Summary
폐의 건강 상태는 폐의 세기관지에있는 면역 세포의 유형과 수에 의해 반영됩니다. 우리는 비 흡착성 세포와 쥐의 하부 호흡기에서 용해되는 요소를 분리하고 연구 할 수있는 기관지 폐포 세척 기술에 대해 설명합니다.
Abstract
BAL (Bronchoalveolar Lavage)은 진행중인 질병 상태에 대한 통찰력을 얻기 위해 생체 내 에서 폐 내강의 세포 및 무세포 함량을 검사하는 데 사용되는 실험 절차입니다.
여기에는 특별한 도구 나 장비가 필요없이 쥐 폐에서 BAL을 수행하는 간단하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. BAL 액은 카테터를 말기 마취 된 마우스의 기관에 삽입함으로써 분리되며,이 마취 된 생쥐를 통해 생리 식염수가 세기관 지로 주입된다. 주입 된 유체는 부드럽게 수축되어 BAL 유체 회수를 최대화하고 전단력을 최소화합니다. 이 기술은기도 및 BAL 유체 내의 세포의 생존 능력, 기능 및 구조가 보존되도록합니다.
많은 기술이 폐의 질병 상태에 대한 추가 이해를 얻기 위해 적용될 수 있습니다. 여기, 면역 세포의 종류의 식별 및 열거에 일반적으로 사용되는 기술은여기에서, 유동 세포 계측법은 형광으로 표지 된 세포 표면 특이 적 마커의 선택 패널과 조합된다. 여기에 제시된 BAL 절차는 쥐 폐 내부의 감염 물질, 유체 성분 또는 흡입 입자를 분석하는데도 사용할 수 있습니다.
Introduction
기도 염증, 병원균의 침입 또는 악성 변화로 이어질 수 많은 모욕을 발생합니다. 폐강 라인 상피 세포는 포유류 신체의 주요 장애물 중 하나를 형성한다. 함께 폐포 대 식세포와 함께, 그들은기도를 통해 체계적인 시스템에 항목을 얻고에서 환경 위협을 방지 할 수 있습니다. 이러한 위협의 예로는 유기 및 무기 화학 물질, 세균, 바이러스를 포함한다. 마찬가지로, 특정 예방 접종이나 치료 개입은 폐를 대상으로 설계 할 수있다. 이 모든 경우에, 유발 응답의 정교한 분석, 이해 개입, 또는 호흡 시스템 내에서 일어나는 생물학적 과정을 방지하는 것이 중요하다.
기관지 폐포 세척액 (BAL)는 결과 샘플이 염증 반응, 면역 메커니즘에 대한 중요한 정보를 포함하기 때문에, 같은 응답을 분석하는 귀중한 방법 및 전염성 질병의 진행입니다즉, 폐기도 (1, 2)에서 발생할 수있다. BAL을 사용함으로써, 침투 세포를 연구하는 것이 가능하다. 이것은 많은 죽은 끈적 세포와 더불어, "더러운"세포 인구를주고 소화 폐와 대조. BAL은 말단 세기관지에 식염수를 도입하고,이어서이 액을 회수함으로써 이루어진다. 검색된 솔루션은 다음 정량화 및 표현형 주민 폐에 침투 염증 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 자주 천식과 같은기도의 질병 모델에서 세포 유입을 연구하기 위해 적용되는, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 전염성 질병 모델. 별도로 휴대 조성물에서, 폐기도의 분자 조성물은 또한 BAL 액에 반영된다. 이 분석을 위해, 효소 면역 분석법 (ELISA), 면역 및 사이토킨 비드 어레이에 의해 다수의 사이토 카인을 동시에 분석 할 수있다사이토 카인 및 케모카인의 존재를 평가하기 위해 수행되었다.
BAL은 염증성 호흡기 질환 동물 모델에서 염증 세포의 유입을 연구하는 잘 확립 된 방법입니다. 세포 유입의 변화 ( 예 : 림프구, 호산구 또는 호중구의 증가)는 질병에 대한 더 나은 통찰력을 이끌어 낼 수 있으며 치료 적 개입의 성과를 평가하는 객관적인 매개 변수가 될 수 있습니다.
BAL 세포 분석의 정확하고 재현성있는 해석을 위해서는 BAL이 올바르게 수행되고 수집 된 유체가 올바르게 처리되고 처리되어야합니다. 기간 "기관지 세척"는 Stitt 3 에 의해 80 년 이상 전에 도입되었습니다. 1961 년 Myrvik은 토끼 폐 세척액에서 폐포 대 식세포를 얻었습니다 3 . BAL은 이제 마우스 모델에서 폐를 분석하고 모니터하는 데 일반적으로 사용되는 방법이지만다시 과학 문헌 4 , 5 에서 표준화 된 BAL 절차에 대한 보고서는 아직 없습니다. 또한 BAL을 수행하는 방법에는 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 기술을 사용하는 연구소가 있기 때문에 가능할 수 있습니다. BAL에서 얻은 데이터는 폐의 일부가 아닌 전체 쥐 폐를 나타내는 것이 중요합니다. 이러한 종류의 다양성은 다른 시험 사이의 결과 해석 및 비교를 복잡하게합니다.
여기에서, 마우스의기도 내강에 존재하는 세포질 및 가용성 분획의 수집을 허용하는 염기성의 저렴하고 재현성있는 BAL 절차가 기술되어있다. 요컨대, 카테터는 노출 된 기관fa 마취 된 마우스. 주사기를 카테터에 연결하고, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유하는 완충 된 염수 용액을 폐에 도입 하였다. 폐 루멘은 플런저를 사용하여 염수 용액을 부드럽게 반복하여 세척하여 샘플링합니다. 이 단계에서 부압이 가해지면기도 붕괴를 최소화 할 수 있습니다. 수집 후, 얻은 BAL은 흐름 cytometry에 의해 세포를 열거하고 식별하기 위해 더 처리해야합니다.
Protocol
이 연구에서 설명 된 모든 동물 실험은 국가 별 (벨기에 법 14/08/1986 및 22/12/2003, 벨기에 왕령 06/04/2010) 및 유럽 법령 (EU 지침 2010 / 63 / EU 및 86 / 609 / EEC). 생쥐와 모든 동물 실험에 대한 모든 실험은 Ghent University의 윤리위원회 (허가 번호 LA1400091 및 EC2016-027)에 의해 승인되었습니다.
1. 준비
- 세정액
- 100 μm의 ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA)와 균형 소금 솔루션을 준비합니다.
참고 : BAL 액에서 단백질 수준을 측정하려면 BAL 액에서 프로테아제 활성을 방지하기 위해 프로 테아 제 억제제를 추가하는 것이 좋습니다.
- 100 μm의 ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA)와 균형 소금 솔루션을 준비합니다.
- 카테터
- 투명한 플라스틱 폴리에틸렌 21G 튜빙 (내경 : 0.58 mm, 외경 : 0.965 mm, 길이 : 0.5 cm)에 23 G 바늘을 삽입하여 카테터를 만드십시오. Premade 카테터를 사용할 수도 있습니다.
- 마취바람
- 호흡 정지 ( 예 : 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 sodium pentobarbital (> 100 mg / kg) 용액과 같은 바르비 투르 레이트)를 유발하는 말기 마취제를 준비하십시오.
참고 : 흡입 마취는 BAL 액량에 영향을 줄 수 있으므로 마취 대신 주사 마취를 사용하는 것이 좋습니다. CO 2 는 예를 들어 혈액의 pH에 영향을 미치기 때문에 다른 화합물의 재분배에 영향을 미친다.
- 호흡 정지 ( 예 : 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 sodium pentobarbital (> 100 mg / kg) 용액과 같은 바르비 투르 레이트)를 유발하는 말기 마취제를 준비하십시오.
- 염화 암모늄 - 칼륨 (ACK) 적혈구 용해 완충액
- 100 μM EDTA와 1 H의 H 2 O에 8.29 g의 NH 4 Cl 및 1 g의 KHCO 3 를 용해시켜 ACK 용해 완충액을 제조한다; 적혈구 용해 완충액은 외부 공급원으로부터 구입할 수도 있습니다.
2. BAL (Bronchoalveolar Lavage) 수행하기
- 기관으로 카테터 도입하기
- 26 G 바늘을 사용 속효성 바르비 투르 마취제의 치사량의 복강 내 주사하여 마우스를 안락사. 적절한 치명적인 마취를 확인하기 위해, 발 반사를 확인 집게와 마우스의 후면 발을 꼬집어.
- 수술 접시에 자사의 뒷면에있는 동물을 놓고 사지를 고정하여 마우스를 고정합니다.
- 소독 할 수있는 목에 70 % 에탄올 스프레이. 메스를 사용하여 기관 근처의 목 피부에 절개를합니다.
- 침샘을 노출 피부를 엽니 다. sternohyoid 근육을 노출 집게를 사용하여 침샘을 분리합니다. 기관을 노출 집게를 사용하여 기관 주변의 근육을 절개.
- 집게를 사용하여 기관에서 목화 스레드를 놓습니다.
- 조심스럽게 26 G 바늘 개의 연골 고리의 노출 기관의 중앙 천공. 더 이상 기관이 손상되지 않도록주의하십시오.
- 기관에 0.5 cm에 대한 카테터를 삽입합니다. cathe 있는지 확인이 폐 구조의 손상을 초래할 수 TER은 너무 멀리 아래 기관에 삽입되지 않았습니다.
- 단계 2.1.5 배치 면사를 사용 카테터 주변 기관지 매 의해 카테터 안정화. 카테터가 충분히 연결되지 않은 경우, 주입 균형 염 용액 대신 다운 폐로 호흡기의 상단 부분을 향해 유동 할 수있다.
- 세정액 유체를 수집
- 100 μM EDTA 멸균 균형 염 용액 1 ㎖와 함께 1 ml 주사기로드.
- 카테터에 1 ml 주사기를 연결하고 부드럽게 폐로 염 / EDTA 용액을 주입.
- 마우스의 가슴을 마사지하면서 부드럽게 솔루션을 대기음. 흡 유체가 주사기에 표시되지 않는 경우, 신중하게 조금 더 아래로 또는 기관까지 카테터를 삽입합니다.
- 바늘에서 주사기를 제거하고 얼음에 위치 된 15 ㎖의 튜브에 회수 된 세정액을 전송. 일반적으로 700-900 &181; BAL의 L은 주사 용액 1 ㎖로 회수된다.
- 2.2.4 두 번 더 - 반복 2.2.1 단계를 반복합니다.
참고 : 목적이 아닌 세포의 콘텐츠를 분석하는 경우,이 감도에 문제가있는 경우 풀링 된 샘플을 집중하는 것이 좋습니다.
3. BAL 유체의 세포와 비 세포 구성 요소를 수집
- 400 XG에서 7 분, 39 ° C에 대한 세척액을 원심 분리기.
- -80 ℃에서 추가 분석 (예, ELISA) 또는 동결을 위해 사용 즉시 상층 액을 모아서. 폐의 세포 유입을 분석하기 위해 세포 펠렛을 유지합니다.
- ACK 용균 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
참고 : 그대로 백혈구를 유지하면서이 단계는 적혈구의 용해를 보장합니다. - RT에서 2 분 동안 인큐베이션.
참고 : 빨간색 세포 용해에 의한 변화를 줄이기 위해이 단계 이상 2 분 동안 수행 할 수 없습니다. 상기 ACK 용균 완충액을 희석하여 차가운 PBS 1 ㎖를 추가한다. - 400 XG에서 7 분, 39 ° C 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 전방 분석 (하기 참조)의 PBS 충분한 양의 세포를 다시 일시.
참고 : PBS의 볼륨이 수행됩니다 하류 연구에 따라 달라집니다.
유동 세포 계측법에 의한 기관지 폐포 세척액에서 다른 세포 유형의 4. 분석
주 : 하나의 가능성은 유세포 분석을 수행하여 BAL 유체의 절대 및 상대 세포 조성물을 분석하는 것이다. 이 논문의 목적은 BAL의 기술을 정교하게하는 것입니다. 유동 세포 계측법은 그 자체 전문 기술이다. 기술 13, 14, 15, 16, 17 유동 세포 계측법에 대한 전문적인 논문을 읽을 것을 권장합니다. 형광의 t에 결합 항체특정 세포 유형에 특이적인 표면 항원 ( 표 1 참조)이 사용됩니다. 게이팅 전략을 사용함으로써 BAL 세포 분획에서 T 세포, 대 식세포, 수지상 세포, B 세포, 호산구 및 호중구를 확인할 수 있습니다.
| 항원 | 셀 유형 |
| 차별화 클러스터 3 (CD3) | T 세포에 표현됨 |
| 분화 클러스터 11c (CD11c) | 대부분의 수지상 세포뿐만 아니라 단핵 세포, 대 식세포, 호중구 및 일부 B 세포에서도 높은 발현. |
| 분화 클러스터 (11b) (CD11b) | 단핵 세포, 호중구, 자연 살상 세포, 과립구 및 대 식세포를 포함한 많은 백혈구의 표면에 표현됩니다. |
| SiglecF | 에이폐포 대 식세포 및 호산구. |
| MHCII | 수지상 세포, 단핵 식세포 및 B 세포와 같은 항원 제시 세포에서만 정상적으로 발견됩니다. |
| CD19 | B- 림프구 항원 |
| Ly-6G | 단핵 세포, 과립구 및 호중구에 대한 마커 |
표 1 : 면역 세포 표면 항원의 선택. 이 표는 다른 세포 유형을 특성화하는 데 사용되는 표면 에피토프의 목록을 제공합니다. 특정 세포 유형을 확실하게 정의하려면 여러 마커를 조합해야합니다.
| 견본 | ||||
| 튜브 | 세포에 첨가되는 항원 - 형광 단 항체 저장 농도 (mg / mL) | 항체 희석 | 총 부피 (μL) | |
| 고정 생존 염료 | 0.2 | 1/1000 | 50 | |
| CD11c | 0.2 | 1/800 | 50 | |
| SiglecF | 0.2 | 1/100 | 50 | |
| 샘플 X | MHCII | 0.2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| CD19 | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| CD1b | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| Ly6G | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| 전압 제어 | ||||
| 튜브 | 항원 - 형광 세포에 첨가 할 | 항체 스톡 농도 (㎎ / ㎖) | 항체 희석 | 전체 볼륨 (μL) |
| 흠 세포 | / | / | / | (50) |
| 단일 염색 된 세포 | 고칠 가능성 염료 | 0.2 | 1/1000 | (50) |
| 단일 염색 된 세포 | 중 CD11c | 0.2 | 1/800 | (50) |
| 단일 염색 된 세포 | SiglecF | 0.2 | 1/100 | (50) |
| 단일 염색 된 세포 | MHCII | 0.2 | 1/200 | (50) |
| 단일 염색 된 세포 | CD3 | 0.2 | 1/200 | 50 |
| 단일 염색 세포 | CD19 | 0.2 | 1/200 | 50 |
| 단일 염색 세포 | CD1b | 0.2 | 1/200 | 50 |
| 단일 염색 세포 | Ly6G | 0.2 | 1/200 | 50 |
| 보상 제어 | ||||
| 튜브 | 비드에 첨가되는 항원 - 형광체 | 항체 저장 농도 (mg / mL) | 항체 희석 | 총 부피 (μL) |
| 염색되지 않은 구슬 | / | / | / | 200 |
| 단일 염색 된 구슬 | CD11c | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| 단일 염색 된 구슬 | SiglecF | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| 단일 염색 된 구슬 | MHCII | 0.2 | 1/200 | 200 |
| 단일 염색 된 구슬 | CD3 | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| 단일 염색 된 구슬 | CD19 | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| 단일 염색 된 구슬 | CD1b | 0.2 | 1/400 | 200 |
| 단일 염색 된 구슬 | Ly6G | 0.2 | 1/200 | 200 |
표 2. 포함될 제어 목록. 이 표에는 얻은 결과를 정확하게 해석하기 위해 필요한 모든 컨트롤이 나와 있습니다.
- 세포 표면 염색
참고 : 그것은 impo입니다.유동 세포 계측법 분석을위한 모든 중요한 컨트롤을 포함해야합니다. 3 세트의 튜브가 필요하다. ( 표 2 참조) : (1) 시료가 들어있는 튜브; (2) 단일 항체를 만드는 각 항체 - 발색단을위한 BAL 세포가있는 튜브; 이것은 유동 세포 계측기의 각 채널에 대한 전압 측정을 허용합니다. 및 (3) 단일 항체를 만들기위한 각 항체 - 발색단을위한 비드가있는 튜브; 이것은 보상 매트릭스를 결정하는 것입니다.- 적절한 희석액으로 PBS에서 항체와 Fc 차단제 (anti-CD16 / CD32)를 섞는다 ( 표 2 참조). 실험 전에 각 항체에 대한 최적의 작업 희석을 결정하는 것이 필요합니다.
- 샘플에 대한 항체 믹스의 50 μL에있는 세포를 Resuspend하고 중요한 컨트롤에 적절하게 희석 항체 50 μL를 추가합니다.
참고 : 얼룩은 96 웰, U 자 모양의 플레이트에서 수행 할 수 있습니다. 이것은 얼룩 부피를 용이하게 감소시킬 수있다.차 샘플의 상당한 양을 실행합니다. - 4 ℃에서 어둠 속에서 30 분 동안 인큐베이션.
- 400 XG에서 7 분, 39 ° C 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- 200 μL의 최종 볼륨 PBS에서 세포를 다시 일시 중지합니다.
참고 :이 최종 부피가 유동 세포 계수기가 액세스 할 수있는 최소한의 양에 따라 달라집니다. 이 기계 사이에 약간 다를 수 있습니다. 또한, 읽기 볼륨은 샘플 흐름 cytometer에서 실행하는 데 걸리는 세포 및 / 또는 시간의 수에 따라 달라집니다. - 유세포 분석을 위해 샘플과 컨트롤을 사용합니다.
참고 : 다른 세포 인구의 절대 세포 수를 확인하려면 계산 구슬을 추가해야합니다. 구슬 같은 수의 추가 단지 측정하기 전에 각 샘플 (25,000 구슬을 ±). 유동 세포 계측법에 의해 식별 될 수있는 비드를 카운트 앞으로 사용 및 측면 스 캐터에 의해 (도 1 참조). 이어서, 샘플에서 세포의 절대 수는 제를 비교함으로써 계산 될 수있다e 비드 이벤트 대 셀 이벤트의 비율. 다음 수식을 사용할 수 있습니다.
- 유세포 분석
참고 : 유세 세포 분석은 염색 프로토콜 완료 후 즉시 수행해야합니다. 신호 검출을위한 적절한 레이저 및 필터가있는 유동 세포 계측기를 사용해야합니다. 표 3 은이 원고에서 설명한 연구에 필요한 레이저 및 필터의 개요를 제공합니다. 유세포 분석에 대한 더 자세한 정보는 Adan et al. 18 .- 파편과 이중 선을 제외하고 전방 및 측면 산란에 기초하여 1 차 게이트를 설치하십시오 ( 그림 1 참조).
- 단일 염색 세포와 구슬의 도움으로 스펙트럼 중복에 대한 전압과 보상을 조정하십시오.
참고 :이 설정은 각 유동 세포 계측기마다 다르므로 모든 실험 전에 확인해야합니다. 에프정확한 흐름 분석을 위해서는 전방 및 측면 산란 전압이 중요합니다. 올바른 전방 및 측면 산란은 분석 된 세포의 확인 및 확인에 도움이 될 수 있습니다. 이 전압을 결정하기 위해서는 염색되지 않은 샘플을 먼저 실행해야합니다. - 표면 항원에 대한 형광 게이트를 설정하고 ( 그림 1 참조) 샘플을 분석합니다.
| 레이저 유형 | 필터 설정 | |
| 505 LP | 525/50 | |
| 파란색 (488 nm) | 550 LP | 575/26 |
| 100 mW | 670 LP | 685/35 |
| 750 LP | 780/60 | |
| 바이올렛 405 nm | 450/50 | |
| 100 mW | ||
| 적색 633 nm | 660/20 | |
| 70 mW | 750 LP | 780/60 |
도표 3 :이 학문에서 사용 된 유동 세포 계측기의 레이저 그리고 여과기의 개관.
Representative Results
3x 1 mL의 완충 된 소금 용액으로 BAL을 수행 한 후 2 ~ 3 mL 사이의 부피를 회복해야합니다. 이 BAL 유체는 세포 및 비 세포 함량을 특성화하기 위해 더 분석 될 수 있습니다. 사이토 카인 및 케모카인의 존재를 조사하기 위해, ELISA 19 , 면역 블롯 20 및 사이토 카인 비드 어레이 21 에 의한 다중 사이토 카인의 동시 분석이 수행 될 수있다. 또한,이 유체의 알부민 및 총 단백질 함량을 측정 할 수 있습니다 22 .
예를 들어,이 원고는 유동 세포 계측법으로 BAL 액의 세포 내용을 분석하는 방법을 설명합니다. 분석 한 BAL 액을 지중해에 리포 다당류를 주입 한 24 시간 후, 암컷 Balb / cAnNCrl 마우스 (7 주령)로부터 수집 하였다. 형광 물질에 결합 된 다음 항체, w중 CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g 및 CD11b를 (표 1 및 재료의 도표 참조) 감수은 상이한 세포 유형을 식별하기 위해 사용된다. 정착 가능 생존 염료도 사용되었다. 다른 세포 집단 (도 1)의 표면 항원의 발현 차이에 기초하여 게이팅 전략을 사용함으로써, 대 식세포, 수지상 세포, B 세포, T 세포, 호중구, 호산구를 식별 할 수 있었다.
먼저, 파편 및 이중선은 순방향 및 측면 산란 파라미터에 기초하여 게이팅 하였다. 생존력 염료는 살아있는 세포에 게이팅을 촉진. 다음 중 CD11c 높은 세포 중 CD11c 낮은 세포가 확인되었다. 의 CD11c 높은 인구에서, 대 식세포와 수지상 세포는 각각 MHCII 및 SiglecF 표현을 기반으로 확인되었다. 중 CD11c 낮은 인구, T 세포와 B 세포를 각각 CD3ε 및 CD19의 발현에 기초하여 동정 하였다. 일에서즉 나머지 세포군, 호중구 및 호산구는 각각는 CD11b 및 LY-6G 마커의 발현에 기초하여 동정 하였다.
계산 구슬 셀 이벤트 (23)에 비드 이벤트의 비율을 비교하여 다른 세포 집단의 절대 세포 수를 결정 하였다. 이 계산 구슬들은 순방향 및 측면 산란 특성 (그림 1)을 기준으로 확인되었다. 표 4의 다당류 5㎍을 24 시간 동안 자극 한 나이브 마우스의 BAL 유체에서 다른 세포 집단의 절대 세포 수 및 마우스의 개요를 제공한다.
도 1 : 대 식세포의 유세포 검출 용 게이팅 전략, 수지상 세포, T 세포, B 세포, 호중구, 호산구 나n BAL 유체. BAL 세포는 기술 된 BAL 프로토콜을 사용하여 단리되었다. lipopolysaccharide의 기관 내 주입 후 24 시간 쥐에서 세포를 분리 하였다. 구슬과 세포를 세는 것은 전방 및 측면 산란 특성에 기초하여 확인되었다. 셀 게이트에서, 단일 세포는 전방 및 측면 산란을 이용하여 동정되었다. 이 마지막 집단에서는 살아 있던 세포가 확인되었습니다. CD11c 고 세포와 CD11c 저 세포가 확인되었다. CD11c 고 모집단에서, 대 식세포 및 수상 세포는 각각 MHCII 및 SiglecF 발현에 기초하여 동정되었다. CD11c 저 모집단에서는 CD3ε 및 CD19 발현에 따라 T 세포 및 B 세포가 각각 동정되었다. 나머지 세포 집단에서 CD11b 및 Ly-6G 발현에 기초하여 호중구 및 호산구가 각각 동정되었다. 여기를 클릭하여이 그림의 더 큰 버전.
| 세포 집단 | 순진한 마우스의 절대 세포 수 | LPS 자극 마우스에서의 절대 세포 수 |
| 대 식세포 | 79,612 | 25,439 |
| 수지상 세포 | 495 | 671 |
| T 세포 | 45,271 | 28,089 명 |
| B 세포 | 4,164 | 2,926 |
| 호중구 | 632 | 566,716 |
| 호산구 | 3,483 | 4,332 |
도표 4 : RepresenNaive 및 LPS- 자극 된 마우스의 BAL 유체에 대한 유동 세포 계측법 분석 결과.
Discussion
BAL은 감염이나 약물에 대한 반응으로 세포학 및 생화학 적 정보를 얻는 유용한 기술입니다. 초기에 BAL은 인체 독성을 앓고있는 환자에서 과도한 점액 생성을 관리하는 데 사용되었습니다 3 . 요즘이 기술은 인간의 폐 병태 생리, 진단 및 질병 치료 관리에 사용됩니다 3 , 24 . 실험실 동물에서 BAL은 일반적으로 폐기도 1 , 2 에서 발생하는 염증 반응, 면역 기전 및 전염병 과정을 모니터링하는 데 사용됩니다.
호흡기 질환 모델에서 염증 세포 패턴을 연구하려면 BAL 다음에 절대 및 차별 세포 계수가 이어져야합니다. 절대 세포 수 이외에 상대 세포 수도 중요합니다. 예를 들어, 수선 및 암 모델은 v적은 양의 BAL 세포 수가 증가합니다. 이 모델에서는 세포 조성의 평가가 유용합니다. 광학 현미경 검사와 결합 된 세포 염색법을 사용하여 호산구, 호중구, 대 식세포 및 림프구와 같은 다양한 세포 유형을 형태학 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30을 기준으로 확인할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 다른 T 세포 표현형을 확인하는 것과 같은 특정 평가에 사용될 수 있습니다 7 , 31 . 서로 다른 침윤성 세포 집단의 동정 외에도 폐의 비 세포 성 조성물은 BAL을 사용하여 조사 할 수 있습니다. ELISA, 면역 블롯, 사이토 카인 비드 어레이, 면역 조직 화학 및 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응을 BAL 유체에서 수행하여 사이토 카인, 성장인자 및 기타 염증 성분을 포함한다. 폐 손상을 측정하기 위해 BAL 액의 총 단백질 및 젖산 탈수소 효소 수준도 측정 할 수 있습니다 (32 , 33) .
새로운 진단 도구가 개발됨에 따라 BAL 구성 요소의 게놈 및 프로 테오 믹 특성이 조만간 가능할 것입니다. 확장 된 계산 기능과 높은 처리량의 유전자 발현 기술의 결합으로 다양한 질병 상태에 대한 특정 유전자 발현 프로파일을 정의 할 수 있습니다. BAL 유체에서 이러한 기술을 수행하면 폐 질환의 여러 단계에 관여하는 중요한 분자를 확인하는 유전자 및 단백질 발현 패턴을 제공 할 수 있습니다.
BAL 유체에서 얻은 데이터의 주요 한계는 여러 연구 시험 3 , 9 사이의 비교 가능성 부족입니다. 높은 수준의세척 기술의 가변성 및 BAL 유체의 후속 공정 각 BAL 시험을 비교할 수 있으려면 주입되는 세척액 유형, 점안 부위 및 세포 및 비 세포 성분 분석을위한 분획을 표준화해야합니다. 서로 다른 시도 사이에 세척 률의 수에 상당한 차이가 있으며, 1 회에서 14 회까지 34 , 35 , 36 에서 다양합니다. 이 차이는 폐의 추정 총 세포 수에 영향을 줄 수 있습니다. 어떤 BAL 유체 분획이 대부분의 세포를 함유하고 있는지를 아는 것이 중요합니다. 송 외. 총 세포 수의 약 70 %가 분획 1 내지 3에서 회수되었음을 보여 주었다. 그러나 다른보고에 따르면 두 번째 세척은 첫 번째 세척보다 더 많은 세포를 포함한다고합니다. 37,38
기관지 폐포 액의 비 셀룰러 조성은 폐 (33), (39), (40)의 건강 상태에 대한 중요한 정보가 포함되어 있습니다. 기관지 폐포 액의 희석 변형 시험의 결과에 차이에 따라서, 수용성 분획 정량의 차이에 기여. 노래 등. 단백질 각각 세척 분획 젖산 탈수소 효소 수준을 비교하고 제 세척 분획 번째 분획에 비해 2 ~ 3 배 이상을 함유하는 것으로 결론 지었다.
분석을위한 대표적인 BAL 샘플을 검색하려면, 몇 가지 기술적 인 고려 사항이 중요하다. 그 중 하나는 적절한 마취를 수행하는 것입니다. 발 심판을 확인하는 것이 매우 중요합니다터미널 진정을 보장하기 위해 마우스의 렉스. 이것은 윤리적 인 이유 때문에 중요 할뿐만 아니라 마우 네가 적절하게 마취되지 않으면 카테터를 올바른 위치에 놓고 유지하기가 어렵 기 때문에 또한 중요합니다.
두 번째 중요한 기술적 고려 사항은 기관 내 카테터의 위치입니다. 카테터가 너무 깊게 삽입되면 폐 구조가 손상 될 수 있습니다. BAL 절차 중 카테터의 말단부가 폐에 도달하지 않아야합니다. 카테터는 또한 안정화되고 면사로 묶여 야합니다. 카테터가 안정화되지 않은 경우 주사 된 염분 용액이 폐 아래가 아닌 비강 내로 위쪽으로 흐를 수 있습니다. 생리 식염수 주입 및 흡입 중에 카테터를 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다.
BAL 액에서 얻은 데이터는 쥐 폐 전체를 나타내야합니다. 그러므로 적절한 양의 생리 식염수를 주입하는 것이 중요합니다 ( 즉,3 mL, 3 mL 씩 1 mL 씩). 세포 수율과 BAL 수율 간에는 선형 관계가 없습니다. 마우스의 흉부를 마사지하는 동안 용액을 부드럽게 모으는 것이 중요합니다. 전단력이 너무 강하면기도 및 BAL 유체 내의 세포의 생존 능력, 기능 및 구조가 손상 될 수 있습니다. 흡입 한 유체가 주사기에 보이지 않으면 조심스럽게 카테 테르를기도의 깊숙이 깊숙히 움직여야합니다.
BAL 처리 및 분석의 특정 측면에 대해 특별한주의를 기울여야합니다. 이렇게하면 BAL 샘플에서 유지되는 정보가 최대화됩니다. BAL 후 세포는 영양이 부족한 염분 매질에 있습니다. 따라서 BAL 샘플링 후 1 시간 이내에 샘플을 처리하는 것이 매우 중요합니다. 장기간 보관이 필요한 경우, 영양분이 보충 된 배지를 사용해야합니다.
세포 생존 능력을 유지하려면 표면에 세포가 달라 붙는 것을 방지하는 튜브를 피하십시오. 피할 ce세포의 완전성을 손상 시키거나 회수 된 BAL 세포의 균일 한 재 부유를 방지하는 속도로 세포 현탁액을 비유 해. BAL 유체 함유 세포는 400 xg 및 4 ° C에서 7 분간 원심 분리해야합니다. 세포 현탁액은 처리하는 동안 4 ° C에서 유지되어야한다는 것을 명심하는 것이 중요합니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
LVH는 Ghent University의 Biomedical Molecular Biology학과의 연구 조교입니다. ERJ는 UniVacFlu, 승인 번호 607690에서 지원됩니다. KR은 EC-FP7 프로젝트 FLUNIVAC에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
| ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
| 23 G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0.60 x 30 mm |
| 26 G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0.45 x 12 mm |
| plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023") O.D. 0.965 mm (0.38") 30.5 m (100') |
| sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca2+ Mg2+ or phenol red; sterile filtered |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | nonpyrogenic and nontoxic |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
| centrifuge tube 50 mL | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| centrifuge tube 15 mL | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
| Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile-filtered |
| live/dead - efluor 506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
| CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
| SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
| MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
| CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
| CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
| CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
| Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
| flow cytometer | BD Biosciences | ||
| catheter | BD Biosciences | 393202 |
References
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