Introduction
O conceito de ativação imune materna (MIA) tem origem nos estudos epidemiológicos sobre a associação da infecção materna com autismo e esquizofrenia 1. Devido à ausência de agentes patogénicos virais detectáveis se replicar na placenta ou do cérebro fetal após a infecção viral materna 2,3, o efeito da infecção sobre a descendência é a hipótese de ser causadas pela activação do sistema imune materno, em vez do que os próprios agentes patogénicos .
Para elucidar a relação de causa e efeito entre MIA e distúrbios psiquiátricos, injecção de quimicamente sintetizados, viral mímico dupla polyinosinic ARN de cadeia: ácido polycytidylic (poli (I: C)) em roedores grávida tem sido amplamente utilizado como modelo animal para a MIA 4,5. Poli (I: C) é reconhecida pelo receptor? Toll-like 3 (TLR3), e a administração sistémica de poli (I: C) induz-viral como a resposta inflamatória aguda. Um dos mecanismos pelos quais a poli (I: C) PRoduces anomalias comportamentais e neuropatologias na prole é por causando um desequilíbrio de citocinas pró-inflamatórias e anti no eixo materno-placentária-fetal 6. Vários grupos adotaram o modelo MIA para compreender a etiologia dos transtornos psiquiátricos 7, e devido aos diversos interesses entre grupos de pesquisa, vários pontos de tempo de ativação imune têm sido utilizados para alcançar diferentes perturbações no desenvolvimento do cérebro e comportamentos 7.
O laboratório Paul H. Patterson no Califórnia Institute of Technology adota a estratégia de injecção de poli (I: C) em murganhos grávidas no dia embrionário 12,5 (E12.5), que demonstrou com sucesso que a MIA é capaz de induzir comportamental, neurológica, e alterações imunológicas na descendência que estão associados com a esquizofrenia e autismo 8-11. Nossas obras anteriores mostram que MIA prole apresentar anomalias comportamentais (por exemplo, impairmen sociaist, défice de comunicação, comportamentos repetitivos, comportamento de ansiedade-like, e latente déficit de inibição 8,10,12), imune desregulação e citocinas desequilíbrio 8,13,14, alteração da expressão do gene do cérebro fetal 15, perda de células de Purkinje no lóbulo VII do cerebelo 11, alteração de propriedades sinápticas no hipocampo 9, gene x interação ambiente 13, alteração da permeabilidade do intestino e intestino composição da microbiota 16. Além disso, as estratégias terapêuticas e profiláticas são também desenvolvido a partir deste sistema modelo 13,16,17. Ao induzir MIA em E12.5, outros mostraram que MIA produz ativação fetal microglial e alteração de desenvolvimento colinérgicos no cérebro anterior basal 18, cepa específica de interacção 19, anormalidades ultra-estruturais do cérebro sinaptossomais cerebral, mitocondriais respiratórias anormalidades cadeia hiperfunção, o downregulation das moléculas sinaptossomais cerebrais 17 ,comportamentos de tipo depressivo, déficit cognitivo e do hipocampo potenciação de longa duração (LTP) e déficit de neurogênese adulta 20.
Aqui, nós fornecemos um método detalhado de como induzir MIA em E12.5 por poli (I: C), bem como os paradigmas de como aplicar este modelo para estudar a etiologia da esquizofrenia e autismo. É importante notar que a MIA é um factor de risco para uma variedade de distúrbios 4, e os seus resultados são extremamente sensíveis ao tempo e método de indução, bem como a criação de barragens grávidas. Como tal, mesmo pequenas inconsistências entre laboratórios muitas vezes resultam em baixa reprodutibilidade e / ou diferentes fenótipos na descendência. Nosso método é projetado especificamente para os interessados em estudar MIA como um fator de risco ambiental para o autismo e esquizofrenia, e a descrição detalhada fornecida irá ajudar os pesquisadores a melhorar a reprodutibilidade dos seus dados.
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Protocol
Todos os protocolos foram realizados sob a aprovação do California Institute of Comité Cuidados e Uso de Animais Institucional Tecnologia (IACUC).
1. Preparação para Pairs cronometrado-acasalamento
- Use pelo menos 6 barragens para experimentos comportamentais e 3 para análise da expressão gênica.
NOTA: Use o dobro do número de ratos fêmeas estimados, já que apenas cerca de 50% dos ratos será conectado a partir da cronometrado-acasalamento. - Use ratos fêmea com nenhum gravidez antes e, 8-16 semanas de idade.
NOTA: os ratos fêmeas que tenham exposição sexual antes de camundongos machos, mas não foram grávida são aceitáveis. - Casa a ratos fêmea juntos e colocar as gaiolas ao lado do outro, a fim de sincronizar o ciclo estral. Use uma gaiola de ratos padrão com uma altura de mais de 5,5 polegadas e um piso interior 75 polegada quadrada para permitir habitação de 5 ratos adultos. Etiquetar cada rato fêmea utilizando um soco orelha.
2. Configurando cronometrado-mating Pair
- Configure o cronometrado-acasalamento 0-2 horas antes do ciclo escuro começa. Coloque dois ratos fêmeas em cada gaiola. Retire os ratos e pesá-los individualmente. Registe o peso do corpo de cada ratinho fêmea.
- Coloque um rato macho em cada gaiola com as duas fêmeas de camundongo. Use trio de acoplamento para minimizar o efeito paterno confundindo.
3. Vaginal bujão de verificação (E0.5)
- Verifique a fêmea ratos 0-4 horas após o ciclo escuro termina. Levante cuidadosamente o rato fêmea da base da cauda e permitir que o mouse para pegar a grade de arame, gaiola superior, ou a borda gaiola.
- Procurar sinais de plugue vaginal: plugue vaginal é uma massa esbranquiçada visível na abertura vaginal. Se a ficha não é óbvio, insira suavemente uma ponteira 200 mL na abertura vaginal. Resistência de coagulação confirma formação de um tampão vaginal. Verifique o plugue vaginal uma vez por dia.
NOTA: plugue Vaginal é apenas uma indicação de que a cópula ocorreu e, portanto, não ggravidez ARANTIA. rolhão vaginal podem ser difíceis de identificar, em determinadas estirpes de murganhos. Procure a ajuda de um cuidador ratos experiente para aumentar a precisão da identificação plugue. - Mova os ratos ligados a uma nova gaiola e grupo abrigá-los. Definir o dia da aparição plugue vaginal como embrionária 0,5 dia (E0.5).
4. Na E10.5-11.5, verificar se a gravidez
- Levante cuidadosamente a base da cauda e permitir que o mouse para pegar a grade de arame, gaiola superior, ou a borda gaiola. Observe a área do abdômen para verificar se há sinais de gravidez, por exemplo, uma protuberância no abdômen (Figura 1).
NOTA: O sinal de gravidez é sempre mais óbvio à E11.5 do que em E10.5. - Pesar os ratinhos para verificar a gravidez. O ratinho grávida geralmente pesa cerca de 20% mais pesados em E10.5 e 30% mais pesados em E12.5 em comparação com um ratinho não grávidas (Figura 2). Única casa os ratos grávidas em gaiolas limpas.
5. 20 mg /kg de poli (I: C) Preparação
- Use pelo menos 6 barragens por grupo para experimentos comportamentais e 3 por grupo para análise de expressão de genes. Prepara-se o valor correspondente de poli (I: C).
- Pesa-se o poli (I: C) de pó num tubo de 50 ml para fazer uma concentração final de 40 mg / ml. A fim de minimizar e padronizar o stress causado pelo volume de injecção, injectar 5 ul de poli (I: C) por cada grama de peso corporal do rato (5 mL / g, ou 5 ml / kg). Para induzir a MIA, que injectar 20 mg de poli (I: C) por kg.
NOTA: A concentração de poli (I: C) é necessária (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Uma vez que a poli (I: C) em pó contém 10% de poli (I: C), é necessário fazer uma concentração final de ml de poli (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / (I: C).
CUIDADO: O poli (I: C) em pó é muito leve. Tenha cuidado para não perder qualquer pó durante a transferência da espátula para o tubo cônico. - Adicionar o volume correspondente de cloreto de sódio a 0,9% (solução salina) para a banheira cónicae e fechar a tampa. Dissolve-se o pó por laminagem suavemente a gota de solução salina através da poli (I: C) de pó até a solução ficar clara. Centrifuga-se o tubo cónico a 800 xg durante 1 min (Figura 3C). Filtra-se o poli: solução por filtro de 0,22? M (I C). Transferir o poli: solução (I C) para um tubo de 1,5 ou 2 ml de microcentrífuga. Opcional: Use um espectrofotómetro para medir a razão entre o poli (I: C) 260/280 solução. Assegurar o rácio situa-se entre 1,54-1,82 (Figura 3) tal como descrito pelo fabricante. NOTA: A solução salina utilizada para dissolver o poli (I: C) em pó e servem como controlo de injecção deve ser de grau farmacêutico e estéril.
6. Saline ou poli (I: C) Injeção em E12.5
- Pesar o rato na escala e colocá-lo de volta para a jaula. Utilize a seguinte fórmula para calcular o volume de injecção tanto para solução salina e poli (I: C) ratos: o peso corporal (g) multiplicados por 5 = volume de injecção desejado (ul). Use um insul 0,3 mlem seringa para elaborar o volume calculado de solução salina ou 20 mg / kg de poli (I: C), por exemplo, 150 mL de um rato 30 g.
- Gentilmente pegar o mouse pela base da cauda e colocá-lo no topo da gaiola. Lidar com o mouse com cuidado para evitar efeitos de confusão induzida por stress. Inserir a agulha, bisel para cima, a aproximadamente 20 ° em relação ao rato para o centro dos seus dois bocais superiores (Figura 4), e injectar o (I: C) solução salina ou solução de poli. NOTA: A agulha deve ser substituída para cada rato após a injeção.
- Posicione o mouse de volta para sua gaiola. Coloque as gaiolas numa zona calma, de baixo sala de tráfego para evitar outros efeitos de confusão.
7. O Dia Depois de poli (I: C) Injeção (E13.5)
- Verificar os ratinhos injectados na manhã seguinte. Use uma escala para medir o peso corporal.
NOTA: poli (I: C) injectados murganhos grávidas geralmente ganhar menos peso do que os murganhos injectados solução salina no dia após a injexão. - Não perturbe os ratos até que a prole nascem.
8. Medidor de MIA Offspring
- A fim de minimizar os efeitos de indução de MIA, siga as diretrizes listadas abaixo para medir o uso de MIA prole.
- Excluir as ninhadas de prematuro ou nascimento atrasado, ou se o tamanho da leitegada é menor do que 5.
- Euthanize os filhotes excessivas de CO 2, se o tamanho da ninhada é maior do que 10.
9. Opcional: Examine a resposta inflamatória aguda Após MIA
- Sacrificar a grávida ratos 3 horas após soro fisiológico ou poli (I: C) injecção utilizando o método descrito no protocolo aprovado-comité cuidados com os animais da instituição.
NOTA: Deslocação cervical é muitas vezes preferido, uma vez que minimiza o efeito de CO drogas 2 / eutanásia sobre a barragem e do embrião. - Recolher o baço dos camundongos grávidas adultos e isolar a placenta e bra fetalno sob o microscópio estereoscópico.
- Para a coleta de baço, coloque o mouse sobre a placa de dissecação e pulverizar 70% de etanol na região abdominal dos ratos grávidas. Utilizar um par de tesouras estéreis para fazer um corte vertical, no centro da área abdominal abaixo da caixa torácica através da pele.
- O baço fica no quadrante abdominal superior, esquerda. Use uma pinça para isolar o baço. Rolar o baço em limpadores tarefa delicada para remover o tecido adiposo em torno do órgão. Recolher cerca de 50 mg de tecido do baço e colocá-los individualmente em tubos de Eppendorf com 500 RNA ul estabilizar tampão ou TRIzol para evitar a degradação do ácido nucleico. Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização congelador.
- Para a coleta de placenta, retire com cuidado os cornos uterinos do corpo. Coloque as trompas uterinas num prato de Petri cheio com solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS) e deixar o prato em gelo. Use duas pinças para rasgar a parede uterina e expor o saco amniótico.
- Cuidadosamente usar a pinça para abrir o saco amniótico, sem danificar a placenta e o feto. Separa-se a placenta do feto e cortar o cordão umbilical tão perto quanto possível da placenta. Remover o saco amniótico detritos a partir da placenta. Coloque a placenta individualmente em tubos de Eppendorf com 500 ul de ARN estabilizar tampão ou Trizol. Armazenar a amostra a -80 ° C até à sua utilização congelador.
- Para a coleta de cérebro fetal, armazenar o feto no RNA estabilizar tampão do passo 9.2.2 até dissecção. Amole fora da membrana pial do ventrículo do cérebro utilizando fórceps delicados # 5 sob o microscópio estereoscópico. Remova cuidadosamente toda a membrana do cérebro fetal. Coloque os cérebros fetais individualmente em tubos de Eppendorf com 500 RNA ul estabilizar tampão ou TRIzol. Armazenar a amostra a -80 ° C até à sua utilização congelador.
- Extrai-se a ARN a partir do tecido e converter o ARN em ADNc. Analisar a expressão de genes IL6 no cDNA por real-time PCR.
- Extrai-se a ARN dos tecidos, seguindo o protocolo de fabrico de TRIzol. Se os tecidos são armazenados no buffer de estabilização de ARN. Descongelar a amostra e girar o buffer. Transferir o tecido por ponta para outro eppendorf com 500 mL de TRIzol e continuar a extracção de ARN.
- Utilizar um espectrofotómetro para determinar a concentração de, 260/280 e 260/230 razão do ARN. Certifique-se os índices são acima de 2,0.
- Eliminar a contaminação de ADN do ARN por tratamento com ADNase I. mistura de 1 ug de ARN, 1 ul de tampão de reacção 10X, 1 ul de DNase isenta de RNase, e água isenta de nuclease para um volume final de 10 ul. Incubar a mistura principal a 37 ° C durante 30 min. Adicione 1 solução DNase parada ul para terminar a reacção. Incubar a mistura a 65 ° C durante 10 min.
- Reverter transcrever o RNA para cDNA. Usar 20 reacções ul, e até 1 ug de ARN total por reacção. Misture 4 l de 5x tampão de transcrição reversa (RT) mistura de reacção, 1 ul reverse transcriptase, 11 ul de molde de ARN após tratamento com ADNase I e 4 ul livre de nuclease H2O para fazer uma solução final de 20 ul. Programar as condições termociclador para RT. Uma condição genérica incluem: Passo 1: 25 ° C durante 5 min; Passo 2: 42 ° C durante 30 min; Passo 3: 85 ° C durante 5 min; Passo 4: manter a 4 ° C. Dilui-se o ADNc de 5 vezes. Para armazenagem a curto prazo, armazenar o ADNc a 4 ° C. Para armazenamento a longo prazo, congelar o cDNA a -20 ° C.
- Analisar a expressão do gene IL6 no cDNA por PCR em tempo real e normalizar a expressão do gene IL-6 para a p-actina a expressão do gene.
- Faça uma mistura mestre para IL6 e detecção de β-actina. Usar 25 ul de reacção, a mistura principal para cada gene inclui 12,5 uL da mistura de SYBR Verde, 0,5 ul de 10 mM iniciador directo, 0,5 ul de 10 pM e iniciador inverso 6,5 ul livre de nuclease H 2 O.
- Coloque 5 jul 5x diluída cDNA umt o fundo do poço da placa de reacção óptica de 96 poços. Pipetar 20 ul de mistura principal para cada poço, para fazer uma de 25 uL finais mistura de PCR. Triplicado, cada gene para cada amostra. Selar a placa usando película adesiva óptica. Girar a placa a 800 xg durante 3 min a 4 ° C, utilizar o programa standard de PCR em tempo real: Passo 1: 50 ° C durante 2 min; Passo 2: 95 ° C durante 10 min; Passo 3: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e a temperatura de 60 ° C durante 1 min. Adicionar uma etapa adicional para a curva de dissociação.
10. Examine as anormalidades comportamentais em Offspring MIA Adulto (opcional):
- Execute os testes de comportamento nas idades de 8-12 semanas. Mudar a cama gaiola de pelo menos 3 dias antes do teste. Aclimatar os ratos ao ambiente de teste comportamental, pelo menos, 30 min antes do teste.
- Para a inibição pré-pulso (PPI), restringir os ratos no cilindro de plexiglass com um sensor piezo-elétrico debaixo dela. Aclimatar os ratos ao PPIcâmara por 5 min. Expor os ratos com 6 ensaios de 120 dB de ruído branco (sobressalto).
- Em seguida, expor os ratos com misturas randomizados de 14 ensaios de ruído de fundo, 14 ensaios de sobressalto, 14 ensaios de pré-pulso 5 dB (5 dB maior do que o ruído de fundo) + Startle (PPI5), e 14 ensaios de pré-pulso de 15 dB (15 dB mais elevados do que o ruído de fundo + Startle (PPI15).
- Em média, a resposta de sobressalto para os primeiros 6 ensaios de 120 ensaios dB. Em média, a resposta de sobressalto para os outros estímulos individuais. Converter o valor para a inibição pré-pulso por (Startle - PPI5 ou PPI15) / Startle.
- Para o teste de campo aberto, coloque o mouse no canto de uma arena praça aberta (50 x 50 x 50 cm 3). Grave a trajetória do rato durante 10 min através de uma câmera montada no teto. Definir o centro de como a zona central (17 x 17 cm2) na arena. Quantificar a distância percorrida, entradas de fuso centro, eo tempo passado na zona centro manualmente ou por software de análise automática baseada em imagem. Para o teste de enterramento mármore, aclimatar o mouse para uma gaiola de teste com cinco centímetros de profundidade comprimido, roupas de cama de pinho, limpo Aspen para 10 min. Devolver o mouse para a sua homecage. Delicadamente, coloque 20 azul marinho 1,5 cm de diâmetro bolinhas de vidro na forma de 4 x 5 arranjo. Coloque o mouse de volta para a jaula de teste com berlindes para 10 min. Conte os mármores que tem sido enterrados no período de testes de 10 min.
11. Examine a neuropatologia cerebelar em Offspring MIA Adulto (opcional):
- Eutanásia do salina e MIA filhos adultos pelo anestésico. Perfundir o rato com 50 ml de PBS e, subsequentemente, 50 ml de 4% de paraformaldeído através do sistema cardiovascular.
- Remover cuidadosamente o cérebro e pós- fixarem o cérebro em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. Lavar o cérebro com PBS três vezes, e armazenar o cérebro em PBS com 0,02% de azida de sódio num frigorífico a 4 ° C até à sua utilização.
NOTA: O cérebro fixadas posteriormente pode ser armazenado em PBS com 0,02% de SODazida ium na geladeira por até um mês. - Seção do cérebro em 50 mm fatias finas sagital utilizando vibratome. Recolher as seções do cérebro usando um pincel macio. Terminar a actividade da peroxidase endógena por incubação das secções em peróxido de hidrogénio a 0,6% durante 30 min à temperatura ambiente.
- Incubam-se as secções em anticorpo anti-calbindina diluído no tampão de bloqueio (soro de cabra a 10% com 0,1% de Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio em PBS) durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, incubar as secções na correspondente anticorpo secundário biotinilado diluído em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Incubam-se as secções em DH avidina - peroxidase de tampão H complexo biotinilado para detectar a biotina, durante 1 h à temperatura ambiente. Desenvolver as secções utilizando o substrato de peroxidase para visualizar o antigénio. Lavam-se as secções com PBS três vezes entre os passos. Montar as secções em lâminas de microscópio. Imagem as seções sob o microscópio.
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Representative Results
A injecção de 20 mg / kg de poli (I: C) em E12.5 pode evocar uma resposta inflamatória aguda no eixo materno-fetal e placentário-precipitar um efeito crónico para o desenvolvimento do cérebro e fenótipos comportamentais 12,13. Os níveis elevados de uma citocina pró-inflamatória, interleucina (IL) -6, é um indicador fiável da resposta inflamatória aguda após MIA. O tempo de pico para a expressão do gene IL6 na placenta e no cérebro fetal é de 3 horas pós-poli (I: C) 12,13 injecção. Mostrámos que a poli (I: C) induz a expressão do gene mais elevada em toda a IL6 baço cérebro-placenta maternal e fetal (Figura 5) (dados adaptados de Wu et al, 2015). 13. Pesquisadores poderia combinar esse paradigma com outro tratamento para estudar os fatores que podem alterar a resposta inflamatória aguda após MIA, por exemplo, dietas maternas, ratos mutantes genéticos, anti-inflamatórios, etc.
ent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Por outro lado, as mudanças comportamentais também são características do modelo MIA Vários testes comportamentais podem ser realizadas na prole adulta MIA para demonstrar diferente autista e esquizofrênico-like. comportamentos. Geralmente, quando comparado à prole salina, MIA prole exibir menos entradas de zona centro e menor duração zona central passou em teste de campo aberto. Eles também apresentam comportamentos Burying mais frequentes em mármore enterrando teste e menor PPI (Figura 6) (Data adaptada de Wu et al., 2015) 13. a perda de células de Purkinje no cerebelo lóbulo VII é outra marca de MIA prole (Shi et al., 2009). Quando coradas com anticorpo calbindina, há menos células de Purkinje calbindina positivo no cerebelo lóbulo VII da prole MIA em comparação com o controlo de solução salina descendentes (Figura 7).3643 / 53643fig1.jpg "/>
Figura 1. O sinal de ratas grávidas. Rato metade da gestação pode ser identificado por a protuberância na sua área abdómen (Seta). Congênito estirpe C57BL / 6 mouse é usado aqui como um exemplo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. mudanças de peso corporal dos camundongos C57BL / 6N grávidas de embrionárias (E) 0.5-12.5 dias. Ao comparar os ratos grávidas e não grávidas com tampões vaginais presentes em E0.5, o (A) peso corporal e (B) porcentagem do peso corporal sofre um aumento dramático na E10.5 em camundongos grávidas. Grávida n = 10, não-grávida n = 5. Os dados estão apresentados como média ± SE. *** P <0,001, ****p <0,0001. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Medição de absorção dos poli (I: C).. Solução Verifique se o rácio 260/280 é entre 1,54-1,82 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. O poli (I: C) injecção na embrionário (E) 12,5 dias Scruff o mouse grávida suavemente.. O local de injecção situa-se no ponto médio dos bocais superiores. Injectar a agulha, bisel para cima, a aproximadamente 20 ° em relação ao ângulo de rato. Congênito C57BL / 6 mouse estirpe é usado aqui como um exemplo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. poli (I: C) de injecção aumenta a expressão do gene IL-6 no eixo cérebro-baço da placenta fetal da barragem dados são apresentados como média ± SEM.. * P <0,05, ** p <0,01 (Os dados são originalmente de Wu et al., 2015 e modificada para o artigo 13). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. & #160;. MIA filhos adultos apresentam alterações comportamentais associadas com os endofenótipos de autismo e esquizofrenia No teste de campo aberto, MIA prole (A) entrar na zona central com menos frequência e (B) gastam menos tempo na zona centro. (C) No teste de enterramento mármore, MIA prole enterrar mais bolas do que descendentes de controle salina. MIA prole exibem inibição de pré-pulso défice (PPI) em (D) de pré-pulso de 5 dB e (E) de pré-pulso de 15 dB. A média ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 (Os dados são originalmente de Wu et al., 2015 e modificada para o artigo 13). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. MIA filhos adultos apresentam alterações neuropatológicas associadas aos endofenótipos de autismo. A perda de células de Purkinje no lóbulo VII tem sido demonstrado em MIA filhos adultos. Arrow: células de Purkinje Calbindina +. ML: camada molecular, GCL: camada de células granulares, PCL:. Camada de células de Purkinje Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
indução MIA em diferentes janelas de tempo perturba diferentes eventos de desenvolvimento cerebral em roedores e, consequentemente, leva a anomalias comportamentais diferentes e neuropatologias na prole. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir MIA em camundongos com poli (I: C) injecção a E12.5. Este método de indução MIA leva a comportamental, neurológica, imunológico, e anomalias gastrointestinais associados com o autismo e esquizofrenia na prole 8,10,11,16. É importante notar que, porque MIA é um factor de risco ambiental, é esperado que o fenótipo da prole ter variação maior do que o de ratos a partir de modelos genéticos de desordens do neurodesenvolvimento. Assim, para gerar precisão e consistência do autismo e fenótipos relacionados com a esquizofrenia através de MIA, que é especialmente importante para minimizar as variáveis adicionais que podem confundir os resultados.
O cronograma descrito no protocolo deve ser seguido pertoly. janela de tempo de injeção correto seria garantir que MIA perturba o desenvolvimento da prole cérebro na fase desejada. Indução de MIA em E12.5 em rato corresponde a perturbações perto do fim do primeiro trimestre de gestação humana 21 - um período durante o qual ocorre desenvolvimento significativo do cérebro, incluindo o desenvolvimento de células de Purkinje e putâmen caudado, e neurogénese na camada cortical. Outras investigações serão necessárias para comprovar a associação entre a perda de células de Purkinje no cerebelo e MIA a perturbação no início do desenvolvimento do cérebro.
Embora o tratamento consistente, exame, e até mesmo criação das barragens iria minimizar o efeito do estresse materno sobre o fenótipo prole, nosso protocolo ainda contém advertências que os investigadores devem estar cientes. Por exemplo, as barragens única casa no dia anterior à injecção de poli (I: C) e em todo o restante da gravidez. A nossa estratégia é deixar as ratas grávidas em um undisturbeambiente d. No entanto, essa ação pode induzir a resposta ao estresse no ambiente materno. Embora não sabemos se esta resposta ao estresse induzido pelo isolamento interfere com o desenvolvimento da prole, o efeito MIA pode ser observada, seguindo o nosso procedimento.
Além disso, a estirpe genética e fundo dos ratinhos tem de ser cuidadosamente escolhido e testado para a indução de MIA. Até agora, o efeito de MIA está na maior parte em replicado de tipo selvagem C57BL / 6N ratinhos 8,10,13,16. Outros têm também observou o efeito MIA em BTBR estirpe de ratinhos 19. Demonstrou-se que a poli (I: C) poderia induzir diferentes respostas imunitárias em ratinhos geneticamente modificados 13,22-24, que pode introduzir efeitos de confusão adicionais à prole.
Em termos do número de repetições biológicas, usamos pelo menos 6 ninhadas por grupo para ensaios comportamentais ou fisiológicos e 3 ninhadas por grupo para a expressão do gene, proteína, ou imunoabordagens histoquímica. Testamos todos os descendentes dentro de uma ninhada em vez de usar um ou dois filhos dentro de uma maca para evitar viés experimental. Nós também, em média, os dados para todos os descendentes dentro de uma ninhada, e usar essa média como um ponto de dados (tais que n = o número de ninhadas) para evitar inadequadas estatísticas 13. Os dados de cada gênero também são reunidas porque nenhuma diferença entre os sexos óbvia foi observado no modelo MIA 13.
A lógica por trás aferição MIA prole pelo tamanho da ninhada é minimizar a variação causada pelo aleitamento materno e carinho. O tamanho da maca foi mostrado para correlacionar com comportamentos estereotipados em ratinhos C57BL / 6 25. Especula-se que isto pode ser devido à atribuição de recursos durante a amamentação materna e carinho. Para evitar este efeito de confusão, o nosso padrão tamanho da ninhada desejado é 6-10 de camundongos C57BL / 6.
Mesmo quando seguindo o protocolo de perto, o experimentador pode encontrariar uma resposta imune excessivamente fraca ou excessivamente potente em ratos grávidas depois de poli (I: C) injecção. Para evitar isso, é essencial para validar a actividade pirogénica e cytokinogenic de lotes diferentes de poli (I: C). Diferentes lotes e lotes de poli (I: C) da mesma empresa poderia conduzir a diferentes níveis de resposta inflamatória em ratinhos; Surpreendentemente, a injecção de doses idênticas de poli (I: C) a partir de diferentes lotes pode resultar em até 10 diferenças de dobragem no plasma IL-6 26. Determinar a dosagem e lote de poli (I: C) para obter mais experiência MIA pela leitura da mulher não-grávida de medição IL-6 pode ajudar a reduzir a variação do efeito da indução de MIA.
Se for necessário para modificar a dosagem para lotes específicos de poli (I: C), é também importante para modificar a concentração da poli (I: C) solução para injecção de tal modo que o volume injectado permanece aproximadamente 5 mL por grama de peso mouse. Por exemplo, de acordo com a manufprocedimento de acturer, poli (I: C) é supostamente reconstituído em ~ 10 mg / ml de água para se obter um polinucleótido em solução fisiológica tamponada com fosfato. Em comparação com a solução de 40 mg / ml, a concentração mais baixa iria aumentar o volume de injecção de 4 dobras. Para ratas grávidas, um grande volume de injeção de tampão poderia potencialmente aumentar a pressão sobre os embriões e introduzir indesejada, efeitos para a prole de confusão. Portanto, podemos escolher a dissolver-se poli (I: C) de pó de cloreto de sódio a 0,09% com uma concentração final elevada de modo a reduzir o volume de injecção.
IL-6 é escolhido para ser o marcador de resposta inflamatória aguda, porque pesquisas anteriores identificou IL-6 de sinalização como um fator crítico na mediação dos efeitos de MIA no desenvolvimento do cérebro e comportamento. Seguindo poli (I: C) de tratamento, a IL-6 é a citoquina mais regulada positivamente no sangue materno e da placenta 10,12. Mais importante ainda, Smith et ai. demonstrado que vários decitocinas altamente regulados positivamente, somente a IL-6 exibiram ambas condições necessárias e suficientes para a indução do cérebro MIA-associado e alterações comportamentais. Isto é, injecção materna de anticorpos anti-IL-6 pode prevenir eficazmente a anomalias comportamentais e transcriptomic anormais em MIA descendentes, enquanto outras citocinas neutralizantes não 10. Além disso, a injeção materna de IL-6 recombinante sozinho (sem poli (I: C)) reproduz transcricional MIA-associado e alterações de comportamento visto no cérebro fetal MIA e descendentes 12,15.
Em comparação com outros métodos para induzir MIA (por exemplo, lipopolissacárido (LPS) ou influenza), poli (I: C) é relativamente segura e proporciona uma maneira fácil de controlar a intensidade da resposta imune. Embora a resposta inflamatória induzida por poli materna (I: C) é a administração aguda e transiente, o seu efeito sobre os comportamentos prole e desenvolvimento do cérebro é profunda. Em geral, uma vez que a técnica de induzir MIA tpoli hrough (I: C) injecção na E12.5 é dominado, pode-se então proceder para executar diferentes ensaios comportamentais e biológicos para examinar o efeito deste fator de risco ambiental sobre a prole. Ao mesmo tempo, pode-se também combinar com o método de modificações genéticas ou outros tratamentos antes, durante, ou após a gravidez para investigar as causas e possíveis abordagens terapêuticas para o autismo e esquizofrenia.
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Acknowledgments
Nós gostaríamos de homenagear o falecido Dr. Paul H. Patterson por suas contribuições para o progresso do modelo MIA, autismo e pesquisa da esquizofrenia. Nós reconhecemos Sarkis K. Mazmanian por seu grande apoio a este protocolo; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni, e Leslie A. Neumann de assistência administrativa; Ali Khoshnan e Jan C. Ko para a assistência sobre as filmagens; Elaine Y. Hsiao e Natalia Malkova para os seus conselhos na indução MIA; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, e Natalie A. Verduzco para a sua criação de animais especialista. Este trabalho foi financiado pelo NIH Award Conte Center (NIH 5P50MH086383-04, de Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, a Paul H. Patterson); Fundação Simons (# 322839, com Sarkis K. Mazmanian); NIH Training Grant (NIH / NRSA T32GM07616 de K.-HC); Caltech Verão Graduação Research Fellowship (SURF) (para ZY); Amgen Scholars Programa no Caltech (para ZY); e pós-doutorado frConselho om National Science, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, para W.-LW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% sodium chloride INJ. USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml conical screw cap tubes | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | 1000 | Optional |
| Stereomicroscope | Wild Heerbrugg | M5A | Optional |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm | Roboz | RS-5045 | Optional |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | Optional |
| TRIzol reagent | Life Technologies | 15596-026 | Optional |
| RQ1 Rnase-free DNase | Promega | M610A | Optional |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | Optional |
| FastStart universal SYBR green master mix with ROX | Roche | 4913922001 | Optional |
| Real-time PCR | ABI | 7300 | Optional |
| Primer: Il6 forward | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | Optional |
| Primer: Il6 Reverse | Life Technologies | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | Optional |
| Primer: beta-actin forward | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | Optional |
| Primer: beta-actin Reverse | Life Technologies | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | Optional |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | Life Technologies | 4306737 | Optionl |
| MicroAmp optical adhesive film | Life Technologies | 4311971 | Optionl |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | Optionl |
| SR-LAB apparatus (PPI) | San Diego Instruments | SR-LAB | Optionl |
| Marbles | PENN-PLAX | Blue gem stones marbles | Optionl |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21600-069 | Optionl |
| Paraformaldehyde | MACRON | 2621-59 | Optionl |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Optionl |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Optionl |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Optionl |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | 18312 | Optionl |
| Goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | Optionl |
| Rabbit anti-calbindin antibody | Abcam | ab11426 | Optionl |
| Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Optionl |
| VECTASTAIN ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | Optionl |
