Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Дифференцирование хондроцитов из периферических кроветворных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Published: July 18, 2017 doi: 10.3791/55722
Automatic Translation
2, 1, 3, 1
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

Summary

Мы представляем протокол для получения хондрогенной линии из периферической крови человека (PB) через индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) с использованием метода без интеграции, который включает образование эмбриоидного тела (EB), расширение фибробластических клеток и хондрогенную индукцию.

Abstract

В этом исследовании мы использовали клетки периферической крови (PBC) в качестве семенных клеток для получения хондроцитов через индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) в методе без интеграции. После образования эмбриоидного тела (EB) и расширения фибробластических клеток iPSCs индуцируются для хондрогенной дифференцировки в течение 21 дня в условиях без сыворотки и без ксенонов. После индукции хондроцитов фенотипы клеток оценивают с помощью морфологических, иммуногистохимических и биохимических анализов, а также путем количественного анализа ПЦР в реальном времени маркеров хондрогенной дифференцировки. Хондрогенные гранулы показывают положительное синее голубое и толуидиновое окрашивание синим. Иммуногистохимия окрашивания коллагена II и X также положительна. Содержание сульфатированного гликозаминогликана (sGAG) и маркеры хондрогенной дифференцировки COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 и AGGRECAN значительно повышены в хондРогенных гранул по сравнению с hiPSCs и фибробластическими клетками. Эти результаты показывают, что PBC могут использоваться в качестве семенных клеток для создания iPSC для восстановления хряща, который является специфичным для пациента и экономически эффективным.

Introduction

Хрящевая ткань обладает очень низкой способностью к самовосстановлению и регенерации. Различные хирургические вмешательства и биологические методы лечения используются для восстановления функции хряща и суставов с неудовлетворительными результатами. Недавняя разработка технологии стволовых клеток может изменить всю область восстановления хряща 1 . Различные стволовые клетки изучались как семенные клетки, но человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), по-видимому, являются наиболее перспективным выбором, поскольку они могут обеспечить многие типы специфичных для пациента клеток, не вызывая реакции отторжения 2 . Кроме того, они могут преодолеть ограниченную пролиферативную природу взрослых клеток и сохранить свои способности к самообновлению и плюрипотентности. Более того, генный нацеливание может использоваться для изменения генотипа для получения конкретных типов хондроцитов.

Фибробласты широко используются для создания iPSC, потому что их перепрограммирующие потенциалы также хорошо изучены.Тем не менее, все еще есть некоторые ограничения, которые необходимо преодолеть, такие как болезненная биопсия у пациентов и необходимость расширения фибробластов in vitro , что может привести к мутациям гена 3 . Недавно было обнаружено, что PBCs выгодны для перепрограммирования 4 ; Кроме того, они обычно использовались и содержались в большом количестве. Возможно, они могут перенаправить фокус исследования с кожи. Однако, насколько нам известно, имеется несколько сообщений о перепрограммировании PBC с последующей дифференциацией на хондроциты.

В текущем исследовании мы используем PBC как альтернативный источник, перепрограммируя их в iPSC, а затем дифференцируя iPSCs в хондрогенную линию через систему культивирования гранул, чтобы имитировать образование хондроцитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол генерации hiPSCs из PBC можно найти в нашем предыдущем исследовании 5 . Исследование было одобрено Советом по институциональному обзору нашего учреждения.

1. Образование эмбриоидного тела (EB)

  1. Сделайте 50 мл среды hiPSC: нокаут Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 15% нокаутной сыворотки (KSR), 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 × несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L -глутамина и 8 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF).
  2. Сделайте 50 мл среды образования ЕВ: DMEM с добавлением 15% KSR, 5% FBS, 1x несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ L-глутамина.
  3. Получают 50 мл основной питательной среды: DMEM с добавлением 20% FBS, 1 × несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ L-глутамина.
  4. Подготовьте 10 мл раствора для дозирования, 1 мг / мл в нокаут DMEM.
  5. CultuRe hiPSCs на 60-миллиметровые чашки для культивирования ткани с питающими клетками ( т.е. монослоем облученных клеток эмбриональных фибробластов мыши). Когда клетки сходятся на 80-90%, отключите клетки, чтобы распределить и пропустить hiPSC 1: 3 каждые 4-5 дней. Поместите клетки в 37 ° C и 5% CO 2 инкубатора.
  6. Рассеивайте недифференцированные колонии hiPSC на более мелкие кусочки (диаметром около 50-100 мкм), используя иглу из огнеупорного стекла, когда iPSCs сливаются на 80-90%. Как правило, используйте колонии hiPSC в 60-миллиметровой чашке для генерирования EB в чашке Петри 100 мм.
    1. Культура менее 100 небольших кусочков колоний в 100-миллиметровой не-придерживающейся чашке Петри, содержащей 10 мл среды образования ЕВ. Поместите посуду в инкубатор 37 ° C и 5% CO 2 .
  7. Заменяйте приблизительно 25% исходной среды равным количеством базальной культуральной среды каждые 2 дня. Наклоните блюдо, чтобы позволить EBs успокоиться. Тщательно удалите 3 млВерхней среды и добавить 4 мл свежей базальной культуральной среды. Не мешайте EB.
    ПРИМЕЧАНИЕ. EBs морфологически характеризуются кусками колоний, которые имеют округлый вид с плавными границами под микроскопом.
  8. После 10 дней культивирования в неадгезивной чашке Петри нанесите новую 100-миллиметровую чашку для культивирования ткани с 4 мл 0,1% желатина в течение 30 мин при 37 ° С перед использованием.
  9. Перенесите среду плюс ЭБ из 100-миллиметровой, не придерживающейся чашки Петри в 15-мл коническую трубку. Дайте осадкам ЭБ в течение 4-5 мин. Аспирируйте супернатант осторожно и оставьте менее 0,5 мл среды плюс EBs
  10. Высевают менее 100 ЕВ на 100-миллиметровую чашку для культивирования ткани с желатином с 10 мл основной питательной среды. Поместите посуду в инкубатор 37 ° C и 5% CO 2 .

2. Формирование клеточного гранулята и дифференциация хондроцитов

  1. Сделайте 10 мл 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Сделайте 80 млКультуральную среду: DMEM с добавлением 20% FBS, 1x несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ L-глутамина.
  2. Сделайте 10 мл среды хондрогенной дифференцировки: DMEM (высокая глюкоза), дополненная 10% раствором инсулина-трансферрина-селена (ITS), 0,1 мкМ дексаметазона, 1 мМ аскорбиновой кислоты, 1% пирувата натрия и 10 нг / мл трансформирующего фактора роста - Beta 1 (TGF-β1).
  3. Обновите среду 10 мл базальной культуральной среды через 48 часов. После этого обновляйте среду каждые три дня с помощью 10 мл основной питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Через 10 дней в культуре фибробластические клеточные выросты должны были расшириться от EB.
    1. Перед использованием наносите 100 мм посуду с 4 мл 0,1% желатина в течение 30 мин при 37 ° С. Удалите клеточный супернатант и промойте клетки с помощью фосфат-буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS) один раз.
    2. Дай дайджест клеткам 3 мл 0,25% трипсина / ЭДТА при 37 ° С в течение 5 мин и нейтрализуйте 4 мL основной питательной среды.
  4. Диссоциировать клетки в отдельные клетки путем пипетирования вверх и вниз в 5-10 раз и пропускания их через нейлоновую сетку 70 мкм. Центрифугируют клеточную суспензию при 200 мкг в течение 5 мин. Повторно засеивают клетки на новой 100-миллиметровой, покрытой желатином чашке для культивирования ткани с 10 мл основной питательной среды.
  5. Обновите среду 10 мл базальной культуральной среды через 48 часов. После этого обновляйте среду каждые три дня с помощью 10 мл основной питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки приобретают гомогенную, фибробластоподобную морфологию.
  6. Когда достигается слияние ~ 90-100% ( т. Е. Около 5-7 дней), собирайте клетки с 3 мл 0,25% трипсина / ЭДТА при 37 ° С в течение 5 мин. Нейтрализуйте с помощью 4 мл основной питательной среды. Диссоциировать клетки в отдельные клетки путем пипетирования вверх и вниз 5 раз. Для подсчета количества клеток используйте гемоцитометр.
    1. Поместите 3 × 10 5 клеток в 15-миллилитровую полипропиленовую трубку. Центрифуга при 200 мкгВ течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды хондрогенной дифференцировки.
  7. Повторно центрифугируйте клетки при 300 × g в течение 3 минут и поддерживайте клетки в форме мелких гранул. Поместите трубку в термостат 37 ° C и 5% CO 2 в течение 21 дня. Не плотно прикручивайте крышку и не дайте газообмену.
  8. Заменяйте 3/4 культуральной среды каждые три дня свежей средой хондрогенной дифференциации.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Через 21 день в культуре должны образовываться hiPSC-хондрогенные гранулы (hiPSC-Chon). Мезенхимальные стволовые клетки человека (MSC), как положительный контроль, также собирают и культивируют в среде хондрогенной дифференцировки в течение 21 дня с образованием хондрогенных гранул (hMSC-Chon).

3. Анализ хондрогенной дифференцировки

  1. Подготовьте 10 мл 10% нейтрального буферного формалина.
  2. Подготовьте 50 мл 0,1% синего голубого реагента и 50 мл 1% толуидинового синего реагента.
  3. PrEpare 1 мл первичных антител: кроличьи поликлональные антитела против коллагена II (1:50) или мышиные моноклональные антитела против коллагена X (1:50). Кроме того, готовят антитела против кроликов или мыши.
  4. Сделайте 1 мл раствора папаина: 10 ед / мл в PBS с 0,1 М ацетатом натрия, 2,4 мМ EDTA и 5 мМ L-цистеином.
  5. Сделайте 100 мл диметилметиленового синего (DMMB) красителя: 100 мкл 16 мг / л 1,9-диметилметиленового синего, 40 мМ глицина, 40 мМ NaCl и 9,5 мМ HCl; PH 3,0.
  6. Оценить хондрогенную дифференциацию по голубым синим и толуидиновым синим окраскам гранул.
    1. Закрепите одну таблетку hiPSC-Chon или гранулу hMSC-Chon в 1 мл 10% нейтрализованного буферным раствором формалина в течение 24 часов.
    2. Перенесите гранулу в 1 мл 70% этанола в H 2 O. Дегидратируйте таблетку с 1 мл градуированной серии этанола ( то есть 25, 50, 75, 90, 95, 100 и 100%, 3 мин каждый).
    3. Уточнить таблетку в 1 мл 100% ксилола три раза. инфильтратE таблетка с парафином в течение 1 часа в печи с температурой 65 ° C. Вставьте гранулу в парафиновые блоки с основанием 7 x 7 x 5 мм 3 , следуя рутинным гистологическим процедурам 6 .
    4. Сделайте смежные секции микротомом толщиной около 4 мкм 7 . Прикрепите секции к стеклянным слайдам.
    5. Высушите слайды в течение 2 часов при температуре 60 ° C в духовке. Депарафинизировать секции в три цикла (по 3 мин каждый) с использованием 100% ксилола.
    6. Используйте уменьшающуюся спиртовую серию для регидратации ( то есть 100, 100, 95, 95, 70, 50 и 25% в H 2 O, по 3 минуты каждый), а затем выполните окончательное промывание деионизированной водой в течение 5 минут.
    7. Процедите участки с 0,1% -ным синим жирным реагентом или окрашиванием 1% толуидинового синего в течение 4-5 ч, а затем промойте их дистиллированной водой.
    8. Обезвоживают с помощью градуированной серии этанола ( то есть 25, 50, 75, 90, 95, 100 и 100%, 3 мин каждый), а затем три последовательныхEps осветления в 100% ксилоле. Установите слайды и визуализируйте их под микроскопом.
  7. Выполните иммуногистохимию.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Дополнительные гранулы дополнительно оценивают с помощью иммуногистохимии.
    1. После депарафинизации и регидратации доведите слайды до кипения в 1 мМ ЭДТА, pH 8,0 (водонепроницаемый в воде, кипящей автоклавом). Дайте им посидеть в течение 8 минут при температуре подкисления, а затем дайте слайдам остыть при комнатной температуре.
    2. Промойте слайды деионизированной водой 3 раза. Инкубируйте секции в 3% растворе H 2 O 2 в метаноле при RT в течение 15 мин, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы.
    3. Промойте слайды деионизированной водой и погрузите их в DPBS в течение 5 мин. Нанесите 50-100 мкл соответственно разбавленного (1:50) первичного антитела на секции на слайдах и затем инкубируйте их в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 1 часа.
    4. Промойте слайды 3 раза (по 5 минут каждый) с DPBS. Инкубируйте саС помощью соответствующих вторичных антител ( т. Е. Против кролика или мыши) в течение 15 мин при комнатной температуре.
    5. Промойте слайды 3 раза (по 5 минут каждый) с DPBS. Выполните обнаружение DAB под микроскопом.
    6. Промойте слайды с DPBS 3 раза (по 2 минуты каждый). Противодействовать ядрам клеток, погружая слайды в гематоксилин в течение 1-2 мин. Обезвоживают с помощью градуированной серии этанола (25, 50, 75, 90, 95, 100 и 100%, 3 мин каждый), а затем три последовательных этапа осветления с помощью ксилола. Наконец, установите слайды и визуализируйте их под микроскопом.
  8. Обнаружить содержание sGAG.
    1. Дайджест хондрогенных гранул в растворе папаина при 60 ° С в течение 2 часов.
    2. Определите содержание ДНК с использованием набора для анализа dsDNA и системы флуорометра. Измерьте содержание sGAG путем смешивания его с раствором красителя DMMB при измерении поглощения при 525 нм 8 .
    3. Рассчитайте концентрацию sGAG на стандартную кривуюАкула хондроитин сульфат.
  9. Проведите ПЦР-анализ в реальном времени маркеров хондрогенной дифференцировки в гранулах hiPSC-Chon.
    1. Убирают 3-4 из тех же хондрогенных гранул путем добавления 500 мкл ледяного реагента для экстракции в одну пробирку. Вихрь тщательно. Инкубируйте образец в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Добавить 0,1 мл хлороформа. Вверните образец в течение 15 с и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 3 мин. Центрифугируйте образец в течение 15 минут при 12000 xg и 4 ° C. Перенесите верхнюю водную фазу (около 250 мкл) в новую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
    3. Добавьте 25 мкл ацетата натрия и 1 мкл гликогена к образцу. Осаждайте РНК путем смешивания ее с 250 мкл изопропилового спирта. Тщательно перемешайте. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 10 мин.
    4. Центрифугируют в течение 10 минут при 12000 xg и 4 ° C. Удалите супернатант полностью. Вымойте гранулу РНК дважды 500 мкл 75% этанола.
    5. Центрифуга в течение 5 минПри 7500 x g и 4 ° C. Удалите весь оставшийся этанол и высушите на воздухе гранулу РНК в течение 5-10 мин. Растворите РНК в 10 мкл свободной от нуклеазы воды.
    6. Преобразуйте РНК в кДНК с использованием системы обратной транскриптазы. Представьте образцы кДНК ПЦР в реальном времени с использованием основного набора компонентов qPCR (2x) и системы PCR в реальном времени 9 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательности праймеров:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTGGTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Хондрогенная дифференциация hiPSCs:

Среда для образования ЕВ и базальная культуральная среда использовались для дифференциации hiPSCs в мезенхимную линию. Использовался многоступенчатый метод культивирования ( рисунок 1 ). Во-первых, hiPSCs спонтанно дифференцировались через образование EB в течение 10 дней (D10; фиг. 2A ). Во-вторых, клетки выросли из EBs еще на 10 дней (D10 + 10). Во время этих двух шагов iPSC постепенно теряли свои первоначальные морфологии и получали шпиндельные морфологии ( рис. 2B ), которые после перехода к фибропластической форме затем менялись. В-третьих, клетки были расширены в монослое после субкультуры ( рис. 2C ). Остальные недифференцированные клетки были исключены на этом этапе. Затем клетки расширяли и переносили на фибробластоподобные клетки после5-7 дней в монослойной культуре (D10 + 10 + 7). В-четвертых, когда hiPSC-фибробластоподобные клетки (hiPSC-F) достигли около 90% слияния, их индуцировали дифференцирование в хондроциты посредством 3D-культуры гранул ( рис. 2D ) 10 .

Характеристика hiPSC-Chon Pellets:

HiPSC-F культивировали в 15 мл полипропиленовых пробирках в таблетке в течение 21 дня. Хондрогенные клетки могут собираться in vitro и продуцировать характерный внеклеточный матрикс, когда в культуре с высокой плотностью. В конце культуры мы могли видеть плотный хрящевой агрегат, гранулу hiPSC-Chon, длина до 2-3 мм и толщину 3 мм ( рисунок 2D ). Клетки были положительными для окраски голубого ( рис. 3А ) и толуидинового синего ( рис. 3В ), что указывало на успехUl хондрогенная дифференциация гранул hiPSC. Иммуногистохимический анализ коллагена II ( рис. 3C ) и коллагена X ( рис. 3D ) также доказал, что гранулы hiPSC-Chon разработали фенотип, подобный хондроциту. Отрицательные контрольные показатели иммуногистохимии для коллагена II и коллагена Х проводились для лучшего подтверждения положительного окрашивания (данные не показаны) 5 .

Анализ sGAG также проводился после хондрогенной дифференцировки ( рис. 3Е ). Содержание sGAG было обнаружено в гранулах hiPSC-Chon, hiPSC-F, EB и недифференцированных hiPSC. Содержание sGAG значительно повышалось в гранулах hiPSC-Chon, чем в других группах ( P <0,05). В положительном контроле hMSC-Chon содержание sGAG также значительно повышалось ( P <0,05) по сравнению с hMSC. Однако содержание sGAGМежду гранулами hMSC и гранулами hiPSC-Chon не было различий ( P > 0,05).

Экспрессия генов маркеров хондрогенной дифференцировки:

Для характеристики фенотипа хондрогенных гранул использовали генную экспрессию маркеров дифференцировки для линии хондро-предшественников ( SOX9 и COL2 ) и полностью дифференцированных хондроцитов ( AGGRECAN и COL10 ) ( рисунок 4 ). В сравнении hiPSCs, hiPSC-F и hiPSC-Chon гранулы, выражения COL2 , COL10 , SOX9 и AGGRECAN были значительно повышены в hiPSC-Chon, чем в других группах ( P <0,05). В положительном контроле hMSC-Chon экспрессия этих маркеров также была значительно выше, чем в hMSC ( P <0,05). Однако экспрессия гена между hMSC и гранулы hiPSC-Chon не выявили различий ( P > 0,05). В целом, эти результаты указывают на успешный процесс хондрогенной дифференциации от человеческих iPSC.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схематический обзор протокола. Многоступенчатый метод культивирования, используемый для дифференциации человеческих iPSCs в хондроциты, включая : 1) спонтанную дифференциацию через образование EB, 2) рост клеток из EBs, 3) культуру монослоевых клеток после субкультуры и 4) культуру 3D-гранулы. Фенотип хондроцитов оценивают путем гистологического анализа, биохимического анализа и экспрессии хондрогенного гена. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

"Рисунок Рисунок 2: Генерация хондроцитов из hiPSC. ( A ) EB на D10. Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ) Выращивание клеток из EB на D10 + 10. Шкала шкалы = 100 мкм. ( C ) Однослойная клеточная культура на D10 + 10 + 7. Шкала шкалы = 100 мкм. ( D ) 3D-культура гранул. Эта цифра была изменена из нашего предыдущего исследования 5 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Характеристика гранул hiPSC-Chon. ( A ) окрашивание алкановым синим и ( B ) толуидиновое синее окрашивание гликозаминогликанов и протеоновгликано. Шкала шкалы = 100 мкм. ( C и D ) Иммуногистохимия для коллагена II и коллагена X. Шкала шкалы = 100 мкм. ( E ) Биохимическая характеристика гранул hiPSC-Chon по сравнению с hiPSCs, EB и hiPSC-F по сравнению с hMSC-Chon против hMSC. SGAG на ДНК. Полоса представляет среднее значение ± SEM. N = 3, * P <0,05. Эта цифра была изменена из нашего предыдущего исследования 5 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Анализ экспрессии генов. RT-qPCR анализ экспрессии генов маркеров хондрогенной дифференцировки ( COL2 , COL10 , SOX9 и AGGRECAN ) в hiPSC-Chon против hiPSCs и hiPSCF по сравнению с hMSC-Chon против hMSC. Полоса представляет среднее значение ± SEM. N = 3, * P <0,05. Эта цифра была изменена из нашего предыдущего исследования 5 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы предоставляем протокол для получения хондроцитов из PBC через iPSC. Поскольку ПБС более распространены и широко используются в клинической области, они представлены в качестве потенциальной альтернативы для перепрограммирования. В этом исследовании эписомальные векторы (EV) использовались для перепрограммирования PBC в iPSC, следуя методу, установленному Zhang et al. 11 . Этот подход, основанный на интеграции, не включает интеграцию связанной с вирусом генотоксичности, которая, как полагают, имеет широкий эффект в клинической области 12 , 13 . Эффективность перепрограммирования для создания бесклассовых iPSC из клеток крови в этом исследовании была удовлетворена. Более 30 iPSC могут быть получены из 2 мл периферической крови. Следовательно, PBCs могут быть семенными клетками, используемыми для создания iPSC для хрящевой инженерии и других клинических применений.

Основные этапы хондрогенного различияВключение из hiPSC включало: образование EB, клеточный рост от EB, монослойную культуру и 3D-культуру гранул. Недифференцированные колонии hiPSC расчленяются на более мелкие кусочки, используя иглу из огнеупорного стекла. Механический метод, хотя и более технический, лучше, чем ферментативное переваривание (например, дозирование или коллагеназа) из-за уменьшенного повреждения и определенного размера (диаметр 50-100 мкм) при приобретении. Кроме того, механическое переваривание может вручную утилизировать питающие элементы, что будет подавлять дифференциацию hiPSC. HiPSCs спонтанно дифференцируются с образованием EB, которые характеризуются как трехмерные многоклеточные агрегаты с гладкими границами. Несколько EB могут группироваться вместе, чтобы сформировать нерегулярные формы. Чтобы поддерживать ЭБ в хороших условиях, менее 100 мкВ культивируют в 100-миллиметровой, не прилипшей чашке Петри, с 10 мл среды образования ЕВ. Считается, что около 50 ЕВ в одном 100-миллиметровом блюде - лучшая концентрация. EB затем высевают на До 10 см, покрытые желатином блюда с основной культуральной средой. Плотность распределения EB важна для достаточного роста EB. Менее 100 мкВ культивируют на 100-миллиметровой таре. В течение 10 дней после культивирования фибробластические клетки постепенно перерастают и расширяются от ЭБ. Стадия монослоя выполняется для исключения остаточных недифференцированных клеток, присутствующих в ЭБ, а также для расширения клеток, выделенных для мезенхимной линии. 0,5-1 × 10 6 клеток высевают в 100-миллиметровое блюдо для культивирования однослойных клеток. Экспрессия маркеров клеточной поверхности на hiPSC-F была проанализирована поточно-цитометрическим анализом в нашем предыдущем исследовании 5 . Результаты показали, что большинство hiPSC-F выражали CD73 (81,81 ± 2,05%) и CD105 (эндоглин, 81,90 ± 1,61%), которые, как известно, являются положительными мезенхимальными маркерами человека. Кроме того, для воспроизведения этих методов использовались шесть различных iPSC и одна эмбриональная стволовая клетка человека (ESC).

Ve_content "> Индуцированная хондрогенная дифференциация плюрипотентных клеток также является сложным ключевым процессом. Ввиду этого классическая хондрогенная среда использовалась для индукции хондрогенеза из hiPSCs. TGF-бета1 и дексаметазон дополняются в культуральной среде гранул. Эти факторы Было продемонстрировано, что они оказывают значительное влияние на способности хондрогенного потенциала 14. Другим отличием от других протоколов была концентрация 10% ITS, которая намного выше, чем типично 1% ITS 15 , 16,1 % ITS плюс 10% FBS Образование хряща в других методах 17 , 18. ITS как заменитель сыворотки может способствовать пролиферации и образованию хондроцитов и сохранять хондрогенные фенотипы. Чтобы заменить компоненты животного FBS, мы повысили концентрацию ITS до 10%, что было доказано Эффективно рекламироватьт.е дифференциации хондроцитов 7.

Культура клеток высокой плотности является еще одним важным фактором хондрогенной дифференциации. Существует много других методов клеточной культуры, которые могут быть использованы для индуцирования хондрогенной дифференциации, таких как культура микромассы, совместная культура с другими клетками, культура на основе биоматериалов и генетическая манипуляция 1 , 19 , 15 . 3D-культура гранул в нашем исследовании, которая приводит к высокой плотности клеток и высокому взаимодействию с клетками, легче выполнять без других клеток или материалов. Так как он выполняется в 15-миллилитровых центрифужных пробирках, одно ограничение заключается в том, что его можно использовать только в небольшом анализе хондрогенной дифференцировки. Однако в качестве многообещающей альтернативы можно использовать 96-луночные планшеты с круглым днищем 7 . Поэтому другие улучшения методов культивирования могли бы повысить эффективность хондрогенногоДифференцировки in vitro . В нашем исследовании хондрогенная индукция в течение 21 дня проводилась в условиях отсутствия сыворотки и без ксенонов, в течение которых все компоненты, связанные с животными, удалялись. Поэтому процедура в нашем исследовании адаптируется для будущих клинических применений.

Считается, что аутологичные стволовые клетки будут идеальным выбором для ремонта хряща, поскольку они могут не только уменьшить отторжение, но и добиться регенерации тканей, используя естественный ход эмбрионального развития 20 , 21 . Однако было установлено, что они имеют ограниченный пролиферативный потенциал in vitro 22 . Таким образом, интеграционный метод для получения хондроцитов из PBC через iPSC может быть более перспективным подходом для инженерии тканей хряща. В нашем методе 2 мл крови может быть достаточным для индуцирования специфических для пациента хондроцитов, необходимых для хряща defecц. Более того, мы также использовали hMSC в качестве положительного контроля для сравнения с клетками, дифференцированными от iPSC, что предположило, что iPSCs обладают хорошими потенциалами хондрогенной дифференцировки.

В заключение, это исследование доказало, что ПБК можно использовать в качестве кандидатов на регенерацию хондроцитов. Это могло бы также отразить будущее направление для создания семенных клеток для восстановления хряща в индивидуальном и экономически выгодном подходе к регенеративной медицине.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Xiaobin Zhang за его плазмиду. Мы также благодарим Шаоронг Гао и Цяньфэй Ван за их любезную помощь во время эксперимента. Это исследование поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81101346, 81271963, 81100331), проектом талантов высокого уровня в Пекине-215 (№ 2014-3-025) и Фондом больниц Пекин-Чао-Янь (нет CYXX-2017-01) и Ассоциацией содействия инновациям молодежи Китайской академии наук (YL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Invitrogen 10829018 Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium
Knockout Serum Replacement (KSR) Invitrogen 10828028 A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone sh30070.03 Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture
Nonessential amino acids Chemicon TMS-001-C Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability
L-glutamine Invitrogen TMS-002-C An amino acid required for cell culture
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech 100-18B A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs
Dispase Invitrogen 17105041 Used for hiPSC dissociation for subculture
DMEM Gibco C11960 Basal medium used for MSC culture medium
0.1% gelatin Millipore ES-006-B Used for cell attachment onto the dishes
0.25% trypsin/EDTA Gibco 25200072 Used for cell dissociation
DPBS Gibco 14190250 A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing
2-mercaptoethanol invitrogen 21985023 Used as a growth supplement in all the cell culture medium.
ITS invitrogen 41400045 Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.
Ascorbic acid Sigma 4403 Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.
Transforming growth factor-beta 1 Peprotech AF-100-21C A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II Abcam ab34712 This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X Abcam ab49945 This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.
Permount Fisher Scientific SP15-100 For mounting and long-term storage of slides
Toluidine blue Sigma 89640 Used for proteoglycans detection.
Alcian blue Amresco #0298 Used for glucosaminoglycans detection.
Papain Sigma P4762-25MG Used to digest chondrogenic pellets.
Dimethylmethylene blue Sigma 341088-1G Used to quantitate glycosaminoglyans
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-250MG Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851 (100) Used to determine DNA content
TRIzol Invitrogen 15596018 Used for RNA isolation from cells
Reverse Transcriptase System Promega A3500 Used to convert RNA into cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix Kapa KK4601 Used for Real-time PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

Tags

Биология развития выпуск 125 индуцированные плюрипотентные стволовые клетки периферическая кровь дифференцировка эмбриоидное тело фибробластические клетки хондроцит
Дифференцирование хондроцитов из периферических кроветворных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T.… More

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T. Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (125), e55722, doi:10.3791/55722 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter