Summary
Behavioral testing er gullstandarden for å avgjøre utfall etter hjerneskade, og kan identifisere tilstedeværelsen av utviklingshemming hos spedbarn og barn. Nevrologiske reflekser er et tidlig tegn på disse abnormaliteter. En rekke lett dyktig utviklings refleks tester i nyfødt gnager ble utviklet og beskrevet her.
Abstract
Neurodevelopmental refleks testing er vanlig brukt i klinisk praksis for å vurdere modning av nervesystemet. Nevrologiske reflekser er også referert til som primitive reflekser. De er følsomme og konsistent med senere utfall. Unormale reflekser er beskrevet som et fravær, persistens, tilbakekomst, eller ventetid av reflekser, som er prediktive indeksene for spedbarn som har høy risiko for nevrologiske lidelser. Dyremodeller av nevrologiske handikap, for eksempel cerebral parese, ofte vise avvikende utviklings reflekser, som ville bli observert i menneskebarn. De teknikker som er beskrevet vurderer en rekke nevrologiske reflekser i neonatale rotter. Neurodevelopmental refleks testing tilbyr etterforsker en testmetode som ellers ikke er tilgjengelig i slike unge dyr. Metodikken som presenteres her tar sikte på å hjelpe etterforskerne i å undersøke utviklingsmessige milepæler i neonatale rotter som en metode for å påvise tidlig debut brain skade og / eller bestemmelse av effekten av terapeutiske inngrep. Metodikken som presenteres her tar sikte på å gi en generell retningslinje for etterforskerne.
Introduction
Nevrologiske reflekser, eller utviklingsmessige milepæler, er en av de tidligste vurderingene som brukes på menneskelige nyfødte og spedbarn. Nevrologiske reflekser er ufrivillige og repeterende bevegelser som viser hjernestammen og ryggmargen reflekser. Modning av høyere kortikale nettverk som kjennetegnes ved å utvikle migrasjon, myelinisering, og synaptogenesis fremme frivillig kontroll og kortikale inhibering. Endringer i den normale progresjon av sentralnervesystemet utvikling kan forstyrre utviklingen av hjernen, noe som resulterer i unormal kortikal ledninger, fungerer, og myelinering, forårsaker nevrologiske refleks forsinkelser eller fravær. Spebarn med høy risiko for utvikling av nervesystemet uførhet ofte vise unormale tidlige reflekser. Unormale reflekser som kan presentere en forsinkelse i anskaffelse, fravær, forlenget nærvær eller tilbakekomst senere i livet, og er prediktive for utviklingshemming. 1, 2 DerforEr det viktig å etterligne refleks forsinkelser i eksperimentelle modeller av nevrologiske funksjonshemninger.
Gnagere blir ofte anvendt som eksperimentelle modeller. Rotteunger er altricial når født, og derfor for umoden til å gjennomføre spesifikke eller kompleks motor, sensoriske og / eller kognitive atferds oppgaver. I denne forbindelse, deres utviklings umodenhet gjelder både deres fysiske og organutvikling. Rotter er født naken med en manglende evne til å thermoregulate, er blinde, og ute av stand til å gå. Med henvisning til hjernens utvikling, oppstår betydelig kortikal modning fødselen. Nyfødte rotteunger (dagen for fødsel referert til som postnatal dag 1; PD1) har blitt foreslått for å oppnå et hjerne modningsnivå som er lik en tidlig menneskelige hjerne av 23 - 28 ukers svangerskap, mens PD7-10 valpene er ekvivalent med nær- Betegnelsen human hjerne. 3, 4, 5, 6Denne korrelasjonen er basert på brutto anatomiske analyser, men andre mål på hjerne modning som myelinisering og amplitude integrert electroencephalograms er også blitt beskrevet. 5, 7 kan for eksempel pre-oligodendrocytter er de dominerende cellene i utviklingen av human føtal hjerne fra 23 - 32 uker i livmoren, og dette modningstrinnet svarer til en PD1-3 gnager. 5, 8, 9, 10 Videre begynner myelinisering i livmoren hos mennesker, mens i rotteunger vises det i forhjernen rundt PD7-10; den nyfødte gnagerhjerne forblir stort sett u-myelinerte. 11, 12 Tucker et al. funnet at amplituden integrerte elektroencefalogram mønster av et P1 rotte til å være lik en 23-ukers Gestasjon humant foster, mens en PD7 og PD10 pup er beslektet med en 30-32 uke og fullbårne barn, henholdsvis. 7. Av disse grunner gir nyfødt refleks testing i neonatale rotteunger en mulighet for å fange ontogeny og / eller forstyrrelse av hjernens utvikling.
Batteriet av reflekser er beskrevet nedenfor, tilpasset fra studier av WM Fox og A. Lubics 13, 14 WM Fox var en av de tidligste søkerne med hensyn til ontogeny av reflekser hos mus. 13 Disse reflekser omfatter, men er ikke begrenset til, lem gripe og plassere, klippe unngåelse, rettende, akselerert rettende, gangart, auditorisk sjokk, holdning, og øynene åpne. Både forbena og bakbena grep (referert til som palmar og plantar grep hos mennesker, henholdsvis) er tilrettelagt av spinale reflekser og corticospinal inhibering av ikke-primære motoriske områder. 15, 16 i bakbenet emisjon (plantar refleks) reflekterer modning av corticospinal kanalen. 16, 17, 18 Cliff unngåelse (beskyttende respons), rettende (labyrinten), og akselerert rettende involverer integrasjon og kommunikasjon mellom sanseinntrykk og motor utgang (slik som de som er involvert med den vibrissae og vestibulære systemer). 19, 20, 21 reflekterer Gait bevegelse. 14 Auditory skremme vurderer akustisk stimulering og synaptiske forbindelser gigant-nevroner i nukleus reticularis Pontis caudalis. 21 holdning omfatter egnede kortikale-spinal / rygg-cortical spring, muskelstyrke og nevromuskulær innervasjon. 22, 23 Maturation av gamma-aminosmørsyre-reseptorer kan korrelere med øynene åpne. 24 Det er viktig å huske på at refleksene gjenspeiler en mye mer komplisert nettverk og gitt her er en generell sammenheng. Videre disse refleksene gir en rask og enkel metode for å vurdere nevrologisk utvikling hos svært unge alder der mer komplekse atferds testing er ikke gjennomførbart.
Formålet med denne artikkelen er å tilveiebringe en generell retningslinje for utvikling av nervesystemet refleks testing som lett kan innlemmes i eksperimentelle neonatale rottestudier. Metodikken beskrevet ble utført i Long-Evans neonatal rotteunger og kvantifisering av resultatene var basert på første dag av utseende. Den dagen refleks testing initieres og det anvendte utstyr kan modifiseres for å bedre passe til en annen eksperimentell modell (for eksempel for forskjellige stammer og arter). Ved å etablere den normale fysiologiske progresjon av reflex modning i en spesiell dyremodell, kan forskere evaluere virkningene av eksterne stress, endogene manipulasjoner, og / eller terapeutiske intervensjoner på neurodevelopment i neonatale rottemodeller. Alt i alt er bruken av reflekser som en bestemmelse av hjerne modenhet fordelaktig å forutsi perinatal hjerneskade, og er reflekterende av senere nevrologisk utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care og bruk Committee, Health Sciences ved University of Alberta godkjent alle dyrestudier.
Merk: Selv om denne protokollen kan tilpasses andre arter og stammer, er denne protokollen skrevet for Long-Evans rotter. Disse rotter har vist seg å ha overlegne motoriske ytelser og synsstyrke sammenlignet med andre stammen av gnagere. 25, 26 Protokollen for tidsbestemt svangerskap, kosttilskudd, mors inflammasjon, nevrologiske og reflekser er som følger.
1. forsøksdyr
- Når rottene kommer til dyret boliger anlegget, avstå fra enhver interaksjon for en dag eller to for å tillate dem å akklimatisere seg til sitt nye miljø. Etter akklimatisering, håndtere rottene hver dag i cirka fem dager, eller når rottene er ikke lenger viser tegn til stress. Human-indusert stress kan forandre testresultater og leannonsen til graviditet tap.
- Når rottene er komfortable, begynner avl. Plassere to hunner og en hannrotte i en dobbel Decker ynglekassen (h = 38 cm, 1800 cm 2 gulvareal) over natten (3 PM - 8 AM). Disse burene forebygge stress og overbefolkning. Om morgenen ved hjelp av en overføring pipette, skylles vagina hos de hunnrotter med omtrent 0,25 ml saltvann. Overfør løsningen til et mikrosentrifugerør.
- Plasser de to tisper og hann tilbake til sine respektive konvensjonelle bur.
- Se den løsning som utvinnes i seksjon 1.2 under et lysmikroskop (100X) for å bestemme hvilket stadium av brunst rotte opplever og hvorvidt eller ikke spermier er til stede. Dersom det finnes sæd, registrere datoen som embryonisk dag (E1) (figur 1). Hvis du er gravid, gi den kvinnelige sitt eget bur på E14.
MERK: Cellene i vaginalutstryket er derfor klart bruke en lav lys innstilling. Sikre at kondensatoren blir justert til sin laveste innstilling. annonsebare den lysstyrkekontroll for å dempe lyset. Hvis en lysstyrke dial er tilgjengelig, sette den til en.
2. Kosttilskudd
MERK: Denne protokollen er ment til å vurdere den terapeutiske effekten av kost brokkoli spire forbruket i løpet av siste uke av svangerskapet. Grow spirer ifølge Wu et al. 27.
- Suge brokkoli spirer frøene til 2 - 3 timer. Spredning av frøene ut på en disk frø sprouter boksen og satt på en varm overflate for spiring.
- Vanne frøene to ganger daglig, en gang i AM (8-9 AM) og en gang i PM (3-4 PM).
- På dag fem, plasserer spirer ved et vindu for dagen (spirer skal ha to blader hver, og vil bli grønn i løpet av dagen).
- På slutten av dagen, høste spirer ved å forsiktig trekke brokkoli spirer ut av siktet boksen og lå på et flatt underlag for å tørke.
- Når spirer er fullstendig tørket, weigh ut 200 mg og sted i en forseglet plastpose.
- Fra og med E14, mate hver drektige rotter 200 mg tørkede brokkoli spirer daglig inntil PD21 (dag unger blir avvent).
3. Betennelse
- For å indusere betennelse og reprodusere hvit substans skade i avkommet, injisere drektige rotter med lipopolysakkarid (LPS) hver 12 timer på E19 og E20. På dagen for injeksjon, ta buret inn i laboratoriet fra huset anlegget. La gravid rotte akklimatiseres og bli rolig i minst en time. Hvis en rotte viser kliniske tegn på permanent systemisk eller nyreskader, vil det bli avlives umiddelbart og fjernet fra studien.
- Veie gravid demningen.
- Oppløs 200 ug / kg LPS (serotype 0127: B8) i 100 ul saltvann. Aspirer oppløsning i en 1 ml sprøyte utstyrt med en 30 G nål ½.
- Bruk en ny nål til hver injeksjon. La løsningen å varme opp for et par min for å minimere ubehag.
- Spill tiden og injisere den gravide demningen intraperitonealt. Vekslende injeksjoner mellom sidene for å sikre jevn fordeling.
MERK: Machholz et al. beskriver riktige tilbakeholdenhet og injeksjonsprosedyrer. 28
4. Utviklings Reflex Tester
- På PD1 (dagen for fødsel), fjerne hvalper fra demningen og platefødselsvekt. Plasser valpene tilbake til sine respektive bur og flytte dem til dyret anlegget til PD3. Dette sikrer moder binding mellom demningen og pup.
- Spill refleks testing for pålitelig vurdering. Juster videokameraet slik at det har maksimal lukkerhastighet for ramme-for-ramme analyser (1 / 1.000 s). Plasser videokameraet slik at den er rett over eller ved siden av rotteunge og alle materialer som brukes for hver refleks. For eksempel, for bakbenet plassering, plassere kameraet ved rotteunge for å sikre at løfting og plassering av bakbenområdet er tatt.
- For akselerert rettende, plassere kameraet over rotteunge og landing puten for å registrere evnen til pup til høyre i luften.
- Rekord vekter daglig inntil slutten av forsøket. På PD3, begynne neurodevelopmental refleks testing (figur 4). Beveg bur inn i et stille rom i minst 1 time før testing for å tillate tilpassing til miljøet.
- Utfør neurodevelopmental refleks testing på en konsekvent tid hver dag som rotter er nattdyr. For eksempel, test mellom 9 AM - 24:00 hver dag. Hold valpene direkte under en varmelampe eller på en varmepute til enhver tid, for å opprettholde en stabil kroppstemperatur på 36,5 ° C; rotteunger i denne alderen mister varme lett. Mål med en rektal temperaturprobe. Hvis det gjøres effektivt, trenger valpene kroppstemperaturen ikke endres fordi de ikke er fjernet fra demningen og søppel lenge nok. MERK: Overvåk temperaturen på varmelampe for å sikre at det ikke overstiger 37 ° C.
- forbena fatte
- Begynnelsen på PD3, gjennomføre forbena grep refleks test. Plasser en stump stang mot håndflaten av hver forpoten og bruke et lett trykk manuelt. Den lette trykket bør lett forskyve forpoten for å sikre at det dannes kontakt og valpene kan føle stangen. Gripe vises som fleksjon av alle tall rundt stangen. Vellykkede oppkjøpet av denne refleksen skjer når begge forpotene gripe stangen i to dager på rad.
- Resultat forbena grep:
0 for ingen gripe
1 for vellykket griping av en forpoten (venstre eller right forpoten kan spesifiseres her)
2 for vellykket grep av begge forpotene
- bakbenet fatte
- Begynnelsen på PD3, gjennomføre bakben grep refleks test. Plasser en stump stang mot sålen av hver bakpote, og bruke et lett trykk manuelt. Den lette trykket bør lett forskyve bakpote for å sikre at det dannes kontakt og valpene kan føle stangen. Vellykket gripingen av stangen vises som fleksjon av sifrene rundt stangen. Vellykkede oppkjøpet av denne refleksen skjer når begge bakpoter gripe stangen i to dager på rad.
- Resultat bakbenområdet grep:
0 for ingen gripe
1 for vellykket gripe etter en bakpote (venstre eller høyre bakpote kan angis her)
2 for vellykket grep av begge bakpoter
- rettende
- Begynnelsen på PD3, begynner den rettende refleks test. Hold fast valpen i liggende stilling, med alle fire poter oppreist. La gå of valpen og umiddelbart starte timeren. Rettende oppnås når pup er i stand til flip / rulle over på alle fire poter, og hver labb er vinkelrett på legemet. Gi hver valp maksimalt 15 s for å oppnå dette målet.
- Resultat rettende:
0 til å ligge på baksiden (eller 15 s for den maksimalt tildelte tids)
1 til å ligge på den side (venstre eller høyre side kan angis her) eller evne til pup til høyre, men i feil stilling (eller 15 s for den maksimalt tildelte tids)
2 for vellykket rettende og riktig holdning
- bakbenet plassering
- Begynnelsen på PD4, begynner bakbenområdet plassere refleks test. Hold valpen vertikalt i luften, med overkroppen. Stryk dorsum av bakpote med en butt overflate (for eksempel kanten av et bord). En riktig plassering refleks er når den rotteunge trekker det stimulerte bakben, etterfulgt av plassering av bakben ned på denne overflate.
- Resultat bakbenområdet placing refleks:
0 for ingen suksess
1 for plassering av en bakpote (venstre eller høyre bakpote kan angis her)
2 for vellykket bakbenet plassering for begge bakpoter
- Cliff Avhold
- Begynnelsen på PD4, begynner klippen unngå testing. Plasser rotteunge ved kanten av en flat overflate, slik at forpotene og snute på pup er over kanten. Den korrekte resultatet er en beskyttende respons, hvor det rotteunge vender seg bort fra kanten av klippen. Experimenter hånd eller et skum landing er plassert under klippen å fange pup fra fallet.
- Resultat klippen unngåelse:
0 til ingen bevegelse eller å falle utenfor kanten
1 for forsøk på å bevege seg bort fra klippen, men med hengende lemmer
2 for vellykket bevegelse bort fra stupet
- gangart
- Begynn evalueringen av gangart på PD6. Plasser valper i sentrum av en 15 cm diameter sirkel og la valpen 30 s å fullføre oppgaven. 14 En vellykket gangart utføres når rotteunge er i stand til å bevege seg både forlemmene utenfor sirkelen i mindre enn 30 sek.
- Resultat gangart som tiden i sekunder det tar rotta valpen til å bevege seg utenfor sirkelen. Spill tiden det tar valpen å flytte begge forpotene utenfor sirkelen. Rekord 30 s hvis valpen er ute av stand til å fullføre oppgaven innen en gitt tid
- auditiv Sjokk
- Begynn analyse av auditiv skremme på PD10. Presentere et høyt støynivå (bjelle) direkte over valpen for å vurdere hvorvidt en skremmeeffekt er til stede. En positiv skremmeeffekt observeres når pup viser et 'rykk' bevegelse, bort fra lyden.
- Resultat hørselsskremme:
(Eller ingen) for ingen skremmeeffekt
(Eller jo) for en positiv skremmeeffekt
- Holdning
- Begynn holdning analyse på PD12. Sett pups på en ikke-glatt med åpen overflate, og observere kroppsholdning pup har ved flytting. En umoden holdning reflekteres ved å dra av abdomen ved flytting, og vinkelrett peking av både forlemmene og bakpoter i forhold til legemet. En moden stilling oppnås når pup kan løfte magen fra overflaten og både forlemmene og bakpoter er spisse rett eller parallelt med legemet, ved flytting.
- Resultat holdning:
0 til ingen bevegelse
1 for umoden holdning ved flytting
2 for moden stilling under flytting
- Eye Åpning
- Begynn tankevekkende analyse på PD12. Spill dagen begge øyelokkene åpne:
0 for ingen synlige øyne
1 for en synlig øye (venstre eller høyre side kan angis her)
2 for to synlige øyne
- Begynn tankevekkende analyse på PD12. Spill dagen begge øyelokkene åpne:
- akselerert rettende
- Begynnelsen på PD14, begynner akselerert rettende testing. Plasser valpen i liggende stilling 30,48 centimeters over et skum landing. Slipp valpen og observere dens evne til å rette seg selv. Rettende refererer til når den pup er i stand til å slå over til liggende stilling og lande på potene.
- Resultat akselerert rettende:
0 for å falle på ryggen
1 for å falle på siden (venstre eller høyre side kan angis her)
2 for landing på potene
Merk: Ulike typer kvantifisering av reflekser er tilgjengelige avhengig av spørsmålet om etterforskerne. Kvantifisering av reflekser kan gjøres som første observasjon av en refleks, første dagen av utseende opp til forsvinningen av refleks, tiden det tar å kunne utføre oppgaven, hastigheten på ytelsen og / eller forbedring av ytelse over tid. 13, 14, 29, 30, 31 for C-jeldende studien, den første dag av utseende ble brukt som en poengsum. Ved bruk av flergangsmodeller, valper fra samme kull vanligvis oppfører seg på samme måte på grunn av deres genetiske sminke, in utero og postpartum miljø, og ernæringsmessige tilgjengelighet. 32 Derfor kan et enkelt pup ikke kan tas hensyn til som en n = 1 på grunn av søppel skjevhet. Unger undersøkt i løpet av et kull kan bli midlet, slik at hvert kull representerer en n = 1. 32, 33 Alternativt kan flere pups innenfor samme kull kan analyseres ved bruk av den blandede effekter modellen, som tar hensyn til pups innenfor samme kull. 32, 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidslinjen av denne eksperimentelle konstruksjon er presentert i figur 2. 30 Metodene og resultatene har tidligere vært publisert. 30 Målet med studien var å vurdere hvorvidt kosttilskudd med brokkoli spirer i drektighetstiden og den preweaning periode beskyttet avkom fra neurodevelopmental forsinkelse indusert ved in utero eksponering overfor LPS. Tidsbestemte gravide rotter ble gitt intraperitoneale injeksjoner av saltvann (kontroll, 100 uL) og LPS (200 ug / kg fortynnet i 100 ul sterilt saltvann) i E19 og E20 hver 12 timer. Tilfeldig valgte gravide dammer ble også gitt kosttilskudd av tørkede brokkoli spirer (200 mg / dag) fra E14 til PD21. LPS ble anvendt for å etterligne maternale betennelse og brokkoli spirer ble gitt som en potensiell terapeutisk intervensjon for å beskytte avkommet. Valpene ble født naturlig på E23 (
fødselsvekt
Analyse av fødselsvekt viste en hovedeffekt av behandlingen (F (1,23) = 18,5, 0,0003), diett (F (1,23) = 6,5, p = 0,02), og en interaksjonseffekt (F (1,23) = 7,4, p = 0,01). LPS, som en gjenspeiling av mors inflammasjon, resulterte i unger (5,1 ± 0,2 g) født betydelig mindre sammenlignet med saltløsning unger (6,3 ± 0,2 g, Tukey s p <0,001), saltløsning + brokkoli spirer unger (6,2 ± 0,2 g, Tukey s s <0,001), og LPS + brokkoli spirer unger (6.0 ± 0,1 g, Tukey s p <0,01). Fødselsvekt av LPS + brokkoli spirer unger var ikke forskjellig fra kontroller, noe som tyder på at brokkoli spirer spart LPS-avkom fra å bli veksten begrenses.
Neurodevelopmental Reflex Testing
fatte Reflex
Ingen effekt av behandling eller diett ble observert for begge forbena og bakbena fatte. Alle valpene var i stand til å utføre disse oppgavene.
bakbenet Plassering
En hovedeffekt av behandlingen (F (1,23) = 6,8, p = 0,02) ble påvist for plassering med bakbena. Sammenlignet med saltvann (4,3 ± 0,1 dager, Tukey s p <0,05) og saltløsning + brokkoli spirer (4,3 ± 0,0 dager, Tukey s p <0,05), ble LPS pups betydelig forsinket (5.1 ± 0.3dager). Selv om utførelsen av LPS + brokkoli spirer pups ikke var forskjellig fra LPS-unger, de ikke lenger var forskjellig fra kontroller, noe som tyder på en forbedring av denne oppgave refleks fra de unger som fikk LPS og ingen behandling.
Cliff Avhold
En hovedeffekt av behandlingen (F (1,25) = 6,0, p = 0,02) etter klippe unngåelsesanalyse ble påvist. LPS unger (5,8 ± 0,4 dager) ble signifikant nedsatt i å oppnå denne refleks sammenlignet med saltoppløsning (4,4 ± 0,2 dager, Tukey s p <0,05). LPS + brokkoli spirer pups ikke oppføre seg forskjellig fra enhver av gruppene, noe som antyder en forbedring i ytelse.
gangart
En signifikant effekt av behandling (F (1,24) = 15,1, p = 0,0007), diett (F (1,24) = 6,3, p = 0,02), og en intervirkning mellom behandling og diett (F (1,24) = 9,5, p = 0,005) ble funnet etter gangart analyser. En forsinket anskaffelse av gangart ble påvist i LPS unger (9,7 ± 0,4 dager) sammenlignet med saltvannsoppløsning (7,5 ± 0,3 dager, Tukey s p <0,001), saltløsning + brokkoli spirer (7,7 ± 0,3 dager, Tukey s p <0,001), og LPS + brokkoli spirer unger (7,9 ± 0,2 dager, Tukey s p <0,01).
auditiv Sjokk
Ingen forskjeller ble observert.
rettende
En sex effekt ble påvist (F (1,43) = 16,3, p = 0,0002) for rettende, derfor, hann og hunnvalper ble undersøkt hver for seg. Ingen forskjeller ble funnet for menn. Hos kvinner, en hovedeffekt av Diet (F (1,21) = 11,8, p = 0,002) og en interaksjonseffekt (F (1,21) = 15,6,p = 0,0007) ble funnet. LPS + brokkoli spirer unger (4,9 ± 0,4 dager) var i stand til rett tidligere i forhold til LPS-unger (6,7 ± 0,6 dager, Tukey s p <0,05).
akselerert rettende
Den akselererte rettende test viste en signifikant hovedeffekt av behandlingen (F (1,25) = 4,51, p = 0,04). LPS (17,4 ± 0,6 dager) og LPS + brokkoli spirer unger (16,9 ± 0,2 dager) ble forsinket i å utføre akselerert rettende sammenlignet med saltoppløsning (16,0 ± 0,4 dager) og saltløsning + brokkoli spirer (16,4 ± 0,5 dager).
Holdning
En signifikant interaksjon effekt av behandlingen og diett (F (1,24) = 5,8, p = 0,02) ble påvist følgende analyse av stilling. LPS + brokkoli spirer unger (14,9 ± 0,4 dager) hadde en moden holdning tidligere enn LPS (17,0 ± 0,4 dager, Tukey s p <0,05).
Eye Åpning
En signifikant hovedeffekt av diett (F (1,23) = 4,71, p = 0,04) ble observert i forhold til øynene åpne. Begge Saline + BrSp (15,9 ± 0,1 dager) og LPS + brokkoli spirer unger (15,4 ± 0,2 dager) oppnådd denne refleksen tidligere enn saltvann (16,0 ± 0,2 dager) og LPS unger (16,0 ± 0,1 dager).
Totalt brokkoli spire forbruk sent i svangerskapet og preweaning perioden var i stand til å ha råd til beskyttelse mot LPS-indusert utviklingsmessige forsinkelser i flere av reflekser undersøkt. Vennligst referer til den refererte artikkelen for ytterligere detaljer. 30
Figur 1. Pomerksomme Vaginal Smear. Et eksempel på en vaginalutstryket avbildes med et 10X objektiv linse på et lysmikroskop. Dette lysbildet er et positivt lysbilde indikert ved nærvær av sædceller (pil). Når man utfører en vaginalutstryket kan brunst hos rotter vurderes som enten proestrus, estrus, metestrus, eller diestrus. Dette bidrar til nøyaktig timing avl for en høyere graviditet suksessrate.
Figur 2. Experimental Design Tidslinje. Den eksperimentelle tidslinje for evaluering avkom av demninger gitt intraperitoneale injeksjoner av LPS. Kosttilskudd med brokkoli spirer begynner på E14 opp til PD21. Dammer injiseres på E19 og E20 hver 12. time (betegnet som gule piler). Maternelle vekter blir registrert med en vektskala og kroppstemperaturen med en rektal temperatur sonde som er dekket med smøremiddel. Ungene fødes naturally på E23 (betegnes som en svart pil). Begynnelsen på PD3 pups gjennomgå flere refleks testing. På PD21, pups gjennomgå den åpne felttest for å evaluere atferdsmessige responser.
Figur 3. Eksempel på en tidslinje for Vurdering av nevrologisk reflekser. Reflekser vises på ulike stadier av utviklingen, og dermed fange oppkjøpet av disse refleksene krever at testing begynne noen dager før. Denne studien brukte Long-Evans rotteunger, men forskjellene mellom stammer og arter finnes derfor en foreløpig eksperiment bør utføres ved hjelp av disse datoene som en generell veiledning. Forbena grep, bakbenet grep, og rettende vurderes på PD3, bakbenet plassering og klippe unngåelse på PD4, og gangart på PD6. Hørselsskremme vurderes PD10, holdning og øye åpninger på PD12, og akselerert rettende på PD14.
Figur 4. Bilder av Developmental Reflekser. Bilder av refleks testing utført på PD3 i Long-Evans rotteunger. Forbena grep (A), bakbenet grep (B), og rettende (C) eksamen starter på PD3. Cliff unngåelse (D) og i bakbenet plassering (E) testing begynner på PD4. Gait (F) analyser begynner på PD6. Apparatet for akselerert rettende er vist (G). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| undersøkelse Parameter | Grupper (gjennomsnitt ± SEM) | Viktigste effektene (p-verdi) | |||||
| Kull Størrelse og vekt | Saline | Saltvann + brokkoli spirer | LPS | LPS + brokkoli spirer | Behandling | Kosthold | Interaksjon |
| Kullstørrelse (antall unger) | 13.3 ± 1.0 | 13.1 ± 1.0 | 10.3 ± 1.5 | 11 ± 1.2 | 0,03 | 0.8 | 0.7 |
| Fødselsvekt * # d | 6.3 ± 0.2 | 6.2 ± 0.2 | 5.1 ± 0.2 | 6,0 ± 0,1 | 0,0003 | 0,02 | 0.01 |
| PD7 Vekter * d | 15,0 ± 0,5 | 15.5 ± 0.4 | 11.4 ± 1.1 | 13.6 ± 0.3 | 0,0006 | 0,09 | 0.2 |
| PD21 Vekter d | 50.0 ± 1.4 | 48,7 ± 1,6 | 46.4 ± 1.2 | 48.2 ± 1.4 | 0.2 | 0.9 | 0.3 |
| Neurodevelop- mentale Reflekser | |||||||
| Forbena tak en | 3.0 ± 0.0 | 3.0 ± 0.0 | 3.0 ± 0.0 | 3.0 ± 0.0 | n / a | n / a | n / a |
| Bakbenet tak en | 3.6 ± 0.3 | 3,5 ± 0,3 | 4.6 ± 0.6 | 3.3 ± 0.1 | 0.3 | 0.1 | 0.1 |
| Bakbenet Plassere * en | 4,3 ± 0,1 | 4.3 ± 0.0 | 5.1 ± 0.3 | 4,5 ± 0,2 0,02 | 0,07 | 0.2 | |
| Cliff Unngåelse * en | 4.4 ± 0.2 | 4,7 ± 0,2 | 5.8 ± 0.4 | 5.0 ± 0.4 | 0,02 | 0.4 | 0.1 |
| Gangart * # en | 7.5 ± 0.3 | 7.7 ± 0.3 | 9.7 ± 0.4 | 7.9 ± 0.2 | 0,0007 | 0,02 | 0,005 |
| Auditiv Sjokk en | 11.5 ± 0.3 | 11.5 ± 0.1 | 12.0 ± 0.5 | 11.8 ± 0.2 | 0.2 | 0.8 | 0.9 |
| Posture #A | 15,6 ± 0,5 | 15.9 ± 0.6 | 17,0 ± 0,4 | 14.9 ± 0.4 | 0.8 | 0,08 | 0,02 |
| Eye Åpninger en | 16.0 ± 0.2 | 15.9 ± 0.1 | 16,0 ± 0,1 | 15.4 ± 0.2 | 0,08 | 0,04 | 0.2 |
| Akselerert Rettende en | 16,0 ± 0,4 | 16.4 ± 0.5 | 17.4 ± 0.6 | 16.9 ± 0.2 | 0,04 | 1 | 0.3 |
| Rettende #a (hunner) | 4.9 ± 0.5 | 5.1 ± 0.4 | 6.7 ± 0.6 | 4.6 ± 0.4 | 0,09 | 0,003 | 0,0007 |
| Rettende a (hanner) | 3.9 ± 0.2 | 4.6 ± 0.3 | 5.9 ± 1.9 | 4.2 ± 0.6 | 0.4 | 0.6 | 0.2 |
| en dag utseende | * Signifikant forskjellig mellom LPS og Saline | ||||||
| b Antall ganger aktiviteten ble utført | # Signifikant forskjellig mellom LPS og LPS + BrSp | ||||||
| c sekunder | |||||||
| d gram | |||||||
Tabell 1. Vekter og nevrologiske Reflex utfall. Resultatene fra avkom utsatt for i utero inflammasjon og / eller kosttilskudd brokkoli spirer tilskudd. 30 Vektene som presenteres her er fra fødsel, PD7, og PD21. Tidspunktene ble valgt til å representere en tidlig, sikt, og 1-2 år gamle spedbarn. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistiske analyser ble brukt i studien var en to-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey post hoc test.a = dag av utseende, b = antall ganger aktiviteten ble utført, og c = tiden (e) aktiviteten ble utført, * = signifikant forskjell mellom LPS og kontroll, # = signifikant forskjell mellom LPS og LPS + brokkoli spirer. n = 5 - 7 kull per gruppe (verdier fra fire avkom, to menn og to kvinner, i et kull ble tatt et gjennomsnitt for å representere kullet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurodevelopmental refleks-testing er en prediktiv mål på unormal kortikale utvikling og modning, som kan være av betydning under omstendigheter hvor overt nevro er ikke tydelig. Under utvikling av nervesystemet testing, er det viktig å sikre at pups er undersøkt på samme tid hver dag. Rotter er nattlige og derfor kan deres døgnrytme endre ytelsen hvis testing utføres på forskjellige tidspunkter i løpet av dagen. 34 Testing skal være ferdig i et stille rom som høye lyder kan legge stress til valpene. 35 Masser krever et minimum på 1 time for å akklimatisere seg til nye omgivelser, siden transport, human håndtering, og nye innstillinger kan indusere spenning i valpene. 35 Unger trenger også å bli testet direkte under en oppvarmet lampe eller på en oppvarmet pute. Den yngre valpene, mindre stand de er i stand til å thermoregulate. 36 Av denne grunn er valper gitt 15s og 30 s for å utføre det opprettende på PD3 og gangart på PD6, respektivt. 36 I tillegg kontrollunger bør ikke vekst begrenset når født, som i vekt representerer en problemfaktor. Kull bør også være valgt 8 - 10 for å tilveiebringe lik næring og representasjon av kjønn. Når valpene født, er det viktig å tillate en dag for rotten å danne en binding med demningen for å forhindre maternal forsømmelse.
Unger må testes en dag eller to før den dag de skaffer den refleks for å fange den begynnende utseende. Avhengig av eksperimentell modell, kan enkelte modifikasjoner være nødvendig. Nyfødte mus er mye mindre enn rotter. Derfor er størrelsen av utstyret som brukes kan måtte justeres til størrelsen av den nyfødte mus. Noen feilsøking kan også være nødvendig. Forskjellige stammer eller arter kan ha litt forskjellig tidspunkt for start av reflekser. 13 Tidspunktet beskrevet i denne rapporten er spesific til Long-Evans unger, med testing av nye reflekser begynner på PD3, 4, 6, 10, 12, og 14 (figur 3). Undersøkeren kan være nødvendig å utføre refleks tester på 2 - 3 kull for å etablere den naturlige progresjon refleks før eksperimentell testing. Dessuten, når det utføres statistisk analyse på de data som samles inn, må experimenter bruke egnede teknikker for å hindre søppel skjevhet. Unger fra samme kull har en tendens til å utføre tilsvarende til hverandre, således at kullet representerer en n-1, ikke den enkelte pup. 32, 33
Testing nevrologiske reflekser er viktig fordi det er den eneste testing tilgjengelig for nyfødte gnagere, siden mer komplekse atferds testing ikke er mulig på disse tidene. Ingen andre tiltak er tilgjengelig i denne tidlige perioden i tillegg til vekt og utseende. De metodene som her er blitt anvendt av flere forskere, og dermed støtterbruk av nevrologiske refleks testing, særlig i små gnagere der andre adferdstester ikke er gjennomførbare. 13, 14, 29, 30, 31, 37, 38 Disse testene er parallelle med refleks tester utført i menneskebarn, er prediktive for nevrologiske lidelser så som cerebral parese, og gi ytterligere informasjon om den ontogeny av nevrale nettverk. Fremveksten av reflekser forekommer under bestemte tider i løpet av preweaning perioden, noe som reflekterer den modning av nervesystemet. 39 En begrensning av denne fremgangsmåte er at ikke alle eksperimentelle modeller kan bli utsatt for refleks testing. Gnagere er født umoden, slik at deres postnatal utvikling har fordelen av å fange utbruddet av refleks utvikling. Andre dyremodeller sliktsom lammet er født moden og utvikler seg forskjellig fra gnagere, slik at noe av refleks testing er ikke aktuelt for denne modellen. Dessuten er refleks testing ikke et direkte mål av kognitive eller unormal oppførsel, og det er usikkert om de observerte forandringer er forbigående eller vedvarende.
I tillegg til reflekser, kan atferdstester utføres for utfyllende analyser mot eldre aldersgrupper. Dette er av betydning fordi avvikende refleks forsinkelser ikke alltid føre til nevrologiske lidelser. 2, 40 Testene ble typisk administrert som begynner på PD21 (dagen for avvenning) når gnagere er i stand til å utføre kognitive og motoriske oppgaver. Disse testene er Bot ikke er begrenset til rota-stav, Morris vannlabyrint, og eleverte pluss labyrint. Kort sagt blir den rota-stav-testen utført ved å plassere den gnager på en roterende stang, og innspilling ytelsen på stangen for en periode av tid eller inntil gnager fallerav. Denne testen evaluerer motorisk læring og styrke, samt integriteten av hjernestrukturer, slik som basalgangliene og cerebellum. 41 Den Morris vannlabyrint består i å plassere den gnager i en pool av melkehvit vann, og registrere den tid det tar for den gnager for å finne en neddykket plattform. Signaler kan plasseres over hver kvadrant av bassenget med det samme signalet alltid over plattformen. Dette undersøker egosentriske vs allocentric former av hippocampal mediert romlig læring og hukommelse. 42 Den forhøyede plus maze test måler frykt og angst, så vel som iboende utforskende adferd. Gnagere er plassert i sentrum av fire armer, to lukkede og to åpne, hevet over bakken. 43 Unngåelse og utforskende opptreden (målt som tid brukt i hver arm) av gnagere blir registrert. 43 Disse ytterligere testene undersøke sensorimotoriske og kognitiv funksjon, slik at den undersøker til såsess hvorvidt den fornærmelse varer inn i voksen alder, eller hvorvidt det er forbigående.
Sen utvikling er forutsigbar, og supplerende adferdsundersøkelsen er nødvendig for å tilveiebringe komplementære bevis for tilstedeværelsen av en lidelse senere i livet. I tillegg må kontrollresponsene optimaliseres før eksperimentering med strekk og artsforskjeller, genetiske forandringer, medikament-administrering, etc. Til tross for disse betingelser, blir de beskrevne teknikker lært raskt, lett mestret, billig, og gir viktig informasjon angående utviklingen av nervesystemet. De tilbyr en mulighet til å evaluere ontogeny og modning av nervesystemet hos avkom i en alder da de ikke klarer å utføre modne atferds oppgaver. Videre menneskebarn ofte gjennomgå utviklings refleks testing, og gir således gnager refleks testing et middel for translatability. Som konklusjon, er det en utmerket metode for preliminær screening av unormalnevrologiske utvikling hos nyfødte som kan føre til senere undersøkelse av kognisjon og oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke våre virkemiddelapparatet, som inkluderer NeuroDevNet (a National Centres of Excellence), ALVA Foundation, Kvinne og barns helse Research Institute og University of Alberta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding | |||
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 12-711-9AM | Used for vaginal flushes. |
| Sterile Saline | Hospira | 7983254 | The solution used to collect cells during vaginal flushes. |
| 400 µL Microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-120 | Used to hold the saline solution. |
| Light microscope | Leica | Leica ATC 2000 | For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab. |
| Slides | Fisherbrand | 12-552-5 | The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab. |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-F | To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab. |
| Dietary Supplementation | |||
| Broccoli Sprouts seeds | Mumm's Sprouting Seeds | Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab. | |
| Countertop Seed Sprouter Box | Mumm's Sprouting Seeds | A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest. | |
| 250 mL beaker | The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used. | ||
| Maternal Inflammation | |||
| Lipoplysaccharide (LPS) | Sigma | L3129 | The endotoxin used to mimic maternal inflammation. |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 309659 | Used to inject the pregnant rat. |
| Gauge (30 G x 1/2) | BD PrecisionGlide Needle | 305106 | Use the smallest needle to avoid pain and discomfort. |
| Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) | Hospira | Saline is used to dissolve LPS. | |
| Weights | |||
| Scale | Denver Instrument | For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab. | |
| Neurodevelopmental Reflexes | |||
| Thin blunt rod | Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping. | ||
| Round filter paper | Whatman | 1001 150 | 15 cm diameter paper used for gait analysis. |
| Timer | Fisher Scientific | 06-662-51 | For timing the time allocated to righting and gait. |
| Blunt surface | Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance. | ||
| Foam landing | For when the pups perform accelerated righting. | ||
| Video recorder | Sony | VCT-D580RM | To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1,000 fps |
| Bell | For auditory startle. | ||
| Heat lamp or pad | To maintain the body temperature of the pups underoing examination. |
References
- Farber, J. M., Shapiro, B. K., Palmer, F. B., Capute, A. J. The diagnostic value of the neurodevelopmental examination. Clin Pediatr (Phila. 24 (7), 367-372 (1985).
- Zafeiriou, D. I. Primitive reflexes and postural reactions in the neurodevelopmental examination). Pediatr. Neurol. 31 (1), 1-8 (2004).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. S. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog. Neurobiol. , (2013).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch. Dis. Child. 48 (10), 757-767 (1973).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr. Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with. Dev. Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Back, S. A., Riddle, A., McClure, M. M. Maturation-dependent vulnerability of perinatal white matter in premature birth. Stroke. 38, 724-730 (2007).
- Back, S. A., et al. Late oligodendrocyte progenitors coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury. J. Neurosci. 21 (4), 1302-1312 (2001).
- Downes, N., Mullins, P.
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front. Neuroanat. 3 (5), (2009).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim. Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Lubics, A., et al. Neurological reflexes and early motor behavior in rats subjected to neonatal hypoxic-ischemic injury. Behav. Brain Res. 157 (1), 157-165 (2005).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int. J. Pediatr. , 191562 (2012).
- Hashimoto, R., Tanaka, Y. Contribution of the supplementary motor area and anterior cingulate gyrus to pathological grasping phenomena. Eur. Neurol. 40 (3), 151-158 (1998).
- Isaza Jaramillo, S. P., et al. Accuracy of the Babinski sign in the identification of pyramidal tract dysfunction. J. Neurol. Sci. 343 (1-2), 66-68 (2014).
- Donatelle, J. M. Growth of the corticospinal tract and the development of placing reactions in the postnatal rat. J. Comp. Neurol. 175 (2), 207-231 (1977).
- Palanza, P., Parmigiani, S., vom Saal, F. S. Effects of Prenatal Exposure to Low Doses of Diethylstilbestrol, o,p'DDT and Methoxychlor on Postnatal Growth and Neurobehavioral Development in Male and Female Mice. Horm. Behav. 40 (2), 252-265 (2001).
- Pantaleoni, G. C., et al. Effects of maternal exposure to polychlorobiphenyls (PCBs) on F1 generation behavior in the rat. Fundam. Appl. Toxicol. 11 (3), 440-449 (1988).
- Yeomans, J. S., Frankland, P. W. The acoustic startle reflex: neurons and connections. Brain Res. Rev. 21 (3), 301-314 (1995).
- Vinay, L., Brocard, F., Clarac, F. Differential maturation of motoneurons innervating ankle flexor and extensor muscles in the neonatal rat. Eur. J. Neurosci. 12 (12), 4562-4566 (2000).
- Geisler, H. C., Westerga, J., Gramsbergen, A.
- Heinen, K., et al. Gabaa receptor maturation in relation to eye opening in the rat visual cortex). Neuroscience. 124 (1), 161-171 (2004).
- Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behav. Brain Res. 145 (1-2), 221-232 (2003).
- Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behav. Brain Res. 136 (2), 339-348 (2002).
- Wu, L., et al. Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (18), 7094-7099 (2004).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Rousset, C. I., et al. Maternal exposure to lipopolysaccharide leads to transient motor dysfunction in neonatal rats. Dev. Neurosci. 35 (2-3), 172-181 (2013).
- Nguyen, A. T., Bahry, A. M. A., Shen, K. Q., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Consumption of broccoli sprouts during late gestation and lactation confers protection against developmental delay induced by maternal inflammation. Behav. Brain Res. 307, 239-249 (2016).
- Black, A. M., Armstrong, E. A., Scott, O., Juurlink, B. J., Yager, J. Y. Broccoli sprout supplementation during pregnancy prevents brain injury in the newborn rat following placental insufficiency. Behav. Brain Res. 291, 289-298 (2015).
- Wainwright, P. E. Issues of design and analysis relating to the use of multiparous species in developmental nutritional studies. J. Nutr. 128 (3), 661-663 (1998).
- Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14, 14-37 (2013).
- Sergio, D. P., Sanchez, S., Ruben, V. R., Ana, B. R., Barriga, C. Changes in behaviour and in the circadian rhythms of melatonin and corticosterone in rats subjected to a forced-swimming test. J Appl Biomed. 1 (47), (2005).
- Castelhano-Carlos, M., Baumans, V. The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats. Lab. Anim. 43 (4), 311-327 (2009).
- Zimmerberg, B., Ballard, G. A., Riley, E. P. The development of thermoregulation after prenatal exposure to alcohol in rats. Psychopharmacology (Berl. 91 (4), 479-484 (1987).
- Fan, L. W., et al. Hypoxia-ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat). Behav. Brain Res. 165 (1), 80-90 (2005).
- Smart, J. L., Dobbing, J. Vulnerability of developing brain. VI. Relative effects of foetal and early postnatal undernutrition on reflex ontogeny and development of behaviour in the rat. Brain Res. 33 (2), 303-314 (1971).
- Fox, M. W. Neuro-Behavioral ontogeny: A synthesis of ethological and neurophysiological concepts. Brain Res. 2 (1), 3-20 (1966).
- Piper, M. C., Mazer, B., Silver, K. M., Ramsay, M. Resolution of neurological symptoms in high-risk infants during the first two years of life. Dev. Med. Child Neurol. 30 (1), 26-35 (1988).
- Shiotsuki, H., et al. A rotarod test for evaluation of motor skill learning. J. Neurosci. Methods. 189 (2), 180-185 (2010).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat. Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
