbehandlade ryggmärgs bitar med hjälp av fina nålar i en PDMS fodrade petriskål containing kall (4 ° C) Ringers lösning.
- Ta bort ventrala Meninx Primitiva med fin pincett.
- Skär sido områden av ryggmärgen med en skalpell blad vid mittpunkten av den skivade ryggsektionen lämnar den centrala kolumnen i reticulospinal axoner intakta i ryggmärgen Figur 2d.
- Placera en droppe immersionsolja på linsen.
- Placera poly-lysin belagda täckglas (figur 3a, överdel, röd rektangel) i spåret på inspelningen kammaren Figur 3 och tillämpa vakuum fett på alla kanter (utrymmet mellan röda och blå rektanglar i figur 3a, för att underlätta en tätning. Skruv toppen på plats. Placera kammare i infällningen på inspelnings riggen.
- Lägg Ringers lösning in i inspelningen kammaren med hjälp av en Pasteur-pipett.
- Anslut utflödesslangen på tryckflaska som innehåller frostskyddsmedel lösning på den termoelektriska kylanordning ingångsslangen. Anslut outpUT slangar av den termoelektriska kylanordning till den ingående änden av den yttre kylmantel och utgångsänden till reservoaren figur 3b.
- Placera en bit av ryggmärgen i taget i inspelningen kammaren och försiktigt separera ryggmärgen behålla den längs täck alltid använder Teflon belagda pincett tills axoner isoleras Figur 2e och figur 2f.
- Bring inspelningslösningstemperaturen till 10 ° C genom att passera den trycksatta (kvävgas trycks in i flaskan) frostskyddslösningen (genom förskjutning), via den termoelektriska kylanordning, genom den yttre kylmantel av inspelningen kammaren figur 3b.
- Tillåt axoner att återhämta sig efter en h efter dissociation vid 10 ° C.
Figur 3 Schematisk för inspelning kammare för elektrofysiologiska experiment. Mått som är i inches. Röd rektangel visas i basepiece diagram (a) visar placering av täckglas i täck spåret i basepiece. Området mellan den röda och blå rektangel, som visas i basepiece diagrammet (a) är där högvakuum fett appliceras. (B) visar den sammansatta inspelningen kammaren.
4 Märkning och identifiering av Presynaptiska Terminaler med FM 1-43
- Märk presynaptiska terminaler, genom att införliva FM 1-43 i vesicles under synaptiska exo-endocytos under hög K + depolarisation. BEGJUTA beredning med 5 ^ M FM 1-43 (i 5 ml Ringers lösning innehållande 30 mM KCl).
- BEGJUTA beredning med 1 mg / ml ADVASEP-7 (i 5 ml Ringers lösning) för att avlägsna överskott av FM-färgämne) 18.
- BEGJUTA beredning med Ringers lösning för 15 min till washout någon Remant färgämnet och ADVASEP.
- Bild med 100 X oljeimmersionslins (NA 1.25) på ett inverterat fluorescensmikroskop, tillsammans med en digital CCD-kamera och bild förvärv programvara Micromanager, användning av standard fluorescens avbildningsprotokoll.
- Identifiera fluorescerande presynaptiska terminaler för att rikta för inspelning Figur 4c och 4d figur.
5. Immunohistokemi av isolerade Reticulospinal Axoner
- Fyll skålen infällda (protokoll avsnitt 2.10.) Med tvåvärda-jon (Ca2 + och Mg2 +) gratisRingers lösning.
- Tillverka patch pipetter i en P-87 mikropipett avdragare. Placera en liten mängd av sutur lim vid en ände av poly-lysin infälld med hjälp av en patch-pipett (1,5 mm glas ytterdiameter) och sugning (med användning av en silikonslang, 0,89 mm inre diameter med en mikropipett spets fäst på insug ände).
- Utför dissociations med samma metod som nämnts i protokollenheten 3 Figur 2. Placera en ände av ryggmärgen på suturen lim och tryck lätt med pincett för att vidhäfta det starkt till ytan. Lägg en annan droppe sutur lim i andra änden av infällda och försiktigt sträcka ryggmärgen tills axoner dissocieras och följa den fria ryggmärgen ände genom att dra den försiktigt över suturen lim. Fix på plats genom att försiktigt trycka ned med pincett.
- Utbyte tvåvärd frigöra Ringers lösning med regelbunden Ringers lösning genom perfusion.
- Tillåt axoner att återhämta sig under 20 min efter dissociation vid 10 ° C.
- Fix dissocierade axoner i 4% paraformaldehyd (PFA) {framställd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4)} för 20 min. Filter PFA lösning före användning genom att passera genom en 0,2 fiM sprutfilter.
- Tvätta ur PFA genom perfusion 0,1 M glycin (i PBS) under 10 min.
- Inkubera i 0,1% Triton-X (i PBS) under 10 min.
- Tvätta genom perfusion PBS i 20 min.
- Block med 5% fettfri mjölk (i PBS) under 6 h vid 4 ° C.
- Lägg i primär antikropp till VGCC av intresse (1: 200 spädning i PBS) och inkubera under 20 h vid 4 ° C.
- Tvätta genom perfusion PBS i 20 min.
- Block med 5% fettfri mjölk (i PBS) under 10 min vid 4 ° C.
- Lägg i sekundär antikropp (1: 400 utspädning i PBS) och inkubera i mörker i 2 timmar vid 4 ° C.
- Tvätta genom perfusion med PBS under 20 min.
- Block med en% Bovine Serum Albumin (i PBS) under 20 min.
- Lägg i Alexa Fluor 488 phalloidin (5 enheter / ul arbetskoncentration, lager förberett i metanol 200 enheter / ml).
- Tvätta genom perfusion med PBS under 20 min.
- Bild använder 100X nedsänkning i vatten lins konfokalmikroskop.
6. Elektrofysiologiska inspelning
- Tillverka aluminiumsilikat glas patch pipetter (pipett motstånd 2-5 Mohm) i ett P-87 mikropipett avdragare. Design fläckpipetten sådan att pipettspetsen omfattar hela presynaptiska terminalen diameter.
- PDMS coat patch pipetter genom att doppa plåstret pipetten i 50-60 psi tryck i PDMS 23 (bifoga en silikonslang, 0,89 mm innerdiameter, som är ansluten till en kvävgascylinder, till den bakre änden av plåstret pipetten) och torka med hjälp av en värme pistol. Alternativt manuellt kappa pipetten med PDMS, applicera beläggningen så nära spetsen som möjligt, under ett mikroskop.
- Brand polish patch pipetter med en MICRoforge (en specialbyggd platinaglödtråd monterad på scenen av en sammansatt mikroskop).
- Identifiera isolerade axoner demonstrerar märkta presynaptiska terminaler genom fluorescensmikroskopi.
- Fyll inspelning lösning (utformad för att isolera Ca2 + strömmar, 10 mM CaCl2 eller 90 mM BaCl2 som laddningsbärare, HEPES buffrat pH 7,6, osmolaritet 270 mOsm) i plåstret pipetten med hjälp av en spruta.
- Sätt patch pipett i pipetten hållaren och position ovanför badet med hjälp av en motordriven manipulator MP225. Sänk försiktigt plåstret pipetten i badet och position mot ansiktet av en fluorescens identifierad presynaptiska terminalen.
- Advance plåstret pipetten sakta tills kontakt sker med membranet. Vid denna punkt, uppnå en gigaohm tätning genom försiktig munnen sug genom ett rör fäst till pipetten hållaren.
- För att uppnå de extremt låga bakgrundsljud som krävs för att spela in en enda kanal Ca2 + strömmar, använda en Axopatch 200B med en kyld huvudsteg för inspelningarna. Exempeldata vid 20-50 kHz och filter med hjälp av en 5 kHz Bessel-filter. Utför datainsamling med hjälp av en Axograph X.
- Använd en vanlig steg protokoll, i steg om 10 mV som stimulans. Införliva en pre-puls i protokollet, som föregår steget protokollet, för att säkerställa maximal aktivering av Ca2 +-kanaler. Införliva en 10 mV läcka steg in i steg protokoll för efteranalys subtraktion av läckströmmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna dissociation protokoll avkastning friska och funktionella isolerade reticulospinal axoner saknar postsynaptiska projektioner figur 2f, men som ändå behåller funktionella presynaptiska terminaler kan framkallade synaptiska vesikler exo-och endocytos Figur 4c och 4d figur. Delar av de isolerade regionerna i de reticulospinal axoner tydligt kan identifieras under ljusmikroskop för att vara fri från alla andra neuronala processer som möjliggör obegränsad tillgång till reticulospinal Axon membran Figur 2f. De axoner bibehåller strukturell integritet efter dissociation. Isolerade axoner var lappat i hela cellen konfiguration och fyllda med Alexa Fluor 488 hydrazid. Färgämnet fördelade likformigt inom axonet och ingen färgämnesläckage observerades från axonet Figur 4a.
/ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4 Representativa inspelningar från en isolerad reticulospinal axon. (A) Enstaka reticulospinal axon fylld med Alexa Fluor 488 hydrazid med en patch pipett i hela cellen konfiguration. Pipett position anges med en vit pil. (B) i. Representant aktionspotential eldas i en isolerad reticulospinal axon. ii. Representant aktionspotential eldas i en reticulospinal axonet i intakta ryggmärgen. Svart pil visar tidpunkt för stimulering. (C) och (d) Två bilder av en isolerad reticulospinal axon visar punktat märkning av presynaptiska terminaler med FM 1-43 och inriktning för en enskild presynaptiska terminal med patch pipett för cell-anslutna patch inspelning. Gröna pilar markerar enskilda presynaptiska terminaler medan vita pilen markerar plåstret pipetten. (E) Dead isolerade reticulospinal axon visar indiscriminate inkorporering av FM 1-43 hela axonet. 4f. Representativt exempel som visar cell bifogade inspelning av Ca 2 + strömmar (10 mM [Ca2 +] externt i inspelningslösning i plåstret pipetten) från presynaptiska frisättningen ansiktet membran visar öppnandet av flera Ca 2 +-kanaler. Solid linjen markerad 0 indikerar stängt tillstånd av kanalen, medan streckade linjer anger Gaussiska toppar för kanalöppningar.
Akut dissocierade axoner behåller elektriska egenskaper. Vila membranpotential (RMP) kan mätas genom att spetsa den skiljas axon med en mikroelektrod eller med lapp axonet i hela cellen konfiguration i strömtång läge. Liknande RMPs registreras i båda metoderna, med ett medelvärde på -57,94 ± 1,63 mV (n = 17 axoner). Dessutom dissocierade axoner kan stimuleras till brand aktionspotentialer Figur 4b, med formen och tidsförloppet för aktionspotentialen är jämförbartill en eldas i en reticulospinal axonet i intakta ryggmärgen.
Vesikelfusion och återvinning kvar i dissocierade axoner. Återvinning vesikel kluster kan märkas med styryl färgämnet FM 1-43 under hög kalium (30 mM KCl) stimulering 19. Vid färgämne clearance, kan observeras distinkt punktat märkning av presynaptiska terminaler Figur 4c och 4d figur, med en fördelning som liknar reticulospinal axoner i det intakta ryggmärgen 13. FM 1-43 färgning ger en tydlig skillnad mellan friska och ohälsosamma axoner som ohälsosamma axoner visar urskillningslös FM färgämne inträde hela axonet Figur 4e. Förmågan att tydligt identifiera enskilda presynaptiska terminaler gör att vi kan rikta dem med en patch pipett för registrering Figur 4c och 4d figur. Med hjälp av denna förmåga, har vi spelat in Ca 2 + ström direkt från släppytan membrane av enstaka presynaptiska terminaler Figur 4f.
Den akut isolerade reticulospinal axon förberedelse erbjuder också tydliga fördelar jämfört med den intakta ryggmärgen för immunohistokemi av enstaka presynaptiska terminaler. Avsaknaden av någon bakgrunds autofluorescens och frånvaron av färgning på postsynaptiska strukturer eller glia möjliggör entydig identifiering av märkning antikropp vid identifierade presynaptiska terminaler (Figur 5b, i). Tillsammans med en presynaptisk markör som Alexa-488 konjugerade phalloidin (figur 5a, ii) och (Figur 5b, ii), vilka etiketter presynaptiska aktin 20, lokalisering av immunhistokemisk märkning till presynaptiska terminaler klart kan visas (figur 5a, iii). Detta tillvägagångssätt har använts i samband med konfokalmikroskopi att utföra immunhistokemisk karakterisering av de olika VGCC subtyper som visar tarvinge specifik lokalisering till presynaptiska terminaler figur 5a.
Figur 5 Immunfärgning av en isolerad reticulospinal axon. (A) Immunohistokemisk karakterisering av R-typ (CaV2.3) kalciumkanal vid enskilda presynaptiska terminaler. i. En polyklonal primär antikropp användes för att märka en epitop i den intracellulära slingan mellan domänerna II och III i R-typen kalciumkanal (värd - kanin). Sekundär antikropp var Alexa Fluor 633 hydrazid konjugerad get anti-kanin IgG. ii. Presynaptiska terminaler identifierats av Alexa Fluor 488 phalloidin märkning av presynaptiska aktin. iii. Colocalization mellan R-typ märkning antikropp (röd) och Alexa-488 phalloidin (grön) som visas i en sammanslagen overlay. (B) i. Förinkubering av anti R-typen av kalciumkanaler antikropp medkontrollantigen ger inte någon särskild märkning av kalciumkanaler. ii. Alexa Fluor 488 phalloidin märkning av presynaptiska terminaler för samma axon visar diskreta punktat märkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår dissociation protokollet är viktig genom att ge isolerade reticulospinal axoner saknar postsynaptiska projektioner figur 2f, men som ändå behåller funktionell presynaptiska terminaler Figur 4c och 4d figur. Frånvaron av postsynaptiska processer motsätter den presynaptiska terminalen möjliggör direkt inspelning tillgång till presynaptiska frisättningen ansiktet membran vid enstaka presynaptiska terminaler, som tidigare inte möjligt i centrala synapser och framgångsrikt uppnåtts i endast två calyceal typ presynaptiska terminaler; blomfoder-typ synaps av chick ciliära ganglion 7-10 och rått calyces 11,12. Individuella presynaptiska terminaler, som vid elektronmikrografisk nivå har visat att presentera enkla, enskilda aktiva zoner 21, kan identifieras genom återvinningsmärkning vesikler kluster med FM 1-43 och riktade för inspelning Figur 4c och 4d figur. Ca
Nyckeln till att erhålla isolerade reticulospinal axoner med funktionella presynaptiska terminaler ligger i en serie av kritikeral sekventiella steg. Tissue hindrar akut dissociation av de gigantiska axoner ligger huvudsakligen i dorso-mediala regionen av ryggmärgen Figur 1a hade tas bort först i en vibrerande vävnad slicer Figur 2a. Detta gör det lättare att mekaniskt dissociera ryggmärgen med användning av minsta möjliga kraft. Skivning av den dorsala kolonnen kräver fullständigt avlägsnande av den dorsala Meninx Primitiva eftersom eventuell kvarvarande dorsala Meninx Primitiva skulle hämma den skärande verkan av bladet. Vi finner att de lämnar den ventrala Meninx Primitiva på ryggmärgen vid tidpunkten för skivning hjälper till att upprätthålla formen på ryggmärgen och bistår i bättre skivning. Att upprätthålla spänningen i ryggmärgen under skivprocessen förhindrar sidorörelse eller infall av vävnaden under bladet som skulle skada axoner. 1 cm långa ryggmärgs bitar ger en bra längd för att skiva eftersom vävnaden kan sträckas och nålas ner upprätthålla spänningen while skivning. En annan kritisk faktor för att övervaka är djupet av den del; för grunt en bit förhindrar god separation av ryggmärgen medan alltför djupa en skiva skadar reticulospinal axoner. En bra skiva djupet är en där rygg kolumnen bort synligt lämnar ventrala reticulospinal kolumnen oskadade. Djupet av den del måste mätas under skivprocessen ges det finns variation i ryggmärgen tjocklek mellan djur. Avlägsnandet av den dorsala kolumnen utförs bäst i den mellersta delen av ryggmärgen stycket Figur 2b eftersom den gör det möjligt att unsliced rostralt och stjärtfenan slutar att fungera som handtag för att ta tag i vävnaden under dissociation processen Figur 2e.
Efter avlägsnande av den dorsala kolonnen, behandla de skivade ryggmärgs bitar med en blandning av kollagenas (Kollagenas typ lA från Clostridium histolyticum) och proteas (proteas typ XIV från Streptomyces griseus) enzymer (1 mg / ml i Ringer-lösning) hjälper smälta bindväv och underlättar en skonsammare dissociation. En 30-45 minuters uppslutning vid RT är idealisk för dissociation. Komplett enzymatisk dissociation av nejonöga ryggmärgen har tidigare genomförts med sekventiella behandlingar av kollagenas (2 mg / ml, 30 min) och proteas (2 mg / ml, 45 min) för att isolera spinal nervceller 17. Sekventiell behandling kontra behandling med en cocktail av proteas och kollagenas gav inte bättre resultat i dissociera reticulospinal axoner. Vi experimenterade också med olika koncentrationer av dissociation enzymer. Enzym halter högre än 2 mg / ml eller matsmältnings gånger längre än 45 min resulterade i ryggmärgen förlorar sin konsistens och fattiga dissociations. De högre enzymkoncentrationer och förlängd behandlingsperioder kan hjälpa till fullständig dissociation av ryggmärgen när utbyten av mindre nervceller krävs. Reticulospinal axoner, i motsats härtill har en förlängd structure och behandlingar som är större än 45 minuter var kontraproduktivt. Behålla vissa spänningar i ryggmärgen Aided bättre dissociations.
Nästa viktiga steg är att skära sido skrifter av de enzymbehandlade ryggmärg stycken vid mittpunkten av den skivade regionen att isolera den slutliga dissociation styrka till regionen omfattar reticulospinal axoner. Nedskärningarna ska sträcka sig från sidokanten på ventrala hornet grå frågan till centrala ventro-mediala kolumnen i reticulospinal axoner lämnar dem oskadade Figur 2d. Cutting sidovägarna ger en brännpunkt vid vilken påtvingad separation av ryggmärgen kommer att inträffa under mekanisk dissociation och underlättar en jämnare separation av vävnaden. Fortsatt spänning i ryggmärgen krävs under skärprocessen och kan uppnås genom att sträcka och sätter de stjärtfenan och rostrala ändar av ryggmärgen stycket. Detta förhindrar vävnads deformation under skalpell bladoch skadar axoner.
Det sista steget i dissociation tillämpar mekanisk spänning och försiktigt sträcker vävnaden längs rostro-caudal axeln Figur 2e använder pincett för att gripa vävnaden. Detta steg utförs under poly-lysin belagda täckglas för att möjliggöra vidhäftning av de separerade axoner för efterföljande inspelning. För att uppnå ökad vidhäftning för de långa utsträckta reticulospinal axoner, har vi använt en hög molekylvikt (> 300.000) poly-D-lysin hydrobromid, vilket ger större antal fästpunkter, att belägga täck och petriskål inläggningar. Poly-lysin belagda ytan ger tillräcklig vidhäftning för ryggmärgen slutar och akut isolerade reticulospinal axoner. Teflon belagda pincett är skyldiga att gripa ryggmärgen eftersom det fastnar ordentligt på vanliga rostfria pincett hindrar dissociations. Vävnaden måste sträckas sakta och försiktigt dra axoner ur spsprungliga sladden. Det bästa sättet att få axoner att bosätta sig är att upprätthålla ryggmärgen slutar längs glastäck hela tiden under dissociation processen genom att upprätthålla trycket nedåt på den rostrala och kaudala ryggmärgen slutar med pincett.
De axoner är bäst klassificeras som delvis isolerat eftersom någon del av axonet kvar inne i minst ena änden av ryggmärgen änden beroende på omfattningen av dissociation. Isola kan utföras genom mekanisk separation av de två ändarna av ryggmärgen förrän axonerna är fullständigt avskilt från en ände av ryggmärgen. I detta fall förblir en del av axonet inuti ryggmärgen ände från vilken det tappas medan den återstående delen är isolerat ur ryggmärgen interiör. Terminalen öppna änden av axoner tätar upp av en membranåterförslutningsprocess beroende på hälsa axonet. Isola kan också genomföras så att axoner dyker ut från ryggmärgen, but den kaudala och rostralt ändar ryggmärgen förblir anslutna medelst de isolerade reticulospinal axoner figur 2e. Vid denna punkt, försiktigt släppa trycket gör att axoner under spänning för att koppla av och slinga ut vilket gav isolerade områden i axoner saknar postsynaptiska prognoser. Båda dissociation tekniker erhållande funktionella axoner. Den fysiologiska temperaturen för nejonöga är 10 ° C och följaktligen är preparatet tillåts återhämta sig vid 10 ° C under 1 h för att möjliggöra de axoner att återhämta sig från den akuta dissociation. För elektrofysiologiska inspelningar ades dissociationen utföras på ett poly-lysin-belagda täckglas insatt i en anpassad kammare Figur 3. Lamprey ryggmärg har allmänt upprätthölls vid 10 ± 2 ° C genom perfusion Ringers lösning, förkyld till 10 ° C genom att passera genom en termoelektrisk kylanordning. Exceptionellt låg bakgrundsljud krävs för att lösa en kanal Ca Hög K + (30 mM KCl) används för att depolarisera axoner (avsnitt 4.1), så att FM färgämne införlivas ivesiklar under synaptisk exo-endocytos. Det är svårt att behålla insättning av en mikroelektrod i isolerade axoner under längre perioder som den minsta drift i Axon läge gör att elektroden avta från axonet. Detta gör det svårt att stimulera axoner under längre tid med hjälp av en mikroelektrod. Den stora axonet diameter (20-50 nm) gör det svårt att stimulera användning av en volfram stimuleringselektroden. Därför hög K + användes för att depolarisera axoner. De presynaptiska terminaler i de reticulospinal axoner ha en diameter av 1-2 | im. Ca2 + strömmar är lokaliserade till frigör ansiktet membranet vid presynaptiska terminaler och det är därför mycket viktigt att korrekt rikta den presynaptiska terminalen. Därför är ett nyckelkrav för att uppnå dessa inspelningar att kunna manipulera rörelse fläckpipetten position i ìm steg. Ca 2 + strömmar vid presynaptiska frisättning ansikte membran har visar minsted i calyceal synapser att vara extremt liten i amplitud, mindre än 0,5 pA. Enstaka kanals inspelningar av Ca 2 + strömmar kräver därför extremt låga bakgrundsljud. Låg termisk brus uppnåddes med en Axopatch 200B förstärkare och en kyld huvudsteg. Dessutom kontaminerande bullerkällor måste identifieras systematiskt och elimineras. Patch pipetter tillverkades, från aluminiumsilikat glas för att säkerställa låg ljudnivå eftersom glaset har extremt låga föroreningar och hög resistivitet. Pipetterna skapades så att pipettspetsen diameter var större än diametern på den presynaptiska terminalen därmed helt omfattar den presynaptiska terminalen, kan de dimensioner som tydligt observeras av FM 1-43 märkning. Detta säker inspelning från hela släppytan membran. Den kapacitiva buller reducerades genom beläggning av pipetten med PDMS så nära spetsen som möjligt. De gigaohm tätningar vid presynaptiska terminal membran inte är stabila under lång perIODS och inspelningar varar normalt högst 2 min. Detta gör inspelningarna ytterst svårt att få eftersom den låga framgång kräver ett stort antal försök att få framgångsrika inspelningar. Inspelning lösningar måste utformas så att alla andra kända strömmar i presynaptiska terminalen membranet såsom spänningskänsliga Na + och K +-kanaler och Ca2 + -activated K + kanaler är blockerade, vilket gör inspelning av Ca 2 + strömmar. Det finns vissa begränsningar för användning av poly-lysin självhäftande yta med detta preparat. En är oförmågan att flytta den fysiska placeringen av den kammare som innehåller en beredning, eftersom eventuella skakningar störde beredning. En annan begränsning av adhesivytan upptäcktes under immunohistokemi experiment som rostralt och stjärtfenan ryggmärgs gavlar förlorar vidhäftning vid inkubation i 4% paraformaldehyd. Vi har provat alternativa klister coatings såsom Cell-Tak och mötte liknande frågor. För att lösa dessa problem, använde vi flytande sutur lim för att fästa de ryggmärgs handtagen. De närmare detaljerna om användningen av suturen limmet har diskuterats i en tidigare JUPITER artikel av Chen och Feather 22. Limmet sätter i en långsammare takt i lösningar utan tvåvärda joner och vi drog fördel av egendomen och genomfört dissociations i Ringers lösning utan Ca 2 + och Mg 2 +. Detta gav oss med ytterligare tid för manipulering av vävnaden under dissociation process. Vi antog en liknande inställning till Chen och Featherstone 22 med hjälp av patch pipetter och mun sug genom en slang kopplad till fläckpipetten att applicera lim på det specifika målområdet på dissociation ytan innan du utför dissociation (Protokoll avsnitt 5.2). De dissociations utfördes som beskrivits tidigare, med den enda skillnaden att ryggrads cORD ändar fäst under dissociation processen genom att försiktigt dra i handtaget änden över den tidigare placerade lim (protokoll avsnitt 5.3). När dissociationen var avslutad, den tvåvärda jonen fri Ringers lösning utbyttes mot Ringers lösning innehållande Ca2 + och Mg2 +-joner genom perfusion och beredningen tilläts återhämta sig vid 10 ° C under 20-30 min på en termoelektrisk kylning plattan innan fortsätter med följande steg för immunohistokemi. Nyckeln Börden av denna teknik är en exakt förståelse av Ca2 + kravet på signalsubstansen release, som inte har varit helt löst, trots årtionden av forskning. En övergående ökning av presynaptiska [Ca2 +] har etablerats som avgörande för att utlösa release i alla synapser. Dock konsensus saknas fortfarande på antalet Ca2 +-kanaler som bidrar till Ca2 +-domänen grind RELEAse. Samtidig mätning av Ca2 + strömmar och kapacitansmätningar på frigör ansiktet membranet enskilda presynaptiska terminaler skulle ge ett entydigt svar på denna fråga. Dessutom skulle det göra det möjligt klarlägga tidsförhållande mellan presynaptiska Ca 2 + inresa och vesikelfusion, vilket möjliggör ett exakt mått på synaptisk fördröjning. Den obegränsad tillgänglighet till frigör ansiktet membranet vid enskilda presynaptiska terminaler ger möjlighet att tillämpa ett antal olika experimentella metoder för att studera olika delar av releasen signalsubstans. Exempel på sådana metoder innefattar enstaka vesikler avbildning med kvantprickar att studera synaptiska vesikler fusion. Vesikelfusion händelser kan också vara direkt karakteriseras vid presynaptiska terminaler genom att mäta membran kapacitans förändringar som ligger bakom vesikler fusion händelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S.
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V.
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K.
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
