Protocol
注：所有动物研究方案是由首尔国立大学盆唐医院的机构动物护理和使用委员会（BA1308-134 / 072-01）的批准。
1.玻尿酸，神经酰胺的合成（HACE）
- 在60的双蒸水（DDW）毫升溶解12.21毫摩尔透明质酸（HA）寡聚物和9.77毫摩尔四- 正丁基氢氧化铵（TBA）的。搅拌30分钟。
- 以合成的DS-Y30连接体，溶解8.59毫摩尔的DS-Y30神经酰胺和9.45毫摩尔的三乙胺在25毫升四氢呋喃（THF）。用8.59毫摩尔的THF 4-氯甲基苯甲酰氯混合。搅拌在60℃下6小时。
- 溶解所合成的8.10毫摩尔的HA-TBA和0.41毫摩尔的DS-Y30接头中和THF的混合物中的乙腈（4:1，体积/体积）。搅拌在40℃5小时。
- 通过与过滤剂过滤除去杂质，并消除由真空蒸发有机溶剂。净化用渗析膜产物（分子量截止：3.5 kDa的），并冷冻干燥。
2.纳米颗粒的制备
- 溶解1毫克的HB和在0.5ml二甲基亚砜（DMSO）的1毫克的紫杉醇和通过涡旋混合5分钟，用0.5毫升DDW的混合。然后，溶解HACE在通过涡旋混合该混合物另外5分钟。
- 为了消除在氮气缓流在70℃下4小时的溶剂，热。
- 悬浮脑水肿，HB组成的薄膜，紫杉醇用1毫升DDW的。用注射器过滤器（0.45微米孔径大小）过滤以除去未包封的药物。
3. 在体外光毒性
- 在肺癌细胞系中的纳米颗粒的摄取
- 制备的RPMI-1640含10％中等（体积/体积）胎牛血清和1％（重量/体积）青霉素 - 链霉素。
- 种子A549细胞在24孔细胞培养板中以1×10 5个细胞的密度/孔（一式三份对各组）。在湿润的5％CO 2和95％空气气氛中孵育在37℃下24小时。
- 细胞附着后，除去培养基并加入1 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗细胞。
- 溶解在PBS中，纳米颗粒为2μM/ ml的HB的终浓度。然后，孵育将细胞用1ml的PBS，空纳米颗粒，HB-纳米粒，或HB-P-纳米粒的各孔在黑暗中4小时。
- 除去所有溶液，并通过加入1ml冷PBS洗细胞。重复洗涤步骤一次。添加新鲜的培养基。
- 细胞生存力测定法
- 放置PDT纤维下的细胞培养板（以1厘米的距离从PDT光纤到孔）。戴激光安全眼镜，并与在黑暗中的不同时间一个PDT激光器（630纳米，400毫瓦/厘米2）照射细胞：0，5，10，20，30，和40秒（0，2，4 ，8，12，和16焦耳/厘米2）。然后，孵育所述细胞在黑暗中24小时。
- 吸出培养基并加入1 ml冷PBS洗细胞。重复洗涤步骤一次。
- 添加10微升的细胞毒性测量溶液每个孔中。孵育在黑暗中搅拌2小时。
- 用酶标仪测量450nm处的吸光度。
- 显微分析
- 放置PDT纤维下的细胞培养板（以1厘米的距离从PDT光纤到孔）。戴激光安全眼镜和照亮与在黑暗中的PDT激光器（630纳米，400毫瓦/厘米2）的细胞为0，20，或40秒（0，1,8或16焦耳/厘米2）。然后，孵育所述细胞在黑暗中24小时。
- 吸出培养基并加入1 ml冷PBS洗细胞。重复洗涤步骤一次。
- 添加膜联蛋白V-FITC的50微升和50微升4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1.5微克/毫升）的。轻轻摇动板和孵化它在黑暗中室温下15分钟。
注：使用膜联蛋白V-FITC从荧光显微镜套件。 - 通过加入1ml冷PBS洗细胞。重复洗涤步骤一次。保持所述细胞在新鲜的PBS中。确定用光学显微镜放大100倍的凋亡细胞。
- 荧光激活细胞分选（FACS）分析
- 放置PDT纤维下的细胞培养板（以1厘米的距离从PDT光纤到孔）。戴激光安全眼镜和照亮用PDT激光（630纳米，400毫瓦/厘米2）的细胞为0，20，或40秒（0，1,8或16焦耳/厘米2）。然后，孵育所述细胞在黑暗中24小时。
- 吸出培养基并加入1 ml冷PBS洗细胞。重复洗涤步骤一次。
- 悬浮细胞在1ml 1×结合缓冲液（稀释10倍的结合缓冲液的1份; 0.1M HEPES / NaOH水溶液（pH为7.4），1.4M的NaCl和25mM的氯化钙2至9份蒸馏水）和转让100微升样品溶液至5毫升培养管。
- 添加膜联蛋白V-FITC的5和5μl碘化丙啶（PI）的。轻轻涡旋管孵育在黑暗中室温（RT）15分钟。添加400μl的1×结合缓冲液。
注：从荧光显微镜套件使用膜联蛋白V-FITC和PI。 - 通过使用FACS 14识别凋亡细胞。 PI和膜联蛋白V-FITC的激发激光线分别是488纳米和635纳米。测量PI和膜联蛋白V-FITC的荧光发射在610±20纳米和660±20纳米，分别。收集每10,000事件流式细胞仪获得的细胞。
在荷瘤小鼠4. 在体内的抗癌功效
- 肺癌引起的小鼠模型
- 制备1×10 6个 A549细胞在0.1ml RPMI-1640培养基;保持它在冰上。
- 用甲苯噻嗪的腹腔注射和替来他明和唑拉西泮（1的混合物麻醉小鼠：2,1毫升/公斤）。轻轻捏小鼠皮肤小褶皱确认正确的麻醉。使用对眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。
注意：如果没有观察到运动，动物是充分麻醉开始实验。 - 注入细胞皮下到BALB / c雄性裸鼠的左侧面（6 - 7周龄，20 - 22克）。
- 保持观察老鼠，直到他们开始在笼子里移动。
注：直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧不要离开无人看管的动物。不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到它已经完全康复的动物。保持无特定病原体（SPF）的条件下的小鼠。 - 每天测量肿瘤大小与卡钳。计算肿瘤体积（毫米3）为（长×宽2）/ 2，当肿瘤大小在体积达到约200mm 3，开始实验。
- 抗癌功效研究
- 随机划分小鼠分成4组（n = 10每组）。
- 麻醉小鼠用甲苯噻嗪的腹腔注射和替来他明和唑拉西泮的混合物（1：2,1毫升/公斤）。轻轻捏小鼠皮肤小褶皱确认正确的麻醉。使用对眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。
注意：如果没有观察到运动，动物是充分麻醉开始实验。 - 溶解在PBS中，纳米颗粒为2毫克/毫升的HB的终浓度。通过尾静脉（2毫克/公斤为HB）第0天及7两次注射的PBS，无HB，HB-纳米粒，或HB-P-纳米粒。
- 保持观察老鼠，直到他们开始在笼子里移动。
注：直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧不要离开无人看管的动物。不要返回已动过手术公司其他动物直至完全的动物恢复。保持笼黑暗和具体的SPF条件下。 - 每次注射后24小时，麻醉小鼠用甲苯噻嗪的腹腔注射和替来他明和唑拉西泮的混合物（1：2,1毫升/公斤）。轻轻捏小鼠皮肤小褶皱确认正确的麻醉。使用对眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。
注意：如果没有观察到运动，动物是充分麻醉开始实验。 - 放置PDT纤维下的肿瘤部位（以1厘米的距离从PDT光纤到肿瘤）。戴激光安全眼镜，关掉开关，并用PDT激光（630纳米，400毫瓦/厘米2）500秒（200焦耳/厘米2）1和8天两次照射肿瘤。
- 保持观察老鼠，直到他们开始在笼子里移动。无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。不要返回具有undergon动物Ë手术给公司其他动物，直到完全康复。
- 保持SPF条件下的笼子里。保持在黑暗中的笼激光治疗后24小时。
- 直观地监视肿瘤体积，并在每天肿瘤部位的变化。测量肿瘤大小用卡尺，并计算出体积为（长×宽2）/ 2（毫米3）。就拿肿瘤部位的照片，每天检查后PDT肿瘤表面的改变。
- 在第16天，通过使用异氟烷终端麻醉牺牲每组五只小鼠。
- 随着镊子和剪刀，剪开外皮和揭露肿瘤15。仔细收获他们。解决这些问题，在10％福尔马林，在石蜡中嵌入其中，和与用于组织学分析16苏木精和曙红（H＆E）染色它们。
- 监测后45天，用异氟烷麻醉终端牺牲剩余的老鼠。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们制备的两个HB-NP和HB-P-纳米粒与上述技术。 HB-NP和HB-P-纳米粒子的平均粒径分别为220.9±3.2 nm和211.9±1.6纳米。
后用PBS，空纳米颗粒，HB-纳米粒，和HB-P-纳米粒孵育4小时，然后通过光照射（0至16焦耳/厘米2）A549细胞的细胞活力在图1中示出，如果没有光，则HB-NP治疗组无细胞毒性可言，而HB-P-NP-处理的细胞81.28±0.14％细胞活力。这可能是由于紫杉醇的抗癌作用，其从纳米颗粒释放。下的PDT，细胞存活率是按照在两个HB-NP-和HB-P-NP处理的细胞的光照射时间减少。该HB-P-NP处理的细胞表现出比相同的照射条件下，HB-纳米粒组增加光毒性。当16焦耳/厘米2的照射给予，只有7.52±0.38％的细胞的HB-P-NP处理组中存活。
的一致的结果与膜联蛋白V-FITC染色（ 图2）被可视化。该PDT诱导的细胞凋亡与膜联蛋白V-FITC染色，表达绿色荧光。在相同的照射条件下对HB-P-NP处理的细胞中检测到的最强的绿色荧光信号。
该PDT诱导的凋亡细胞的阶段中通过流式细胞仪分类。通过双重染色膜联蛋白V-FITC和PI，早期凋亡细胞（仅膜联蛋白V-FITC阳性），晚期凋亡细胞（既膜联蛋白V和PI阳性）和坏死细胞（只PI阳性）进行了区分。在相同的PDT的条件下，晚期凋亡细胞的部分中的HB-P-NP-治疗组（ 图3）中增加。
“FO：保持-together.within页=”1“> 在体内肿瘤生长在肺荷瘤小鼠的PBS，无HB，HB-纳米粒，和HB-P-纳米粒的双静脉注射后，随后通过光照射是图4所示。在肿瘤位点的表面也审查（ 图5），B-P-NP处理的小鼠显示出最快的反应，包括出血及坏死，和最慢的肿瘤生长。此外，组织学分析证实了最严重破坏肿瘤细胞的HB-P-NP处理组中（ 图6）。
图 1： 体外 光毒性的A549细胞的 A549细胞用PBS，空纳米颗粒，HB-纳米粒，或HB-P-纳米粒，和光照射处理被给为0，5，10，20，30，或40秒（0，2，4，8，12或16焦耳/厘米2）。在ŧ他同时照射时间内，HB-P-NP治疗组表现出比HB-NP治疗组高光毒性。值表示为平均值±标准差（SD; n = 3 时 ）。 *** P <0.001，相对于PBS处理组。 ## P <0.01，### P <0.001，相对于对HB-NP处理组。从长安等 10改编请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 凋亡的A549细胞的微观分析的A549细胞用PBS，HB-纳米粒或HB-P-纳米粒处理，被赋予0的光照射，2或4焦耳/厘米2。 DAPI（蓝色，第一列）和膜联蛋白V-FITC（绿色，第二列）的双重染色表明核和凋亡细胞，分别。对HB-P-NP处理的细胞显示出比相同的照射条件下对HB-NP处理的细胞更强的绿色荧光信号，表明高得多的光毒性。比例尺= 200微米，放大倍数= 100X。从长安等 10改编请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 细胞凋亡的A549细胞的FACS分析的A549细胞用PBS，HB-纳米粒，或HB-P-纳米粒处理，被赋予0的光照射，2或4焦耳/厘米2。将细胞分为四组。ⅰ）这两种膜联蛋白V-FITC-和PI阴性细胞被认为是未受损，ⅱ）膜联蛋白V-FITC阳性和PI阴性细胞是早期凋亡，ⅲ）两个膜联蛋白V-FITC-和PI阳性细胞为晚期凋亡，和iv）膜联蛋白V-FITC阴性和PI阳性细胞是晚期凋亡或坏死。根据微观分析中，相同的照射条件下，对HB-P-NP处理的细胞显示出比对HB-NP处理的细胞高光毒性，和晚期凋亡细胞水平增加。从长安等 10改编请点击此处查看该图的放大版本。
图4：A549荷瘤小鼠的肿瘤体积监测在天0和7，PBS的双重注射，无HB，HB-纳米粒，和HB-P-纳米粒进行。的PDT（200J / cm 2）的是perforMED每次注射后第1天，第1天和第8处理表现出不同水平的治疗效果，与HB <HB-纳米粒<HB-P-纳米粒。 45天，HB-P-纳米粒治疗组显示出相比于其它基团的显著降低肿瘤体积。值表示为平均值±标准差（SD; N = 4）。肿瘤体积（毫米3）定义为（长×宽2）/ 2，从长安等 10改编请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 在A549荷瘤小鼠的肿瘤部位表面改建肿瘤部位均采用双静脉注射后监测（第0天及7）PBS，免费HB，HB-纳米粒子和HB-的P-纳米粒用200焦耳/ cm 2的光照射1每天每只注射后（在1和8天）。无论是HB-纳米粒子和HB-P-纳米粒子治疗组开始显示出反应的第一个PDT后的第二天。该HB-P-纳米粒子治疗组显示严重出血和坏死的最快发展。从长安等 10改编请点击此处查看该图的放大版本。
图6： 在A549荷瘤小鼠肿瘤组织的组织学分析在第16天，组织学证实被切除的肿瘤组织的H＆E染色进行。该HB-P-纳米粒子治疗组展示了最完整的肿瘤细胞死亡。比例尺= 500微米，放大倍率= 40X。从昌等人改编10 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项研究中最关键的步骤是选择合适的激光条件：波长，功率和照射时间。适合于特定的光敏剂的光的适当波长是必要的PDT。我们使用了一个630纳米的激光，是适当的竹红菌素B的输出功率是另一个重要的因素，这是基于许多试验性研究设定在400毫瓦/厘米2。输出功率超过400毫瓦/厘米2受损细胞或动物的皮肤表面由于照射本身，而低于400毫瓦/厘米2的输出功率太弱，以显示任何治疗效果。 用于体外 和体内研究的适当的照射时间分别为40秒（16焦耳/厘米2）和500秒（200焦耳/厘米2），。从PDT纤维至细胞或动物模型的肿瘤组织的距离也是在这项研究中的一个关键因素。以覆盖整个细胞或肿瘤表面与光1 cm的发现是最佳距离。
如果施加不同光敏剂，利用光的适当波长的可以最大限度地PDT效能。输出功率和照射时间应通过试验和错误来解决。当皮肤表面开始的光照射过程中燃烧时，输出功率应设置得较低。当肿瘤表面示出了在PDT后整天没有变化，这可能表明有必要以增加的输出功率。
这种方法有一定的局限性。首先，虽然从PDT光纤到目标的距离是一个重要的因素在这项研究中，这是很难确保均匀性。因为它是由人类控制的距离可能会略有不同。其次，对于用在器官如肺肿瘤的动物模型，该协议是难以适用，因为内窥镜是必要的和呼吸运动不可避免的。
虽然手术切除是第一用于治疗肺癌的选项，PDT有几个优点作为非侵入性和非手术的替代治疗。当操作是不合适的，例如在多个病灶的情况下，PDT可以是一个有效的选项。此外，术前PDT可减小肿瘤的大小，减少手术17的程度。相比手术，放射治疗，或支气管内近距离治疗时PDT副作用较少。此外，PDT无关，为放射治疗或化疗18提供阻力的突变。
在这项研究中，我们建议既photosensitizer-和抗癌药物包封肺癌靶向纳米颗粒作为一种新型光敏剂递送系统用于PDT。这个概念可以应用于其它光敏剂和抗癌药物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
这项研究是由赠款没有支持。 14-2014-017从SNUBH研究基金。
该作者感谢J.帕特里克·巴伦，名誉教授，日本东京医科大学兼职教授，首尔国立大学盆唐医院这个手稿他的无偿编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oligo hyaluronic acid | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| adipic acid dihydrazide | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(chloromethyl)benzoyl chloride | Sigma Aldrich | 270784 | |
| Tween 80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| syringe filter | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm, RC, PP, 0.45 µm |
| triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex tubes | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| Paclitaxel | Taihua Corporations | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Inc. | 16140071 | |
| Celite (Filter agent) | Sigma Aldrich | 6858 | See step 1.4 |
References
- Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
- Huisman, C., et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460. Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K.
- Pass, H. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sutedja, T. G., Postmus, P. E. Photodynamic therapy in lung cancer. A review . J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).
- Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies. Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).
- Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T.
- Lee, S. J., et al. Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).
- Chang, J. E., et al. Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer. J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).
- Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer. J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).
- Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C.
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
- Penno, M. B., et al. Expression of CD44 in human lung tumors. Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).
- Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).
- Bannas, P., et al. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. J Vis Exp. (98), e52462 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Lam, S.
- Simone, C. B. 2nd, et al. Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).
