Summary
Sundhedstilstanden af lungen reflekteres af typen og antallet af immunceller, der er til stede i bronkioler i lungerne. Vi beskriver en bronkoalveolær lavage teknik, der muliggør isolering og undersøgelse af vedhæftede celler og opløselige faktorer fra de nedre luftveje hos mus.
Abstract
Bronchoalveolære Lavage (BAL) er en eksperimentel procedure, der bruges til at undersøge cellulære og acellulære indhold af lungen lumen ex vivo for at få indsigt i en igangværende sygdomstilstand.
Her er en enkel og effektiv metode, der er beskrevet til at udføre BAL på murine lunger uden brug af specialværktøj eller udstyr. BAL-væske isoleres ved at indsætte et kateter i luftrøret af terminalt bedøvede mus, hvorigennem en saltopløsning inddryppes i bronkioler. Den indpodet fluid forsigtigt trukket tilbage for at maksimere BAL fluid hentning og for at minimere forskydningskræfter. Denne teknik tillader levedygtigheden, funktion og struktur af celler i luftvejene og BAL-væsken skal bevares.
Talrige teknikker kan anvendes for at opnå yderligere forståelse af sygdomstilstanden af lungen. Her, en almindeligt anvendt teknik til identifikation og optælling af forskellige typer af immunceller erBeskrevet, hvor flowcytometri kombineres med et udvalg af fluorescensmærkede celleoverfladespecifikke markører. BAL-proceduren, der præsenteres her, kan også bruges til at analysere infektiøse agenser, væskestoffer eller inhalerede partikler i murine lunger.
Introduction
Luftvejene støder på mange fornærmelser, som kan føre til betændelse, patogeninvasion eller ondartet transformation. Epithelcellerne, der linjer lunnlumenet, danner en af de store barrierer i pattedyrskroppen. Sammen med alveolære makrofager forhindrer de miljømæssige trusler i at komme ind i det systemiske system via luftvejene. Eksempler på sådanne trusler indbefatter organiske og uorganiske kemikalier, bakterier og vira. På samme måde kan specifikke immuniseringer eller terapeutiske indgreb være designet til at målrette mod lungerne. I alle disse tilfælde er en uddybet analyse af det fremkaldte respons vigtigt at forstå, gribe ind eller forhindre biologiske processer, der finder sted i respirationssystemet.
Bronchoalveolar lavage (BAL) er en uvurderlig metode til at analysere sådanne svar, da de resulterende prøver indeholder vigtige oplysninger om de inflammatoriske responser, immunmekanismer og infektionssygdomsprogressionder kan forekomme i de pulmonale luftveje 1, 2. Ved at bruge BAL, er det muligt at studere de infiltrerende celler. Dette står i kontrast med fordøjede lunger, der giver et "beskidt" cellepopulation, med mange døde og klæbrige celler. BAL udføres ved at indføre en saltvandsopløsning i de terminale bronkioler og efterfølgende udvinding denne opløsning. Den hentede opløsning kan derefter anvendes til at kvantificere og fænotypisk analyse hjemmehørende lunge og infiltrerende inflammatoriske celler. Denne metode er ofte anvendt til at studere cellulære indstrømning i sygdomsmodeller i luftvejene, såsom astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), og infektiøse sygdomsmodeller. Bortset fra den cellulære sammensætning, er den molekylære sammensætning af de pulmonære luftveje afspejles også i BAL-væsken. At analysere dette, kan Enzymforbundet immunosorbentassay (ELISA), immunoblot, og den samtidige analyse af flere cytokiner ved et cytokin bead matrix væreUdført for at vurdere tilstedeværelsen af cytokiner og kemokiner.
BAL er en veletableret metode til at studere tilstrømningen af inflammatoriske celler i inflammatoriske respiratoriske sygdoms dyremodeller. Observationen af en ændret cellulær tilstrømning ( f.eks. Forøgede niveauer af lymfocytter, eosinofiler eller neutrofiler) kan føre til bedre indsigt i sygdommen og kan være en objektiv parameter til vurdering af præstationen af en terapeutisk intervention.
Den nøjagtige og reproducerbare fortolkning af BAL-cellanalyse kræver, at BAL udføres korrekt, og at den opsamlede væske håndteres og behandles ordentligt. Udtrykket "bronchial lavage" blev introduceret mere end 80 år siden af Stitt 3 . I 1961 opnåede Myrvik alveolære makrofager fra lavvæske fra kaninungene 3 . BAL er nu en almindeligt anvendt metode til at analysere og overvåge lungerne i musemodellen, dogRe er stadig ingen rapport om en standardiseret BAL-procedure i den videnskabelige litteratur 4 , 5 . Desuden er der sandsynligvis så mange måder at udføre BAL, da der findes forskningslaboratorier ved hjælp af teknikken 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Det er vigtigt, at de data, der er opnået fra BAL, repræsenterer hele den murine lunge, og ikke kun en del af lungen. Denne form for variabilitet komplicerer fortolkningen og sammenligningen af resultaterne mellem forskellige forsøg.
Her beskrives en grundlæggende, billig og reproducerbar BAL-procedure, som tillader opsamling af den cellulære og opløselige fraktion, som er til stede i musens luftvejslumen. Kort sagt placeres et kateter i den eksponerede luftrør ofa terminalt bedøvede mus. En sprøjte er forbundet med kateteret, og en pufret saltvandsopløsning indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) indføres i lungerne. Lunge lumen samples ved forsigtig gentagen skylning af saltopløsningen ved hjælp af stemplet. Det negative tryk påført i dette trin er minimal at forhindre luftvejskollaps. Efter opsamling, bør den opnåede BAL behandles yderligere til at optælle og identificere cellerne ved flowcytometri.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet i denne undersøgelse blev udført i henhold til den nationale lov (belgisk lov 14/08/1986 og 22/12/2003, belgisk kongeligt dekret 06/04/2010) og europæisk lovgivning (EU-direktiver 2010/63 / EU og 86 / 609 / EØF). Alle forsøg på mus og alle dyreprotokoller blev godkendt af Ghent Universitetets etiske udvalg (tilladelsesnummer LA1400091 og EC2016-027).
1. Fremstilling
- Lavage væske
- Forbered en afbalanceret saltopløsning med 100 μM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
BEMÆRK: For at måle proteinniveauer i BAL-væsken anbefales det at tilføje proteasehæmmere for at forhindre proteaseaktivitet i BAL-væsken.
- Forbered en afbalanceret saltopløsning med 100 μM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
- kateter
- Lav et kateter ved at indsætte en 23 G nål i gennemsigtig plastpolyethylen 21 G slange (indre diameter: 0,58 mm, ydre diameter: 0,965 mm og længde: 0,5 cm). Premade katetre kan også bruges.
- AnesthETICS
- Forbered en terminal bedøvelse, helst en, der forårsager åndedrætsanfald ( f.eks. En barbiturat som natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) opløsning i phosphatbufret saltvand (PBS)).
BEMÆRK: Det anbefales at anvende injektionsbedøvelse i stedet for inhaleret anæstesi, da indåndet anæstesi kan påvirke BAL væskenindholdet. CO 2 har for eksempel indflydelse på blodets pH og følgelig omfordeling af forskellige forbindelser 12 .
- Forbered en terminal bedøvelse, helst en, der forårsager åndedrætsanfald ( f.eks. En barbiturat som natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) opløsning i phosphatbufret saltvand (PBS)).
- Ammoniumchlorid-kalium (ACK) lysceller med rød blodcelle
- Forbered en ACK lysis buffer ved at opløse 8,29 g NH4CI og 1 g KHCO3 i 1 liter H20 med 100 μM EDTA; Lysceller med rød blodcelle kan også købes fra en ekstern kilde.
2. Udførelse af Bronchoalveolar Lavage (BAL)
- Introduktion af kateteret i luftrøret
- Aflive mus ved intraperitoneal injektion af en dødelig dosis af en korttidsvirkende barbiturat bedøvelsesmiddel under anvendelse af en 26 G nål. For at bekræfte korrekt dødelig bedøvelse, klemme den bagerste pote af musen med en pincet til at kontrollere foden refleks.
- Placer dyret på ryggen på en kirurgisk plade og reparere musen ved pinning ned lemmerne.
- Spray 70% ethanol på halsen for at desinficere. Lav et snit i nakken huden i nærheden af luftrøret ved hjælp af en skalpel.
- Åbn huden for at eksponere spytkirtlerne. Adskil spytkirtlerne ved anvendelse tænger for at blotlægge sternohyoid muskel. Incise musklen omkring trachea under anvendelse af tænger for at blotlægge trachea.
- Placer en bomuldstråd under luftrøret hjælp knibtang.
- punktere omhyggeligt midten af den blotlagte trachea mellem to bruskringene med en 26 G nål. Pas på ikke at beskadige luftrøret yderligere.
- Indsætning af kateteret omkring 0,5 cm ind i luftrøret. Sørg for, at CatheTer er ikke indsat for langt ned i luftrøret, da dette kan medføre skade på lungestrukturen.
- Stabiliser kateteret ved at binde luftrøret omkring kateteret ved hjælp af bomuldstråden placeret i trin 2.1.5. Hvis kateteret ikke er bundet tilstrækkeligt, kan den injicerede, afbalancerede saltopløsning strømme mod den øvre del af luftvejen i stedet for ned i lungerne.
- Saml skyllevæsken
- Indsæt en 1 ml sprøjte med 1 ml sterilbalanceret saltopløsning med 100 μM EDTA.
- Tilslut 1 ml sprøjten til kateteret og indsigt forsigtigt salt / EDTA-opløsningen i lungen.
- Aspirer opløsningen forsigtigt, mens du masserer thoraxen af musen. Hvis aspiratvæsken ikke er synlig i sprøjten, skal du forsigtigt indsætte kateteret lidt længere nede eller op ad luftrøret.
- Fjern sprøjten fra nålen og overfør den genvundne skyllevæske ind i et 15 ml rør anbragt på is. Normalt 700 - 900 &# 181; L fra BAL udvindes fra 1 ml injiceret opløsning.
- Gentag trin 2.2.1 - 2.2.4 to gange mere.
BEMÆRK: Hvis formålet er at analysere den ikke-cellulære indhold, anbefales det at koncentrere de puljede prøver, når der er problemer med følsomhed.
3. Indsamling af Cellular og ikke-cellulære komponenter i BAL Fluid
- Centrifugeres udskylningsvæsken i 7 min ved 400 xg og 4 ° C.
- Indsamle supernatanten og umiddelbart bruge det til yderligere analyse (fx ELISA) eller fryse ved -80 ° C. Hold cellepelleten at analysere det cellulære tilstrømning i lungerne.
- Resuspender cellepelleten i 200 pi af ACK lyserende puffer.
BEMÆRK: Dette trin sikrer lysis af erythrocytterne og samtidig holde de hvide blodlegemer intakt. - Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: For at reducere variationen forårsaget af lyse af røde blodlegemer, bør ikke udføres dette trin i mere end 2 minutter. Tilsæt 1 ml kold PBS til fortynding af ACK lyseringsbufferen. - Centrifuge i 7 minutter ved 400 xg og 4 ° C. Kassér supernatanten og suspender cellerne igen i et tilstrækkeligt volumen af PBS til nedstrømsanalyse (se nedenfor).
BEMÆRK: Volumenet af PBS afhænger af den downstream undersøgelse, der vil blive udført.
4. Analyse af de forskellige celletyper i BAL-væsken ved hjælp af flowcytometri
BEMÆRK: En mulighed er at analysere den absolutte og relative cellulære sammensætning af BAL-væsken ved at udføre flowcytometri. Målet med dette papir er at udarbejde teknikken for BAL. Flowcytometri er en specialiseret teknik alene. Det anbefales at læse specialpapirer på flowcytometriteknikken 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Antistoffer koblet til en fluorofor that genkender overfladeantigener (se tabel 1) er specifikke for en bestemt celletype (r) anvendes. Ved anvendelse af en gating strategi, er det muligt at identificere T-celler, makrofager, dendritiske celler, B-celler, eosinofiler og neutrofiler i cellen brøkdel af BAL.
| Antigen | celletype |
| Differentieringsklynge- 3 (CD3) | Udtrykt på T-celler |
| Differentieringsklynge- 11c (CD11) | Høj ekspression på de fleste dendritiske celler, men også på monocytter, makrofager, neutrofiler og nogle B-celler. |
| Differentieringsklynge- 11b (CD11b) | Udtrykt på overfladen af mange leukocytter, herunder monocytter, neutrofiler, naturlige dræberceller, granulocytter og makrofager. |
| SiglecF | ENlveolar makrofager og eosinofiler. |
| MHCII | Normalt findes kun på antigenpræsenterende celler, såsom dendritiske celler, mononukleære fagocytter og B-celler. |
| CD19 | B-lymfocyt antigen |
| Ly-6G | En markør for monocytter, granulocytter og neutrofiler |
Tabel 1: Valg af Immune celleoverfladeantigener. Denne tabel indeholder en liste af overfladevand epitoper, der anvendes til at karakterisere de forskellige celletyper. Kombinationer af flere markører vil være forpligtet til pålideligt definere en specifik celletype.
| Prøver | ||||
| Rør | Antigen-fluorofor hvormed celler Antistofbestandskoncentration (mg / ml) | Antistof fortynding | Samlet volumen (μL) | |
| Fixable levedygtig farve | 0,2 | 1/1000 | 50 | |
| CD11 | 0,2 | 1/800 | 50 | |
| SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 | |
| Prøve X | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| Spændingskontrol | ||||
| Rør | Antigen-fluorofor hvormed celler | Antistof lager (mg / ml) | antistof fortynding | Samlet volumen (pi) |
| ufarvede celler | / | / | / | 50 |
| Enkelte farvede celler | Fixable levedygtighedsfarvestof | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| Enkelte farvede celler | CD11 | 0,2 | 1/800 | 50 |
| Enkelte farvede celler | SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| Enkelte farvede celler | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Enkelte farvede celler | CD3 | 00,2 | 1/200 | 50 |
| Enkeltfarvede celler | CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Enkeltfarvede celler | CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Enkeltfarvede celler | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Kompensationskontrol | ||||
| Rør | Antigen-fluorophore til at blive tilsat til perler | Antistofbestandskoncentration (mg / ml) | Antistof fortynding | Samlet volumen (μL) |
| Ufarvede perler | / | / | / | 200 |
| Enkelt farvede perler | CD11 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Enkelt farvede perler | SiglecF | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Enkelt farvede perler | MHCII | 0,2 | 1/200 | 200 |
| Enkelt farvede perler | CD3 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Enkelt farvede perler | CD19 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Enkelt farvede perler | CD11b | 0,2 | 1/400 | 200 |
| Enkelt farvede perler | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 200 |
Tabel 2. Oversigt over kontroller, der skal medtages. Denne tabel viser alle nødvendige kontroller for den præcise fortolkning af de opnåede resultater.
- Celleoverfladefarvning
BEMÆRK: Det er impoRtant at inkludere alle de kritiske kontroller til flowcytometrianalysen. Tre sæt rør er nødvendige (se tabel 2 ): (1) rør indeholdende prøverne; (2) rør med BAL-celler for hvert antistof-fluorfor for at fremstille enkelte pletter; Dette tillader bestemmelse af spændingerne for hver kanal på flowcytometeret; Og (3) rør med perler for hvert antistof-fluorofor til fremstilling af enkelte pletter; Dette er at bestemme kompensationsmatrixen.- Lav en blanding af antistofferne og Fc-blokken (anti-CD16 / CD32) i PBS ved passende fortyndinger (se tabel 2 ). Det er nødvendigt at bestemme den optimale arbejdsfortynding for hvert antistof forud for eksperimentet.
- Resuspender cellerne i 50 μl af antistofblandingen til prøven og tilsæt 50 μL af det passende fortyndede antistof til de kritiske kontroller.
BEMÆRK: Farvningen kan udføres i en 96-brønd u-formet plade. Dette gør det muligt nemt at reducere pletvolumenet and køre betydelige mængder af prøver. - Inkuber i 30 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Centrifuge i 7 min ved 400 xg og 4 ° C. Supernatanten kasseres.
- Re-suspendere cellerne i PBS til et endeligt volumen på 200 pi.
BEMÆRK: Denne endelige volumen afhænger af det minimale volumen flowcytometeret kan få adgang til. Dette kan variere lidt mellem maskiner. Hertil kommer, at læse volumen afhænger af antallet af celler og / eller tid prøven vil tage at køre i flowcytometeret. - Brug prøver og kontroller til flowcytometrisk analyse.
BEMÆRK: For at bestemme den absolutte celleantal på de forskellige cellepopulationer, bør tilføjes tælle perler. Tilsæt samme antal perler (± 25.000 perler) til hver prøve lige før måling. Ved anvendelse af fremadrettet og sidespredning, tælle perler kan identificeres ved flowcytometri (se figur 1). Efterfølgende kan det absolutte antal celler i prøven beregnes ved at sammenligne the-forhold perlehændelser til celle begivenheder. Følgende formel kan anvendes:
- Flowcytometrianalyse
BEMÆRK: flowcytometrisk analyse bør ske umiddelbart efter afslutningen af farvningen protokol. En flowcytometer med passende lasere og filtre til signaldetektering skal benyttes. Tabel 3 giver en oversigt over de lasere og filtre, der er nødvendige for undersøgelsen, der er beskrevet i dette manuskript. For mere information om flowcytometrisk analyse, se Adan et al. 18.- Oprette de primære porte baseret på den forreste og sidespredning, eksklusive snavs og dubletter (se figur 1).
- Justere spændingen og kompensation for spektral overlapning med hjælp af de enkeltstrengede farvede celler og perler.
BEMÆRK: Disse indstillinger er forskellige for hver flowcytometer og behøver kontrolleres før hver eksperiment. FEller korrekt flowanalyse er frem- og sidespredningsspændingerne kritiske. En korrekt fremad og sidestrøm kan hjælpe med identifikation og bekræftelse af identiteten af de analyserede celler. For at bestemme disse spændinger skal en ufarvet prøve køres først. - Opsæt fluorescensporte for overfladeantigenet (se figur 1 ) og analyser prøverne.
| Lasertype | Filtreringsopsætning | |
| 505 LP | 525/50 | |
| Blå (488 nm) | 550 LP | 575/26 |
| 100 mW | 670 LP | 685/35 |
| 750 LP | 780/60 | |
| Violet 405 nm | 450/50 | |
| 100 mW | ||
| rød 633 nm | 660/20 | |
| 70 mW | 750 LP | 780/60 |
Tabel 3: Oversigt over Lasere og filtre af flowcytometeret anvendt i denne undersøgelse.
Representative Results
Efter udførelse BAL med 3x 1 ml bufret saltopløsning, bør et volumen mellem 2 og 3 ml udvindes. Denne BAL-væsken kan analyseres yderligere for at karakterisere det cellulære og ikke-cellulært indhold. For at undersøge tilstedeværelsen af cytokiner og chemokiner, ELISA 19, immunoblot 20, og den samtidige analyse af flere cytokiner ved et cytokin vulst arrayet 21 kan udføres. Derudover kan det albumin og totalt proteinindhold på denne væske bestemmes 22.
Som et eksempel, dette manuskript beskriver, hvordan at analysere det cellulære indhold af BAL-væsken ved flowcytometri. Den analyserede BAL-væsken blev opsamlet fra Balb / cAnNCrl mus (alder: 7 uger) 24 timer efter de blev intratrachealt indpodet med lipopolysaccharid. Følgende antistoffer, der er koblet til en fluorophor, wførend anvendes til at identificere de forskellige celletyper: CD11, SiglecF, MHCII, CD3e, CD19, Ly6g, og CD11b (se tabel 1 og tabel of Materials). Den fixable levedygtighedsfarvestof blev også anvendt. Ved anvendelse af en gating strategi baseret på den differentielle ekspression af antigener på overfladerne af de forskellige cellepopulationer (figur 1), var det muligt at identificere makrofager, dendritiske celler, B-celler, T-celler, neutrofiler og eosinofiler.
Første, snavs og dubletter blev gated ud baseret på fremadrettede og side-scatter parametre. En levedygtighed farvestof lettet gating på levende celler. Derefter blev CD11c høje celler og CD11c lave celler identificeret. I CD11c stor befolkning, blev makrofager og dendritiske celler identificeres på basis af MHCII og SiglecF ekspression hhv. I CD11c lav befolkningstæthed, blev T-celler og B-celler identificeres på basis af CD3e og CD19-ekspression. I thDen resterende cellepopulation, neutrofiler og eosinofiler blev identificeret baseret på henholdsvis CD11b- og Ly-6G-markørekspression.
Tælleperler blev tilsat for at bestemme de absolutte celleantal af de forskellige cellepopulationer ved at sammenligne forholdet mellem perlehændelser og cellehændelser 23 . Disse tælleperler blev identificeret ud fra deres frem- og sidestrømsegenskaber ( figur 1 ). Tabel 4 giver et overblik over de absolutte celleantal af de forskellige cellepopulationer i BAL-væsken af en naiv mus og en mus, der blev stimuleret i 24 timer med 5 μg lipopolysaccharid.
Figur 1: Gatingstrategi for flowcytometrisk detektion af makrofager, dendritiske celler, T-celler, B-celler, neutrofiler og eosinofiler iN BAL-væske. BAL-celler blev isoleret under anvendelse af den beskrevne BAL-protokol. Celler blev isoleret fra mus 24 timer efter intratracheal instillation af lipopolysaccharid. Tælleperler og celler blev identificeret baseret på frem- og sidestrømsegenskaber. I celleporten blev enkelte celler identificeret ved hjælp af fremad og sidestrøms. I denne sidste population blev celler, der var i live identificeret. CD11c- høje celler og CD11c- lave celler blev derefter identificeret. I CD11c-højpopulationen blev makrofager og dendritiske celler identificeret baseret på henholdsvis MHCII og SiglecF-ekspression. I CD11c-lavpopulationen blev T-celler og B-celler identificeret baseret på henholdsvis CD3ε og CD19-ekspression. I den resterende cellepopulation blev neutrofiler og eosinofiler identificeret baseret på henholdsvis CD11b og Ly-6G-ekspression. Klik her for at se enstørre udgave af dette tal.
| cellepopulation | absolutte antal celler i naive mus | absolutte antal celler i LPS-stimulerede mus |
| makrofager | 79.612 | 25.439 |
| dendritiske celler | 495 | 671 |
| T-celler | 45.271 | 28.089 |
| B-celler | 4164 | 2926 |
| neutrofiler | 632 | 566.716 |
| eosinofiler | 3483 | 4332 |
Tabel 4: repræsenTative resultater af flowcytometrianalysen på BAL-væsken af naive og LPS-stimulerede mus.
Discussion
BAL er en nyttig teknik til at opnå cytologisk og biokemisk information som reaktion på infektioner eller lægemidler. I første omgang blev BAL brugt til at styre den overdrevne slimproduktion hos mennesker, der lider af fosgen toksicitet 3 . I dag bruges teknikken til mennesker til at undersøge lungepathogenese, diagnose og terapeutisk behandling af sygdomme 3 , 24 . I forsøgsdyr bruges BAL almindeligt til at overvåge inflammatoriske reaktioner, immunmekanismer og infektionssygdomme, der forekommer i lungeluftvejene 1 , 2 .
For at studere det inflammatoriske cellulære mønster i respiratoriske sygdomsmodeller bør BAL efterfølges af absolut og differentiel celletælling. Udover det absolutte celleantal er de relative celle tal også af interesse. For eksempel viser reparations- og kræftmodeller vEry lille eller ingen BAL celletælling stiger. I denne model er vurderingen af cellulær sammensætning nyttig. Ved anvendelse af cellefarvning kombineret med lysmikroskopi kan forskellige celletyper, såsom eosinofiler, neutrofiler, makrofager og lymfocytter identificeres baseret på morfologi 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Flowcytometri kan anvendes til specifikke vurderinger, såsom at identificere forskellige T-cellefænotyper 7 , 31 . Udover identifikationen af de forskellige infiltrerende cellepopulationer kan lungens ikke-cellulære sammensætning undersøges ved anvendelse af BAL. Metoder såsom ELISA, immunblot, cytokinperle-array, immunhistokemi og kvantitativ polymerasekædereaktion udføres på BAL-væske for at bestemme cytokiner, vækstFaktorer og andre inflammatoriske komponenter. For at bestemme lungeskader kan total protein og lactat dehydrogenase niveauer i BAL væsken også måles 32 , 33 .
Med udviklingen af nye diagnostiske værktøjer vil den genomiske og proteomiske karakterisering af BAL-komponenter være mulig i nær fremtid. Kombinationen af ekspanderende beregningsmuligheder og high-throughput genekspressionsteknologier vil gøre det muligt at definere specifikke genekspressionsprofiler for forskellige sygdomstilstande. Udførelse af disse teknikker på BAL-væske kan tilvejebringe gen- og proteinekspressionsmønstre for at identificere de vigtige molekyler involveret i de forskellige faser af lungesygdomme.
Hovedbegrænsningen af data opnået fra BAL-væske er manglen på sammenlignelighed mellem forskellige forsøgsforsøg 3 , 9 . Der er en høj grad afVariabilitet i lavage teknik og den efterfølgende behandling af BAL væske. For at kunne sammenligne hvert BAL-forsøg er det nødvendigt at standardisere typen af skyllevæske, der er indstillet, instillationsstedet og den fraktion, der skal analyseres for cellulær og ikke-cellulær sammensætning. Der er signifikante forskelle i antallet af lavagefraktioner mellem forskellige forsøg, varierende fra en til 14 gange 34 , 35 , 36 . Denne forskel kan have indflydelse på de estimerede samlede celleantal i lungerne. Det er vigtigt at vide, hvilken BAL væske fraktion indeholder størstedelen af cellerne. Song et al. Viste, at ca. 70% af det samlede antal celler blev hentet i fraktion en til tre 22 . Andre rapporter foreslog dog, at den anden lavage indeholdt flere celler end den første 37 , 38
Den ikke-cellulære sammensætning af BAL-væsken indeholder værdifulde oplysninger om sundhedstilstanden af lungen 33 , 39 , 40 . Variationer i fortyndingen af BAL-væsken bidrager til forskellen i kvantificeringen af den opløselige fraktion og følgelig til forskelle i resultaterne mellem forsøgene. Song et al. Sammenlignede protein- og lactatdehydrogenase-niveauerne for hver lavagefraktion og konkluderede, at den første lavagefraktion indeholdt to til tre gange mere end den anden fraktion.
For at hente en repræsentativ BAL-prøve til analyse er nogle tekniske overvejelser afgørende. En af dem er at udføre ordentlig bedøvelse. Det er meget vigtigt at kontrollere fodrefleksenlex af musen for at sikre terminal sedation. Det er ikke kun vigtigt for etiske grunde, men også fordi det er svært at placere og fastholde kateteret i den korrekte position, hvis musen ikke er korrekt bedøvet.
En anden vigtig teknisk overvejelse er placeringen af i luftrøret kateteret. Når der indsættes for dybt kateteret, kan det beskadige lungestrukturen. Den distale ende af kateteret skal ikke nå lungerne under BAL proceduren. Kateteret bør også stabiliseres og bundet med en bomuldstråd. Hvis kateteret ikke er stabiliseret, kan den injicerede saltopløsning strømme opad ind i næsehulen i stedet for ned i lungerne. Under injektion og aspiration af saltopløsningen, er det vigtigt at holde kateteret konstant.
Opnået fra BAL-væsken data skal repræsentere hele murine lunge. Derfor er det vigtigt at indpode et tilstrækkeligt volumen saltvand puffer (dvs.3 ml, opdelt i 3 portioner på 1 ml hver). Der er noget lineært forhold mellem celleudbytte og BAL-væsken udbytte. Det er vigtigt at samle løsningen blidt mens masserer brystkassen af musen. Hvis forskydningskræfter er for stærk, kan levedygtigheden, funktion og struktur af celler i luftvejene og BAL-væsken være kompromitteret. Hvis den aspirerede væske ikke er synlig i sprøjten, bevæger omhyggeligt kateteret dybere eller højere i luftrøret.
Særlig meddelelse skal gives til specifikke aspekter af BAL behandling og analyse. Dette vil maksimere oplysninger bevaret fra BAL-prøver. Efter BAL er cellerne i et næringsfattigt saltvandsmedium. Det er derfor meget vigtigt at behandle prøverne inden for 1 time efter BAL prøveudtagning. Hvis langvarig lagring er nødvendig, kræves anvendelsen af et næringsstof-suppleret medium.
At bevare cellelevedygtighed, undgå rør, som fremmer cellevedhæftning til overfladen. Undgå centrifugation af cellesuspensioner ved hastigheder, der sandsynligvis vil kompromittere cellulær integritet eller for at undgå ensartet resuspension af de hentede BAL-celler. BAL væske indeholdende celler skal centrifugeres ved 400 xg og 4 ° C i 7 min. Det er vigtigt at huske på, at der bør holdes cellesuspensioner ved 4 ° C under behandlingen.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
LVH er forskningsassistent ved Institut for Biomedicinsk Molekylær Biologi på Ghent Universitet. ERJ er støttet af UniVacFlu, er tilskud nummer 607690. KR støttet af EF-FP7 projekt FLUNIVAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
| ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
| 23 G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0.60 x 30 mm |
| 26 G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0.45 x 12 mm |
| plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023") O.D. 0.965 mm (0.38") 30.5 m (100') |
| sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca2+ Mg2+ or phenol red; sterile filtered |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | nonpyrogenic and nontoxic |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
| centrifuge tube 50 mL | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| centrifuge tube 15 mL | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
| Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile-filtered |
| live/dead - efluor 506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
| CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
| SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
| MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
| CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
| CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
| CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
| Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
| flow cytometer | BD Biosciences | ||
| catheter | BD Biosciences | 393202 |
References
- Stankunas, K., et al. Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).
- Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).
- Gee, J. B., Fick, R. B.
- Tornling, G., et al. Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz. Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material. Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).
- Morris, A., et al. Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection. Microbiome. 4 (1), 38 (2016).
- Naessens, T., et al. GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation. J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).
- Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease. Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).
- Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference. Chest. 90 (1), 122-131 (1986).
- Baughman, R. P.
- Singletary, M. L., et al. Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).
- Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents. Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
- Rubio-Navarro, A., et al. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J Vis Exp. (116), (2016).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), (2011).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. (82), e51105 (2013).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
- Database, J. S. E. The ELISA method. J Vis Exp. , (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting. J Vis Exp. (58), (2011).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).
- Seliger, C., et al. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).
- Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease. Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).
- Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).
- Delayre-Orthez, C., et al. PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse. Respir Res. 6, 91 (2005).
- Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse. Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).
- Hachet-Haas, M., et al. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).
- Ble, F. X., et al. Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice. Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).
- Ble, F. X., et al. Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging. Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).
- Reber, L. L., et al. A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).
- Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage. Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).
- Forget, G., et al. An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances. Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).
- Sung, J. H., et al. Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats. Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).
- Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung. Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).
- Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions. Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).
- Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis. Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).
- Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats. Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).
- Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects. J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).
