Protocol
הערה: כל הפרוטוקולים מחקר בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של האוניברסיטה הלאומית בסיאול Bundang החולים (BA1308-134 / 072-01).
1. סינתזה של חומצה היאלורונית-Ceramide (הארנבת)
- Solubilize 12.21 מילימול של חומצה היאלורונית (HA) oligomer ו 9.77 מילימול של אַרְבַּע- הידרוקסיד n -butylammonium (TBA) ב 60 מ"ל מים מזוקקים פעמיים (DDW). מערבבים למשך 30 דקות.
- כדי לסנתז והמקשר DS-Y30, לפזר 8.59 מילימול של ceramide DS-Y30 ו 9.45 מילימול של triethylamine ב 25 מ"ל של tetrahydrofuran (THF). מערבבים עם 8.59 מילימול של כלוריד 4-chloromethylbenzoyl ב THF. מערבבים במשך 6 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
- ממיסים את 8.10 מסונתז מילימול של HA-TBA ו 0.41 מילימול של מקשר DS-Y30 בתערובת של THF ו אצטוניטריל (4: 1, V / V). מערבבים במשך 5 שעות ב 40 מעלות צלזיוס.
- סור זיהומים על ידי סינון עם סוכן מסנן, ולחסל את הממס האורגני על ידי אידוי ואקום. לטהר את המוצר באמצעות קרום דיאליזה (משקל מולקולרי חתוך: 3.5 KDA) ו Lyophilize.
2. הכנת החלקיקים
- ממיסים 1 מ"ג של HB ו 1 מ"ג של פקליטקסל ב 0.5 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO) ומערבלים עם 0.5 מ"ל של DDW ידי מערבולת ללישת למשך 5 דקות. לאחר מכן, solubilize hace באותה תערובת ידי ערבוב מערבולת במשך 5 דקות נוספות.
- על מנת לפסול את, החום ממס על 70 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות תחת זרם עדין של גז חנקן.
- Resuspend הסרט מורכב הארנבת, HB, ו- paclitaxel עם 1 מ"ל של DDW. מסנן עם מזרק מסנן (0.45 מיקרומטר גודל נקבובי) כדי להסיר תרופות unencapsulated.
3. במבחנה phototoxicity
- ספיגה של חלקיקים בשורות תאי סרטן הריאות
- כן המכילים בינוני RPMI-1640 10% (V / V) בסרום שור עוברי 1% (w / v) פניצילין, סטרפטומיצין.
- A549 זרע תאי צלחות תרבית תאי 24 גם בצפיפות של 1 × 10 5 תאים / טובה (triplicates עבור כלקְבוּצָה). דגירה של 24 שעות ב 37 ° C באווירת אוויר 2 ו -95% 5% humidified CO.
- לאחר מצורף התא, להסיר את בינוני לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS).
- ממיסים את חלקיקים ב PBS לריכוז סופי של HB 2 מיקרומטר / מ"ל. לאחר מכן, דגירה התאים עם 1 מ"ל של PBS, NPS ריק, HB-NPS, או HB-P-צירופים בכל טוב עבור 4 שעות בחושך.
- הסר את כל הפתרון לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של קר PBS. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת. הוסף בינוני תרבות טרי.
- assay כדאיות התא
- מניח את צלחת תרבית תאים תחת סיבי PDT (עם 1 סנטימטר של מרחק סיבי PDT אל הבאר). יש להרכיב משקפיים בטיחות לייזר ולהאיר את התאים עם לייזר PDT (630 ננומטר, 400 mW / cm 2) בחושך במשך פרקי זמן שונים: 0, 5, 10, 20, 30, ו -40 שניות (0, 2, 4 , 8, 12, ו -16 J / cm 2). לאחר מכן, דגירה התאים למשך 24 שעות בחושך.
- לשאוב בינוני לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של קר PBS. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת.
- הוסף 10 μl של פתרון מדידה cytotoxicity היטב כל אחד. דגירה בחושך במשך שעה 2.
- מדוד את הספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.
- ניתוח מיקרוסקופי
- מניח את צלחת תרבית תאים תחת סיבי PDT (עם 1 סנטימטר של מרחק סיבי PDT אל הבאר). יש להרכיב משקפיים בטיחות לייזר ולהאיר את התאים עם לייזר PDT (630 ננומטר, 400 mW / cm 2) בחושך במשך 0, 20, או 40 שניות (0, 8, או 16 J / cm 2). לאחר מכן, דגירה התאים למשך 24 שעות בחושך.
- לשאוב בינוני לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של קר PBS. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת.
- הוסף 50 μl של Annexin V-FITC ו -50 μl של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5 מיקרוגרם / מ"ל). נער בעדינות את הצלחת דגירה אותו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
הערה: השתמש Annexin V-FITC מתוך הערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. - שוטפים את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של קר PBS. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת. שמור את התאים ב PBS הטרי. זהה את תאים אפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה 100X.
- מיון תא הקרינה מופעל (FACS) ניתוח
- מניח את צלחת תרבית תאים תחת סיבי PDT (עם 1 סנטימטר של מרחק סיבי PDT אל הבאר). יש להרכיב משקפיים בטיחות לייזר ולהאיר את התאים עם לייזר PDT (630 ננומטר, 400 mW / cm 2) עבור 0, 20, או 40 שניות (0, 8, או 16 J / cm 2). לאחר מכן, דגירה התאים למשך 24 שעות בחושך.
- לשאוב בינוני לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של קר PBS. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת.
- Resuspend התאים 1 מ"ל של 1 × חיץ מחייב (לדלל 1 חלק למאגר מחייב 10x; 0.1 מ 'Hepes / NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl, ו -25 מ"מ CaCl 2 עד 9 חלקים מים מזוקקים) ולהעביר 100 μl של הפתרון מדגם ל -5 מ"לצינור תרבות.
- הוסף 5 μl של Annexin V-FITC ו -5 μl של יודיד propidium (PI). בעדינות מערבולת הצינור דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) בחושך. להוסיף 400 μl של 1 × חיץ מחייב.
הערה: השתמש Annexin V-FITC ו PI מתוך הערכה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. - זהה את תאים אפופטוטיים באמצעות FACS 14. קווי לייזר עירור של FITC-V PI ו Annexin הם 488 ננומטר ו 635 ננומטר, בהתאמה. מדוד את פליטת הקרינה של PI ו Annexin V-FITC ב 610 ± 20 ננומטר ו 660 ± 20 ננומטר, בהתאמה. אוסף את התאים הנרכשים על cytometer הזרימה ל -10,000 אירועים.
4. יעילות נגד סרטן בשנת vivo בעכברים נושאי גידולים
- במודל עכבר ריאות נגרמת סרטן
- הכן 1 × 10 6 תאים A549 ב 0.1 מ"ל בינוני RPMI-1640; לשמור אותו בקרח.
- להרדים את העכברים עם זריקה ip של xylazine ותערובת של tiletamine ו zolazepam (1: 2, 1 מ"ל /ק"ג). אשר הרדמה תקינה על ידי צובט קפל קטן בעדינות של עור עכבר. השתמש במשחת וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
הערה: אם אין תנועה הוא ציין, החיה הוא הרדים מספיק כדי להתחיל את הניסויים. - להזריק את התאים מתחת לעור בירכיים שנשארו עכברי גבר עירום BALB / C (6 - בן 7 שבועות, 20 - 22 גרם).
- שמור התבוננות העכברים עד שהם מתחילים לנוע בכלוב.
הערה: אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין. שמור על העכברים בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים (SPF). - מדוד את גודל הגידול עם מחוגה מדי יום. חשב את נפח הגידול (3 מ"מ) כמו (אורך × רוחב 2) / 2. כאשר גודל הגידול ומגיע לכ 200 מ"מ 3 בנפח, להתחיל בניסוי.
- מחקר יעיל נגד הסרטן
- אקראי לחלק העכברים ל -4 קבוצות (n = 10 לכל קבוצה).
- להרדים את העכברים עם זריקה ip של xylazine ותערובת של tiletamine ו zolazepam (1: 2, 1 מ"ל / ק"ג). אשר הרדמה תקינה על ידי צובט קפל קטן בעדינות של עור עכבר. השתמש במשחת וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
הערה: אם אין תנועה הוא ציין, החיה הוא הרדים מספיק כדי להתחיל את הניסויים. - ממיסים את חלקיקים ב PBS לריכוז סופי של HB 2 מ"ג / מ"ל. להזריק PBS, חינם HB, HB-NPS, או HB-P-צירופים דרך וריד הזנב (2 מ"ג / ק"ג כמו HB) פעמיים בימים 0 ו -7.
- שמור התבוננות העכברים עד שהם מתחילים לנוע בכלוב.
הערה: אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד מלאהתאושש. שמור הכלובים כהים ובתנאי SPF ספציפיים. - 24 שעות לאחר כל זריקה, להרדים את העכברים עם זריקה ip של xylazine ותערובת של tiletamine ו zolazepam (1: 2, 1 מ"ל / ק"ג). אשר הרדמה תקינה על ידי צובט קפל קטן בעדינות של עור עכבר. השתמש במשחת וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
הערה: אם אין תנועה הוא ציין, החיה הוא הרדים מספיק כדי להתחיל את הניסויים. - מניח את אתר גידול תחת סיבי PDT (עם 1 סנטימטר של מרחק סיבי PDT אל הגידול). יש להרכיב משקפי בטיחות ליזר, לכבות את המתג, ולהאיר את הגידול עם ליזר PDT (630 ננומטר, 400 mW / cm 2) תמורת 500 שניות (200 J / cm 2) פעמים בימים 1 ו -8.
- שמור התבוננות העכברים עד שהם מתחילים לנוע בכלוב. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תחזור חיה יש undergonניתוח ה לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין.
- שמור הכלובים בתנאי SPF. לשמור על הכלובים בחושך במשך 24 שעות לאחר הטיפול בלייזר.
- מבחינה ויזואלית לפקח על נפח הגידול והשינויים באתר הגידול מדי יום. מדוד את גודל גידול עם מחוגה, ולחשב את הנפח כמו (אורך × רוחב 2) / 2 (3 מ"מ). צלמו תמונות של אתרי הגידול מדי יום כדי לבדוק אם קיימים שינויים משטח הגידול לאחר PDT.
- ביום 16, להקריב חמישה עכברים בכל קבוצה על ידי הרדמת מסוף באמצעות isoflurane.
- עם מלקחיים ומספריים, לחתוך את העור החיצוני ולחשוף הגידולים 15. בזהירות למסוק אותם. תקן אותם 10% פורמלין, להטביע אותם פרפין, להכתים אותם עם hematoxylin ו eosin (H & E) עבור ניתוח היסטולוגית 16.
- לאחר 45 ימים של ניטור, להקריב את העכברים הנותרים על ידי הרדמת מסוף באמצעות isoflurane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנו הוא HB-NPS ו HB-P-צירופים עם הטכניקות שהוזכרו לעיל. בקטרים הממוצעים של HB-NPS ו HB-P-צירופים היו 220.9 ± 3.2 ננומטר בכ- 211.9 ± 1.6 ננומטר, בהתאמה.
הכדאיות התא של תאים A549 לאחר 4 שעות של דגירה עם PBS, NPS ריק, HB-NPS, ו HB-P-צירופים ואחריו הקרנת אור (0 עד 16 J / cm 2) מוצג באיור 1. בלי אור, בקבוצת הטיפול HB-NP לא הראו רעילות בכלל, בעוד תאים שטופלו HB-P-NP הראה כדאיות התא 81.28 ± 0.14%. זה יכול להיות בגלל האפקט אנטי הסרטני של פקליטקסל, אשר שוחרר מן החלקיקים. תחת PDT, את הכדאיות תא הוקטנה בהתאם לזמן חשיפה לאור בשני HB-NP- ותאי HB-P-NP-מטופל. התאים שטופלו HB-P-NP והראו גדילת phototoxicity מאשר קבוצת HB-הצירופים באותם תנאי ההקרנה. כאשר 16 J / cm 2 של קרינה ניתנה, רק 7.52 ± 0.38% של התאים ששרדו בקבוצת הטיפול HB-P-NP.
התוצאות העקביות היו דמיינו עם Annexin V-FITC מכתים (איור 2). התאים אפופטוטיים הנגרמת PDT הוכתמו Annexin V-FITC, להביע פלואורסצנטי ירוק. האות פלואורסצנטי הירוקה החזקה זוהתה בתאי HB-P-NP-המטופלים באותם תנאי ההקרנה.
השלבים של תאים אפופטוטיים הנגרמת PDT סווגו על ידי cytometry הזרימה. חלקי פנים צביעה כפולה עם Annexin V-FITC ו PI, מוקדם תאים אפופטוטיים (V-FITC Annexin רק חיובי), מאוחר תאים אפופטוטיים (הן Annexin-V ו- PI חיובית) ותאי נמקי (רק PI חיובית) היו מכובדים. באותם תנאים PDT, החלק של תאים אפופטוטיים מאוחר הוגדל בקבוצת HB-P-NP שטופלו (איור 3).
"FO: keep-together.within-page =" 1 "> צמיחת גידול בשנת vivo בעכברים נושאי-גידול ריאות לאחר הזרקה תוך ורידית כפולה של PBS, חינם HB, HB-NPS, ו HB-P-צירופים ואחריו הקרנת אור היא שמוצג באיור 4. משטחי באתרי הגידול נבדקו גם (איור 5). העכברים שטופלו HB-P-NP הראה התגובות המהירות, כולל דימום ונמק, ואת צמיחת הגידול האיטי ביותר. יתר על כן, ניתוח היסטולוגית אישר את רוב תאי גידול נפגעו קשה היו בקבוצת טיפול HB-P-NP (איור 6).
איור 1:. במבחנת phototoxicity של תאי A549 תאי A549 טופלו PBS, NPS ריק, HB-NPS, או HB-P-NPS, ואת הקרנת אור ניתן 0, 5, 10, 20, 30, או 40 שניות (0, 2, 4, 8, 12, או 16 2 J / cm). תחת tהוא באותו זמן הקרנה, בקבוצת הטיפול HB-P-NP הראה phototoxicity גבוה יותר בקבוצת הטיפול HB-NP. ערכים באים לידי ביטוי כאמצעי ± סטיות תקן (SD; n = 3). *** P <0.001, לעומת הקבוצה שטופלה-PBS. ## P <0.01, p ### <0.001, בהשוואה לקבוצת הטיפול HB-NP. מעובד מתוך צ'אנג et al. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. ניתוח מיקרוסקופי של תאים A549 אפופטוטיים תאים A549 טופלו PBS, HB-צירופים או HB-P-NPS, ואת הקרנת אור ניתנה 0, 2, 4 או J / cm 2. הדו-כתם של DAPI (כחול, עמודה ראשונה) ו Annexin V-FITC (ירוק, עמודה שנייה) מצביעים גרעיניםו תאים אפופטוטיים, בהתאמה. HB-P-NP-תאים שטופלו הראו אותות קרינה ירוקים חזקים יותר תאי HB-NP-מטופלים באותם תנאי ההקרנה, מה שמעיד על phototoxicity הרבה יותר גבוה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר, גדלה = 100X. מעובד מתוך צ'אנג et al. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. ניתוח FACS של תאים A549 אפופטוטיים תאים A549 טופלו PBS, HB-NPS, או HB-P-NPS, ואת הקרנת אור ניתנה 0, 2, 4 או J / cm 2. התאים היו מסווגים לארבע קבוצות. אני) שניהם Annexin V-FITC- ותאי שלילי PI נחשבים ניזוק, ii) Annexin V-FITC חיובי ו PI-שלילי תאיםאפופטוטיים ראשונים הם, iii) הוא Annexin V-FITC- ותאי PI-חיובי הם אפופטוטיים מאוחר, iv) Annexin V-FITC שלילי PI חיוב תאים הם או מאוחר אפופטוטיים או נימקים. בהתאם ניתוח מיקרוסקופי, באותם תנאים הקרנה, התאים שטופלו HB-P-NP הראה phototoxicity גבוה יותר מאשר תאים HB-NP-מטופל, ורמות תאים אפופטוטיים מאוחר הוגדלו. מעובד מתוך צ'אנג et al. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. האזנת נפח גידול של עכברי A549 נושאי גידול בימים 0 ו -7, הזריקות הכפולות של PBS, חינם HB, HB-NPS, ו HB-P-צירופים בוצע. PDT (200 J / cm 2) היה performed 1 יום לאחר כל הזרקה, בימים 1 ו -8 הטיפולים הראו רמות שונות של השפעה טיפולית, עם HB <HB-צירופים <HB-P-NPS. ביום 45, בקבוצת טיפול HB-P-הצירופים הראה ירידת נפח גידול באופן משמעותי לעומת הקבוצות האחרות. ערכים מוצגים כאמצעי ± סטיות תקן (SD; n = 4). היקף הגידול (3 מ"מ) הוגדר (אורך × רוחב 2) / 2. מעובד מתוך צ'אנג et al. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. השינויים והציור על לאזור הגידול של עכברי נושאות גידולי A549 אתרי הגידול נוטרו לאחר זריקות תוך ורידים כפולים (בימים 0 ו -7) של PBS, חינם HB, HB-NPS, ו HB-P-צירופים עם 200 J / cm 2 הקרנת אור 1 יום לאחר כל זריקה (בימים 1 ו -8). הן HB-NPS ו קבוצות טיפול HB-P-הצירופים החל להראות תגובות למחרת PDT הראשון. בקבוצת הטיפול HB-P-צירופים הראה דימום חמור בהתפתחות המהירה של נמק. מעובד מתוך צ'אנג et al. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. ניתוח היסטולוגית של רקמות גידול בעכברי A549 נושאי גידול ביום 16, אישור היסטולוגית בוצע על ידי כתם H & E של רקמות גידול ניכרות. בקבוצת טיפול HB-P-הצירופים הדגימה את המוות של תאים סרטניים השלם ביותר. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר, הגדלה = 40X. מעובד מתוך צ'אנג ואח. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר במחקר זה הוא בחירת תנאי הליזר הנכון: גל, כוח, זמן הקרנה. אורך הגל הנכון של אור מתאים והחומר המבוקש הוא הכרחי עבור PDT. השתמשנו לייזר 630 ננומטר כי היה מתאים ב hypocrellin מתח היציאה היה גורם חשוב נוסף, אשר נקבע על 400 mW / cm 2 מבוסס על מחקרים טייס רבים. סמכויות פלט העולה על 400 mW / cm 2 פגום התאים או על פני העור של החיות בשל ההקרנה עצמו, בעוד כוחות הפלט שלהלן 400 mW / cm 2 היו חלשים מכדי הראה כל השפעה טיפולית. בפעמי ההקרנה המתאימות במבחנה במחקרי vivo היו 40 שניות (16 J / cm 2) ו -500 שניות (200 J / cm 2), בהתאמה. המרחק בין סיבי PDT לתאים או לרקמות הגידול של המודלים של בעלי החיים גם היה גורם קריטי במחקר זה. כדי לכסות את כל התא או משטח גידול עםאור, 1 סנטימטר נמצא המרחק האופטימלי.
אם פוטוסנסיטייזר שונה מוחל, שימוש של אורך הגל של אור הנכון יכול למקסם את יעילות PDT. שעת כוח הקרנת פלט צריכה להיות קבועה באמצעות ניסוי וטעייה. כאשר פני העור מתחילים לשרוף במהלך הקרנת האור, את הספק צריך להיות מוגדר נמוך. כאשר פני השטח הגידול מראה שום שינוי בכלל מחרתיים PDT, זה עשוי להצביע על כך שיש צורך להגדיל את הספק.
לשיטה זו מספר מגבלות. ראשית, אם כי המרחק בין סיבי PDT אל המטרה הוא גורם חשוב במחקר זה, קשה על מנת להבטיח אחידות. המרחק עשוי להשתנות מעט משום שהיא נשלטת על ידי בני אדם. שנית, עבור במודל החיה עם גידולים באיברים כגון ריאות, פרוטוקול זה קשה להחיל מאז אנדוסקופיה הכרחי ותנועת נשימה בלתי נמנע.
למרות כריתה כירורגית הוא הראשוןאפשרות לטיפול בסרטן הריאות, יש PDT מספר יתרונות כטיפול לא פולשני ולא ניתוחי חלופי. כשהמבצע אינו מתאים, כגון במקרי נגע מרובים, PDT יכול להיות אפשרות חוקית. כמו כן, לפני הניתוח PDT יכול להקטין את גודל הגידול ולהפחית את מידת ניתוח 17. יש PDT פחות תופעות לוואי בהשוואה ניתוח, הקרנות או ברכיתרפיה endobronchial. בנוסף, PDT אינה רלוונטית מוטציות המספקות עמיד הקרנות או כימותרפיה 18.
במחקר זה, הצענו שני חלקיקים במיקוד סרטן ריאות photosensitizer- ו נגד סרטן-כמוס תרופה כמערכת משלוח פוטוסנסיטייזר חדשנית PDT. תפיסה זו ניתן להחיל הפוטוסנסיטייזרים אחרים תרופות נגד סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי שום מענק. 14-2014-017 מהקרן למחקר SNUBH.
המחברים חייבים תודה ג'יי פטריק Barron, פרופ 'אמריטוס, האוניברסיטה הרפואית טוקיו ופרופסור נספח החולים Bundang האוניברסיטה הלאומית בסיאול לעריכה בהתנדבות שלו של כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oligo hyaluronic acid | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| adipic acid dihydrazide | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(chloromethyl)benzoyl chloride | Sigma Aldrich | 270784 | |
| Tween 80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| syringe filter | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm, RC, PP, 0.45 µm |
| triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex tubes | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| Paclitaxel | Taihua Corporations | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Inc. | 16140071 | |
| Celite (Filter agent) | Sigma Aldrich | 6858 | See step 1.4 |
References
- Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
- Huisman, C., et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460. Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K.
- Pass, H. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sutedja, T. G., Postmus, P. E. Photodynamic therapy in lung cancer. A review . J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).
- Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies. Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).
- Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T.
- Lee, S. J., et al. Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).
- Chang, J. E., et al. Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer. J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).
- Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer. J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).
- Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C.
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
- Penno, M. B., et al. Expression of CD44 in human lung tumors. Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).
- Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).
- Bannas, P., et al. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. J Vis Exp. (98), e52462 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Lam, S.
- Simone, C. B. 2nd, et al. Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).
