Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

Published: July 10, 2016 doi: 10.3791/54283
Automatic Translation
1, 1,2
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

Summary

Dette håndskrift beskriver en blød litografi-baseret teknik til at konstruere ensartede arrays af tredimensionale (3D) epitelvæv med defineret geometri omgivet af ekstracellulær matrix. Denne metode kan underkastes en lang række celletyper og eksperimentelle sammenhænge og giver mulighed for high-throughput screening af identiske gentagelser.

Introduction

Udviklingen af ​​forgrenede epitelvæv, kendt som forgrening morfogenese, reguleres af celleafledte, fysiske og miljømæssige faktorer. I mælkekirtlen, forgrening morfogenese er en iterativ proces, hvorigennem styret kollektiv cellemigrering skaber en trælignende arkitektur. Det første skridt er primære knop dannelse fra mælkekanalerne, efterfulgt af gren initiering og forlængelse 1,2. Invasion af grene i det omgivende stroma induceres af den systemiske afgivelse af steroidhormoner ved puberteten. Nye primære knopper derefter starter fra enderne af eksisterende filialer, og denne proces fortsætter med at skabe en epitelial træ 3. Selv om der er identificeret mange vigtige biokemiske signaler, en omfattende forståelse af cellens biologiske mekanismer, der styrer denne komplekse udviklingsproces øjeblikket mangler. Desuden mekanistiske undersøgelser af påvirkninger af specifikke signaler er vanskelige at dekonstruere fra erfamenter in vivo, så præcise spatiotemporale forstyrrelser og målinger er ofte ikke muligt.

Tre-dimensionelle (3D) kultur teknikker, såsom hele orgel kultur, primære organoids, og cellekultur modeller, er nyttige værktøjer til systematisk at undersøge mekanismerne bag vævsmorfogenese 4-6. Disse kan være særligt nyttige til bestemmelse af påvirkninger af specifikke faktorer enkeltvis, såsom mekaniske kræfter og biokemiske signaler, på en række celle- adfærd, herunder migration, proliferation og differentiering. 6 Engineered cellekulturmodeller, navnlig let aktivere den forstyrrelse af individuelle celler og deres mikromiljø.

Én sådan kultur model bruger en mikrofabrikation tilgang til ingeniør model brystepitelceller væv med kontrolleret 3D-struktur, der konsekvent og reproducerbart danner grene, der vandrer kollektivt ved induktion med enppropriate vækstfaktorer. Den største fordel ved modellen er evnen til præcist at manipulere og måle effekterne af fysiske og biokemiske faktorer, såsom mønstre af mekanisk belastning, med høj statistisk konfidens. Denne teknik, sammen med datamodellering, er allerede blevet anvendt til at bestemme de relative bidrag fra fysiske og biokemiske signaler i vejledning af den normale udvikling af brystepitelceller væv og andre forgrenede epitel 7-11. Præsenteret her er en detaljeret protokol til opbygning disse model væv, som let kan udvides til andre typer af celler og ekstracellulær matrix (ECM) geler, og som tjener som et potentielt værktøj til test af terapeutiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af opløsninger

  1. Til fremstilling af en 5 mg / ml opløsning af insulin, fortyndes den pulveriserede insulin lager med 5 mM saltsyre (HCI) i dH2O (500 mg insulin i 100 ml opløsningsmiddel). Fremstilling af 100 ml opløsningsmiddel ved tilsætning af 50 pi koncentreret HCI til 100 ml destilleret vand (dH 2 O).
  2. For at gøre en 1x opløsning af PBS, fortyndes 10x phosphatbufret saltvand (PBS) stamopløsning til 1x med dH2O under sterile betingelser.
  3. Forbered polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer opløsning som følger: Bland PDMS præpolymer sammen med hærdningsmidlet i en 10: 1 (vægt: vægt) forhold.
  4. Forbered celledyrkningsmediet som følger: til 500 ml lager Dulbeccos modificerede Eagle-medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12), der tilsættes 10 ml sterilt føtalt bovint serum (FBS), 500 pi gentamicin reagens, og 500 pi af 5 mg / ml insulin.
  5. Til fremstilling af 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS-opløsning, der tilsættes 1% (w: V) opløsning af BSA pulver til 1x PBS og blandes.
  6. Til fremstilling af en 4 mg / ml opløsning af neutraliseret bovin type I collagen, tilsættes 50 pi 10x Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) puffer, 30 pi 0,1 N natriumhydroxid (NaOH), 30 pi celledyrkningsmedium, og 400 pi stock kollagen til en afkølet 1,5 ml mikrocentrifugerør. Bland langsomt ved pipettering op og ned; undgå at indføre bobler. For at fjerne eventuelle bobler, kortvarigt centrifugeres blandingen ved 4 ° C.
  7. Der fremstilles en fikseringsopløsning ved at fortynde 16% paraformaldehyd 1: 4 (v: v) i 1 x PBS.
  8. Forbered en kerner mærkning løsning ved at fortynde lager kerner mærkning løsning 1: 1000 (v: v) i 1x PBS.
  9. Der fremstilles en 0,3% phosphatbufret saltvand og detergent (PBST) opløsning ved blanding 1x PBS med 0,3% (vol: vol) detergent.
  10. Forbered blokerende buffer ved fortynding gedeserum 1:10 (vol: vol) i 0,3% PBST.
  11. Der fremstilles en primær antistofopløsning for et bestemt protein af interesse ved at fortynde primary antistof (fx kanin-anti-fokal adhæsion kinase (FAK)) 1: 200 (vol: vol) i blokerende buffer.
  12. Forbered et sekundært antistof ved at fortynde en fluorescerende probe-konjugeret antistof (fx ged anti-kanin) 1: 1.000 (vol: vol) i blokerende buffer.

2. Udarbejdelse af Elastomere Frimærker for 3D Micropatterning

Bemærk: Elastomere stempler er lavet med PDMS.

  1. Lav en PDMS løsning på samme forhold som beskrevet i trin 1.3 og bland grundigt. Placer blandingen i et vakuumkammer i 15-30 min for at fjerne eventuelle luftbobler, som blev indført under blandeprocessen.
  2. Hæld afgasset opløsning i en plastik vejer båd eller en petriskål indeholdende et silicium mester der litografisk mønstrede med træk af ønskede geometri. For de bedste resultater, helbrede PDMS løsningen ved 60 ° C i ~ 12 timer.
    Bemærk: De silicium mestre er meget tilpasses; denne protokol bruger rektangulære strukturer med dimensioner på 50um x 200 um x 50 um afstand 200 um fra hinanden. Silicium mastere kan fremstilles ved anvendelse af standard fotolitografiske teknikker. Kort beskrevet en epoxy-baseret fotoresist spin-coated på toppen af ​​en siliciumskive. En maske med angivelse af de ønskede stempel funktioner er placeret på toppen af ​​fotoresist-belagt wafer, som derefter udsættes for UV-lys. De ønskede funktioner ikke er blokeret af masken udsættes for lys og den fotoresist på disse steder bliver tværbundet, mens den resterende del af fotoresist coatingen er opløselig og kan vaskes væk.
  3. Efter PDMS er hærdet rundt om de ønskede funktioner på silicium mester, fjerne PDMS og mester fra plastikbeholder. Adskil forsigtigt PDMS fra silicium wafer og fjerne overskydende PDMS fra omkring prentet funktioner ved hjælp af en ren barberblad.
  4. Nu skære PDMS mønstrede med påtrykt funktioner i individuelle rektangulære frimærker (~ 8 mm x 5 mm) med et barberblad. Opbevar disse feature-side-up i en kelen 100-mm-diameter petriskål.
  5. Derudover bruger PDMS løsningen beskrevet i trin 1.3 at gøre understøtninger for de rektangulære frimærker.
  6. Ved hjælp af en spin-coater, spredt ~ 2-3 g af PDMS opløsning jævnt på en 100 mm-diameter Petri skål og hærde PDMS for ~ 12 timer ved 60 ° C som i trin 2.1. Derefter, under anvendelse af et barberblad, sender en tyndt lag af PDMS i rektangler (~ 5 mm x 2 mm).
    Bemærk: Der er behov for to understøtninger for hver PDMS frimærke foretaget i trin 2.3. Bærerne kan lagres i 100-mm-diameter petriskål, der indeholder de PDMS frimærker.
  7. Før kan bruges PDMS frimærker og understøtninger til celledyrkning, der steriliseres ved nedsænkning i 70% ethanol og tør bruge en aspirator i et biosikkerhed skab (cellekultur hætte).

3. Fremstilling af 3D epitelvæv

  1. I et bio kabinet, tilsættes en dråbe på ca. 50 pi 1% BSA i PBS til toppen af ​​hvert frimærke. Placer dråben dækket frimærker ved 4 ° C i en minimum af 4 timer for at sikre, at BSA adsorberer til overfladen af ​​stemplet.
  2. Aspirer BSA-opløsning fra PDMS frimærker.
  3. Vask overfladerne af stempler to gange med celledyrkningsmedium (50 pi per vask pr stempel bør være tilstrækkelig), aspirering efter hver vask.
  4. Håndter de steriliserede PDMS frimærker og støtter ved hjælp af buede stål pincet i rustfrit. I et biosikkerhed skab, lægge ud en 35-mm-diameter vævskulturskål for hver PDMS frimærke. I hver skål, fastsætter to PDMS understøtninger adskilt af en afstand lidt mindre end længden af ​​PDMS frimærker.
  5. Under anvendelse af pincetten, steriliseres så mange cirkulære dækglas (15 mm i diameter, # 1), som der er PDMS frimærker anvendelse af 70% ethanol. Aspirer den overskydende væske fra dækglas, mens du holder dem med en pincet. Opbevar de vaskede dækglas i en separat 100-mm-diameter petriskål.
  6. Dispensere ~ 50 pi af kollagen blandingen jævnt coate overfladen af ​​hver PDMS stempel.
  7. Samle ophver kollagen-coatede PDMS stempel med pincet og vend forsigtigt dem. Sænk de omvendte stempler oven på PDMS understøtter lagt ud i 35-mm-diameter vævskultur diskes således, at kollagen er mellem stemplet og bunden af ​​vævskulturskål. Inkuber skåle ved 37 ° C i 30 minutter.
  8. Dispensere ~ 50 pi af den resterende kollagen blandingen på hver af de cirkulære dækglas (senere, vil disse blive placeret på toppen af ​​de konstruerede væv helt at indkapsle dem i collagen) og inkubere dem ved 37 ° C i 30 minutter.
  9. Opnå en 100 mm diameter vævskultur skål indeholdende epithelceller (ex. EpH4 muse mammaepitelceller) på ~ 40% sammenflydning. Aspirer celledyrkningsmediet og vask en gang med 10 ml 1x PBS. Tilsæt 2 ml trypsin til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min.
  10. Tilsæt 8 ml frisk dyrkningsmedium til vævskulturskål indeholdende trypsinerede celler, løsgøre tilbageværende vedhæftende celler fra skålen. Bland forsigtigt ved pipettering og flytte celleblandingen til et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 100 x g i 5 min.
  11. Aspirer supernatanten fra konisk rør og resuspender cellepelleten i celledyrkningsmediet. Anvendelse af et hæmocytometer, tælle cellerne for at bestemme koncentrationen af ​​suspensionen. Justere lydstyrken suspensionen til opnåelse af en slutkoncentration på ~ 10 6 -10 7 celler / ml.
  12. Fjern de gelerede kollagen prøver fra inkubatoren. Ved hjælp af en pincet, forsigtigt løfte PDMS stempler lige opad for at frigøre dem fra det støbte kollagen og kassere dem.
  13. Dispensere ~ 30 pi af den koncentrerede cellesuspension på overfladen af ​​hver kollagen gel indeholdende støbte hulrum ønskede geometri. Overhold cellerne under et lysfelt mikroskop med en 10X / 0,25 NA mål, mens forsigtigt at ryste den retter side til side for at fremme celle afregning inden for hulrum. De hulrum skal fyldes inden ~ 5 min.
  14. Til rEFlyt overskydende celler fra hele hulrummene, vippe hver vævsdyrkningsskål på sin side og forsigtigt dispensere ~ 400 pi cellekulturmedium over overfladen af ​​kollagengelen. Aspirere væsken og gentag vask 1-2 gange mere, kontrol af kollagengeler under mikroskopet i mellem hver vask.
  15. Efter de overskydende celler er blevet fjernet fra omkring celle-fyldte hulrum i kollagen skimmel, placere vævskulturskåle i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i 15 minutter. Så ved hjælp af en pincet, vend forsigtigt collagencoatede klasse dækglas og placere dem på toppen af ​​cellen fyldt kollagen forme, således at collagen fra dækglassene danner en hætte over cellen fyldt hulrum. Inkuber prøverne ved 37 ° C i 15 minutter.
  16. Når collagen hætter har klæbet til den celle-fyldte collagen skimmel, dispensere ~ 2-2,5 ml celledyrkningsmedium langsomt over dækglas på toppen af ​​gelerne. Kultur prøverne ved 37 ° C i 1-3 dage.
    Note:24 timer efter indledende podning kan de epitelvæv behandles med vækstfaktorer, såsom epidermal vækstfaktor (EGF) eller hepatocytvækstfaktor (HGF) for at inducere forgrening.

4. Immunofluorescens og billedanalyse

  1. Aspirer celledyrkningsmediet fra vævsdyrkningsskåle og tilføje nok fikseringsopløsning til at dække celleholdige geler. Inkubér retter på stuetemperatur i 15 minutter på et rysteapparat ved 200 rpm.
  2. Aspirer fiksativ, fylde vævskulturskåle med 1x PBS, og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter på et rysteapparat ved 200 rpm. Gentag to gange for i alt tre vaske.
  3. For at mærke kerner: Aspirer PBS fra vævskulturskål og erstatte med Hoechst løsning. Inkuber ved stuetemperatur i 15-20 min. For at plette for FAK eller en anden markør, der kan påvises med antistoffer, springe til trin 4.5.
  4. Aspirer nukleare opløsning mærkning og vask celleholdige gels tre gange med 1x PBS som i trin 4.2. Farvede prøver kan opbevares i 1x PBS ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
  5. At farve for et protein af interesse: Aspirer PBS fra vævskulturskåle, tilsættes 300 pi 0,3% PBST, og inkubere prøven ved stuetemperatur i 15 minutter.
  6. Aspirer PBS, dække gelerne med blokerende buffer, og inkuber på et rysteapparat (200 rpm) ved stuetemperatur i ~ 4 timer.
  7. Aspirer blokerende buffer, dække gelerne med primær antistofopløsning, og inkuber på et rysteapparat ved 200 rpm natten over ved 4 ° C.
  8. Aspirer primære antistofopløsning, tilsæt 0,3% PBST-opløsning, og der inkuberes på et rysteapparat ved 200 rpm ved stuetemperatur i 30 min. Aspirer PBST og gentage hver 30 min i 3-4 timer.
  9. Gentag trin 4.7 og 4.8, denne gang inkubering med det sekundære antistof opløsning. Wrap vævskulturskåle med aluminiumfolie for at forhindre fotoblegning af det sekundære antistof. Efter final vask, kan farves prøver opbevares i 1x PBS ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
  10. For at visualisere prøver, bruge en 10X / 0,30 NA mål fokuseret på midplane af epitelvæv.
  11. For at visualisere cellekerner, billede faste prøver mærket med en nuklear markør ved hjælp af en 10X / 0,30 NA mål under UV-belysning.
  12. At visualisere prøver farvet for et protein af interesse, billede under anvendelse af en 10X / 0,30 NA mål på et inverteret fluorescensmikroskop.
  13. At skabe frekvens kort af protein farvning af flere væv (typisk 50 eller flere) af identisk indledende geometri, første import hver af billeder ved hjælp af standard billedanalyse software (se Materialer) og konvertere dem til 8-bit gråtoner.
  14. Til tærsklen disse billeder, konvertere dem til binær (dvs. halvtone / sort og hvid) ved at definere en gråtoner cutoff point; gråtone værdier under tærsklen bliver sort, og dem over tærsklen bliver hvidt. Derefter kombinerehver af de individuelle binære billeder til et enkelt billede stak.
  15. Dernæst registrere de stablede billeder (dvs. justere eller matche dem) i analysen software. Mange Billedanalyse software pakker kommer med en frit tilgængelig registrering plugin.
    1. Brug hvert billede i en stabel som en skabelon for tilpasningen af ​​det næste billede, således at billederne i hele stakken flugter ved formering. Endelig overlay (projekt) billederne i den linie billedstak baseret på gennemsnitlig intensitet danner et enkelt billede med en pixel frekvens kortet. Dette billede kan derefter farvekodet hjælp billedredigeringsprogram valg 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oversigtsdiagram af mamma-epitelvæv mikrofabrikation

En generel skematisk af mikrofabrikation procedure skitserer det eksperimentelle arbejde flow er vist i figur 1. Slutresultatet er en vifte af epitelvæv med identisk geometri og afstand, der er fuldstændig indlejret i en ECM gel. Et repræsentativt eksperiment anvender EpH4 musebryst epitelceller dyrket i en gel af bovin type I collagen i en koncentration på 4 mg / ml. For at sikre den højeste kvalitet af manipuleret væv, bør de teknikker, der er skitseret i protokollen følges nøje. 2A og 2B viser lav og høj forstørrelse synspunkter arrays af rektangulære brønde, der er blevet støbt ind i en type I collagen gel før celle såning. Formen af ​​brøndene er bestemt af formen af ​​funktionerne på silicium master. Det er vigtigt at løfte the PDMS skimmel lige op fra kollagen for ikke at fordreje hulrummet geometri. Figur 2C viser rektangulære brønde i en type I collagen gel, der er blevet fyldt med mammaepitelceller (overskydende celler er blevet vasket af overfladen af kollagen). I dette eksempel hver 200 um x 50 um rektangulære brønd indeholder ca. 80-100 celler.

Tilsætning af vækstfaktorer inducerer morfogenese

24 timer efter podning, kan vævene behandles med vækstfaktorer, såsom HGF eller EGF og dyrkes i flere dage til at modellere forgrening morfogenese. Typisk grene begynder at danne så tidligt som 4 timer efter vækstfaktorstimulering. Figur 3A viser repræsentative resultater fra rektangulære brystepitelceller væv i et type I collagen gel 24 timer efter mikrofabrikation procedure, hvorefter cells har klæbet til collagen og til hinanden. Ingen grene observeres før vækstfaktor tilsætning. Figur 3B viser et repræsentativt rektangulært væv, der har undergået forgrening 24 timer efter tilsætningen af HGF ved 10 ng / ml. I dette tilfælde forekommer grene ved enderne af vævene (i modsætning til midten), hvor cellerne oplever den højeste mekaniske belastning 9. Flere væv af samme indledende geometri i samme gel kan derefter afbildes til bestemmelse population gennemsnit af gren placering og gren længde, muliggør high-throughput analyse.

Immunofluorescens-farvning til visualisering proteinlokalisering

Immunofluorescens-farvning af vævsarrays i kulturen model tillader os at bestemme proteinlokalisering inden for et væv med høj statistisk konfidens. Figur 4A viser reprætative resultater fra en forgrening rektangulær mamma epitelvæv farvet for fokal adhæsion kinase (FAK). Oprettelse frekvensplaner af væv af identisk geometri kan anvendes til at visualisere den gennemsnitlige rumlige lokalisering af proteiner af interesse inden for de væv, der kan sammenlignes med lokaliseringen af ​​andre proteiner samt forgrening aktivitet. Figur 4B viser en frekvens kort over gennemsnittet FAK farvning for 50 væv viser FAK berigelse ved de korte ender af rektangulære væv, hvor branching typisk forekommer.

figur 1
Figur 1. Skematisk skitserer mikrofabrikation procedure. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 2. Billeder taget under mikrofabrikation processen. (A) Lav og (B) og høje forstørrelse fase-kontrast billeder af rektangulære hulrum i type I collagen oprettet ved hjælp af en elastomer PDMS skimmel. (C) Hulrum fra (A) og (B) er fyldt med mammaepitelceller. Scale barer, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. mikrofabrikerede væv gennemgår forgrening morfogenese. (A) Fase-kontrast billede af en repræsentativ rektangulær væv 24 timer efter mikrofabrikation. (B) Fase-kontrast billede af en fornyetpresentative rektangulære væv, der er begyndt at gennemgå forgrening 24 timer efter tilsætning af HGF ved 10 ng / ml. Hvide pile angiver nydannede grene. Scale barer, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Immunofluorescens-farvning af mikrofabrikerede væv. (A) Immunfluorescensfarvning for FAK i et mamma-epitelvæv efter gren initiering. (B) En frekvens kort over gennemsnittet FAK farvning i 50 væv. Scale barer, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David & Lucile Packard Foundation, Camille & Henry Dreyfus Foundation, og Burroughs Velkommen fonden. ASP blev delvist understøttet af en Charlotte Elizabeth Procter hædrende Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184
PDMS curing agent Ellsworth Adhesives Sylgard 184
Lithographically patterned silicon master self-made N/A
Plastic weigh boat Fisher Scientific 08-732-115
100-mm-diameter Petri dishes BioExpress D-2550-2
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200 Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O
Razor blade American Safety Razor 620179
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) Hyclone SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14185-052
Insulin Sigma Aldrich I6634-500MG
Gentamicin Life Technologies 15750-060
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399-500
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 221465-500G
Bovine type I collagen (non-pepsinized) Koken IAC-50
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich A-7906
Curved stainless steel tweezers Dumont 7
35-mm-diameter tissue culture dishes BioExpress T-2881-6
15 ml conical tubes BioExpress C-3394-2
1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube USA Scientific 1615-5500
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter Bellco Glass Inc. Special order
0.05% 1x Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Paraformaldehyde VWR 100503-916
Triton X-100 Perkin Elmer N9300260 Detergent
HGF Sigma Aldrich H 9661 Resuspended in dH2O at 50 mg/ml
Rabbit anti-mouse FAK antibody Life Technologies AMO0672
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Life Technologies A-11034
Adobe Photoshop Adobe N/A Used for color-coding pixel frequency maps.
FIJI (ImageJ) NIH N/A Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
  3. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  4. Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
  5. Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
  6. Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
  7. Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
  8. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
  10. Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
  11. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
  12. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  13. Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
  14. Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).

Tags

Bioengineering Micropatterning biomekanik molekylærbiologi tissue engineering væv geometri forgrening morfogenese
Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. … More

Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. M. Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (113), e54283, doi:10.3791/54283 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter