Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.
Abstract
In dieser Studie verwendeten wir periphere Blutzellen (PBCs) als Samenzellen, um Chondrozyten über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in einer integrationsfreien Methode zu erzeugen. Nach der Embryoidkörperbildung (EB) und der fibroblastischen Zellexpansion werden die iPSCs für die chondrogene Differenzierung für 21 Tage unter serumfreien und xenofreien Bedingungen induziert. Nach der Chondrozyteninduktion werden die Phänotypen der Zellen durch morphologische, immunhistochemische und biochemische Analysen sowie durch die quantitative Echtzeit-PCR-Untersuchung von chondrogenen Differenzierungsmarkern ausgewertet. Die chondrogenen Pellets zeigen eine positive alcianblaue und toluidinblaue Färbung. Auch die Immunhistochemie der Kollagen II und X Färbung ist positiv. Der sulfatierte Glycosaminoglycan (sGAG) -Gehalt und die chondrogenen Differenzierungsmarker COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 und AGGRECAN sind in chond signifikant hochreguliertRogene Pellets im Vergleich zu hiPSCs und fibroblastischen Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PBCs als Samenzellen verwendet werden können, um iPSCs für die Knorpelreparatur zu erzeugen, die patientenspezifisch und kostengünstig ist.
Introduction
Knorpelgewebe hat eine sehr schlechte Fähigkeit zur Selbstreparatur und Regeneration. Verschiedene chirurgische Eingriffe und biologische Behandlungen werden verwendet, um Knorpel und Gelenkfunktion wiederherzustellen, mit unbefriedigenden Ergebnissen. Die jüngste Entwicklung der Stammzellentechnologie kann das gesamte Knorpelreparaturfeld verändern 1 . Verschiedene Stammzellen wurden als Samenzellen untersucht, aber menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) scheinen die vielversprechendste Wahl zu sein, da sie viele Arten von patientenspezifischen Zellen liefern können, ohne Ablehnungsreaktionen zu verursachen 2 . Darüber hinaus können sie die begrenzte proliferative Natur der erwachsenen Zellen überwinden und ihre Selbsterneuerung und pluripotenten Fähigkeiten beibehalten. Darüber hinaus kann Gen-Targeting verwendet werden, um den Genotyp zu ändern, um spezifische Arten von Chondrozyten zu erhalten.
Fibroblasten wurden weithin verwendet, um iPSCs zu erzeugen, weil ihre Umprogrammierungspotentiale auch gut untersucht wurden.Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die überwunden werden müssen, wie die schmerzhafte Biopsie von Patienten und die Notwendigkeit für die in vitro Expansion der Fibroblasten, die zu Genmutationen führen können 3 . Kürzlich wurden PBCs als vorteilhaft für die Umprogrammierung von 4 gefunden ; Darüber hinaus wurden sie häufig genutzt und reichlich gelagert. Es ist möglich, dass sie den Studienfokus von der Haut umleiten können. Allerdings gibt es nach unserem besten Wissen nur wenige Berichte über die PBC-Neuprogrammierung, gefolgt von der Differenzierung in Chondrozyten.
In der aktuellen Studie nutzen wir PBCs als alternative Quelle, indem wir sie in iPSCs umprogrammieren und dann die iPSCs in die chondrogene Linie durch ein Pelletkultursystem differenzieren, um die Chondrozytenbildung zu imitieren.
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Protocol
Das Protokoll zur Erzeugung von hiPSCs aus PBCs findet sich in unserer vorherigen Studie 5 . Die Studie wurde von der Institutional Review Board unserer Institution genehmigt.
1. Embryoidkörper (EB) Bildung
- Machen Sie 50 ml hiPSC-Medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 15% Knockout Serumersatz (KSR), 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L Glutamin und 8 ng / ml basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF).
- Machen Sie 50 ml EB-Formationsmedium: DMEM, ergänzt mit 15% KSR, 5% FBS, 1x nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin.
- Machen Sie 50 ml Basalkulturmedium: DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin.
- 10 ml Disposelösung, 1 mg / ml im Knockout DMEM vorbereiten.
- KultusRe hiPSCs auf 60-mm-Gewebekulturschalen mit Feeder-Zellen ( dh eine Monoschicht von bestrahlten embryonalen Fibroblasten-Zellen). Wenn die Zellen 80-90% konfluent sind, disassoziieren die Zellen mit Disposition und Passage der hiPSCs 1: 3 alle 4-5 Tage. Legen Sie die Zellen in einen 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator.
- Die undifferenzierten hiPSC-Kolonien in kleinere Stücke (ca. 50-100 μm Durchmesser) mit einer feuergezogenen Glasnadel zerlegen, wenn die iPSCs 80-90% konfluent sind. Im Allgemeinen verwenden Sie hiPSC-Kolonien in einer 60-mm-Schale, um EBs in einer 100 mm Petrischale zu erzeugen.
- Kultur weniger als 100 kleine Stücke von Kolonien in einer 100 mm, nicht adhärenten Petrischale mit 10 ml EB-Formationsmedium. Legen Sie das Geschirr in einen 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator.
- Ersetzen Sie etwa 25% des Ausgangsmediums mit einer gleichen Menge des Basalkulturmediums alle 2 Tage. Kippen Sie die Schale, damit sich die EBs absetzen können. Entfernen Sie vorsichtig 3 mlDes oberen Mediums und füge 4 ml frisches Basalkulturmedium hinzu. Störe die EBs nicht
HINWEIS: Die EBs sind morphologisch durch die Kolonien charakterisiert und nehmen ein rundes Aussehen mit glatten Rändern unter dem Mikroskop auf. - Nach 10 Tagen Kultur in der nicht adhärenten Petrischale eine neue 100-mm-Gewebekulturschale mit 4 ml 0,1% iger Gelatine für 30 min bei 37 ° C vor Gebrauch einwickeln.
- Übertragen Sie das Medium plus EBs von einer 100 mm, nicht adhärenten Petrischale zu einem 15-ml-Kegelrohr. Lassen Sie die EBs für 4-5 min sedimentieren. Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig und lassen Sie weniger als 0,5 ml Medium plus EBs
- Seed weniger als 100 EBs auf eine 100 mm, gelatinebeschichtete Gewebekulturschale mit 10 ml Basalkulturmedium. Legen Sie das Geschirr in einen 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator.
2. Zellpelletbildung und Chondrozytendifferenzierung
- 10 ml 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben. Machen Sie 80 ml BasAl Kulturmedium: DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 1x nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin.
- 10 mL Chondrogen-Differenzierungsmedium: DMEM (hohe Glukose), ergänzt mit 10% Insulin-Transferrin-Selen-Lösung (ITS), 0,1 μM Dexamethason, 1 mM Ascorbinsäure, 1% Natriumpyruvat und 10 ng / ml transformierenden Wachstumsfaktor- Beta 1 (TGF-β1).
- Erfrischen Sie das Medium mit 10 ml Basalkulturmedium nach 48 h. Danach das Medium alle drei Tage mit 10 ml Basalkulturmedium auffrischen.
ANMERKUNG: Nach 10 Tagen in der Kultur sollten sich die Fibroblastischen Zellwälder von den EBs erweitern.- Die 100 mm-Schale mit 4 ml 0,1% iger Gelatine für 30 min bei 37 ° C vor Gebrauch beschichten. Den Zellüberstand verwerfen und die Zellen mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) einmal waschen.
- Die Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin / EDTA bei 37 ° C für 5 min verdauen und mit 4 m neutralisierenL des Basalkulturmediums.
- Dissoziieren Sie die Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren auf und ab 5-10 mal und durchlaufen sie durch ein 70 μm Nylon Mesh. Die Zellsuspension bei 200 xg für 5 min zentrifugieren. Die Zellen auf einer neuen 100 mm, mit Gelatine beschichteten Gewebekulturschale mit 10 ml Basalkulturmedium re-seed.
- Erfrischen Sie das Medium mit 10 ml Basalkulturmedium nach 48 h. Danach das Medium alle drei Tage mit 10 ml Basalkulturmedium auffrischen.
HINWEIS: Die Zellen erlangen eine homogene, fibroblastenartige Morphologie. - Wenn ~ 90-100% Konfluenz erreicht ist ( dh etwa 5-7 Tage), ernten Sie die Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin / EDTA bei 37 ° C für 5 min. Neutralisieren mit 4 ml Basalkulturmedium. Dissoziieren Sie die Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren auf und ab 5 mal. Verwenden Sie ein Hämocytometer, um die Zellzahl zu zählen.
- Legen Sie 3 x 10 5 Zellen in ein 15 ml Polypropylenrohr. Zentrifuge bei 200 xgFür 5 min bei Raumtemperatur (RT). Die Zellen in 1 ml chondrogenem Differenzierungsmedium erneut suspendieren.
- Die Zellen bei 300 xg für 3 min erneut zentrifugieren und die Zellen in einer kleinen Pelletform aufrechterhalten. Setzen Sie den Schlauch in den 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 21 Tage. Schrauben Sie den Deckel nicht fest und lassen Sie den Gasaustausch.
- Ersetzen Sie 3/4 des Kulturmediums alle drei Tage durch frisches chondrogenes Differenzierungsmedium.
ANMERKUNG: Nach 21 Tagen in Kultur sollten sich hiPSC-chondrogene Pellets (hiPSC-Chon) gebildet haben. Menschliche mesenchymale Stammzellen (MSCs) als Positivkontrolle werden auch im chondrogenen Differenzierungsmedium für 21 Tage gesammelt und kultiviert, um chondrogene Pellets (hMSC-Chon) zu bilden.
3. Analyse der chondrogenen Differenzierung
- 10 ml 10% neutral-gepuffertes Formalin zubereiten.
- Vorbereiten von 50 ml 0,1% alcianblauem Reagenz und 50 ml 1% Toluidinblau-Reagenz.
- PrEpare 1 ml der primären Antikörper: Kaninchen polyklonale Antikörper gegen Kollagen II (1:50) oder Maus monoklonale Antikörper gegen Kollagen X (1:50). Auch Anti-Kaninchen oder Maus sekundäre Antikörper vorbereiten.
- Machen Sie 1 ml Papain-Lösung: 10 U / ml in PBS mit 0,1 M Natriumacetat, 2,4 mM EDTA und 5 mM L-Cystein.
- 100 ml Dimethylmethylenblau (DMMB) Farbstofflösung: 100 μl 16 mg / l 1,9-Dimethylmethylenblau, 40 mM Glycin, 40 mM NaCl und 9,5 mM HCl; PH 3,0
- Beurteilen Sie die chondrogene Differenzierung durch alcianblaue und toluidinblaue Flecken der Pelletabschnitte.
- Fixieren Sie ein hiPSC-Chon-Pellet oder hMSC-Chon-Pellet in 1 ml 10% neutral-gepuffertem Formalin für 24 h.
- Übertragen Sie das Pellet auf 1 ml 70% iges Ethanol in H 2 O. Dehydrieren Sie das Pellet mit 1 ml einer abgestuften Ethanolreihe ( dh 25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min).
- Klären Sie das Pellet in 1 ml 100% Xylol dreimal. InfiltratE das Pellet mit Paraffin für 1 h in einem 65 ° C Ofen. Einfügen des Pellets in Paraffinblöcke mit einer 7 x 7 x 5 mm 3 Grundform nach routinemäßigen histologischen Verfahren 6 .
- Mischen Sie angrenzende Abschnitte durch Mikrotom mit einer Dicke von ca. 4 μm 7 . Befestigen Sie die Abschnitte auf Glasrutschen.
- Trocknen Sie die Objektträger für 2 h bei 60 ° C in einem Ofen. Deparaffinieren Sie die Abschnitte in drei Zyklen (jeweils 3 min) mit 100% Xylol.
- Verwenden Sie eine abnehmende Alkoholreihe für die Rehydratisierung ( dh 100, 100, 95, 95, 70, 50 und 25% in H 2 O, jeweils 3 min) und führen Sie dann mit abisoliertem Wasser 5 min ab.
- Färben Sie die Sektionen mit 0,1% alcianblauem Reagenz oder 1% Toluidin-Blau-Färbung für 4-5 h und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab.
- Dehydrieren mit einer abgestuften Ethanolreihe ( dh 25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min), gefolgt von drei aufeinanderfolgenden stEps der Klärung in 100% Xylol. Montiere die Dias und visualisiere sie unter einem Mikroskop.
- Führen Sie Immunhistochemie durch.
HINWEIS: Zusätzliche Pelletabschnitte werden durch Immunhistochemie weiter beurteilt.- Nach der Entparaffinierung und Rehydratisierung bringen Sie die Objektträger in 1 mM EDTA, pH 8,0 (wasserdicht in Wasser, das von Autoklaven gekocht wird) zum Kochen bringen. Lassen Sie sie für 8 min bei einer Unterkochtemperatur sitzen und lassen Sie dann die Objektträger bei RT abkühlen.
- Spülen Sie die Dias mit deionisiertem Wasser 3 mal. Inkubieren Sie die Abschnitte in 3% H 2 O 2 -Lösung in Methanol bei RT für 15 min, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren.
- Spülen Sie die Folien mit deionisiertem Wasser und tauchen Sie sie in DPBS für 5 min ein. 50-100 & mgr; l eines entsprechend verdünnten (1:50) primären Antikörpers auf die Abschnitte auf den Objektträgern auftragen und dann 1 h in einer befeuchteten Kammer bei RT inkubieren.
- Die Dias 3 mal (jeweils 5 min) mit DPBS waschen. Inkubiere die saMit den entsprechenden sekundären Antikörpern ( dh Anti-Kaninchen oder Maus) für 15 min bei RT.
- Die Dias 3 mal (für jeweils 5 min) mit DPBS waschen. DAB-Erkennung unter einem Mikroskop durchführen.
- Waschen Sie die Dias mit DPBS 3 mal (jeweils 2 min). Gegen die Zellkerne durch Eintauchen der Folien in Hämatoxylin für 1-2 min. Dehydrieren mit einer abgestuften Ethanolreihe (25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min), gefolgt von drei aufeinanderfolgenden Schritten der Klärung mit Xylol. Schließlich montiere die Dias und visualisiere sie unter dem Mikroskop.
- SGAG-Inhalt erkennen.
- Chondrogene Pellets in Papain-Lösung bei 60 ° C für 2 h ausbauen.
- Bestimmen Sie den DNA-Gehalt mit dem dsDNA-Assay-Kit und dem Fluorometersystem. Messen Sie den sGAG-Gehalt durch Mischen mit DMMB-Farbstofflösung unter Messabsorption bei 525 nm 8 .
- Berechnen Sie die Konzentration von sGAG gegen eine Standardkurve vonHai-Chondroitinsulfat.
- Führen Sie die Echtzeit-PCR-Analyse der chondrogenen Differenzierungsmarker in hiPSC-Chon-Pellets durch.
- Ernte 3-4 der gleichen chondrogenen Pellets durch Zugabe von 500 μl eiskaltes Extraktionsreagenz zu einem Röhrchen. Vortex gründlich. Inkubieren Sie die Probe für 5 min bei RT.
- 0,1 ml Chloroform zugeben. Vortex die Probe für 15 s und inkubiere sie bei RT für 3 min. Die Probe für 15 min bei 12.000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Übertragen Sie die obere wässrige Phase (ca. 250 μl) in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Füge 25 μl Natriumacetat und 1 μl Glykogen zur Probe hinzu. Fälligkeit der RNA durch Mischen mit 250 μl Isopropylalkohol. Gründlich mischen. Inkubieren Sie die Probe bei RT für 10 min.
- 10 min bei 12.000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand vollständig entfernen. Das RNA-Pellet zweimal mit 500 μl 75% igem Ethanol waschen.
- 5 min zentrifugierenBei 7.500 xg und 4 ° C. Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Ethanol und lüften Sie das RNA-Pellet für 5-10 min. Die RNA in 10 μl nukleasefreies Wasser auflösen.
- Umwandlung der RNA in cDNA unter Verwendung eines reversen Transkriptase-Systems. Betrachten Sie die cDNA-Proben in Echtzeit-PCR mit qPCR Kit Master Mix (2x) und einem Echtzeit-PCR-System 9 .
HINWEIS: Die Primerfolgen sind:
H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.
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Representative Results
Chondrogene Differenzierung von hiPSCs:
EB-Formationsmedium und Basalkulturmedium wurden verwendet, um die hiPSCs in die mesenchymale Linie zu differenzieren. Es wurde eine mehrstufige Kulturmethode verwendet ( Abbildung 1 ). Zuerst wurden die hiPSCs spontan über EB-Bildung für 10 Tage differenziert (D10, Abbildung 2A ). Zweitens stiegen die Zellen von den EBs für weitere 10 Tage (D10 + 10). Während dieser beiden Schritte verloren die iPSC allmählich ihre ursprünglichen Morphologien und erhielten spindelförmige Morphologien ( Abbildung 2B ), die sich dann nach der Passage in eine fibroblastische Form verwandelten. Drittens wurden die Zellen nach der Subkultur in Monoschicht expandiert ( Abbildung 2C ). Restliche undifferenzierte Zellen wurden während dieses Schrittes ausgeschlossen. Dann wurden die Zellen erweitert und nach fibroblastischen Zellen nach5-7 Tage in Monolayer Kultur (D10 + 10 + 7). Viertens, als die hiPSC-fibroblastischen Zellen (hiPSC-F) etwa 90% Konfluenz erreichten, wurden sie induziert, um über eine 3D-Pelletkultur in Chondrozyten zu differenzieren ( Abbildung 2D ) 10 .
Charakterisierung von hiPSC-Chon Pellets:
HiPSC-F wurden in 15 ml Polypropylenröhrchen im Pellet für 21 Tage kultiviert. Chondrogene Zellen können sich in vitro zusammenstellen und eine charakteristische extrazelluläre Matrix erzeugen, wenn sie in einer hochdichten Kultur vorliegen. Am Ende der Kultur konnten wir ein dichtes, knorpelartiges Aggregat sehen, das hiPSC-Chon-Pellet, das bis zu 2-3 mm lang und 3 mm dick war ( Abbildung 2D ). Die Zellen waren positiv für alcianblau ( Fig. 3A ) und Toluidinblau ( Fig. 3B ) Färbung, die den Erfolg zeigteUl chondrogene Differenzierung von hiPSC Pellets. Die Immunhistochemieanalyse für Kollagen II ( Abbildung 3C ) und Kollagen X ( Abbildung 3D ) zeigte weiterhin, dass die hiPSC-Chon-Pellets einen chondrozytenähnlichen Phänotyp entwickelt hatten. Negative Kontrollen der Immunhistochemie für Kollagen II und Kollagen X wurden durchgeführt, um die positive Färbung (Daten nicht gezeigt) besser zu beweisen 5 .
Die sGAG-Analyse wurde auch nach der chondrogenen Differenzierung durchgeführt ( Abbildung 3E ). SGAG-Inhalte wurden in hiPSC-Chon-Pellets, hiPSC-F, EBs und den undifferenzierten hiPSCs nachgewiesen. Der sGAG-Gehalt wurde in hiPSC-Chon-Pellets signifikant hochreguliert als in den anderen Gruppen ( P <0,05). Bei der positiven Kontrolle von hMSC-Chon wurde der sGAG-Gehalt auch im Vergleich zu hMSCs signifikant hochreguliert ( P <0,05). Der sGAG-Inhalt ist jedochZwischen hMSC-Pellets und hiPSC-Chon-Pellets zeigte keinen Unterschied ( P > 0,05).
Genexpression der chondrogenen Differenzierungsmarkierungen:
Die Genexpression der Differenzierungsmarker für die Chondro-Progenitor-Linie ( SOX9 und COL2 ) und volldifferenzierte Chondrozyten ( AGGRECAN und COL10 ) wurden zur Charakterisierung des Phänotyps der chondrogenen Pellets verwendet ( Abbildung 4 ). Bei Vergleichen zwischen hiPSCs, hiPSC-F und hiPSC-Chon-Pellets wurden die Ausdrücke von COL2 , COL10 , SOX9 und AGGRECAN in hiPSC-Chon signifikant hochreguliert als in den anderen Gruppen ( P <0,05). Bei der positiven Kontrolle von hMSC-Chon war auch die Expression dieser Marker signifikant hochreguliert als bei hMSCs ( P <0,05). Die Genexpression zwischen hMSC-Pellets und hiPSC-Chon-Pellets zeigten keine Unterschiede ( P > 0,05). Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf einen erfolgreichen chondrogenen Differenzierungsprozess von humanen iPSCs hin.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. Eine mehrstufige Kulturmethode, die verwendet wird, um menschliche iPSCs in Chondrozyten zu differenzieren, einschließlich : 1) spontane Differenzierung über EB-Bildung, 2) Zellwachstum von EBs, 3) Monolayerzellkultur nach Subkultur und 4) 3D-Pelletkultur. Der Chondrozyten-Phänotyp wird durch histologische Analyse, biochemische Analyse und chondrogene Genexpression bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Erzeugung von Chondrozyten aus hiPSCs. ( A ) EB-Bildung auf D10. Maßstab = 100 μm. ( B ) Zellwachstum von EBs auf D10 + 10. Maßstab = 100 μm. ( C ) Monolayerzellkultur auf D10 + 10 + 7 Maßstab = 100 μm. ( D ) 3D-Pelletkultur. Diese Zahl wurde von unserer vorherigen Studie geändert 5 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung von hiPSC-Chon-Pellets. ( A ) Alcian-Blau-Färbung und ( B ) Toluidin-Blau-Färbung von Glycosaminoglykanen und ProteoGlycans Maßstab = 100 μm. ( C und D ) Immunhistochemie für Kollagen II und Kollagen X. Maßstab = 100 μm. ( E ) Biochemische Charakterisierung von hiPSC-Chon-Pellets gegenüber hiPSCs, EBs und hiPSC-F im Vergleich zu hMSC-Chon gegenüber hMSCs. SGAG pro DNA. Der Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM. N = 3, * P <0,05. Diese Zahl wurde von unserer vorherigen Studie geändert 5 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Genexpressionsanalyse. RT-qPCR-Genexpressionsanalyse von chondrogenen Differenzierungsmarkern ( COL2 , COL10 , SOX9 und AGGRECAN ) in hiPSC-Chon gegenüber hiPSCs und hiPSCF im Vergleich zu hMSC-Chon gegenüber hMSCs. Der Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM. N = 3, * P <0,05. Diese Zahl wurde von unserer vorherigen Studie geändert 5 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung von Chondrozyten aus PBCs über iPSCs zur Verfügung. Weil PBCs häufiger und weit verbreitet im klinischen Bereich sind, werden sie als eine mögliche Alternative zur Umprogrammierung dargestellt. In dieser Studie wurden episomale Vektoren (EV) verwendet, um PBCs in iPSCs zu programmieren, nachdem die Methode von Zhang et al. 11 Dieser integrationsfreie Ansatz beinhaltet nicht die Integration der virusassoziierten Genotoxizität, von der angenommen wird, dass sie eine breite Wirkung im klinischen Bereich 12 , 13 hat . Die Umprogrammierungseffizienz der Erzeugung von integrationsfreien iPSCs aus Blutzellen in dieser Studie war erfüllt. Mehr als 30 iPSCs konnten aus 2 ml peripherem Blut produziert werden. Daher haben PBCs das Potenzial, die Saatzellen zu sein, die zur Erzeugung von iPSCs für Knorpeltechnik und andere klinische Anwendungen verwendet werden.
Die wichtigsten Schritte der chondrogenen differeNtiation von hiPSCs enthalten: EB-Bildung, Zellauswuchs aus EBs, Monolayer-Kultur und 3D-Pelletkultur. Undifferenzierte hiPSC-Kolonien werden in kleinere Stücke mit einer feuergezogenen Glasnadel zerlegt. Die mechanische Methode, obwohl mehr technische, ist besser als enzymatische Verdauung (wie Dispase oder Kollagenase) wegen der reduzierten Schäden und der spezifischen Größe (50 - 100 μm im Durchmesser) bei der Akquisition. Darüber hinaus kann die mechanische Verdauung manuell die Feeder-Zellen entsorgen, die die hiPSC-Differenzierung unterdrücken werden. HiPSCs unterscheiden sich spontan zu EBs, die als dreidimensionale, zelluläre Aggregate mit glatten Grenzen charakterisiert sind. Mehrere EBs können sich zusammenreißen, um unregelmäßige Formen zu bilden. Um die EBs unter guten Bedingungen zu halten, werden weniger als 100 EBs in einer 100 mm, nicht adhärenten Petrischale mit 10 ml EB-Formationsmedium kultiviert. Etwa 50 EBs in einer 100-mm-Schale sind die beste Konzentration. EBs werden dann ausgesät Bis 10 cm, gelatinebeschichtete Schalen mit basalem Kulturmedium. Die Dichte der Verteilung der EBs ist für das ausreichende Auswachsen der EBs wichtig. Weniger als 100 EBs werden auf einer 100-mm-Schale kultiviert. Innerhalb von 10 Tagen nach der Kultur werden fibroblastische Zellen allmählich herausgewachsen und von den EBs erweitert. Der Monolayer-Schritt wird durchgeführt, um restliche undifferenzierte Zellen, die in den EBs vorhanden sind, auszuschließen sowie Zellen, die an die mesenchymalen Linie gebunden sind, zu expandieren. 0,5-1 x 10 6 Zellen werden in einer 100-mm-Schale für Monolayer-Zellkulturen ausgesät. Die Expression von Zelloberflächenmarkern auf hiPSC-F wurde durch Flow-zytometrische Analyse in unserer früheren Studie 5 analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mehrheit von hiPSC-F CD73 (81,81 ± 2,05%) und CD105 (Endoglin; 81,90 ± 1,61%) exprimierte, von denen bekannt ist, dass sie die positiven menschlichen mesenchymalen Marker sind. Darüber hinaus wurden sechs verschiedene iPSCs und eine menschliche embryonale Stammzelle (ESC) verwendet, um diese Methoden zu reproduzieren.
Ve_content "> Die induzierte chondrogene Differenzierung von pluripotenten Zellen ist auch ein komplexer Schlüsselprozess, in der hier ein klassisches chondrogenes Medium zur Induktion der Chondrogenese aus hiPSCs verwendet wurde, wobei TGF-beta1 und Dexamethason im Pelletkulturmedium ergänzt werden Haben gezeigt, dass sie einen signifikanten Einfluss auf die chondrogenen potentiellen Fähigkeiten haben 14. Ein weiterer Unterschied zu anderen Protokollen war die Konzentration von 10% ITS, was viel höher ist als die typischerweise 1% ITS 15 , 16 % 1% plus 10% FBS erhöht Knorpelbildung bei anderen Methoden 17 , 18. ITS als Serumersatz kann die Chondrozytenproliferation und -bildung fördern und die chondrogenen Phänotypen beibehalten. Um die tierischen Bestandteile von FBS zu ersetzen, haben wir die Konzentration von ITS auf 10% erhöht, was bewiesen wurde Effizient zu fördernTe chondrozytendifferenzierung 7 .Eine hochdichte Zellkultur ist ein weiterer wesentlicher Faktor für die chondrogene Differenzierung. Es gibt viele andere Zellkulturmethoden, die verwendet werden können, um eine chondrogene Differenzierung zu induzieren, wie Mikromassenkultur, Co-Kultur mit anderen Zellen, Biomaterial-basierte Kultur und genetische Manipulation 1 , 19 , 15 . Die 3D-Pelletkultur in unserer Studie, die zu einer hohen Zelldichte und einer hohen Zell-Zell-Interaktion führt, ist leichter ohne andere Zellen oder Materialien durchzuführen. Da es in den 15-ml-Zentrifugenröhrchen durchgeführt wird, ist eine Einschränkung, dass es nur in einem kleinen chondrogenen Differenzierungsassay verwendet werden kann. Allerdings könnten 96-Well-Platten mit runden Böden als vielversprechende Alternative verwendet werden 7 . Daher könnte eine weitere Verbesserung der Kulturmethoden die Effizienz von chondrogenen fördernDifferenzierung in vitro In unserer Studie wurde die chondrogene Induktion für so lange wie 21 Tage unter serumfreiem und xenofreiem Zustand durchgeführt, bei dem alle tierbezogenen Komponenten entfernt wurden. Daher ist das Verfahren in unserer Studie für zukünftige klinische Anwendungen anpassbar.
Es wird angenommen, dass autologe Stammzellen die ideale Wahl für die Knorpelreparatur sein würden, da sie nicht nur die Ablehnung verringern, sondern auch die Geweberegeneration erreichen können, indem sie den natürlichen Verlauf der embryonalen Entwicklung nutzen 20 , 21 . Sie wurden jedoch proliferative Potential in vitro 22 haben nur begrenzte gefunden. Daher kann ein integrationsfreies Verfahren zur Erzeugung von Chondrozyten aus PBCs über iPSCs ein vielversprechenderer Ansatz für die Knorpelgewebetechnik sein. Mit unserer Methode könnten 2 ml Blut ausreichen, um die patientenspezifischen Chondrozyten zu induzieren, die für den Knorpeldefekt benötigt werdenTs Darüber hinaus nutzten wir auch hMSCs als Positivkontrolle, um mit den von iPSCs differenzierten Zellen zu vergleichen, was darauf hindeutet, dass iPSCs gute chondrogene Differenzierungspotentiale aufweisen.
Abschließend zeigte diese Studie, dass PBCs als Kandidaten für die Chondrozytenregeneration verwendet werden können. Dies könnte eine zukünftige Richtung reflektieren, um Samenzellen für die Knorpelreparatur in einem patientenspezifischen und kostengünstigen Ansatz für die regenerative Medizin zu erzeugen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Xiaobin Zhang für sein Plasmid. Wir danken auch Shaorong Gao und Qianfei Wang für ihre freundliche Hilfe während des Experiments. Diese Studie wird von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.81101346, 81271963, 81100331), dem Peking 215 High-Level-Talent-Projekt (Nr. 2014-3-025) und dem Peking Chao-Yang Hospital Fund (Nr CYXX-2017-01) und die Jugend-Innovationsförderungsvereinigung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (YL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
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