Protocol
HINWEIS: Alle Tierstudie Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Use Committee von der Seoul National University Bundang Krankenhaus genehmigt wurden (BA1308-134 / 072-01).
1. Synthese von Hyaluronsäure-Ceramid (HACE)
- Solubilisieren 12,21 mmol von Hyaluronsäure (HA) Oligomeren und 9,77 mmol Tetra- n -butylammonium Hydroxid (TBA) in 60 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW). Rühre 30 min.
- Um die DS-Y30-Linker synthetisiert, aufzulösen 8,59 mmol DS-Y30 Ceramid und 9,45 mmol Triethylamin in 25 ml Tetrahydrofuran (THF). Mix mit 8,59 mmol 4-Chlormethylbenzoylchlorid in THF. Rühre 6 Stunden bei 60 ° C.
- Löse das synthetisierte 8.10 mmol HA-TBA und 0,41 mmol des DS-Y30 Linkers in einem Gemisch aus THF und Acetonitril (4: 1, v / v). Rühre 5 Stunden bei 40 ° C.
- Entfernen von Verunreinigungen mit einem Filtermittel Filterung und Beseitigung des organischen Lösungsmittels durch Vakuumverdampfung. Reinige das Produkt eine Dialysemembran (Molekulargewichts-Cut-off: 3,5 kDa) und lyophilisieren.
2. Herstellung der Nanoteilchen
- Man löst 1 mg HB und 1 mg Paclitaxel in 0.5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und Mischung mit 0,5 ml DDW durch Vortex-Mischen für 5 min. Dann solubilisieren HACE in diesem Gemisch durch Wirbelmischen für weitere 5 min.
- Um das Lösungsmittel, Wärme bei 70 ° C für 4 Stunden unter einem schwachen Stickstoffgasstrom zu eliminieren.
- Resuspendieren Film, der aus HACE, HB, und Paclitaxel mit 1 ml DDW. Filter mit einem Spritzenfilter (0,45 & mgr; m Porengröße) zu offenen Drogen zu entfernen.
3. In - vitro - Phototoxizität
- Aufnahme von Nanopartikeln in Lungenkrebszelllinien
- Bereiten RPMI-1640-Medium enthaltenden 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 1% (w / v) Penicillin-Streptomycin.
- Seed A549 - Zellen in 24-well Zellkulturplatten in einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen / Vertiefung (Triplikaten für jedeGruppe). In einem befeuchteten 5% CO 2 und 95% Luftatmosphäre bei 37 ° C für 24 Stunden inkubieren.
- Nach Zellanheftung, um das Medium zu entfernen und die Zellen zu waschen, indem 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Man löst die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 & mgr; M / ml HB. Dann brüten die Zellen mit 1 ml PBS, leer NPs, HB-NPs oder HB-P-NPs in jeder Vertiefung für 4 Stunden im Dunkeln.
- Entfernen all der Lösung und Waschen der Zellen durch Zugabe von 1 ml kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. In frischem Kulturmedium.
- Die Lebensfähigkeit der Zellen-Assay
- Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) im Dunkeln für verschiedene Zeiträume: 0, 5, 10, 20, 30 und 40 Sekunden (0, 2, 4 , 8, 12 und 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln.
- Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- Fügen Sie 10 & mgr; l der Zytotoxizität Messlösung in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln für 2 Stunden.
- Messen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Reader.
- Die mikroskopische Analyse
- Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) im Dunkeln für 0, 20 oder 40 Sekunden (0, 8, oder 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln.
- Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- Je 50 ul von Annexin V-FITC und 50 ul 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1,5 ug / ml). Die Platte vorsichtig schütteln und für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
HINWEIS: Verwenden Sie Annexin V-FITC aus dem Fluoreszenzmikroskop-Kit. - Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Halten Sie die Zellen in frischem PBS. Identifizieren Sie die apoptotischen Zellen unter Verwendung von Lichtmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung.
- Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Analyse
- Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) für 0, 20 oder 40 Sekunden (0, 8, oder 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln.
- Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1 × Bindungspuffer (verdünnt 1 Teil des 10x Bindungspuffer, 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, und 25 mM CaCl 2 bis 9 Teile destilliertes Wasser) und den Transfer 100 ul der Probenlösung auf eine 5-mlKulturröhrchen.
- In 5 ul von Annexin V-FITC und 5 ul Propidiumiodid (PI). Ziehen Sie das Rohr verwirbeln und für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln inkubiert. In 400 ul 1 × Bindungspuffer.
HINWEIS: Verwenden Sie Annexin mit V-FITC und PI aus dem Fluoreszenzmikroskop-Kit. - Identifizieren Sie die apoptotischen Zellen durch FACS unter Verwendung von 14. Die Anregungslaserlinien von PI und Annexin V-FITC sind 488 nm und 635 nm. Messen der Fluoreszenzemission von PI und Annexin V-FITC bei 610 ± 20 nm und 660 ± 20 nm. Sammeln Sie die erworbenen Zellen auf dem Durchflusszytometer pro 10.000 Veranstaltungen.
4. In vivo Wirksamkeit gegen Krebs in Tumor-tragenden Mäusen
- Lungenkrebs-induzierte Mausmodell
- Vorbereitung 1 × 10 6 A549 - Zellen in 0,1 ml RPMI-1640 - Medium; halten Sie es in Eis.
- Anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten. - Injizieren Sie die Zellen subkutan in die linken Flanken von Balb / C männliche Nacktmäuse (6 - 7 Wochen alt, 20 bis 22 g).
- Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt hat. Halten Sie die Mäuse unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen. - Messen Sie die Größe des Tumors mit täglich Sätteln. Berechnen Sie den Tumorvolumen (mm 3) als (Länge × Breite 2) / 2. Wenn die Tumorgröße etwa 200 mm 3 im Volumen erreicht, das Experiment zu starten.
- Anti-Krebs-Wirksamkeitsstudie
- Teilen Randomly die Mäuse in 4 Gruppen (n = 10 pro Gruppe).
- Anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten. - Man löst die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml HB. Injizieren PBS, frei HB, HB-NPs oder HB-P-NPs über die Schwanzvene (2 mg / kg als HB) zweimal an den Tagen 0 und 7.
- Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig durchlaufen hatzurückgewonnen. Halten Sie die Käfige dunkel und unter bestimmten Bedingungen SPF. - 24 Stunden nach jeder Injektion anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten. - Platzieren Sie den Tumor unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser auf den Tumor). Tragen Laserschutzbrille, drehen Sie den Schalter ab und beleuchten den Tumor mit einer PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) für 500 sec (200 J / cm 2) zweimal an den Tagen 1 und 8.
- Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die Renovierungsarbeite hate Chirurgie an der Gesellschaft von anderen Tieren, bis sie vollständig erholt.
- Halten Sie die Käfige unter SPF Bedingungen. Pflegen Sie die Käfige im Dunkeln für 24 Stunden nach der Laserbehandlung.
- Optisch überwachen jeden Tag das Tumorvolumen und die Änderungen an der Tumorstelle. Messen Sie die Größe des Tumors mit einer Schieblehre, und berechnen Sie die Lautstärke (Länge × Breite 2) / 2 (mm 3). Machen Sie Fotos von den Tumorstellen für Tumoroberflächenveränderungen nach der PDT jeden Tag überprüfen.
- Am Tag 16, opfern fünf Mäuse pro Gruppe von Terminal Anästhesie mit Isofluran.
- Mit einer Pinzette und Schere, schneiden Sie die Außenhaut und setzen die Tumore 15. Sorgfältig ernten. Fix sie in 10% Formalin, betten sie in Paraffin und färben sie mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) für die histologische Analyse 16.
- Nach 45 Tagen der Überwachung, opfern, um die restlichen Mäuse durch Klemme Narkose mit Isofluran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir bereiteten sowohl HB-NPs und HB-P-NPs mit den oben genannten Techniken. Die mittleren Durchmesser von HB-NPs und HB-P-NPs waren 220,9 ± 3,2 nm und 211,9 ± 1,6 nm.
Die Lebensfähigkeit der Zellen von A549 - Zellen nach 4 h Inkubation mit PBS, leere NPs, HB-NPs und HB-P-NPs durch Bestrahlung mit Licht gefolgt (0 bis 16 J / cm 2) ist in Abbildung 1. Ohne Licht gezeigt, ist die HB-NP zeigte Behandlungsgruppe überhaupt keine Zytotoxizität, während HB-P-NP-behandelten Zellen zeigte 81,28 ± 0,14% Lebensfähigkeit der Zellen. Dies kann auf die Antikrebswirkung von Paclitaxel zurückzuführen sein, die von den Nanopartikeln veröffentlicht wurde. Unter PDT wurde die Lebensfähigkeit der Zellen verringert entsprechend der Belichtungszeit in beiden HB-NP- und HB-P-NP-behandelten Zellen. Die HB-P-NP-behandelten Zellen zeigten eine Phototoxizität als die HB-NPs Gruppe unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen erhöht. Wenn 16 J / cm 2 der Bestrahlung gegeben wurde, nur 7,52 ± 0,38% der Zellen überlebten in der HB-P-NP-Behandlungsgruppe.
Die konsistente Ergebnisse wurden mit Annexin V-FITC - Färbung (Abbildung 2) sichtbar gemacht . Die PDT-induzierten apoptotischen Zellen wurden mit Annexin V-FITC gefärbt, grüne Fluoreszenz ausdrückt. Das stärkste grüne Fluoreszenzsignal wurde in den HB-P-NP-behandelten Zellen unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen nachgewiesen.
Die Stufen der PDT-induzierten apoptotischen Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie klassifiziert. Durch die Doppelfärbung mit Annexin V-FITC und PI, früh apoptotischen Zellen (nur Annexin V-FITC-positiv), spät apoptotischen Zellen (sowohl Annexin-V und PI-positiv) und nekrotischen Zellen (nur PI positiv) unterschieden. Unter den gleichen Bedingungen PDT wurde der Anteil der späten apoptotischen Zellen in der HB-P-NP-behandelten Gruppe (3) erhöht.
"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> In vivo Tumorwachstum in der Lunge tumortragenden Mäusen nach Doppel intravenöse Injektion von PBS, frei HB, HB-NPs und HB-P-NPs durch Bestrahlung mit Licht gefolgt ist in Figur 4 gezeigt. die Oberflächen der Tumorstellen wurden ebenfalls untersucht (Abbildung 5). die HB-P-NP-behandelten Mäusen die schnellsten Reaktionen zeigten, einschließlich Blutungen und Nekrose und das Wachstum langsamsten Tumors. außerdem bestätigt die histologische Analyse der am stärksten geschädigten Tumorzellen wurden in der HB-P-NP - Behandlungsgruppe (Abbildung 6).
Abb . 1: In - vitro - Phototoxizität von A549 - Zellen A549 - Zellen mit PBS, leere NPs behandelt wurden, HB-NPs oder HB-P-NPs und Lichtbestrahlung wurde für 0, gegeben 5, 10, 20, 30 oder 40 sec (0, 2, 4, 8, 12, oder 16 J / cm 2). Unter ter gleichen Bestrahlungszeit, die HB-P-NP-Behandlungsgruppe zeigten eine höhere Phototoxizität als die HB-NP-Behandlungsgruppe. Die Werte sind ausgedrückt als Mittelwert ± Standardabweichungen (SD; n = 3). *** P <0,001 im Vergleich zu der PBS-behandelten Gruppe. ## P <0,01, ### p <0,001 im Vergleich zum HB-NP - Behandlungsgruppe. Angepasst von Chang et al. 10 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 2: Die mikroskopische Analyse von apoptotischen Zellen A549 A549 - Zellen wurden mit PBS, HB-NPs oder HB-P-NPs behandelt und Bestrahlung mit Licht wurde für 0 gegeben, 2 oder 4 J / cm 2. Die Doppel-Fleck von DAPI (blau, erste Spalte) und Annexin V-FITC (grün, zweite Spalte) zeigen Kerneund apoptotischen Zellen. Die HB-P-NP-behandelten Zellen zeigten stärkere grüne Fluoreszenzsignale als die HB-NP-behandelten Zellen unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen, was auf eine deutlich höhere Phototoxizität. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m, Vergrößerung = 100X. Angepasst von Chang et al. 10 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 3: FACS Analyse von apoptotischen Zellen A549 A549 - Zellen wurden mit PBS, HB-NPs oder HB-P-NPs behandelt und Bestrahlung mit Licht wurde für 0 gegeben, 2 oder 4 J / cm 2. Die Zellen wurden in vier Gruppen eingeteilt. I) Sowohl Annexin V-FITC und PI-negative Zellen sind unbeschädigte, ii) Annexin V-FITC-positive und PI-negativen Zellen betrachtetsind früh apoptotische, iii) sowohl Annexin V-FITC und PI-positive Zellen sind späte apoptotische und iv) Annexin V-FITC-negativen und PI-positive Zellen sind entweder späten apoptotischen oder nekrotischen. In Übereinstimmung mit der mikroskopischen Analyse unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen zeigten die HB-P-NP-behandelten Zellen höhere Phototoxizität als die HB-NP-behandelten Zellen und späten apoptotischen Zellspiegel wurden erhöht. Angepasst von Chang et al. 10 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 4: Tumorvolumen Überwachung von A549 tumortragenden Mäusen an den Tagen 0 und 7, die Doppel Injektionen von PBS, frei HB, HB-NPs und HB-P-NPs wurden durchgeführt. Die PDT (200 J / cm 2) war performed 1 Tag nach jeder Injektion an den Tagen 1 und 8. Die Behandlungen zeigten unterschiedliche Ebenen der therapeutischen Wirkung, mit HB <HB-NPs <HB-P-NPs. Am Tag 45 zeigte die HB-P-NPs Behandlungsgruppe eine signifikant Tumorvolumen im Vergleich zu den anderen Gruppen verringert. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichungen (SD; n = 4). Das Tumorvolumen (mm 3) wurde als (Länge × Breite 2) / 2. von Chang et al Angepasst definiert. 10 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 5: Die Oberflächenveränderungen an der Tumorstelle der A549 tumortragenden Mäusen Die Tumorstellen wurden nach Doppel intravenöse Injektionen überwacht werden (an den Tagen 0 und 7) von PBS, frei HB, HB-NPs und HB-P-NPs mit 200 J / cm 2 Lichtbestrahlung 1 Tag nach jeder Injektion (an den Tagen 1 und 8). Sowohl die HB-NPs und die HB-P-NPs Behandlungsgruppen gestartet Reaktionen nach der ersten PDT den Tag zu zeigen. Die HB-P-NPs Behandlungsgruppe zeigten schwere Blutungen und die schnellste Entwicklung von Nekrosen. Angepasst von Chang et al. 10 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6:. Die histologische Analyse von Tumorgewebe in A549 tumortragenden Mäusen am Tag 16, die histologische Bestätigung wurde durch eine H & E - Färbung von exzidierten Tumorgewebe durchgeführt. Die HB-P-NPs Behandlungsgruppe zeigte die vollständigste Tod von Tumorzellen. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m, Vergrößerung = 40X. Angepasst von Chang et al. 10 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der wichtigste Schritt in dieser Studie ist die Auswahl der richtigen Laserbedingungen: Wellenlänge, Leistung und Bestrahlungszeit. Die richtige Wellenlänge des Lichts, geeignet für die spezifische Photosensibilisator für die PDT notwendig. Wir haben eine 630-nm - Laser, der für Hypokrellinverbindung B. Die Ausgangsleistung angemessen war , war ein weiterer wichtiger Faktor, der bei 400 mW / cm 2 basiert auf vielen Pilotstudien festgelegt wurde. Ausgangsleistungen von mehr als 400 mW / cm 2 , um die Zellen oder die Hautoberfläche der Tiere aufgrund der Bestrahlung selbst beschädigt, während Ausgangsleistungen unter 400 mW / cm 2 waren zu schwach , eine therapeutische Wirkung zu zeigen. Die geeigneten Bestrahlungszeiten für die in vitro und in vivo Studien wurden 40 sec (16 J / cm 2) und 500 s (200 J / cm 2), respectively. Der Abstand von der PDT Faser zu den Zellen oder den Tumorgeweben der Tiermodellen auch ein kritischer Faktor in dieser Studie. die gesamte Zelle oder Tumoroberfläche zu bedecken mit derLicht wurde 1 cm der optimale Abstand erwiesen.
Wenn eine andere Photosensibilisator angewendet wird, kann die Verwendung der geeigneten Wellenlänge von Licht, um die PDT Wirksamkeit maximieren. Die Ausgangsleistung und der Bestrahlungszeit sollte durch Versuch und Irrtum festgelegt werden. Wenn die Hautoberfläche während der Bestrahlung mit Licht zu brennen beginnt, sollte die Ausgangsleistung niedriger eingestellt werden. Wenn die Tumoroberfläche keine Veränderung an den ganzen Tag nach der PDT zeigt, kann es die Notwendigkeit anzuzeigen, die Ausgangsleistung zu erhöhen.
Dieses Verfahren hat einige Einschränkungen. Erstens, obwohl der Abstand von der PDT Faser zu dem Ziel ein wichtiger Faktor in dieser Studie ist, ist es schwer für Einheitlichkeit zu sorgen. Der Abstand kann leicht variieren, weil sie von Menschen gesteuert wird. Zweitens für das Tiermodell mit Tumoren in Organen wie der Lunge, ist dieses Protokoll schwierig anzuwenden, da die Endoskopie notwendigen und Atembewegung unvermeidlich ist.
Obwohl die chirurgische Resektion ist die ersteOption für die Behandlung von Lungenkrebs, hat mehrere Vorteile PDT als nicht-invasive und nicht-chirurgische Behandlungsalternative. Wenn der Betrieb nicht geeignet ist, wie beispielsweise in mehreren Fällen Läsion, kann PDT eine gültige Option. Auch präoperative PDT kann die Tumorgröße zu reduzieren und den Grad der Operation 17 zu verringern. PDT hat weniger Nebenwirkungen bei der Operation, Strahlentherapie verglichen, oder endobronchiale Brachytherapie. Zusätzlich ist PDT Mutationen irrelevant , die Resistenz gegen 18 Strahlentherapie oder Chemotherapie bereitzustellen.
In dieser Studie schlug vor, wir beide photosensitizer- und Anti-Krebs-Wirkstoff-verkapselte Lungenkrebs gezielte Nanopartikel als neuartige Photosensibilisator Abgabesystem für die PDT. Dieses Konzept kann auf andere Photosensitizer und Krebsmedikamente eingesetzt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von Zuschuss nicht unterstützt. 14-2014-017 von der SNUBH Research Fund.
Die Autoren danken J. Patrick Barron, Professor Emeritus, Tokyo Medical University und Adjunct Professor, Seoul National University Bundang Krankenhaus für seine Pro - bono - Bearbeitung dieses Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oligo hyaluronic acid | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| adipic acid dihydrazide | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(chloromethyl)benzoyl chloride | Sigma Aldrich | 270784 | |
| Tween 80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| syringe filter | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm, RC, PP, 0.45 µm |
| triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex tubes | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| Paclitaxel | Taihua Corporations | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Inc. | 16140071 | |
| Celite (Filter agent) | Sigma Aldrich | 6858 | See step 1.4 |
References
- Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
- Huisman, C., et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460. Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K.
- Pass, H. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sutedja, T. G., Postmus, P. E. Photodynamic therapy in lung cancer. A review . J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).
- Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies. Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).
- Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T.
- Lee, S. J., et al. Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).
- Chang, J. E., et al. Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer. J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).
- Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer. J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).
- Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C.
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
- Penno, M. B., et al. Expression of CD44 in human lung tumors. Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).
- Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).
- Bannas, P., et al. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. J Vis Exp. (98), e52462 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Lam, S.
- Simone, C. B. 2nd, et al. Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).
