Summary
Nous présentons un protocole pour générer une lignée chondrogénique à partir de sang périphérique humain (PB) via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en utilisant une méthode sans intégration, qui comprend la formation de corps embryoïde (EB), l'expansion des cellules fibroblastiques et l'induction chondrogénique.
Abstract
Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules sanguines périphériques (PBC) comme cellules de semences pour produire des chondrocytes via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une méthode sans intégration. Après la formation de corps embryoïdaux (EB) et l'expansion des cellules fibroblastiques, les iPSC sont induits pour la différenciation chondrogénique pendant 21 jours dans des conditions exemptes de sérum et exemptes de xénon. Après l'induction des chondrocytes, les phénotypes des cellules sont évalués par des analyses morphologiques, immunohistochimiques et biochimiques, ainsi que par l'examen quantitatif en PCR en temps réel des marqueurs de différenciation chondrogénique. Les granulés chondrogénés présentent une coloration au bleu alcien positive et au bleu de toluidine. L'immunohistochimie de la coloration au collagène II et X est également positive. La teneur en glycosaminoglycanes sulfatés (sGAG) et les marqueurs de différenciation chondrogénique COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 et AGGRECAN sont significativement régulés à la hausseGranulés rogéniques par rapport aux hiPSC et aux cellules fibroblastiques. Ces résultats suggèrent que les PBC peuvent être utilisés comme cellules de graines pour générer des iPSC pour la réparation du cartilage, ce qui est spécifique au patient et rentable.
Introduction
Le tissu cartilagineux a une très faible capacité d'auto-réparation et de régénération. Diverses interventions chirurgicales et traitements biologiques sont utilisés pour restaurer le cartilage et la fonction articulaire, avec des résultats insatisfaisants. Le développement récent de la technologie des cellules souches peut changer l'ensemble du champ de réparation du cartilage 1 . Diverses cellules souches ont été étudiées comme cellules de semences, mais les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) semblent être le choix le plus prometteur, car elles peuvent fournir de nombreux types de cellules spécifiques du patient sans provoquer de réactions de rejet 2 . En outre, ils peuvent surmonter la nature proliférante limitée des cellules adultes et maintenir leur auto-renouvellement et leurs capacités pluripotentes. En outre, le ciblage des gènes peut être utilisé pour changer le génotype pour obtenir des types spécifiques de chondrocytes.
Les fibroblastes ont été largement utilisés pour générer des iPSC car leurs potentiels de reprogrammation ont également été bien étudiés.Cependant, il reste encore des limites qui doivent être surmontées, telles que la biopsie douloureuse des patients et la nécessité d' une expansion in vitro des fibroblastes, ce qui peut entraîner des mutations génétiques 3 . Récemment, les PBC ont été jugés avantageux pour la reprogrammation 4 ; De plus, ils étaient couramment utilisés et stockés abondamment. Il est possible qu'ils puissent réorienter l'étude de la peau. Cependant, selon le meilleur de notre connaissance, il existe peu de rapports sur la reprogrammation du PBC suivi d'une différenciation en chondrocytes.
Dans l'étude actuelle, nous utilisons les PBC comme source alternative en les reprogrammes dans les iPSC, puis en différenciant les iPSC dans la lignée chondrogénique à travers un système de culture de pastilles afin d'imiter la formation de chondrocytes.
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Protocol
Le protocole pour la génération de hiPSC des PBC peut être trouvé dans notre étude précédente 5 . L'étude a été approuvée par le Conseil d'examen institutionnel de notre institution.
1. Formation du corps embryoïde (EB)
- Faire 50 mL de milieu HiPSC: Milieu Eagle modifié modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 15% de remplissage sérique knockout (KSR), 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 1 × acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol 55 μM, 2 mM L -glutamine et 8 ng / mL de facteur de croissance de fibroblastes basique (bFGF).
- Faire un milieu de formation de 50 ml de EB: DMEM supplémenté avec 15% de KSR, 5% de FBS, 1x acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol à 55 uM et 2 mM de L-glutamine.
- Faire 50 ml de milieu de culture basal: DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 1 x acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol à 55 uM et 2 mM de L-glutamine.
- Préparez 10 ml de solution de solution, 1 mg / ml dans le DMEM éliminatoire.
- CultuRe HiPSCs sur des boîtes de culture tissulaire de 60 mm avec des cellules nourricières ( c'est-à-dire une monocouche de cellules de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées). Lorsque les cellules sont confondues à 80-90%, dissociez les cellules avec dispase et passez les hiPSC 1: 3 tous les 4-5 jours. Placez les cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% CO 2 .
- Dissectionnez les colonies hiPSC indifférenciées en morceaux plus petits (environ 50 à 100 μm de diamètre) à l'aide d'une aiguille en verre tirée par le feu lorsque les iPSC sont confluent de 80 à 90%. Généralement, utilisez des colonies hiPSC dans un plat de 60 mm pour générer des EB dans une boîte de Petri de 100 mm.
- Culturez moins de 100 petits morceaux de colonies dans une boîte de Petri 100 mm non adhérente contenant 10 ml de milieu de formation d'EB. Placer la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C et 5% CO 2 .
- Remplacer environ 25% du milieu initial par une quantité égale du milieu de culture basal tous les 2 jours. Inclinez le plat pour laisser les EB se déposer. Retirez délicatement 3 mLDu milieu supérieur et ajouter 4 mL de milieu de culture basal frais. Ne pas déranger les EB.
NOTE: Les EB sont caractérisés morphologiquement par les morceaux de colonies, prenant une apparence ronde avec des bordures lisses au microscope. - Après 10 jours de culture dans la boîte de Petri non adhérente, recouvrir un nouveau plat de culture tissulaire de 100 mm avec 4 ml de gélatine à 0,1% pendant 30 minutes à 37 ° C avant utilisation.
- Transférer le milieu plus EB à partir d'une boîte de Petri 100 mm non adhérente à un tube conique de 15 ml. Laissez les EB sédimenter pendant 4-5 min. Aspirer soigneusement le surnageant et laisser moins de 0,5 ml de moyen plus EB
- Émerger moins de 100 EB sur un plat de culture tissulaire de 100 mm, revêtu de gélatine, avec 10 ml de milieu de culture basal. Placer la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C et 5% CO 2 .
2. Formation de pellets cellulaires et différenciation de chondrocytes
- Faire 10 ml de trypsine 0,25% / acide éthylènediaminetétracétique (EDTA). Faire 80 mL de basAl: DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 1x acides aminés non essentiels, 2-mercaptoéthanol à 55 uM et L-glutamine 2 mM.
- Faire 10 mL de milieu de différenciation chondrogénique: DMEM (glucose élevé) additionné de 10% de solution d'insuline-transferrine-sélénium (STI), 0,1 μM de dexaméthasone, 1 mM d'acide ascorbique, 1% de pyruvate de sodium et 10 ng / mL de facteur de croissance transformant- Beta 1 (TGF-β1).
- Rafraîchir le milieu avec 10 mL de milieu de culture basal après 48 h. Ensuite, rafraîchir le milieu tous les trois jours avec 10 mL de milieu de culture basal.
REMARQUE: Après 10 jours de culture, les excroissances cellulaires fibroblastiques auraient dû se développer à partir des EB.- Enduire les plats de 100 mm avec 4 mL de gélatine 0,1% pendant 30 minutes à 37 ° C avant utilisation. Jeter le surnageant de cellules et laver les cellules avec la solution salée tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) une fois.
- Recueillir les cellules avec 3 ml de trypsine à 0,25% / EDTA à 37 ° C pendant 5 min et neutraliser à 4 mL de milieu de culture de base.
- Dissociez les cellules en cellules simples en pipetant de 5 à 10 fois et en les passant par une maille de nylon de 70 μm. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 xg pendant 5 min. Re-semer les cellules sur un nouveau plat de culture de tissu revêtu de gélatine de 100 mm avec 10 ml de milieu de culture basal.
- Rafraîchir le milieu avec 10 mL de milieu de culture basal après 48 h. Ensuite, rafraîchir le milieu tous les trois jours avec 10 mL de milieu de culture basal.
NOTE: Les cellules acquièrent une morphologie homogène, fibroblastique. - Lorsque ~ 90-100% de confluence est atteinte ( c.-à-d. Environ 5-7 jours), récoltez les cellules avec 3 ml de trypsine / EDTA à 0,25% à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser avec 4 ml de milieu de culture basal. Dissocier les cellules en cellules simples en pipetant vers le haut et vers le bas 5 fois. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules.
- Placez 3 x 10 5 cellules dans un tube de polypropylène de 15 ml. Centrifugeuse à 200 xgPendant 5 min à température ambiante (RT). Ré-suspendre les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation chondrogénique.
- Récentrifuger les cellules à 300 xg pendant 3 min et maintenir les cellules sous forme de petites pastilles. Mettre le tube dans l'incubateur à 37 ° C et 5% CO 2 pendant 21 jours. Ne pas visser fermement le couvercle et laisser échouer le gaz.
- Remplacer 3/4 du milieu de culture tous les trois jours par un milieu de différenciation chondrogénique frais.
REMARQUE: Après 21 jours de culture, on a formé des granulés chondrogéniques hiPSC (hiPSC-Chon). Les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC), comme témoin positif, sont également collectées et cultivées dans le milieu de différenciation chondrogénique pendant 21 jours pour former des granulés chondrogéniques (hMSC-Chon).
3. Analyse de la différenciation chondrogénique
- Préparer 10 ml de 10% de formol tampon neutre.
- Préparez 50 ml de réactif bleu alcien 0,1% et 50 ml de réactif bleu toluidine à 1%.
- PrDépasser 1 ml des anticorps primaires: anticorps polyclonaux de lapin contre le collagène II (1:50) ou des anticorps monoclonaux de souris contre le collagène X (1:50). Préparer également des anticorps secondaires anti-lapin ou souris.
- Faire 1 mL de solution de papaïne: 10 U / mL dans du PBS avec de l'acétate de sodium 0,1 M, de l'EDTA 2,4 mM et de la L-cystéine 5 mM.
- Faire 100 ml de solution de colorant au bleu de diméthylméthylène (DMMB): 100 μL de 16 mg / l de 1,9-diméthylméthylène bleu, 40 mM de glycine, 40 mM de NaCl et 9,5 mM de HCl; PH 3.0.
- Évaluer la différenciation chondrogénique par le bleu alcian et les taches bleues de toluidine des sections de pastilles.
- Réparez une pastille de HLPSC-Chon ou une pastille de HMSC-Chon dans 1 mL de 10% de formol tampon neutre pendant 24 h.
- Transférer la pastille à 1 ml d'éthanol à 70% dans de l'H 2 O. Déshydrater la pastille avec 1 ml d'une série d'éthanol graduée ( c.-à-d., 25, 50, 75, 90, 95, 100 et 100%, 3 min chacun).
- Clarifier la pastille dans 1 mL de 100% de xylène trois fois. InfiltratE la pastille avec de la paraffine pendant 1 h dans un four à 65 ° C. Incorporer la pastille dans des blocs de paraffines avec un moule de base de 7 x 7 x 5 mm 3 , suivant des procédures histologiques de routine 6 .
- Faire des sections adjacentes par microtome avec une épaisseur d'environ 4 μm 7 . Adhérer les sections sur les lames de verre.
- Séchez les diapositives pendant 2 h à 60 ° C dans un four. Déparaffiner les sections en trois cycles (3 min chacun) en utilisant 100% de xylene.
- Utilisez une série d'alcool décroissante pour la réhydratation ( c.-à-d., 100, 100, 95, 95, 70, 50 et 25% en H 2 O, 3 min chacun), puis effectuez un rinçage final avec de l'eau désionisée pendant 5 min.
- Tachez les sections avec 0,1% de réactif alcian bleu ou 1% de colorant au bleu de toluidine pendant 4-5 h, puis rincez-les avec de l'eau distillée.
- Déshydrate avec une série d'éthanol graduée ( c.-à-d., 25, 50, 75, 90, 95, 100 et 100%, 3 minutes chacune) suivie de trois st. ConsécutifsEps de clarification dans 100% de xylène. Monter les diapositives et les visualiser sous un microscope.
- Effectuer l'immunohistochimie.
REMARQUE: Des sections de pastilles supplémentaires sont encore évaluées par immunohistochimie.- Après déparaffinisation et réhydratation, amener les diapositives à ébullition dans de l'EDTA 1 mM, pH 8,0 (imperméable à l'eau dans de l'eau bouillie par autoclave). Laissez-les reposer pendant 8 minutes à une température inférieure à l'ébullition, puis laissez les glissières refroidir à la température ambiante.
- Rincer les lames avec de l'eau désionisée 3 fois. Incuber les sections dans une solution à 3% de H 2 O 2 dans du methanol à la RT pendant 15 minutes pour bloquer l'activité de peroxydase endogène.
- Rincer les toboggans avec de l'eau désionisée et les immerger dans du DPBS pendant 5 min. Appliquer 50 à 100 μl d'anticorps primaire dilué (1:50) convenablement aux sections sur les lames, puis les incuber dans une chambre humidifiée à la température ambiante pendant 1 h.
- Lavez les diapositives 3 fois (5 minutes chacune) avec du DPBS. Incuber la saMâche avec les anticorps secondaires correspondants ( c. -à- d. Anti-lapin ou souris) pendant 15 minutes à la RT.
- Lavez les diapositives 3 fois (pendant 5 minutes chacune) avec du DPBS. Effectuer la détection DAB sous un microscope.
- Laver les diapositives avec DPBS 3 fois (2 minutes chacune). Contrôler les noyaux cellulaires en immergeant les glissières dans l'hématoxyline pendant 1 à 2 minutes. Déshydrater avec une série d'éthanol graduée (25, 50, 75, 90, 95, 100 et 100%, 3 min chacun) suivie de trois étapes consécutives de clarification avec du xylene. Enfin, montez les diapositives et visualisez-les sous le microscope.
- Détecter le contenu sGAG.
- Recueillir des pastilles chondrogéniques dans une solution de papaïne à 60 ° C pendant 2 h.
- Déterminer le contenu d'ADN en utilisant le kit d'analyse de dsDNA et le système de fluoromètre. Mesurer le contenu sGAG en le mélangeant avec une solution de colorant DMMB sous une mesure d'absorbance à 525 nm 8 .
- Calculer la concentration de sGAG par rapport à une courbe standard deSulfate de chondroïtine de requin.
- Effectuer l'analyse par PCR en temps réel des marqueurs de différenciation chondrogénique dans les granulés HiPSC-Chon.
- Récoltez 3-4 des mêmes granulés chondrogéniques en ajoutant 500 μL de réactif d'extraction glacé à un tube. Vortex à fond. Incuber l'échantillon pendant 5 min à la température ambiante.
- Ajouter 0,1 ml de chloroforme. Vortex l'échantillon pendant 15 s et incuber à la RT pendant 3 min. Centrifuger l'échantillon pendant 15 min à 12 000 xg et 4 ° C. Transférer la phase aqueuse supérieure (environ 250 μL) dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
- Ajouter 25 μl d'acétate de sodium et 1 μl de glycogène à l'échantillon. Précipiter l'ARN en le mélangeant avec 250 ul d'alcool isopropylique. Bien mélanger. Incuber l'échantillon à la température ambiante pendant 10 min.
- Centrifugez pendant 10 min à 12 000 xg et 4 ° C. Retirez complètement le surnageant. Laver la pastille d'ARN deux fois avec 500 μL d'éthanol à 75%.
- Centrifugeuse pendant 5 minÀ 7 500 xg et 4 ° C. Retirez l'éthanol restant et séchez à l'air libre la pastille d'ARN pendant 5 à 10 minutes. Dissoudre l'ARN dans 10 μL d'eau exempte de nuclease.
- Convertissez l'ARN en ADNc en utilisant un système de transcriptase inverse. Soumettre les échantillons d'ADNc à la PCR en temps réel en utilisant le mélange maître du kit qPCR (2x) et un système de PCR en temps réel 9 .
NOTE: Les séquences d'amorces sont:
H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.
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Representative Results
Différenciation chondrogénique des hiPSC:
Le milieu de formation de EB et le milieu de culture basal ont été utilisés pour différencier les hiPSC dans la lignée de mésenchyme. Une méthode de culture multi-étapes a été utilisée ( figure 1 ). Tout d'abord, les hiPSC ont été spontanément différenciés via la formation d'EB pendant 10 jours (D10, Figure 2A ). Deuxièmement, les cellules dépassent les EB pendant 10 jours (D10 + 10). Au cours de ces deux étapes, les iPSC ont progressivement perdu leurs morphologies d'origine et ont obtenu des morphologies en forme de fuseau ( figure 2B ), qui ont ensuite changé en forme fibroblastique après passage. Troisièmement, les cellules ont été expansées en monocouche après la sous-culture ( figure 2C ). Les cellules résiduelles indifférenciées ont été exclues au cours de cette étape. Ensuite, les cellules ont été développées et se sont engagées dans des cellules fibroblastiques après5-7 jours en culture monocouche (D10 + 10 + 7). Quatrièmement, lorsque les cellules HiPSC-fibroblastiques (hiPSC-F) ont atteint environ 90% de confluence, elles ont été amenées à se différencier en chondrocytes par une culture de granulés 3D ( Figure 2D ) 10 .
Caractérisation des granulés HiPSC-Chon:
HiPSC-F a été cultivé dans 15 ml de tubes de polypropylène en pastille pendant 21 jours. Les cellules chondrogéniques peuvent se monter in vitro et produire une matrice extracellulaire caractéristique lorsqu'elles sont en culture de haute densité. À la fin de la culture, on pouvait voir un agrégat dense, semblable au cartilage, la pastille HiPSC-Chon, qui avait jusqu'à 2-3 mm de long et 3 mm d'épaisseur ( Figure 2D ). Les cellules étaient positives pour la coloration bleue alcian ( Figure 3A ) et le bleu toluidine ( Figure 3B ), ce qui indiquait le succèsDifférenciation chondrogénique des granulés hiPSC. L'analyse de l'immunohistochimie pour le collagène II ( Figure 3C ) et le collagène X ( Figure 3D ) a également prouvé que les granulés HiPSC-Chon avaient développé un phénotype semblable à un chondrocyte. Des contrôles négatifs de l'immunohistochimie pour le collagène II et le collagène X ont été effectués pour mieux prouver la coloration positive (données non présentées) 5 .
L'analyse de sGAG a également été réalisée après différenciation chondrogénique ( figure 3E ). Le contenu du sGAG a été détecté dans les granules HiPSC-Chon, hiPSC-F, EB et les HiPSC indifférenciés. Le contenu de sGAG a été considérablement régulé à la hausse dans les granulés HiPSC-Chon que dans les autres groupes ( P <0,05). Dans le contrôle positif de hMSC-Chon, la teneur en sGAG a également été considérablement régulée à la hausse ( P <0,05) par rapport aux HMSC. Cependant, le contenu de sGAGEntre les granulés HMSC et les pastilles HiPSC-Chon n'a pas démontré de différence ( P > 0,05).
Expression génique des marqueurs de différenciation chondrogénique:
L'expression génique des marqueurs de différenciation pour le lignage chondro-progéniteur ( SOX9 et COL2 ) et les chondrocytes totalement différenciés ( AGGRECAN et COL10 ) ont été utilisés pour caractériser le phénotype des granulés chondrogéniques ( Figure 4 ). Dans les comparaisons entre hiPSCs, HiPSC-F et HiLCC-Chon, les expressions de COL2 , COL10 , SOX9 et AGGRECAN ont été significativement régulées à la hausse dans HiPSC-Chon que dans les autres groupes ( P <0,05). Dans le contrôle positif de hMSC-Chon, l'expression de ces marqueurs a également été significativement régulée à la hausse que dans les HMSC ( P <0,05). Cependant, l'expression du gène entre HMSLes granulés C et les granulés HiPSC-Chon n'ont démontré aucune différence ( P > 0,05). Au total, ces résultats suggèrent un processus de différenciation chondrogénique réussi à partir d'iPSC humains.
Figure 1: Aperçu schématique du protocole. Une méthode de culture multi-étapes utilisée pour différencier les iPSC humaines en chondrocytes, y compris : 1) la différenciation spontanée par la formation de l'EB, 2) la croissance cellulaire des EB, 3) la culture cellulaire monocouche après la sous-culture et 4 la culture de granulés 3D. Le phénotype des chondrocytes est évalué par analyse histologique, analyse biochimique et expression des gènes chondrogènes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Génération de chondrocytes dans les hiPSC. ( A ) formation EB sur D10. Barre d'échelle = 100 μm. ( B ) Élevage cellulaire des EB sur D10 + 10. Barre d'échelle = 100 μm. ( C ) Culture cellulaire monocouche sur D10 + 10 + 7. Barre d'échelle = 100 μm. ( D ) Culture de granulés 3D. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre étude précédente 5 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Caractérisation des granules HiPSC-Chon. ( A ) Coloration bleue Alcian et ( B ) coloration au bleu de toluidine des glycosaminoglycanes et des protéinesGlycans. Barre d'échelle = 100 μm. ( C et D ) Immunohistochimie pour collagène II et collagène X. Barre d'échelle = 100 μm. ( E ) Caractérisation biochimique des granulés HiPSC-Chon par rapport aux hiPSC, EB et HiPSC-F par rapport au hMSC-Chon par rapport aux HMSC. SGAG par ADN. La barre représente la moyenne ± SEM. N = 3, * P <0,05. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre étude précédente 5 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Analyse d'expression génétique. Analyse de l'expression du gène RT-qPCR des marqueurs de différenciation chondrogénique ( COL2 , COL10 , SOX9 et AGGRECAN ) dans hiPSC-Chon par rapport aux HiPSC et HiPSCF par rapport à hMSC-Chon par rapport aux HMSC. La barre représente la moyenne ± SEM. N = 3, * P <0,05. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre étude précédente 5 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous fournissons un protocole pour générer des chondrocytes de PBC via iPSC. Étant donné que les PBC sont plus fréquents et largement utilisés dans le domaine clinique, ils sont présentés comme une alternative potentielle pour la reprogrammation. Dans cette étude, des vecteurs épisomaux (EV) ont été utilisés pour reprogrammer les PBC dans les iPSC, suivant la méthode établie par Zhang et al. 11 . Cette approche sans intégration n'implique pas l'intégration de la génotoxicité associée au virus, qui est censé avoir un effet large dans le domaine clinique 12 , 13 . L'efficacité de la reprogrammation de la génération d'iPSC sans intégration des cellules sanguines dans cette étude a été satisfaite. Plus de 30 iPSCs pourraient être produites à partir de 2 ml de sang périphérique. Par conséquent, les PBC ont le potentiel d'être les cellules de semences utilisées pour générer des iPSC pour l'ingénierie du cartilage et d'autres applications cliniques.
Les principales étapes de la différence chondrogéniqueLa hiérarchisation des hiPSC comprenait: la formation d'EB, la croissance cellulaire des EB, la culture monocouche et la culture de granulés 3D. Les colonies hiPSC indifférenciées sont disséquées en petits morceaux à l'aide d'une aiguille en verre tirée par un feu. La méthode mécanique, bien que plus technique, est meilleure que la digestion enzymatique (comme le dispase ou la collagénase) en raison de la réduction des dommages et de la taille spécifique (50 à 100 μm de diamètre) lors de l'acquisition. En outre, la digestion mécanique peut éliminer manuellement les cellules d'alimentation, ce qui va réprimer la différenciation HiPSC. Les hiPSCs se différencient spontanément pour former des EB, caractérisés comme les agrégats tridimensionnels, multi-cellulaires avec des bordures lisses. Plusieurs EB peuvent se regrouper pour former des formes irrégulières. Afin de maintenir les EB dans de bonnes conditions, moins de 100 EB sont cultivés dans une boîte de Petri non adhérente de 100 mm, avec 10 mL de milieu de formation d'EB. Environ 50 EB dans un plat de 100 mm sont considérés comme la meilleure concentration. Les EB sont ensuite gravés sur À 10 cm, vaisselle revêtue de gélatine avec un milieu de culture de base. La densité de la distribution des EB est importante pour la croissance suffisante des EB. Moins de 100 EB sont cultivés sur un plat 100 mm. Dans les 10 jours de culture, les cellules fibroblastiques sont progressivement dépassées et développées à partir des EB. L'étape de la monocouche est effectuée pour exclure les cellules résiduelles non indifférenciées présentes dans les EB, ainsi que pour développer les cellules engagées dans la lignée mésenchymateuse. 0,5-1 x 10 6 cellules sont ensemencées dans un plat de 100 mm pour la culture cellulaire monocouche. L'expression des marqueurs de surface cellulaire sur hiPSC-F a été analysée par analyse cytométrique en fonction de notre étude précédente 5 . Les résultats ont montré que la majorité des hiPSC-F ont exprimé le CD73 (81,81 ± 2,05%) et le CD105 (endoglin, 81,90 ± 1,61%), qui sont les marqueurs mésenchymateux humains positifs. En outre, six iPSC différents et une cellule souche embryonnaire humaine (ESC) ont été utilisés pour reproduire ces méthodes.
Ve_content "> La différenciation chondrogénique induite des cellules pluripotentes est également un processus clé complexe. À cette vue, on a utilisé un milieu classant classique pour l'induction de la chondrogénèse des hiPSC. Le TGF-beta1 et la dexaméthasone sont complétés dans le milieu de culture des pastilles. Ont été démontrés comme ayant une influence significative sur les capacités de potentiel chondrogénique 14. Une autre différence par rapport aux autres protocoles était la concentration de 10% de STI, ce qui est beaucoup plus élevé que le 1% ITS 15 , 16. 1% ITS plus 10% FBS amélioré Formation de cartilage dans d'autres méthodes 17 , 18. L' ITS en tant que substitut de sérum peut favoriser la prolifération et la formation de chondrocytes et conserver les phénotypes chondrogènes. Pour remplacer les composants animaux de FBS, nous avons amélioré la concentration de STI à 10%, ce qui a été prouvé Pour une promotion efficaceDifférenciation des chondrocytes 7 .Une culture cellulaire à haute densité est un autre facteur essentiel de la différenciation chondrogénique. Il existe de nombreuses autres méthodes de culture cellulaire qui peuvent être utilisées pour induire une différenciation chondrogénique, telles que la culture de micromasses, la co-culture avec d'autres cellules, la culture à base de biomatériau et la manipulation génétique 1 , 19 , 15 . La culture de granulés 3D dans notre étude, qui entraîne une densité cellulaire élevée et une interaction cellule-cellule élevée, est plus facile à réaliser sans d'autres cellules ou matériaux. Comme il est réalisé dans les tubes de centrifugation de 15 mL, une limitation est qu'il ne peut être utilisé que dans un dosage de différenciation chondrogénique à petite échelle. Cependant, des plaques à 96 puits à fond rond pourraient être utilisées comme alternative prometteuse 7 . Par conséquent, d'autres améliorations aux méthodes de culture pourraient favoriser l'efficacité de la chondrogénicitéDifférenciation in vitro . Dans notre étude, l'induction chondrogénique pendant jusqu'à 21 jours a été effectuée sous condition sans sérum et sans xénon, au cours de laquelle tous les composants liés à l'animal ont été enlevés. Par conséquent, la procédure dans notre étude est adaptable pour les applications cliniques futures.
On pense que les cellules souches autologues seraient le choix idéal pour la réparation du cartilage, car elles pourraient non seulement diminuer le rejet, mais aussi obtenir une régénération tissulaire en profitant du développement naturel du développement embryonnaire 20 , 21 . Cependant, on a constaté qu'ils avaient un potentiel prolifératif limité in vitro 22 . Par conséquent, une méthode sans intégration pour générer des chondrocytes de PBC via iPSC peut être une approche plus prometteuse pour l'ingénierie du tissu cartilagineux. Avec notre méthode, 2 mL de sang pourraient être suffisants pour induire les chondrocytes spécifiques au patient nécessaires à la défectuosité du cartilageTs. En outre, nous avons également utilisé les HMSC comme un contrôle positif pour comparer avec des cellules différenciées des iPSC, ce qui suggère que les iPSC possèdent de bons potentiels de différenciation chondrogénique.
En conclusion, cette étude a prouvé que les PBC peuvent être utilisés comme candidats à la régénération des chondrocytes. Cela pourrait encore refléter une orientation future pour générer des cellules de semences pour la réparation du cartilage dans une approche axée sur le patient et rentable de la médecine régénératrice.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier Xiaobin Zhang pour son plasmide. Nous remercions également Shaorong Gao et Qianfei Wang pour leur aide aimable pendant l'expérience. Cette étude est soutenue par la National Natural Science Foundation of China (No.81101346, 81271963, 81100331), le projet de talent de haut niveau de Beijing 215 (n ° 2014-3-025) et le fonds de l'hôpital Chao-Yang de Beijing (non . CYXX-2017-01) et l'Association pour la promotion de l'innovation des jeunes de l'Académie chinoise des sciences (YL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
