Summary

30日猪胚胎的准确和无酚DNA性别鉴定的PCR

Published: February 14, 2016
doi:

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

研究中的猪产前编程已经表明,发育中的胚胎或胎儿的性别可以影响发育结果。因此,确定胚胎的性别的能力是必要的,许多实验特别是关于早期发展。本协议表明猪基因组DNA用PCR使用一种廉价的,快速的和无毒​​的制剂。第30天的胚胎必须按照机构动物政策及福利委员会在本协议确定的方针得到人道收集。整个胚胎此基于PCR性别鉴定技术制备简单地涉及使用预冷研钵和杵研磨冷冻的胚胎成细粉。 PCR的质量DNA从胚胎粉末少量通过在碱性裂解试剂施加热孵育释放。接着,将DNA溶液与中和缓冲液混合,并直接用于PCR。两个引物对产生的DETEC吨特定性别确定Y-染色体(SRY)和在X染色体以高精度和特异性的ZFX区域的区域。相同的协议可以被应用到其它细长胚胎(第10天至14天)比日早30.此外,此协议可与96涌出板筛选大量的胚胎时,使之成为自动化和高可行进行吞吐量性别特征。

Introduction

国内生猪已成为发展,遗传学与营养在人类和畜牧部门的基本研究课题。猪作为生物体模型为人类研究的潜在可以归因于他们的生理相似之处。在家畜,性别比例操纵,提高选择和遗传改良计划1的有效性。性别鉴定单个胚胎是许多实验研究,包括但早期胚胎发育过程中2不限于基因,表观遗传学和性别二态性的X染色体失活使用的基本工具。

在小鼠的研究表明,产妇的饮食和其他因素可能导致男女比例失调3。在猪,性别比例失衡的原因包括父系品种4,子宫容量5,母猪的代谢状况6。因为在胚胎和窝中观察到的差异可以通过本身的影响xual异形,研究人员应借鉴有关他们的研究结论之前,了解胎儿的性别和性别比率。高效的工具和协议,在发展30日性别鉴定胚胎养猪的发展,将在这里讨论。

性分型的各种方法已经被开发用于在模式生物和家畜遗传研究。特别是在家畜,识别雌雄早期胚胎是一个非常普遍的做法,以提高遗传选择用于育种计划。早期胚胎用姬姆萨7或强烈的荧光8,9技术猪核型已被用于性别特征。然而,这些方法是耗时,不适合快速,准确地筛选大量的胚胎。

最有效的性别分型方法是使用热稳定DNA聚合酶和一对引物DNA扩增。通过PCR方法DNA性别鉴定是比较具体的,快速,灵敏,邻NLY需要接入蜂窝材料的微量。是对人类进行的10首基于PCR的胚胎性别鉴定,后来在小鼠11,12牛,水牛13和 14只羊植入前胚胎。在猪,通过单一对Y染色体特异性DNA引物15,建立了植入前胚胎早期的DNA性别分型方法。然而,从雄性特异性SRY基因16和位于X和Y染色体17上的锌指基因的非性判别区域的Y染色体选择用于性别确定的最常见的PCR引物。随后,这些引物已经被应用,以确定在这项研究中具有改进的引物特异性日30的胚胎的性别来检测仅一个锌指基因的X染色体。

从猪植入前胚胎基因组DNA可以通过将一个完整的胚泡与proteinas缓冲提取Ëķ16或通过采取一些细胞活检从个体早期卵裂胚胎15并将它们用于直接PCR。然而,从猪血液,毛发,组织或大小超过几厘米大孕的DNA释放不能有效地使用蛋白酶K法进行。使用任一耗时苯酚/氯仿协议6或昂贵基于列的试剂盒18已经建立了这些材料的DNA提取方法。为了避免使用可能有毒的化学品,有开发价格低廉,容易和自由酚DNA提取方法的趋势。这对PCR的质量的基因组DNA,从鼠标 19和斑马鱼20组织中的隔离型协议的已使用热氢氧化钠和三(能手)成立。这项研究提供了一个协议来获取DNA与PCR性爱能手修改和重新设计的复式引物对直接从日细胞裂解液30猪胚胎打字精度高。

Protocol

按照加拿大议会关于动物饲养的指导方针,并与学院动物政策及福利委员会批准 – 阿尔伯塔大学的畜牧,妊娠母猪由经过培训的人员大约一天收集妊娠和胚胎30安乐死。在过程中使用检查手套在所有时间。 1.样品采集和样品储存使用紧固螺栓接着放血安乐死母猪。戴上手套检查从每个安乐死收集母猪生殖道和胚胎。 注:样品和移植胚胎的快速收集到干冰或液氮,将导致更高质量的组织中其他分子的作品,如芯片和qPCR。 解剖子宫,轻轻的胚胎盘胎膜内所有的胚胎从底层的子宫壁分离21。确保没有母体组织的污染。 回覆冷冻前所有可行的胚胎线的长度和重量。 收集每个人的胚胎,并立即与捕捉液氮冷冻前的铝箔包起来。 转自液氮冷冻胚胎直接到-80℃的冰箱中。 2.磨胚胎标记所有样品管(15ml)中与所需的样本数的样本ID加以分析。 填充干冰热容器半满,并在干冰插入预标记的样品管中。 戴上手套,冬天在上面另一对检查手套从-80转移预冷迫击炮和杵℃冰箱干冰的容器。 放置在冷冻胚胎的干冰砂浆内。 倾足够液氮覆盖胚胎和用杵成细粉研磨它。 胚胎粉末转移到预标记的样品管与MICRospatula(图1),并放置在管中-80℃冷冻机中。 使用干净预冷研钵每个胚胎和研磨每个胚胎,以避免样品间的交叉污染后改变考试手套。 采用改良氢氧化钠方法3基因组DNA制备方法标签所需的所有的样本数的离心管(1.5毫升),以进行分析。 从之前的传递包含胚粉样品管-80℃冷冻到容器用干冰首发。 吸管180微升的50mM的NaOH(氢氧化钠)到每个预标记的微量离心管中。 打开培养箱和预热至95℃。 用牙签胚胎粉末的正确量(约5-10毫克)(图2)从样品管转移到含有50mM的NaOH溶液的预标记的微量离心管中。 拉üP上的同一牙签慢慢可视化所述DNA裂解物作为粘糊糊,白色透明状物质(图3)。 用DNA裂解物转移离心管到预加热的培养箱中于95℃五分钟。紧随管转移到装满冰保丽龙箱。 加入20μl的1M Tris-HCl中直接进入的离心管,并轻轻拍打该管混合。使用pH试纸,以确保pH在大约8.0(图4)之前,离心。 注意:当有大量样品制备的处理,是可以接受的随机挑选几样检查pH值。 离心与DNA裂解液的管中,在2000 xg离心在微量两分钟,在室温下以除去未溶解的组织碎片。 转移150微升顶部澄清上清液的进新管或96孔板中。 注:明确DNA裂解液准备在PC模板使用ř反应,这是在4℃下稳定两周,或者也可以保持在-20℃下一年。 4.设计性别特异性PCR引物获得NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov猪的性别决定区Y(SRY)登录号(NM_214452.3)和锌指蛋白X连锁(ZFX)基因(XM_005673501.1) /。 复制这些NCBI登录号粘贴到一个在线的引物设计工具。 注意:最好的引物信息,包括长度,Tm和GC%以及PCR产物大小(bp)的将在计算机屏幕上产生的(图5)。 验证的使用核苷酸BLAST程序(BLASTN)逆水猪基因组数据库104,以确保这些序列仅位于X和Y染色体为SRY和ZFX分别(图6)这些引物的特异性。 5.基因组DNA PCR直接从DNA裂解液使用仅1微升的DNA裂解物作为15微升的PCR反应的模板的。 注意:可以在用多道移液器类似的方式来执行对96孔板的PCR的高通量筛选方法。 请执行以下操作只是第一次PCR:通过添加购得已知性别的猪的基因组DNA 1微升(0.5纳克)准备一个PCR管无模板阴性对照和阳性对照两个附加管。以后,包括来自上一次成功的性别鉴定分析作为阳性对照的样品,并与用于性别确定的新PCR反应一起运行。 使用任何热启动预拌的PCR酶,并通过添加引物制备主混合物并根据PCR反应的总数无核酸酶的水。加入1微升的DNA裂解成现有预PCR管与PCR主混合物的14微升。添加的引物,使得由两个性别特异性基因的引物的终浓度是在共有15微升的PCR为r的0.3微米反应的影响。 设置以下PCR程序在热循环仪:95℃,3分钟,35个循环,每个为20秒熔化步骤98℃,接着在65℃15秒的退火步骤,接着是15秒延伸步骤在72℃。在最后的步骤,孵育1分钟的反应在72℃下,继续在4℃下孵育直至除去PCR管的用于凝胶电泳验证,以确定的性别。 注意:PCR条件和优化,根据在材料表中提到的PCR试 ​​剂盒的说明书。 制备2%TBE琼脂糖凝胶时添加无毒绿光荧光SYBR DNA凝胶染色的适当的量。 注意:溴化乙锭可以代替绿光荧光染色,如果它是不可用的。 添加1.5微升样染料(10倍)到PCR管中,并通过移液在PCR反应缓冲液向上和向下拌匀。 负载10微升样品放入井并且r联合国琼脂糖凝胶具有适当的电压设置(在100伏的小胶设备,在150V 96孔凝胶装置上,直到染料带贯穿凝胶一半)。 观察和利用激光扫描仪下的荧光设置调整频带的强度,并捕获凝胶的图像。注意:普通的凝胶成像仪可以取代的溴化乙锭的凝胶。 通过识别与一个频带作为女性和两个频带作为男性(图7)的胚胎确定猪胚胎的性别。

Representative Results

从345的DNA裂解物通过PCR筛选性别决定的代表性结果示于图7和表 1中总结。 如在图7中可以看出 ,引物退火温度在65℃是在不同样品之间的这种PCR方案产生类似的强度和谓词的扩增子的大小(图5)的最佳条件。 SRY(400?…

Discussion

最相关的猪胚胎的DNA性别打字现有协议的仅适合于早期预注入阶段15,16。我们已经成功开发出在妊娠后期适用于猪胚胎筛选的协议。基于与从先前的研究6,18胚胎相似发育阶段的研究中,本协议被认为是安全的,成本低。

该协议也适于用于使用PCR通过DNA裂解物转移入96孔板性打字大量样品。板格式允许高通量筛选通过允许转印1μl的DNA的裂解物用于使用多道移液?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者要感谢的合作与下面的科研资助机构的财政捐款:艾伯塔牲畜和肉类代理有限公司,猪肉CRC,艾伯塔猪肉,海波尔一个汉德克斯公司与NSERC CRSNG。

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit  KAPABiosystems KR0370 other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain Life Technologies S33102 Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA Zyagen GP-160-F1 & GP-160-M5 Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner GE Healthcare Life Sciences 28-9969-43 other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves WWR 89038-270 any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid  Fisher BP 359 -212 Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean Eppendorff 0030 108.051 heat resistant
ThermoStat plus Eppendorff 22670204 Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick Bunzl Plc 75200815 Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C Eppendorff 22621807 This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula Fisher SDI28540115 Autoclaved before use each time.

References

  1. Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
  2. Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, 54-62 (2006).
  3. Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
  4. Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
  5. Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
  6. Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
  7. Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
  8. Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
  9. Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
  10. Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
  11. Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
  12. Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
  13. Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
  14. Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
  15. Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
  16. Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
  17. Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
  18. Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
  19. Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
  20. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
  21. Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
  22. Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).

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Blanes, M. S., Tsoi, S. C., Dyck, M. K. Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR. J. Vis. Exp. (108), e53301, doi:10.3791/53301 (2016).

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