Summary
Detta manuskript beskriver en mjuk litografi-baserad teknik för att modifiera enhetliga matriser av tredimensionella (3D) epitelvävnader med definierad geometri omgivna av extracellulär matrix. Denna metod är mottaglig för ett stort antal olika celltyper och experimentella sammanhang och gör det möjligt för high-throughput screening av identiska replikat.
Introduction
Utvecklingen av grenade epitelvävnader, så kallade gren morfogenes, regleras av-cellerna, fysiska och miljöfaktorer. I bröstkörteln, förgrening morfogenes är en iterativ process genom vilken styrs kollektiv migration cell skapar en trädliknande arkitektur. Det första steget är det primära knopp bildning från mjölkgångarna, följt av filial initiering och förlängning 1,2. Invasion av filialer till den omgivande stroma induceras genom systemisk frisättning av steroidhormoner vid puberteten. Nya primära knoppar initierar sedan från ändarna av befintliga filialer, och denna process fortsätter att skapa en epitelceller träd 3. Även om många viktiga biokemiska signaler har identifierats, en omfattande förståelse av cell biologiska mekanismer som styr denna komplicerade utvecklingsprocess för närvarande saknas. Dessutom mekanistiska studier på påverkan av specifika signaler är svåra att dekonstruera från erfaringar in vivo, som exakta Spatiotemporal störningar och mätningar är ofta inte möjligt.
Tredimensionella (3D) odlingstekniker, såsom hel organkultur, primära organoids, och cellkulturmodeller, är användbara verktyg för att systematiskt undersöka de mekanismer som ligger bakom vävnadsmorfogenes 4-6. Dessa kan vara särskilt användbart för att bestämma påverkan av specifika faktorer individuellt, såsom mekaniska krafter och biokemiska signaler, på en mängd olika cellbeteenden, bland annat migration, proliferation och differentiering. 6 Engineered cellodlingsmodeller, i synnerhet lätt möjliggör störningen av enskilda celler och deras mikromiljö.
En sådan kultur modellen använder en mikrobaserad metod att konstruera modellbröst epitelvävnader med kontrollerad 3D-struktur som konsekvent och reproducerbart bildar grenar som migrerar kollektivt när induceras med enppropriate tillväxtfaktorer. Den stora fördelen med den modellen är förmågan att exakt manipulera och mäta effekterna av fysikaliska och biokemiska faktorer, såsom mönster av mekanisk påfrestning, med hög statistisk säkerhet. Denna teknik, tillsammans med datormodellering, har redan använts för att bestämma de relativa bidragen från fysiska och biokemiska signaler i ledning av den normala utvecklingen av bröst epitelvävnader och andra grenade epitel 7-11. Som presenteras här är ett detaljerat protokoll för att bygga dessa modell vävnader, som lätt kan utvidgas till andra typer av celler och extracellulär matris (ECM) geler, och som tjänar som en potentiellt verktyg för testning av terapeutiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av lösningar
- För att framställa en 5 mg / ml lösning av insulin, späd den pulverformiga insulin lager med 5 mM saltsyra (HCl) i dH 2 O (500 mg insulin i 100 ml lösningsmedel). Bereda 100 ml lösningsmedel genom tillsats av 50 | il av koncentrerad HCl till 100 ml destillerat vatten (dH 2 O).
- För att göra en 1x lösning av PBS, späd 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) stamlösning till 1x med dH 2 O under sterila förhållanden.
- Förbered polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer lösning enligt följande: Blanda PDMS prepolymer tillsammans med härdaren i ett 10: 1 (vikt: vikt) förhållande.
- Förbereda cellodlingsmediet enligt följande: till 500 ml av stock Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Blandning F-12 (DMEM / F-12), tillsätt 10 ml sterilt fetalt bovint serum (FBS), 500 | il av gentamicin reagens, och 500 pl av 5 mg / ml insulin.
- För att framställa den 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS-lösning, tillsätt 1% (vikt: V) lösning av BSA pulver till 1x PBS och blanda väl.
- För att framställa en 4 mg / ml lösning av neutraliserad bovint typ I kollagen, tillsätt 50 pl 10x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) buffert, 30 | il 0,1 N natriumhydroxid (NaOH), 30 | il cellodlingsmedium, och 400 | il av stock kollagen till en kyld 1,5 ml mikrocentrifugrör. Blanda långsamt genom att pipettera upp och ned; undvika att införa bubblor. För att avlägsna eventuella bubblor, centrifugera kort blandningen vid 4 ° C.
- Bered en fixeringslösning genom spädning av 16% paraformaldehyd 1: 4 (volym: volym) i 1 x PBS.
- Förbered en kärnor märkning lösning genom att späda ut aktie kärnor märkning lösning 1: 1000 (v: v) i 1x PBS.
- Bered en 0,3% fosfatbuffrad saltlösning och detergent (PBST) lösning genom blandning av 1 x PBS med 0,3% (volym: volym) detergent.
- Förbered blockerande buffert genom att späda getserum 01:10 (v: v) i 0,3% PBST.
- Förbered en primär antikroppslösning för ett särskilt protein av intresse genom att späda primary-antikropp (t ex kanin-anti-fokaladhesion kinas (FAK)) 1: 200 (volym: volym) i blockeringsbuffert.
- Förbereda en sekundär antikroppslösning genom att späda en fluorescerande sond-konjugerad antikropp (exempelvis get-anti-kanin) 1: 1000 (volym: volym) i blockeringsbuffert.
2. Framställning av elastomera stämplar för 3D Micropatterning
Obs: Elastomer stämplar görs med PDMS.
- Gör en PDMS lösning vid samma förhållande som beskrivs i steg 1,3 och blanda väl. Placera blandningen i en vakuumkammare under 15-30 minuter för att avlägsna eventuella luftbubblor som infördes under blandningsprocessen.
- Häll avgasad lösning i en plast väga båt eller petriskål med en kisel mästare som litografiskt mönstras med funktioner av önskad geometri. För bästa resultat, bota PDMS lösning vid 60 ° C under ~ 12 timmar.
Obs: Kisel masters är mycket anpassningsbara, detta protokoll använder rektangulära strukturer med måtten 50im x 200 pm x 50 um avstånd 200 pm från varandra. Kisel masters kan göras med användning av standardfotolitografitekniker. I korthet, en epoxibaserad fotoresist spinnbeläggs på toppen av en kiselskiva. En mask med uppgifter de önskade stämpel funktioner placeras på toppen av fotoresist-belagda skivan, som sedan exponeras för UV-ljus. De önskade funktioner som inte blockeras av masken exponeras för ljus och fotoresisten på dessa platser blir tvärbunden, medan återstoden av fotoresistbeläggningen är löslig och kan tvättas bort. - Efter PDMS härdat runt de önskade egenskaperna på kisel mästare, ta bort PDMS och mästare från plastbehållaren. Försiktigt separera PDMS från kiselskivan och avlägsna överskott PDMS från runt präglade funktioner med en ren rakblad.
- Nu skär PDMS mönstrade med präglade funktioner i enskilda rektangulära stämplar (~ 8 mm x 5 mm) med ett rakblad. Lagra dessa funktionssidan upp i en kelen 100-mm diameter petriskål.
- Dessutom använder PDMS lösning som beskrivs i steg 1,3 för att göra stöd för de rektangulära frimärken.
- Med användning av en spinnbeläggare, spred ~ 2-3 g av PDMS lösning jämnt på en 100-mm-diameter Petri-skål och bota PDMS för ~ 12 timmar vid 60 ° C såsom i steg 2,1. Sedan, med hjälp av ett rakblad, skär tunt skikt av PDMS i rektanglar (~ 5 mm x 2 mm).
Obs: Två stöd behövs för varje PDMS stämpel i steg 2,3. Stöden kan lagras i den 100-mm-diameter petriskål som innehåller de PDMS stämplar. - Innan PDMS frimärken och bärare kan användas för cellodling, sterilisera genom nedsänkning i 70% etanol och torka med användning av en sug i en biosäkerhet skåp (cellodling huva).
3. Beredning av 3D epitelvävnader
- I en biosäkerhet skåp, tillsätt en droppe av ca 50 | il av 1% BSA i PBS till toppen av varje stämpel. Placera droppen täckta stämplar vid 4 ° C under en minimom av 4 h för att säkerställa att BSA adsorberar till ytan av stämpeln.
- Aspirera BSA-lösning från PDMS frimärken.
- Tvätta ytorna på de stämplar två gånger med cellodlingsmedium (50 | il per tvättning per stämpel bör vara tillräckligt), aspiration efter varje tvätt.
- Hantera steriliserade PDMS frimärken och stöd med hjälp av böjda pincett av rostfritt stål. I en biosäkerhet skåp, lägga ut en 35-mm diameter vävnadsodlingsskål för varje PDMS stämpel. I varje maträtt, fastställa två PDMS stöd åtskilda med ett avstånd något mindre än längden på PDMS frimärken.
- Med hjälp av pincett, sterilisera så många cirkulära täckglas (15 mm i diameter, # 1) som det finns PDMS frimärken med hjälp av 70% etanol. Aspirera överflödig vätska från täck medan du håller dem med pincett. Lagra de tvättade täckglas i en separat 100-mm-diameter petriskål.
- Dispensera ~ 50 | il av kollagenblandningen för att jämnt belägga ytan på varje PDMS stämpel.
- Plocka uppvarje kollagenbelagda PDMS stämpel med pincett och försiktigt vänd dem. Sänka de inverterade stämplar på toppen av PDMS stöder läggs ut i 35-mm diameter vävnadsodlings kupade så att kollagenet är mellan stämpeln och botten av vävnadsodlingsskål. Inkubera skålarna vid 37 ° C under 30 min.
- Fördela ~ 50 pl av återstående kollagen blandningen på vart och ett av de cirkulära täck (senare kommer dessa att placeras ovanpå de tekniska vävnader för att helt kapsla in dem i kollagen) och inkubera dem vid 37 ° C under 30 minuter.
- Erhållande av en 100-mm-diameter vävnadsodlingsskål innehållande epitelceller (ex. EpH4 mus bröstepitelceller) vid ~ 40% konfluens. Aspirera cellodlingsmediet och tvätta en gång med 10 ml 1 x PBS. Tillsätt 2 ml trypsin till cellerna och inkubera vid 37 ° C under 5-10 min.
- Tillsätt 8 ml färskt odlingsmedium till vävnadsodlingsskål innehållande trypsinerade celler, lossa eventuella kvarvarande anhängare celler från skålen. Blanda försiktigt genom att pipettera och flytta cellblandningen till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 100 x g under 5 min.
- Aspirera supernatanten från det koniska röret och återsuspendera cellpelleten i cellodlingsmediet. Med användning av en hemocytometer, räkna cellerna för att bestämma koncentrationen av suspensionen. Justera suspensionsvolymen för att erhålla en slutlig koncentration av ~ 10 6 -10 7 celler / ml.
- Ta bort de gelade kollagenprover från inkubatorn. Med hjälp av pincett, försiktigt lyfta PDMS frimärken rakt uppåt för att lossa dem från den formade kollagen och kasta dem.
- Dispensera ~ 30 ^ il av koncentrerad cellsuspension på ytan av varje kollagengel innehållande formade håligheter med önskad geometri. Observera cellerna under ett bright mikroskop med en 10X / 0,25 NA mål medan försiktigt skaka rätter sida till sida för att främja cellsedimentering i hålrummen. Hålrummen bör fyllas i ~ 5 minuter.
- REFlytta överskott celler från runt håligheterna, luta varje vävnadsodlingsplatta på sin sida och försiktigt dispensera ~ 400 | il cellodlingsmedium över ytan på kollagengelen. Aspirera vätska och upprepa tvätta 1-2 gånger, kontrollera kollagengeler under mikroskop mellan varje tvätt.
- Efter det att överskottet cellerna har rensats från hela cellfyllda hålrum i kollagen mögel, placera vävnadsodlingsskålar i en cellkultur inkubator vid 37 ° C under 15 min. Sedan, med hjälp av pincetten försiktigt invertera kollagenbelagda klass täck och placera dem ovanpå cellfyllda kollagen formar så att kollagen från täck bildar ett lock över cellfyllda hålrum. Inkubera proverna vid 37 ° C under 15 min.
- När kollagen mössor har anslutit sig till cellfyllda kollagen mögel, befria ~ 2-2,5 ml cellodlingsmedium långsamt över glastäck ovanpå gelerna. Kultur proverna vid 37 ° C under 1-3 dagar.
Notera:24 h efter initial ympning, kan de epitelvävnader behandlas med tillväxtfaktorer såsom epidermal tillväxtfaktor (EGF) eller hepatocyttillväxtfaktor (HGF) för att inducera förgrening.
4. Immunofluorescens och bildanalys
- Aspirera cellodlingsmediet från vävnadsodlingsskålar och tillsätt tillräckligt fixeringslösning för att täcka de cellinnehållande geler. Inkubera skålarna vid rumstemperatur under 15 min på en skakanordning vid 200 rpm.
- Aspirera fixativ, fylla vävnadsodlingsskålar med 1 x PBS, och inkubera vid rumstemperatur under 15 min på en skakanordning vid 200 rpm. Upprepa två gånger för tre totala tvättar.
- Att märka kärnor: Sug PBS från vävnadsodlingsplatta och ersätta med Hoechst lösning. Inkubera vid rumstemperatur under 15-20 min. Att färga för FAK eller annan markör som kan detekteras med antikroppar, hoppa till steg 4,5.
- Aspirera kärn märkning lösning och tvätta cellinnehållande gels tre gånger med 1 x PBS som i steg 4,2. Färgade prover kan lagras i 1x PBS vid 4 ° C fram till vidare användning.
- För att färga för ett protein av intresse: Aspirera PBS från vävnadsodlingsskålar, tillsätt 300 pl 0,3% PBST och inkubera provet vid rumstemperatur under 15 min.
- Aspirera PBS, täcka geler med blockerande buffert, och inkubera på en skakanordning (200 rpm) vid rumstemperatur under ~ 4 timmar.
- Aspirera blockerande buffert, täcka geler med primär antikropp-lösning och inkubera på en skakanordning vid 200 rpm över natten vid 4 ° C.
- Aspirera den primära antikroppen lösningen, tillsätt 0,3% PBST-lösning och inkubera på en skakanordning vid 200 rpm vid rumstemperatur under 30 min. Aspirera PBST och upprepa varje 30 min för 3-4 timmar.
- Upprepa steg 4,7 och 4,8, denna gång inkubering med den sekundära antikroppen lösning. Linda de vävnadskulturskålar med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning av den sekundära antikroppen. Efter final tvätta, kan färgade proverna förvaras i 1x PBS vid 4 ° C fram till vidare användning.
- Att visualisera prov, använda en 10X / 0,30 NA mål inriktat på mittplan av epitelvävnader.
- Att visualisera cellkärnor, bild fasta prover märkta med en nukleär markör med hjälp av en 10X / 0,30 NA mål under UV-belysning.
- Att visualisera prover som färgats för ett protein av intresse, bild med en 10X / 0,30 NA mål på ett inverterat fluorescensmikroskop.
- Att skapa frekvens kartor över proteinfärgning av multipla vävnader (typiskt 50 eller fler) av samma initiala geometri, första import var och en av bilder med hjälp av standardbildanalysprogram (se Material) och konvertera dem till 8-bitars gråskala.
- Tröskelvärdet dessa bilder, konvertera dem till binär (dvs halvton / svartvitt) genom att definiera en gråskala brytpunkten; gråskalevärden under tröskelvärdet blir svart, och de över tröskeln blir vita. Då, kombineravar och en av de individuella binära bilder till en enda bild stack.
- Därefter registrera de staplade bilder (dvs justera eller matcha dem) i analysprogram. Många bildanalys programpaket kommer med en fritt tillgänglig registrerings plugin.
- Använder varje bild i en stapel som en mall för anpassningen av nästa bild, så att bilderna i hela stapeln är inriktade genom fortplantning. Slutligen, för att överlagring (projekt) bilderna i linje bildstapel baserad på medelintensitet bilda en enda bild med en frekvens pixel map. Bilden kan sedan vara färgkodade med hjälp av bildbehandlingsprogram val 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Allmänt schema över bröst epitelvävnad mikro
Ett allmänt schema över det förfarande som mikrotillverkning beskriver det experimentella arbetet flödet visas i figur 1. Slutresultatet är en array av epitelvävnad med identisk geometri och inbördes avstånd som är helt inbäddade i ett ECM-gel. Ett representativt experiment använder EpH4 mus bröstepitelceller odlade i en gel av bovint typ I-kollagen vid en koncentration av 4 mg / ml. För att säkerställa högsta kvalitet av konstruerade vävnader, bör de tekniker som beskrivs i protokollet följas noggrant. Figurerna 2A och 2B visar låg och hög förstoring vyer av matriser av rektangulära brunnar som har formats till en typ I-kollagen gel före cellsådd. Formen av brunnarna bestäms av formen av de funktioner på kisel mastern. Det är viktigt att lyfta the PDMS mögel rakt upp från kollagen för att inte snedvrida kaviteten geometri. Figur 2C visar rektangulära brunnar i en typ I-kollagen gel som har fyllts med bröstepitelceller (överskott celler har tvättats bort ytan av kollagen). I detta exempel innehåller varje 200 | j, m x 50 ^ m rektangulär brunn ca 80-100 celler.
Tillsats av tillväxtfaktorer inducerar morfogenes
24 timmar efter sådd, kan vävnaderna behandlas med tillväxtfaktorer såsom HGF eller EGF och odlade under flera dagar för att modellera förgrening morfogenes. Typiskt, grenar börjar bildas så tidigt som 4 timmar efter tillväxtfaktorstimulering. Figur 3A visar representativa resultat från rektangulära mjölk epitelvävnader inom en typ I-kollagen gel 24 timmar efter mikroförfarande, varefter cells har anslutit sig till kollagen och till varandra. Inga grenar observeras före tillväxtfaktor tillsats. Figur 3B visar ett representativt rektangulär vävnad som genomgått förgrening 24 timmar efter tillsatsen av HGF vid 10 ng / ml. I det här fallet, grenar förekommer vid ändarna av vävnaderna (i motsats till mitten), där cellerna upplever den högsta mekanisk påfrestning 9. Multipla vävnader med identisk initiala geometri i samma gel kan sedan avbildas för att bestämma populationsgenomsnitt av gren läge och grenlängd, vilket möjliggör hög genomströmning analys.
Immunofluorescensfärgning att visualisera proteinlokalisering
Immunofluorescens färgning av vävnadssamlingar i odlingsmodellen tillåter oss att bestämma proteinlokalisering inuti en vävnad med hög statistisk säkerhet. Figur 4A visar representativa resultat från en förgrening rektangulär bröst epitelvävnad färgades för fokaladhesion kinas (FAK). Skapa frekvensplaner av vävnader med identisk geometri kan användas för att visualisera den genomsnittliga spatial lokalisering av proteiner av intresse inom de vävnader, som kan jämföras med lokalisering av andra proteiner såväl som förgrenings aktivitet. Figur 4B visar en frekvens karta över genomsnittet FAK färgning för 50 vävnader visar FAK anrikning vid de korta ändarna av rektangulära vävnader, där förgrening vanligtvis inträffar.
Figur 1. Schematisk beskriver mikro förfarande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bilder tagna under mikroprocessen. (A) Låg och (B) och hög förstoring fas-kontrastrika bilder av rektangulära håligheter i typ I kollagen skapats med hjälp av en elastomer PDMS mögel. (C) Hålrum från (A) och (B) är fyllda med bröstepitelceller. Skalstrecken, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. mikrofabricerade vävnader genomgår förgrening morfogenes. (A) faskontrast bild av en representativ rektangulär vävnad 24 timmar efter mikro. (B) faskontrast bild av en representative rektangulär vävnad som har börjat genomgå förgrening 24 h efter tillsatsen av HGF vid 10 ng / ml. Vita pilar indikerar nybildade grenar. Skalstrecken, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Immunofluorescens färgning av mikrofabricerade vävnader. (A) Immunofluorescens färgning för FAK i en bröst epitelvävnad efter gren initiering. (B) En frekvens karta över genomsnittet FAK färgning i 50 vävnader. Skalstrecken, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av anslag från NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David & Lucile Packard Foundation, Camille & Henry Dreyfus Foundation, och Burroughs Welcome fonden. ASP stöddes delvis av en Charlotte Elizabeth Procter honorific gemenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
