Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

(C I) Viral Mimik Poli ile Orta gebelik Sahnesi'nde Farelerde Anne Bağışıklık aktivasyonu indüksiyon

Published: March 25, 2016 doi: 10.3791/53643
Automatic Translation
*1, *1,2, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Introduction

Maternal immün aktivasyon kavramı (MIA) otizm ve şizofreni 1 ile maternal enfeksiyon dernek epidemiyolojik çalışmalar kaynaklanır. Plasentanın veya maternal viral enfeksiyondan 2,3 sonrasında fetal beyninde tespit replike viral patojen olmaması, yavru enfeksiyon etkisi oldukça patojenlere kendisinden daha anne bağışıklık sisteminin aktivasyonu neden olduğu varsayılmaktadır .

polisitidilik asit: MIA ve psikiyatrik bozukluklar, kimyasal olarak sentezlenmiş viral taklit çift iplikli RNA Poliinosinik enjeksiyonu arasındaki neden-sonuç ilişkisini aydınlatmak için: Hamile kemirgenler içine (poli (C)) yaygın MIA için hayvan modeli olarak kullanılmıştır 4,5. Poli (I: C) Toll-benzeri reseptör 3 (TLR3) ve poli sistemik uygulama tarafından kabul edilmektedir (I: C) viral benzeri akut inflamatuar yanıtı indükler. mekanizmalardan biri olan poli (l: C) PRyavrularda oduces davranışsal anormallikler ve nöropatolojiler anne-plasental-fetal eksen 6 yanlısı ve anti-inflamatuvar sitokinlerin bir dengesizlik neden gereğidir. Çeşitli gruplar psikiyatrik bozuklukların 7 etiyolojisi anlamak için MIA modelini benimsedik ve bağlı araştırma grupları arasındaki farklı ilgi alanlarına, immün aktivasyon çeşitli zaman noktaları beyin gelişimi ve davranışları 7 farklı tedirginlikler elde etmek için kullanılmıştır.

, Embriyonik 12.5 gün hamile farelere başarıyla MIA davranışsal, nörolojik indükleyebilen olduğunu göstermiştir (E12.5), (C I) California Institute of Technology Paul H. Patterson laboratuvar poli enjekte stratejisini benimsemektedir ve otizm ve şizofreni 8-11 ile ilişkili çocuklarında immünolojik değişiklikler. Bizim önceki çalışmalar MIA yavrular davranışsal anormallikler (örneğin, sosyal impairmen görüntülemek göstermektedirt, iletişim eksikliği, tekrarlayan davranış, anksiyete gibi davranış ve gizli inhibisyon açığı 8,10,12), bağışıklık düzensizliği ve sitokinler dengesizlik 8,13,14, fetal beyin gen ifadesinin 15 değişmesi, lobule VII Purkinje hücresinin kaybı beyincik 11, hipokampus 9 sinaptik özelliklerinin değiştirilmesi, gen x çevre etkileşiminin 13, bağırsak geçirgenliğinin değiştirilmesi ve bağırsak Mikrobiyota kompozisyon 16. Bundan başka, tedavi edici ve önleyici stratejileri, bu model sistemi 13,16,17 arasında geliştirilmiştir. E12.5 MIA uyararak, diğerleri MIA serebral sinaptozomal moleküllerinin 17 fetal mikroglial aktivasyon ve bazal ön beyin 18 kolinerjik gelişimsel değişiklik, soy spesifik etkileşim 19, beyin beyin sinaptozomal ultrastrüktürel anormallikleri, beyin mitokondriyal solunum zinciri hiperfonksiyon abnormalties, infekte ürettiğini göstermiştir ,depresif benzeri davranışlar, biliş ve hipokampal uzun vadeli potensiyalizasyon (LTP) bozulma ve yetişkin hipokampal nöron 20 açığı.

(C I) yanı sıra, otizm ve şizofreni etiyolojisi incelemek için bu modeli uygulamak için nasıl paradigmaları Burada, poli tarafından E12.5 MIA ikna etmek nasıl ayrıntılı bir yöntem sağlar. MIA bozukluklarının 4 çeşitli bir risk faktörü olduğuna dikkat etmek önemlidir, ve sonuçları zaman ve indüksiyon yöntemi yanı sıra hamile barajlardan hayvancılık son derece duyarlıdır. Bu nedenle, laboratuarlar arasında bile küçük tutarsızlıklar genellikle düşük tekrarlanabilirlik ve / veya yavruda farklı fenotipleri neden olur. Bizim yöntem, özellikle otizm ve şizofreni için bir çevresel risk faktörü olarak MIA okuyan ilgilenenler için tasarlanmıştır ve ayrıntılı bir açıklama araştırmacılar verilerinin tekrarlanabilirlik geliştirmemize yardımcı olacaktır sağladı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm protokoller Teknoloji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu California Institute (IACUC) onayı altında gerçekleştirildi.

Zamana-eşleşme çiftleri 1. Hazırlık

  1. gen ekspresyon analizi için en az 6, davranışsal deneyler için baraj ve 3 kullanın.
    Not: farelerin sadece% 50 zamanlı-çiftleşme gelen tıkanırlar olarak, tahmin edilen dişi farelerin iki kat kullanın.
  2. daha önce hiçbir gebelik ve yaş 8-16 haftalık dişi fareler kullanın.
    NOT: Dişi fareler erkek farelere önce cinsel maruz kalma var ama hamile olmamıştır kabul edilebilir.
  3. Ev dişi fareler ve birlikte yanyana onların östrus döngüsü senkronize etmek için kafesleri yerleştirin. 5 yetişkin farelerin konut sağlamak için 5.5 inç üzerinde bir yükseklikte ve 75 inç kare iç zemin ile standart fareler kafes kullanın. bir kulak yumruk kullanarak her kadın fare etiketleyin.

2. Zamanlı-mat kurmaing Çifti

  1. karanlık döngüsü başlamadan önce zamanlanmış-çiftleşme 0-2 saat ayarlayın. Her kafeste iki dişi farelerin yerleştirin. fareler çıkarın ve bunları tek tek tartın. Her dişi fare vücut ağırlığı kaydedin.
  2. İki dişi fareler her kafesin içine bir erkek fare yerleştirin. baba karıştırıcı etkisini en aza indirmek için üçlü çiftleşme kullanın.

3. Vajinal Plug Kontrol (E0.5)

  1. karanlık döngüsü sona erdikten sonra dişi fareler 0-4 saat kontrol edin. Yavaşça kuyruk tabanından kadın fare kaldırın ve kablolu fare ızgara, kafes top, ya da kafes kenar kapmak için izin verir.
  2. Vajinal fiş belirtilerini arayın: vajinal fiş vajinal açılışında görünür beyazımsı kitledir. Fiş açık değilse, yavaşça vajinal açılış içine 200 ul pipet yerleştirin. koagülasyon gelen direnç vajinal tıkacı oluşumunu onaylar. günde bir kez vajinal fişi kontrol edin.
    NOT: Vajinal fişi g nedenle değil çiftleşme oluştuğunu ancak bir göstergesidir veuarantee gebelik. Vajinal tamponun farelerin bazı suşları tespit etmek zor olabilir. Fiş kimlik doğruluğunu artırmak için deneyimli fareler bakıcı yardım isteyin.
  3. Yeni bir kafese takılı fareler taşımak ve grup onlara ev. embriyonik 0.5 gün (E0.5) olarak vajinal fiş görünüm günü belirleyin.

E10.5-11.5 4. Gebelik olup olmadığını kontrol edin

  1. Yavaşça kuyruk tabanını kaldırın ve kablolu fare ızgara, kafes top, ya da kafes kenar kapmak için izin verir. Gebelik, örneğin, karında bir çıkıntı (Şekil 1) belirtilerini kontrol etmek için karın alan gözlemleyin.
    NOT: Gebelik işareti her zaman E10.5 olduğundan daha E11.5 daha açıktır.
  2. gebelik doğrulamak için fareler tartılır. Hamile fare genellikle E10.5 yaklaşık% 20 daha ağır ve bir gebe olmayan fare (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında E12.5% ​​30 ağır bastığından. Tek Evi temiz kafeslerde hamile fareler.

5. 20 mg /kg Poli (I: C):

  1. gen ekspresyon analizi için grup başına en az 6 Davranış deneyler için grup başına baraj ve 3 kullanın. solüsyonu: poli (C I) tekabül eden miktar hazırlayın.
  2. 40 mg / ml bir nihai konsantrasyon yapmak için bir 50 ml konik bir tüp içinde: (Cı) Toz poli tartılır. en aza indirmek ve enjeksiyon hacmi kaynaklanan stres standart poli 5 ul enjekte etmek için (I: C) fare vücut ağırlığı (5 ul / g veya 5 ml / kg) her bir gramı için çözüm. kg'ı başına (Cı) MIA neden olmak için, poli 20 mg enjekte edilir.
    Not: poli konsantrasyonu (I: C) gerekli çözeltisi (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml'dir. poli yana (I: C) Toz,% 10 poli içeren çözelti (I: C), biz (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / poli ml (Cı) bir son konsantrasyon yapmak gerekir.
    DİKKAT: poli (I: C) toz çok hafif. konik tüp spatula aktarma sırasında herhangi bir toz kaybetmemek için dikkatli olun.
  3. Konik küvet içine,% 0.9 sodyum klorid (tuz) karşılık gelen ses eklemeE ve kapağını kapatın. Çözelti berrak olana kadar: (C I) toz hafifçe poli üzerinde tuzlu damlacık haddeleme tozu eritin. 1 dakika boyunca (Şekil 3C) 800 xg'de konik tüp santrifüjleyin. (C I) 0.22 mikron filtre ile çözüm poli Filtre. Bir 1.5 ya da 2 ml mikrosantrifüj tüpüne (Cı) solüsyonu poli aktarın. İsteğe bağlı: Çözüm: poli (C I) 260/280 oranını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Oranı, üretici tarafından tarif edildiği gibi 1,54-1,82 (Şekil 3) arasında olduğundan emin olun. NOT: (: C I) toz ve steril ve ilaç sınıf olmalıdır kontrol enjeksiyonu olarak hizmet poli eritmek için kullanılan tuz.

6. Salin ya da poli (I: C) E12.5 Enjeksiyon

  1. ölçekte fare tartılır ve kafes içine geri koymak. (C I) fareler: vücut ağırlığı (g) 5 ile çarpılarak = istenen enjeksiyon hacmi (ul) tuzlu ve poli hem de enjeksiyon hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın. 0.3 mi Insul kullanın(C I) çözüm, örneğin, bir 30 g fare için 150 ul şırınga tuzlu hesaplanan hacim veya 20 mg / kg poli hazırlamak için.
  2. Yavaşça kuyruk tabanı ile fare pick up ve kafesin üstüne yerleştirin. stresi ile oluşturulan karıştırıcı etkileri önlemek için yavaşça fareyi tutun. Iki üst meme (Şekil 4) merkezi haline fare yaklaşık 20 ° göreceli, yukarı konik, iğne takın ve tuz ya da poli (I: C) enjekte çözüm. Not: iğne enjeksiyonundan sonra her bir fare için değiştirilmelidir.
  3. geri evde kafes fare yerleştirin. diğer karıştırıcı etkilerini önlemek için sessiz, düşük trafik odasında kafesleri yerleştirin.

7. Poli Day After (I: C) Enjeksiyon (E13.5)

  1. Aşağıdaki sabah enjekte edilen fareler kontrol edin. vücut ağırlığını ölçmek için bir ölçek kullanın.
    NOT: Poly: tuzlu inj sonraki gün farelere enjekte daha (C) hamile fareler genellikle daha az kilo enjekteection.
  2. yavrular doğar kadar fareler rahatsız etmeyin.

MIA Offspring 8. Ölçer

  1. MIA indüksiyon karıştırıcı etkilerini en aza indirmek amacıyla, MIA yavruların kullanımını ölçmek için aşağıda listelenen yönergeleri izleyin.
    1. çöp boyutu 5'ten küçük preterm veya gecikmiş doğuştan veya eğer ibrelerin hariç tutun.
    2. Çöp boyutu 10 büyükse CO 2 tarafından aşırı yavrular euthanize.

9. İsteğe bağlı: MIA sonra akut inflamatuar Tepki inceleyin

  1. kurumun Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol anlatılan yöntem kullanılarak enjeksiyon: tuzlu su ya da poli (Cı) sonra hamile farelere 3 saat Kurban.
    NOT: Servikal dislokasyon genellikle baraj ve embriyo üzerinde CO 2 / ötenazi ilaçların etkisini en aza indirir olarak tercih edilmektedir.
  2. plasenta ve fetal sutyen erişkin gebe farelerin dalak toplayın ve izolestereomicroscope altında.
    1. dalak toplama, diseksiyon plaka üzerinde fare koymak ve hamile farelerin karın alanda% 70 etanol sprey. deri yoluyla göğüs kafesi altında karın alanının merkezinde dikey kesim yapmak için steril bir makas kullanın.
    2. Dalak sol üst kadranda oturur. dalak izole etmek için forseps kullanabilir. organın etrafında yağ doku kaldırmak için hassas görev silecekleri üzerinde dalak yuvarlayın. dalak dokusunun yaklaşık 50 mg toplayın ve nükleik asit bozulmasını önlemek için tampon veya TRIzol stabilize 500 ul RNA ile Eppendorf tüpleri tek tek koyun. kullanılana kadar -80 ° C'de derin dondurucuda Örnekleri saklayın.
    3. plasenta toplanması için hafifçe vücuttan rahim boynuzları çekin. otoklavlanmış fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile dolu bir Petri kabındaki rahim boynuzları yerleştirin ve buz üzerinde bir çanak bırakın. rahim duvarına açık gözyaşı ve amniyotik kese maruz iki forseps kullanabilir.
      1. Dikkatle plasenta ve fetusun zarar vermeden amniyotik kese açmak için forseps kullanabilir. fetus plasenta ayrılması ve mümkün olduğunca plasentaya yakın göbek kordonu kesti. Plasenta amniyon kesesi enkaz kaldırmak. tek tampon veya TRIzol stabilize 500 ul RNA ile Eppendorf tüpleri plasenta yerleştirin. kullanılıncaya kadar -80 ° C derin dondurucuda de örnek saklayın.
    4. fetal beyin koleksiyonu için, diseksiyon kadar adım 9.2.2 den tampon stabilize RNA fetusu saklayın. stereomicroscope altında hassas 5. forseps kullanarak beynin ventrikül pial zarı kapalı alay. Dikkatle fetal beyin tüm membran kaldırmak. tek tampon veya TRIzol stabilize 500 ul RNA ile Eppendorf tüpleri fetal beyinleri yerleştirin. kullanılıncaya kadar -80 ° C derin dondurucuda de örnek saklayın.
  3. doku RNA Özü ve cDNA'ya RNA'nın dönüştürün. Gerçek t cDNA Il6 gen ekspresyonunu analizime PCR.
  4. TRIzol imalatı protokolünü takip ederek dokulardan RNA ayıklayın. dokular RNA stabilizasyonu tampon saklanır varsa. örnek çözülme ve tampon aşağı doğru döndürün. 500 ul TRIzol başka Eppendorf ucuyla doku aktarın ve RNA ekstraksiyon devam edin.
  5. konsantrasyon, 260/280 ve 260/230 RNA oranını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. oranlar 2.0 üzerinde olduğundan emin olun.
  6. 10 | il son hacim olması için işlemden DNase I Karışım 1 ug RNA, RNA, 1 ul 10x reaksiyon tamponu, 1 ul Rnaz içermeyen Dnaz ve nükleaz içermeyen su ile DNA kontaminasyonu ortadan kaldırır. 30 dakika boyunca 37 ° C'de ana karışımı inkübe edin. reaksiyonu sonlandırmak için 1 ul DNaz durdurma çözüm ekleyin. 10 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe karışımı.
  7. cDNA RNA'yı ters. 20 ul reaksiyonları kullanın ve yukarı reaksiyon başına toplam RNA mikrogram ile 1. transkripsiyon (RT) reaksiyon karışımı tampon ters 5x 4 ul karıştırın, 1 ul reverse transkriptaz, DNaz I ve 4 ul nükleaz içermeyen H2O ile tedaviden sonra 11 ul RNA şablonu bir son 20 ul çözelti yapmak için. RT için termal döngü cihazı koşullarını programlayın. Genel bir durumu şunları içerir: Adım 1: 5 dakika boyunca 25 ° C; Aşama 2: 30 dakika boyunca 42 ° C; Adım 3: 5 dakika boyunca 85 ° C; Adım 4: 4 ° C'de tutun. cDNA 5 kez seyreltilir. Kısa süreli depolama için, 4 ° C'de cDNA saklayın. Uzun süreli depolama için, -20 ° C'de cDNA dondurmak.
  8. Gerçek zamanlı PCR ile cDNA Il6 gen ifadesini analiz etmek ve p-aktin için gen ekspresyonunu Il6 gen ekspresyonunu normalize.
    1. IL-6 ve β-aktin tespiti için bir master miks yapın. 25 ul reaksiyonu kullanın, her gen için master miks 12.5 ul SYBR Green Mix, 10 uM ileri primer 0.5 ul, 10 mM ters astar ve 6.5 ul nükleaz içermeyen H 2 O 0.5 ul içermektedir
    2. 5 ul 5x seyreltilmiş cDNA a yerleştirinoptik 96 kuyulu reaksiyon plakası kuyunun dibine t. Pipet her bir kuyunun ana karışımı 20 ul son 25 ul PCR karışımı yapmak. Her bir örnek için her bir genin, üç kopya halinde. Optik yapışkan film ile plaka Seal. 4 ° C kullanımı gerçek zamanlı PCR standart bir program 3 dakika boyunca 800 x g'de plaka Spin: Aşama 1: 50 ° C, 2 dakika için; Aşama 2: 10 dakika boyunca 95 ° C; Aşama 3: 15 saniye ve sıcaklık, 1 dakika boyunca 60 ° C sıcaklıkta 95 ° C 40 döngü. ayrışma eğrisi ek bir adım ekleyin.

10. MIA Yetişkin Offspring Davranış Patolojilerin (İsteğe bağlı) inceleyin:

  1. 8-12 hafta yaşlarda davranış testleri gerçekleştirin. en az 3 gün test öncesi kafes yatakları değiştirin. En az 30 dakika test öncesi davranışsal test odasına fareler alıştırıldı.
  2. prepulse inhibisyonu (ÜFE) için, bunun altında bir piezo-elektrikli sensörü ile pleksiglas silindir fareler dizginlemek. ÜFE fareler alıştırıldı5 dakika için bir oda oluşmaktadır. 120 dB beyaz gürültü (irkilme) 6 çalışmalar ile fareler Açığa.
  3. Ardından 15 dB (15 dB daha yüksek arka plan gürültüsü 14 çalışmalarda, irkilme 14 çalışmalarda, prepulse 5 dB (5 dB arka plan gürültü daha yüksek) + irkilme (PPI5) 14 denemeler ve prepulse 14 çalışmaların randomize karışımları ile fareler maruz arka plan gürültüsü + irkilme (PPI15) daha.
  4. 120 dB çalışmaların ilk 6 denemeleri için irkilme tepkisi ortalama. diğer bireysel uyarımlar için irkilme tepkisi ortalama. (- PPI5 veya PPI15 irkilme) / irkilme tarafından prepulse inhibisyonu değeri gizli.
  5. Açık alan testi için açık bir kare arena (50 x 50 x 50 cm 3) köşesinde fare yerleştirin. Bir tavana monte kamera ile 10 dakika fare yörüngesini kaydedin. Merkez bölgesi (17 x 17 cm 2) olarak arena merkezini tanımlayın. manuel veya görüntü tabanlı otomatik analiz yazılımı tarafından merkez bölgede harcanan katedilen mesafeyi, merkez bölge girişleri ve zamanı ölçmek. mermer gömme testi için 10 dakika boyunca sıkıştırılmış 5cm derin, temiz, Aspen çam yatak ile bir test kafesine fare gelmesini. onun homecage fare dönün. Yavaşça 4 x 5 düzenlemenin moda 20 lacivert 1.5 cm çapında cam bilye yerleştirin. 10 dakika boyunca mermerler test kafesine geri fare yerleştirin. 10 dk test süresi gömüldü mermerler sayın.

11. MIA Yetişkin çocuklarında Serebellar nöropatoloji (İsteğe bağlı) inceleyin:

  1. anestezi ile tuzlu ve MIA yetişkin döl euthanize. kalp-damar sistemi boyunca 50 mi, PBS ile fare ve daha sonra 50 mi% 4 paraformaldehid serpmek.
  2. dikkatle beyin çıkarın ve 4 ° C'de gece boyunca 4% paraformaldehid beyin postfix ° C. PBS ile üç kez beyin durulayın ve kullanılana kadar 4 ° C'de buzdolabında% 0.02 sodyum azid içeren PBS beyin saklayın.
    NOT: sabitlendi beyin% 0.02 çim ile PBS içinde saklanabilirBir ay kadar buzdolabında yum azid.
  3. Bölüm 50 mikron ince dilimler halinde beyin sagittally vibratome kullanarak. yumuşak bir fırça kalem kullanarak beyin bölümleri toplayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için% 0.6 hidrojen peroksit bölümleri inkübe edilerek bir endojen peroksidaz etkinliğini iptal eder.
  4. gece boyunca oda sıcaklığında bloke edici tampon (PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 0.02 sodyum azid ile% 10 keçi serumu) içinde seyreltilmiş anti-kalbindin antikoru bölümleri inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında 2 saat süre ile blokaj tamponu içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor tekabül eden bölümleri inkübe edin.
  5. Avidin DH bölümleri inkübe - Biyotinile peroksidaz lH kompleksi tamponu, oda sıcaklığında 1 saat süre ile biyotin tespit etmek. antijeni görselleştirmek için peroksidaz substrat kullanılarak bölümleri geliştirin. adımlar arasında PBS ile üç kez bölümleri yıkayın. mikroskop lamı üzerine bölümleri monte edin. Resim mikroskop altında kesitler.

    6. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

/ Kg poli 20 mg Enjeksiyon: E12.5 (C) anne-plasental-fetal ekseninde bir akut enflamatuar yanıtı uyandırmak ve beyin gelişimi ve davranış fenotipleri 12,13 bir kronik etkisi hızlandırabilir olabilir. proinflamatuvar sitokin yüksek seviyeleri, İnterlökin (IL) -6, MIA sonrası akut inflamatuar yanıtın güvenilir bir göstergesidir. Enjeksiyon 12,13: Il6 gen plasenta ifade ve fetal beyin için zirve zamanı 3 saat sonrası poli (C I) yer almaktadır. Biz poli göstermiştir (I: C) Anne dalak-plasenta-fetal beyin genelinde yüksek Il6 gen ifadesi (Şekil 5) neden olur (Wu uyarlanan veriler ve diğerleri, 2015). 13. Araştırmacılar vb gibi MIA sonrası akut inflamatuar yanıtı, anne diyetler, genetik mutasyona uğramış fareler, anti-inflamatuar ilaçlar, değiştirebilecek etkenlerin incelenmesi, diğer tedavi ile bu paradigmayı birleştirebilirsiniz.

"Fo: keep-together.within sayfa =" KBB Öte yandan 1 ">, davranış değişiklikleri MIA modelinin işaretlerinden da birçok davranış testleri, farklı otistik ve şizofrenik gibi göstermek için MIA yetişkin yavru üzerinde yapılabilir. tuzlu yavrular göre davranışlar. Genellikle, MIA yavrular açık alan testi harcanan az merkez bölge girişlerini ve kısa merkez bölge süresini gösterir. Onlar da (Veri adapte testi ve alt ÜFE (Şekil 6) gömme mermer daha sık gömme davranışlar sergileyebilirler Wu ve diğ., beyincik lobule VII Purkinje hücrelerinin 2015) 13. Zarar (MIA yavru başka özelliğidir Shi ve ark., 2009). kalbindin antikoru ile boyanmış zaman beyincik az kalbindin-pozitif Purkinje hücreleri vardır tuzlu kontrol döl (Şekil 7) ile karşılaştırıldığında MIA yavrunun lobülü VII.

3643 / 53643fig1.jpg "/>
Şekil 1. gebe farelerin işareti. Orta gebelik fare kendi karın bölgesinde (Ok) şişkinliği ile tespit edilebilir. Doğuştan C57BL / 6 fare suşu burada örnek olarak kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
(E) embriyonik 0,5-12,5 gün hamile C57BL / 6N farelerde Şekil 2. Vücut ağırlığı değişir. E0.5 mevcut vajinal fişleri ile gebe ve gebe olmayan fareler karşılaştırıldığında, Vücut ağırlığının (A) vücut ağırlığı ve (B) yüzde hamile farelerde E10.5 dramatik bir artış geçirmektedir. Hamile n = 10, Sigara gebe n = 5. Veri Ortalama ± SE olarak sunulmuştur. *** P <0.001, ****p <0.0001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. poli absorbans ölçümü (I: C).. Solüsyon 260/280 oranı 1.54-1.82 arasında olduğundan emin olun , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Poli (I: C), embriyonik (E) enjeksiyon 12.5 gün ense gebe fare hafifçe.. Enjeksiyon bölgesi üst meme orta noktasında yer almaktadır. , Iğne enjekte fare yaklaşık 20 ° açıyla yukarı eğim. inbred C57BL / 6 fare suşu burada örnek olarak kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Poli (I: C). Enjeksiyonu Veri Ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır barajın dalak-plasenta-fetal beyin ekseninde Il6 gen ifadesini artırır. * P <0.05, ** p <0.01 (veri Wu ve diğ., 2015 ve 13. Maddenin için modifiye aslen). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. & #160;. MIA yetişkin yavrular otizm ve şizofreni endofenotiplerinden ile ilişkili davranışsal anormallikler sergileyen açık alan testinde, MIA yavrular (A) merkez bölgede daha az zaman harcamak merkez daha az sıklıkla bölge ve (B) girin. Mermer gömme testinde (C), MIA yavrular tuzlu kontrol yavru daha fazla mermer gömmek. MIA yavrular (D) prepulse 5 dB prepulse inhibisyonu (ÜFE) açığı ve (E) prepulse 15 dB sergilerler. Ortalama ± SEM. * P <0.05, ** p <0.01 (veri aslında Wu ve diğ., 2015 ve 13. Maddenin değiştirilmiş olan). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7. MIA yetişkin yavrular VII MIA yetişkin yavru gösterilmiştir lobule Purkinje hücrelerinin otizm. Kaybı endofenotiplerinden ile ilgili nöropatolojik anormallikler gösterirler. Ok: Calbindin + Purkinje hücreleri. ML: Moleküler tabaka, GCL: granül hücre tabakası, PCL:. Purkinje hücre tabakası bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

farklı zaman camlara MIA indüksiyon kemirgenlerde farklı beyin geliştirme etkinlikleri bozan ve dolayısıyla yavrularda farklı davranış anormallikleri ve nöropatolijilerin yol açar. E12.5 enjeksiyon: Burada, poli (Cı I) farelerde MIA uyarılması için bir protokol tarif. MIA indüksiyon Bu yöntem davranışsal, nörolojik, immünolojik ve yavrularda 8,10,11,16 yılında otizm ve şizofreni ile ilişkili gastrointestinal anormallikler yol açar. MIA bir çevresel risk faktörü olduğu için, dikkat etmek önemlidir, yavru fenotip nörogelişimsel bozuklukların genetik modellerinden farelerin daha yüksek varyasyon olması bekleniyor. Böylece, doğru ve tutarlı MIA ile otizm ve şizofreni ile ilgili fenotipleri oluşturmak için, sonuçların yanıltabilecek ek değişkenler en aza indirmek için özellikle önemlidir.

protokol açıklanan zaman çizelgesi yakın takip edilmelidirly. Doğru enjeksiyon zaman penceresi MIA istenilen aşamada yavru beyin gelişimini bozan sağlayacak. Fare E12.5 MIA indüksiyon, insan gebelik 21 ilk trimester sonuna tedirginlikler karşılık - önemli beyin gelişimi kortikal tabakasında Purkinje hücreleri ve kaudat putamen geliştirilmesi ve nöron içeren, meydana geldiği bir döneme. Daha fazla araştırma MIA beyincik Purkinje hücrelerinin kaybı ve beyin gelişiminin erken pertürbasyon arasındaki ilişkiyi kanıtlamak için gerekli olacaktır.

tutarlı tedavi, muayene ve barajların bile hayvancılık yavrular fenotip maternal stresin etkilerini minimize edecek olsa da, bizim protokol hala araştırmacılar farkında olmalıdır uyarılar içermektedir. (C: I) ve gebelik geri kalanı boyunca, örneğin biz poli enjeksiyonundan önceki gün evi barajların bekar. Stratejimiz bir undisturbe hamile fareler bırakmaktırd ortam. Ancak, bu eylem anne ortamda stres tepkisine neden olabilir. Bu izolasyon kaynaklı stres yanıtı yavru gelişimi ile müdahale olup olmadığını bilmiyorum rağmen, MIA etkisi bizim prosedürü izleyerek görülebilir.

Buna ek olarak, farelerin zorlanma ve genetik arka plan seçilmiş ve MIA indüksiyon için dikkatli bir şekilde test edilmesi gerekmektedir. Şimdiye kadar, MIA etkisi çoğunlukla yabani tip C57BL / 6N fareler 8,10,13,16 yılında çoğaltılır. Diğerleri de BTBR fare suşu 19 MIA etkisi gözlemledik. Döl ek karıştırıcı etkilerini ortaya çıkarabilir genetik olarak farelerde 13,22-24, farklı bağışıklık yanıtlarına, ortaya olabilir: (Cı I) 'in O poli gösterilmiştir.

Biyolojik kopya sayısı açısından, gen ekspresyonu, protein ya da immüno üzere, grup başına, davranışsal ve fizyolojik deneyler için grup başına en az 6 ibrelerin 3 ibrelerin kullanımıhistokimya yaklaşımları. Bunun yerine, deneysel yanlılığı önlemek için çöp içinde bir veya iki yavru kullanarak bir çöp içindeki tüm yavrular test edin. Biz de bir çöp içindeki tüm yavruları için verilerin ortalamasını ve bir veri noktası (örneğin n = litre sayısı o) önlemek için uygunsuz istatistikler 13 olarak o ortalamayı kullanın. Belirgin bir farkın ortadan MIA modeli 13 gözlenmiştir, çünkü her bir cinsiyet verileri de bir araya getirilmiştir.

çöp büyüklüğüne göre MIA yavru ölçme arkasındaki mantığı anne hemşirelik ve bakım kaynaklanan varyasyonu en aza indirmektir. Çöp boyutu fareler 25/6 C57BL stereotipik davranışları ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Biz bu anne hemşirelik ve bakım sırasında kaynakların atama nedeniyle olabilir spekülasyon. Bu karıştırıcı etkiyi önlemek için, standart istenen çöp boyutu C57BL / 6 fareler için 6-10 olduğunu.

yakından protokol bile, deneyci tr olabilirEnjeksiyon: poli (C I) sonra hamile farelerde aşırı zayıf ya da aşırı güçlü bir bağışıklık yanıtı karşı. Bunu önlemek için, poli farklı partileri (C I) 'pirojenik ve cytokinogenic aktivitesi doğrulamak için gereklidir. Farklı gruplar ve poli çok: farelerde inflamatuvar yanıt farklı düzeylerde yol açabilir aynı şirketten (C); çarpıcı poli özdeş dozlarını enjekte: Farklı gruplar arasında (C), plazma içerisine 10 kat farklı IL-6 seviyeleri 26 ile sonuçlanabilir. dozaj ve poli toplu Belirlenmesi: Gebe olmayan kadın, IL-6 ölçüm okuma daha da MIA deney için (C) MIA indüksiyon itibaren yürürlüğe değişimini azaltmaya yardımcı olabilir.

Bu poli spesifik partileri için dozaj değiştirmek için gerekli ise, enjeksiyon için solüsyon enjekte edilen hacim gramı başına yaklaşık 5 ul kalacak şekilde (I: C), (Cı), poli konsantrasyonunu değiştirmek için de önemlidir fare ağırlık. Örneğin, Manuf göreacturer prosedürü, poli (I: C) sözde fizyolojik fosfat tamponlu çözelti içinde bir polinükleotid elde etmek için, su 10 mg / ml'lik ° 'de yeniden oluşturulur. Bizim 40 mg / ml solüsyon ile karşılaştırıldığında, daha düşük bir konsantrasyon 4 kat enjeksiyon hacmi artacaktır. Hamile farelere için, tampon enjeksiyon büyük hacimli potansiyel yavrular karıştırıcı etkisi, embriyoların üzerindeki baskıyı artırmak ve istenmeyen tanıtmak olabilir. Enjeksiyon hacmi azaltmak için daha yüksek bir son konsantrasyona sahip% 0.09 sodyum klorür (Cı) Toz Bu nedenle, poli eritmek için seçin.

önce araştırma beyin gelişimi ve davranışları üzerindeki MIA etkilerine aracılık kritik bir faktör olarak, IL-6 sinyalizasyon tespit etti, çünkü, IL-6, akut inflamatuvar yanıt belirteç olarak seçilir. Poli aşağıdakı (I: C) tedavisi, IL-6, anne kanı ve plasenta 10,12 en upregüle sitokindir. Daha da önemlisi, Smith ve diğ. birkaçının gösterdiÇok regüle sitokinler, sadece IL-6 MIA ilişkili beyin ve davranış anormallikleri indüksiyonu için hem gerekliliğini ve yeterliliğini sergiledi. Nötralize diğer sitokinler 10 vermedi ederken, etkin bir MIA yavrularda anormal davranış ve transkriptomik anormallikleri önleyebilir anti-IL-6 anne enjeksiyonu olduğunu. Ayrıca, rekombinant IL-6 tek başına (poli olmadan (I: C)) maternal enjeksiyonu MIA fetal beyin ve yavrularda 12,15 görülen MIA ilişkili transkripsiyonel ve davranışsal anormallikler üretir.

MIA indükleme diğer yöntemlere göre (örneğin, lipopolisakarit (LPS) ya da influenza), poli (I: C) nispeten güvenli ve bağışıklık yanıtının yoğunluğunu kontrol etmek için kolay bir yol sunar. anne poli (I: C) tarafından ortaya çıkarılan inflamatuar yanıt rağmen yönetim akut ve geçicidir, yavru davranışları ve beyin gelişimi üzerindeki etkisi büyüktür. Genel olarak, MIA t indükleme tekniği kezhrough poli (I: C) E12.5 enjeksiyon hakim olduğu, bir sonra yavrular bu çevresel risk faktörünün etkisini incelemek üzere farklı davranışsal ve biyolojik testleri gerçekleştirmek için devam edebilirsiniz. Aynı zamanda, bir de öncesinde, sırasında genetik modifikasyon ya da diğer tedavilerle kombine yöntemi olabilir, ya da hamilelik sonrası nedenleri ve otizm ve şizofreni mümkün tedavi yaklaşımlarının araştırmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz MIA modeli, otizm ve şizofreni araştırma ilerleme katkılarından dolayı merhum Dr. Paul H. Patterson onurlandırmak istiyorum. Biz bu protokole onun büyük destek Sarkis K. Mazmanian kabul; idari yardım için Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni ve Leslie A. Neumann; filme yardım için Ali Khoshnan ve Jan C. Ko; MIA indüksiyon onların tavsiye için Elaine Y. Hsiao ve Natalia Malkova; kendi uzman hayvancılık için Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, ve Natalie A. Verduzco. Bu eser (Paul H. Patterson NIH 5P50MH086383-04) NIH Conte Merkezi Ödülü ile desteklenmiştir; Otizm (Paul H. Patterson # 7670) konuşuyor; (Sarkis K. Mazmanian için # 322839), Simons Vakfı; NIH Eğitim Grant (K.-HC NIH / NRSA T32GM07616); (ZY için) Caltech Yaz Lisans Araştırma Bursu (SURF); Amgen Akademisyenler Caltech'te (ZY için) Programı; ve Doktora Sonrası Araştırma Bursu from Ulusal Bilim Konseyi, Tayvan (MGK 101-2917-I-564-039 W.-LW için).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt SIGMA P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP HOSPIRA NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" COVIDIEN 8881600145
50 ml conical screw cap tubes USA SCIENTIFIC 1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC 1000 Optional
Stereomicroscope Wild Heerbrugg M5A Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm Roboz RS-5045 Optional
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76104 Optional
TRIzol reagent Life Technologies 15596-026  Optional
RQ1 Rnase-free DNase Promega M610A Optional
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8891 Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX  Roche 4913922001 Optional
Real-time PCR ABI 7300 Optional
Primer: Il6 forward Life Technologies TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC Optional
Primer: Il6 Reverse Life Technologies TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC Optional
Primer: beta-actin forward Life Technologies AGAGGGAAATCGTGCGTGAC Optional
Primer: beta-actin Reverse Life Technologies CAATAGTGATGACCTGGCCGT Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate Life Technologies 4306737 Optionl
MicroAmp optical adhesive film  Life Technologies 4311971 Optionl
EthoVision Noldus EthoVision Optionl
SR-LAB apparatus (PPI) San Diego Instruments  SR-LAB Optionl
Marbles PENN-PLAX Blue gem stones marbles Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Life Technologies 21600-069 Optionl
Paraformaldehyde MACRON 2621-59 Optionl
Vibratome Leica VT1000 S Optionl
Sodium azide Sigma S2002 Optionl
Triton x-100 Sigma X100 Optionl
Hydrogen peroxide solution Sigma 18312 Optionl
Goat serum Vector Laboratories S-1000 Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody Abcam ab11426 Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody Vector Laboratories BA-1000 Optionl
VECTASTAIN ABC Kit Vector Laboratories PK-4000 Optionl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98 (2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380 (2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240 (2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363 (2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

Tags

İmmünoloji Sayı 109 Maternal enfeksiyon maternal immün aktivasyon (MIA) Poliinosinik: polisitidilik asit (Poli (I: C)) Embriyonik 12.5 gün (E12.5) İnterlökin-6 (IL-6) Anne-placental- fetal eksen Serebellar Purkinje hücreleri Beyin Otizm Şizofreni Davranışsal anormallikler
(C I) Viral Mimik Poli ile Orta gebelik Sahnesi&#39;nde Farelerde Anne Bağışıklık aktivasyonu indüksiyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L.… More

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C). J. Vis. Exp. (109), e53643, doi:10.3791/53643 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter