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Genetics

Détermination de l’emplacement chromosomique optimale pour un élément d’ADN chez Escherichia coli en utilisant une nouvelle approche induite par le Transposon

Published: September 11, 2017 doi: 10.3791/55946
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

Summary

Ici, la puissance d’une insertion aléatoire d’un élément d’ADN non codant, induite par le transposon a été utilisée pour résoudre sa position chromosomique optimale.

Abstract

La position optimale chromosomique d’un élément d’ADN donné a/ont été déterminée par insertion aléatoire induite par le transposon, suivie par la sélection de remise en forme. Chez les bactéries, l’impact du contexte génétique sur la fonction d’un élément génétique peut être difficile à évaluer. Plusieurs mécanismes, y compris les effets topologiques, interférence transcriptionnelle des gènes voisins, et/ou dosage des gènes associés à la réplication, peuvent affecter la fonction d’un élément génétique donné. Nous décrivons ici une méthode qui permet l’intégration aléatoire d’un élément d’ADN dans les chromosomes des Escherichia coli et sélectionnez les emplacements plus favorables à l’aide d’un concours de croissance simple experiment. La méthode tire parti d’un système transposon bien décrit d’insertion aléatoire, de pair avec une sélection de la clone(s) plus fort avantage de croissance, une procédure qui est facilement réglable à besoins expérimentaux. La nature de le clone(s) plus fort peut être déterminée par le séquençage du génome entier sur une population clonale multiples complexe ou par simple gène à la marche pour l’identification rapide des clones sélectionnés. Ici, la région de l’ADN non codant DARS2, qui contrôle l’initiation de la réplication du chromosome chez e. coli, a été utilisée à titre d’exemple. La fonction de DARS2 est connue pour être affecté par le dosage des gènes associés à la réplication ; le plus proche DARS2 obtient à l’origine de réplication de l’ADN, il devient plus active. DARS2 a été insérées au hasard dans le chromosome d’un DARS2-supprimé de souche. Les clones résultantes contenant des insertions individuelles ont été mis en commun et a concouru contre l’autre pour des centaines de générations. Enfin, les clones plus forts étaient caractérisés et avérés pour contenir DARS2 inséré à proximité de l’emplacement d’origine DARS2 .

Introduction

La fonction de tout élément génétique peut être affectée par son emplacement dans le génome. Chez les bactéries, cela s’explique principalement par l’interférence de la transcription des gènes voisins, topologie de l’ADN local et/ou dosage des gènes associés à la réplication. En particulier, les processus de réplication de l’ADN et la ségrégation sont contrôlés, au moins en partie, par les régions chromosomiques non codantes1et le bon fonctionnement de ces régions dépend de génomique emplacement/contexte. Dans e. coli, on peut citer le site dif , requis pour la soeur du chromosome résolution2; Séquences KOPS, nécessaires à la ségrégation des chromosomes3; et données, DARS1et régions DARS2 , requises pour le contrôle de la bonne réplication chromosomique (ci-après ; 4). nous présentons une méthode permettant le déplacement aléatoire, la sélection et la détermination du contexte génétique optimal de n’importe quel élément génétique donné, illustrée ici par l’étude de la région non codante de DARS2 .

Dans e. coli, DnaA est la protéine initiateur responsable de brin d’ADN à l’origine de réplication uniqueoriCd’ouverture et de recrutement de l’hélicase DnaB5,6,7. DnaA appartient à l’AAA+ (c.-à-d., ATPases associée à diverses activités) protéines et peuvent lier les ATP et l’ADP avec haute similaire affinités5. Le niveau de DnaAATP culmine à initiation8, où DnaAATP forme un polymère sur oriC qui déclenche l’ADN duplex ouverture9. Après l’initiation, oriC est fait temporairement indisponible pour la reprise en raison de la séquestration par un mécanisme impliquant la liaison de la protéine de SeqA à hemimethylated oriC10,11. Au cours de la séquestration, le niveau de DnaAATP est réduit par au moins deux mécanismes : l’inactivation réglementaire de DnaA (RIDA)12,13 et données-dépendant DnaAATP hydrolyse (DDAH)14 ,,15. RIDA tant DDAH promouvoir la reconversion de DnaAATP à DnaAADP. Avant un nouveau cycle d’initiation, DnaAADP est réactivé à DnaAATP à des séquences spécifiques DnaA-réactivation (DARS) : DARS1 et DARS216,17. Les chromosomiques données, DARS1, régionset DARS2 sont non codantes et agir dans la manière d’un chaperon pour moduler DnaAATP/DnaAADP interconversion. Ces régions, situées en dehors de l’origine de réplication, permettent à l’Assemblée d’un complexe de DnaA pour soit l’inactivation (données: 14) ou activation (DARS1 et DARS2; 17) de DnaA. Suppression DARS2 dans une cellule ne modifie pas la masse doublement temps mais entraîne une réplication asynchrone initiation15,16,18. Toutefois, DARS2-cellules déficientes ont une adéquation coût par rapport à un type sauvage isogénique sinon les deux concours de croissance continue en milieu riche ou pendant la mise en place de la colonisation dans l' intestin de souris18. Cela signifie que même mineures variations de concentration de l’asynchronisme/origine ont un effet négatif sur la forme bactérienne. Chez e. coli, il y a une pression sélective pour maintenir de symétrie (c.-à-d., deux armes de réplication de longueur presque égale) du chromosome19. Les données, les DARS1et les régions DARS2 ont la même distance relative à oriC dans tous les e. coli souches séquencé18, malgré des variations importantes de dimension des chromosomes.

Ici, nous utilisons la région DARS2 d’e. coli à titre d’exemple pour l’identification de l’ou les positions chromosomique optimale pour sa fonction. DARS2 a été insérée dans le transposon NKBOR et la NKBOR qui en résulte :: transposonDARS2 subséquemment inséré au hasard dans le génome de MG1655 ΔDARS2. Ainsi, nous avons généré une collection de cellules, chaque possession DARS2 placé à un emplacement différent sur le chromosome. In vitro compétition expérimental, où toutes les cellules de la collection ont été mis en commun et a concouru contre l’autre au cours de la croissance continue pour un estimé générations 700 LB, a été réalisée. Le résultat de l’expérience de la compétition a été surveillé/déterminée par Southern blot, gène simple marche et le séquençage du génome entier (groupes de travail ; La figure 1). Clones de point final résolus par la simple gène marche ont été caractérisés par cytométrie de flux pour évaluer les paramètres du cycle cellulaire. Dans une analyse de cytométrie en flux, la taille des cellules, la teneur en ADN et synchronie initiation peuvent être mesurées pour un grand nombre de cellules. Au cours de la cytométrie en flux, un flux des cellules simples passe un faisceau lumineux de la longueur d’onde appropriée pour exciter l’ADN tachée, qui est ensuite simultanément enregistré par Photomultiplier qui recueillent la fluorescence émise, une mesure du contenu en ADN, autant la les cellules sont colorées pour l’ADN. La lumière diffusée vers l’avant est une mesure de la masse cellulaire20.

L’expérience compétition in vitro que nous présentons ici est utilisé pour traiter les questions relatives à l’importance de la position chromosomique et contexte génomique de l’élément génétique. La méthode est facile à utiliser et impartiale.

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Protocol

1. collection de la bibliothèque de Transposon

Remarque : le locus DARS2 chromosomique a été cloné dans le mini Tn 10-basé transposon, NKBOR (sur pNKBOR) 21, ce qui entraîne NKBOR :: DARS2 (pJFM1). pNKBOR peut être obtenu en ligne 22. pNKBOR est un vecteur de base R6K suicide nécessitant l’initiateur protéine π pour réplication 23. PJFM1 de plasmide est donc capable de se répliquer dans une souche d’e. coli (p. ex., Dh5α λ pir) contenant une copie chromosomique du gène pir. Toutefois, lorsque pJFM1 est transformé en le type sauvage de Pir-deficient MG1655, pJFM1 ne peut pas répliquer, menant à la sélection de clones résistants à la kanamycine générés par les insertions aléatoires de NKBOR :: DARS2 dans le chromosome bactérien. Pour plus de simplicité, elles sont appelées DARS2 insertions. Voir la Figure 1 pour une présentation schématique de la méthode.

  1. Prepare electrocompetent MG1655 Δ DARS2 de croissance active des cellules dans un bouillon de lysogénie (LB) cultivée à 37 ° C 24.
  2. Electroporate pJFM1 en electrocompetent MG1655 Δ DARS2, selon Gonzales et al. 24
    1. Ajouter 1 µg de pJFM1 (dans 1 µL d’eau) à 40 µL d’electrocompetent e. coli MG1655 Δ DARS2 et transvaser ce mélange dans une cuvette de l’écart de 0,2 cm préalablement réfrigérées, stérile. Insérez la cuve dans la chambre d’électroporation. Oligonucléotides à 18 kV, Ω 500 et 25 µF ; la constante de temps devrait être de ~5.0 ms, et aucun un arc électrique ne doit avoir lieu.
    2. Récupérer rapidement la suspension bactérienne par il resuspendant dans 1 mL de bouillon LB préchauffé et transfert dans une éprouvette de 15 mL.
    3. Laisse les cellules récupérer en incubant dans des conditions de croissance aéré à 37 ° C pendant 30 min, sans sélection antibiotique. Les bactéries sur plaques de gélose LB additionnés de kanamycine 50µg/mL sur plaque et incuber à 37 ° C jusqu’au lendemain.
  3. Compter les colonies de l’électroporation : une colonie est considérée égale à une insertion de transposon chromosomiques.
    NOTE : Les Colonies peuvent être comptés par œil ou avec un compteur de colonies. Le nombre de colonies est inversement proportionnel à la distance moyenne séparant les transposons situés dans le chromosome de chaque clone.
  4. Ajouter 1 mL de bouillon LB à chaque plaque et laver toutes les colonies ; 1 mL du bouillon LB devrait suffire à laver ~ 100 000 colonies. Réutiliser le même 1 mL de bouillon LB d’augmenter la concentration bactérienne. Mettre en commun toutes les colonies dans le même tube de 50 mL.
  5. Vortex le tube et geler le matériau de départ (t = 0). Pour congeler, mélanger 1 mL de suspension cellulaire avec 1 mL de glycérol à 50 % sur la glace. Transférer les tubes pour sécher la glace pendant 10 min. Une fois que les cultures sont congelés, les transférer sur un congélateur-80 ° C.
    Remarque : Une concentration cellulaire d’un minimum de 50 000 UFC/mL est attendue à cette étape.

2. Concours expérience dans LB

  1. dégel la bibliothèque transposon de-80 ° C sur la glace. Mix de pipetage.
  2. Transférer 100 µL de la bibliothèque de transposon à 10 mL de la LB dans un tube de 15 mL.
  3. Poussent les cellules aérées en continu secouant (250 tr/min), de 8 h à 37 ° C à la phase stationnaire (c.-à-d., OD 600 = ~ 4.0). Ajuster ces paramètres pour différentes conditions de croissance, comme vous le souhaitez.
  4. Propager la population bactérienne en transferts continues dans un milieu frais préchauffée à chaque générations de ~ 10. Pour ce faire transférer 10 µL de la culture de la précédente phase stationnaire à 10 mL de frais LB et Pendant un autre 8 h de plus en plus à la phase stationnaire (c.-à-d., OD 600 = ~ 4,0).
    Remarque : Étant donné la densité optique de début et de fin sont les mêmes, une dilution 1000 fois correspond à ~ 10 générations de croissance (2 10 = 1 024). La population bactérienne peut être propagée directement dans un milieu frais préchauffée ou enregistrée à 0-4 ° C (sur glace) et s’était propagé le lendemain. LB a été utilisée ici pour assurer autant doublements cellulaires dans la plus courte des délais (un temps de doublement près de 22 min).
  5. Après chaque 100 générations de compétition, sauver cinq échantillons de 1 mL à-80 ° C (comme indiqué au point 3.3).
  6. Si les différences de forme entre les cellules qui contiennent des insertions du transposon individuels devraient être petite, garder la durée de la compétition depuis longtemps ; ici, 700 générations (t = 700) ont été utilisées.

3. Analyse de Southern Blot pour surveiller l’expérience compétition dans le temps

  1. prépare la sonde pour le Southern blot (section 1 kb de la NKBOR) en effectuant l’amplification par la polymérase chain reaction (PCR) à l’aide d’amorces spécifiques : NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat et NKBOR_Probe_RV : cgttacatccctggcttgtt.
    1. Incuber à 98 ° C pendant 30 s pour dénaturation initiale. Ensuite, effectuer 35 cycles à 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 45 s. Pour l’extension finale, utilisez 72 ° C pendant 10 min.
      Remarque : Le modèle de la réaction PCR a été un de plasmide purifié pNKBOR 21.
    2. Label le fragment PCR qui en résulte avec dATP [α - 32P] en utilisant le système d’amorçage aléatoire, selon Smith 25.
  2. Préparer l’ADN cellulaire total selon Løbner-Olesen et von Freiesleben 26 pour t = 0 et certains moments jusqu'à t = 700 générations de la concurrence a estimé.
  3. Digérer l’ADN cellulaire total avec Pvu je, qui coupe le NKBOR contenant la région d’intérêt une fois que dans une région non couverte par la sonde, 1 unité de Pvu je peux servir à complètement digest 1 µg d’ADN de substrat.
    Remarque : La sonde reconnaîtra les fragments contenant une partie du transposon, ainsi que de l’ADN chromosomique de différentes longueurs, selon le site d’insertion.
  4. Effectuer un transfert de Southern à l’aide d’un gel d’agarose de 0,7 % selon Løbner-Olesen et von Freiesleben 26.

4. Identification des Clones plus fort

  1. gène facile d’utilisation de marche, tel que décrit par Harrison et al. 27, pour identifier les sites d’insertion DARS2 de clones unique (isolés sur des plaques LB) après 700 générations estimées de la concurrence ; les bandes plus sur la Southern, les isolats de plus sont nécessaires pour couvrir toutes les insertions du transposon.
    1. Isoler l’ADN génomique pour modèle de PCR. Répandre des bactéries sur une gélose LB contenant 50 kanamycine µg/mL et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Cultiver des colonies individuelles du jour au lendemain dans un bouillon LB à 37 ° C et par la suite transférer 20 µL dans 200 µL d’eau distillée autoclavé (ou utilisez purification d’ADN, comme à l’étape 3.2).
      1. Vortex pour mélanger. Faire chauffer le mélange à 100 ° C pour 10 min et centrifuger à vitesse maximum pendant 5 min. sauver la cellule lysate à-20 ° C pour une utilisation future.
    2. Trois amorces imbriquées de recuire dans le transposon de choix de conception (voir la Figure 2 pour obtenir une représentation graphique de la stratégie de la PCR).
      NOTE : Conception d’amorces imbriquées devrait s’assurer qu’imbriqués Primer 3 se trouve plus proche de le connu 5 ' fin du transposon ADN, suivi de Nested amorces 2 et 1. L’espacement entre imbriqués Primer 3 et le 5 ' fin du t connuransposon ADN devrait être suffisant pour une séquence lecture par le biais de l’ADN connue à l’ADN inconnue (pour trouver le site d’insertion de transposon chromosomiques spécifiques). Pour NKBOR les amorces imbriquées suivantes ont été utilisées : pNKBOR_Nested3_RV : gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV : tcagcaacaccttcttcacg et pNKBOR_Nested1_RV : actttctggctggatgatgg. Amorces aléatoires contenant les reconnaissance des sites connus des enzymes de restriction sont également utilisés. Afin d’assurer un résultat, il faut utiliser au moins deux amorces aléatoires différents. Les sites de restriction pour les enzymes de restriction (3AI e.g.,Sau et Hin dIII) doivent être placées à la 3 ' fin et précédé dix bases aléatoires ainsi que 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' et 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' sont les amorces contenant un site de 3AI Sau (GATC) et un site de dIII Hin (AAGCTT), respectivement, où N = A, T, G ou C.
      3. Réaction de PCR
    3. utilisation 200 ng d’ADN génomique dans un 20 µL. Incuber à 98 ° C pendant 30 s pour la dénaturation initiale. Effectuer des cycles de 25 à 98 ° C pendant 30 s, 50 ° C pendant 15 s et 72 ° C pendant 4 min. Pour l’extension finale, utilisez 72 ° C pour 10 min. utilisation des paires d’amorces consistant en imbriqué Primer 1 et l’autre des amorces aléatoires.
    4. Utiliser des paires d’amorces consistant en 2 de Primer imbriqués et la même amorce aléatoire de l’amplification deuxième, 1 µL de sa réaction précédente en utilisant comme modèle.
    5. Répéter l’étape 4.1.4 avec paires d’amorces consistant en imbriqué Primer 3 et la même amorce aléatoire.
    6. Exécuter les produits de la réaction PCR finale sur un gel d’agarose de 1,5 % et la coloration au bromure d’éthidium. Découper une bande dans la gamme 100-800 bp et isoler l’ADN à l’aide de n’importe quel commercial gel ADN extraction kit selon le fabricant ' direction de s. Remettre en suspension l’ADN dans 15 µL d’eau.
      Remarque : attention. Bromure d’éthidium est toxique et doit être manipulé avec soin.
    7. Séquence la bande isolée à l’étape précédente (étape 4.1.6), avec 3 de Primer imbriqués comme l’amorce de séquençage, à l’aide de Sanger sequencing à un fournisseur commercial.
  2. Effectuer WGS.
    1. Effectuer des groupes de travail sur le total de l’ADN extrait sélectionné échantillons prélevés au cours de l’expérience de la compétition, tel que décrit par Frimodt-Møller et al. 4.
  3. Effectuer l’analyse de la séquence.
    1. Align jumelé-fin lit de 150 Ns contiguës à NKBOR, AF310136.1 1 904 … 2 204 en utilisant Bowtie2 28 avec un intervalle entre les sous-chaînes de semences (S, 1, 1.15) et un nombre maximal de caractères ambigus (L, 0, 0.9).
    2. Sélectionner les lectures alignés et puis ré-aligner avec les deux ref MG1655 | NC_000913.3 et NKBOR Go | AF310136 à l’aide de blastN 29
    3. assigner transposition des postes d’insertion au niveau des jonctions MG1655-NKBOR.

5. Cytométrie en flux

  1. prélever des échantillons pour la cytométrie.
    1. Balance chaque culture de maintenir dans la phase de croissance exponentielle au moins 10 générations. Vérifiez l' OD 600 et assurez-vous qu’il ne dépasse jamais 0,3.
    2. Recueillir deux types d’échantillons de flux.
      1. Pour RIF-faux-rond, transférer 1 mL de culture dans un tube de 15 mL contenant 30 µL de RIF-CEF (300 µg/mL rifampicine et la céphalexine 36 µg/mL dissous dans NaOH de 12,5 mM). Laissez-le à 37 ° C pendant au moins 4 h de secousse.
        Remarque : La rifampicine bloque indirectement l’initiation de la réplication du chromosome tout en tenant compte des séries en cours de réplication de continuer à la cessation d’emploi. Céphalexine empêche la division cellulaire, qui se traduit par le faux-rond de réplication (RIF-faux-rond) et l’accumulation de cellules avec des chromosomes entièrement répliqués. Le nombre de chromosomes entièrement répliqués est égal au nombre d’origine au moment du traitement par la rifampicine et la céphalexine 20.
      2. Pour l’échantillon EXP, transférer 1 mL d’en croissance exponentielle de la culture dans un tube de 1,5 mL sur glace.
  2. Fixer les cellules comme suit. Récolter les cellules par centrifugation à 15 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 100 µL de glacé 10 mM Tris pH 7,5 et ajouter 1 mL d’éthanol glacé de 77 %. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  3. Tacher les cellules comme suit. Récolter 100-300 µL de cellules fixes par centrifugation à 15 000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 130 µL de " solution de coloration de l’ADN " (90 µg/mL mithramycine, 20 bromure d’éthidium µg/mL, 10 mM MgCl 2 et 10 mM Tris pH 7,5). Placer les échantillons sur la glace et dans l’obscurité ; les échantillons sont prêts pour l’analyse en cytométrie en flux après 10 min.
    NOTE : Les autre ADN taches que le bromure d’éthidium et mithramycine peut également être utilisée 30 , 31.
  4. Déterminer l’origine par la cellule, la masse de la cellule relative et la teneur relative en ADN par analyse en cytométrie en flux.
    1. Perform cytométrie en flux, comme décrit plus haut 32. Exécutez le RIF-faux-rond et EXP-échantillons à l’aide du fabricant cytomètre de flux ' s directives . Pour les cellules teinté bromure d’éthidium et mithramycine -, utiliser l’excitation longueurs d’onde 395 et 440 nm et recueillir la fluorescence au-dessus de 565 nm.
      1. Pour déterminer la teneur en ADN cellulaire relative massive et relative, exécuter les EXP-échantillons afin d’obtenir le seul paramètre lumière avant dispersion contre histogrammes numéros de cellulaire et intensité de la fluorescence par rapport aux histogrammes numéros cellulaire pendant au moins 30 000 événements correspondant au signal cellulaire.
      2. Utilisation diffusée avant seul paramètre répartition de la lumière pour mesurer la moyenne relative cell Mass
        NOTE : La lumière diffusée vers l’avant est une mesure de la masse moyenne des cellules 20.
      3. Distributions du seul paramètre d’intensité fluorescence d’utilisation pour mesurer l’ADN moyenne content 20.
      4. Obtenir la concentration d’ADN comme étant le rapport moyen du contenu d’ADN à la masse moyenne des cellules 20.
    2. Déterminer le nombre d’origines par cellule.
      1. Échantillons run RIF-faux-rond pour obtenir l’intensité de la fluorescence du seul paramètre contre cell histogrammes numéros pendant au moins 30 000 événements correspondant au signal cellulaire.
      2. Distributions de seul paramètre intensité utilisation fluorescence pour déterminer le nombre de chromosomes dans chaque cellule 20.
  5. Calculer l’indice d’asynchronie (IA).
    1. Calculer l’IA, tel que décrit par Løbner-Olesen et al. 32, en utilisant les distributions de seul paramètre intensité de fluorescence des échantillons RIF-faux-rond et l’IA formule = (f3, f5, f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), où fx est la fraction des cellules avec x nombre de chromosomes entièrement répliqués. Examiner les initiations asynchrone quand A > 0.1.

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Representative Results

Une tache méridionale a été faite pour vérifier que DARS2 a été répartis au hasard le chromosome dans la bibliothèque de transposons (t = 0) et que les clones plus aptes persisterait au fil du temps. La Southern a été réalisée sur l’ADN extrait de la piscine de transposon initiale (t = 0) et chaque tranche de 100 estimée à 700 générations de compétition (Figure 3). Ici, l’ADN cellulaire total à chaque point de temps a été digéré avec le Pvuj’ai des enzymes de restriction, connu pour couper le transposon NKBOR ::DARS2 une fois que dans une région non couverte par la sonde. La Southern a été sondée avec un fragment d’ADN marqué radioactivement complémentaire à la partie de NKBOR. Comme vu dans la Figure 3, la piscine DARS2 initiale (t = 0) n’a pas fourni de bandes distinctes, qui montre que DARS2 a été inséré au hasard dans le chromosome. Au fil du temps, un modèle a émergé où la grande piscine initiale de clones DARS2 développé en seulement un ou quelques clones DARS2 persistants (Figure 3; t = 0 à t = 700).

Dans l’exemple illustré, DARS2 sites d’insertion de l’expérience de la compétition ont été identifiés par WGS et gène facile à pied. Ici, les WGS servait à identifier les sites d’insertion de la piscine début (t = 0) et après 300, 400 et 700 générations de la concurrence. Notez que la couverture dans le séquençage en profondeur actuelle ne suffisait pas pour une cartographie complète des sites d’insertion à t = 0 ; Cependant, il y a un sous-ensemble représentatif du nombre total d’insertions. WGS a confirmé le résultat du Southern blot (c.-à-d., la sélection des clones DARS2 plus aptes), se terminant par environ 98 % de tous les DARS2 insertions proche du type sauvage DARS2 localisation chromosomique (DARS2 IR de clone et Clone rppH), tandis que les 2 % restants étaient ailleurs sur le chromosome (Figure 4). Ceci suggère fortement que la position de type sauvage est optimale pour la fonction DARS2 . À t = 400, une insertion a été retrouvée sur le bras opposé de réplication avec une distance presque identique à oriC comme le type sauvage DARS2 position (Figure 4), mais cette insertion n’a pas restauré après 700 générations. Ainsi, le dosage des gènes associés à la réplication ne peut pas être le seul déterminant de la position optimale.

Gène simple marche servait à identifier les sites d’insertions DARS2 en simples clones isolés après 700 générations estimées de la concurrence. Ici, les deux sites d’insertion DARS2 mentionnés ci-dessus ( rppHDARS2 Clone IR et Clone) ont été identifiés. Gène facile à pied a été fait seulement sur 20 clones, et c’est ce qui explique pourquoi toutes les insertions DARS2 sites cartographiés dans WGS n’étaient pas identifiés. DARS2-cellules déficientes ont déjà montrés d’initier la réplication dans l’asynchronie et à une diminution de la concentration d’origine par rapport au type sauvage des cellules4,16,17, 18. nous avons donc utilisé l’écoulement cytometry pour résoudre la synchronie dans l’initiation de la réplication et cellulaire contenu d’origine ADN pour les deux souches sélectionnées (DARS2 Clone IR et Clone rppH) qui, dans les deux cas, ont été restaurés au type sauvage niveaux (Figure 5). Un exemple représentatif d’une souche possédant une seule copie du DARS2 situé à l’extrémité apparaît (Figure 5E). Ici, la présence d’un élément DARS2 dans le terminus ne restaure pas synchronie ou le contenu d’origine cellulaire à des niveaux de type sauvage, tandis que les sélectionnés DARS2 clones IR et rppH .

Figure 1
Figure 1 : Aperçu de la méthodologie. Présentation schématique de la méthodologie. La région chromosomique de DARS2 est clonée dans le mini Tn10 sur pNKBOR, création de pJFM1. pJFM1 se transforme en e. coli MG1655 ΔDARS2, qui déclenche une insertion aléatoire du DARS2 lié à Tn10 sur le chromosome d’e. coli MG1655 ΔDARS2. Environ 70 000 clones, contenant chacune une insertion de DARS2 chromosomique différente, ont été mis en commun et a participé directement contre l’autre dans un bouillon LB à 37 ° C. L’expérience de la concurrence directe dans un bouillon LB a été réalisée pour une générations de 700 environ, où un échantillon a été isolé pour chaque 100 générations de concurrence directe. L’ADN total a été extrait de chaque échantillon isolé et utilisé pour le transfert de Southern et l’identification des insertions DARS2 par WGS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Présentation graphique de la simple gène marche. Cette figure illustre une matrice d’ADN génomique d’une séquence d’ADN inconnue adjacente à une séquence connue avec des sites d’amorçage pour les amorces aléatoires et des amorces de Nested 1, 2 et 3. Les résultats des trois amplifications successives effectuées à l’aide des trois amorces imbriquées sont illustrées ci-dessous. Le produit final (du cycle 3) est séquencé en utilisant imbriqués Primer 3. Ce chiffre a été adapté de Harrison et al. 27. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Southern blot sondé pour NKBOR. Une analyse Southern de DARS2 insertions dans une DARS2-souche déficiente. ADN génomique extrait de toutes générations de ~ 100 de concurrence directe, à partir de t = 0 et se terminant à 700 générations, ont été digérés avec Pvuj’et gel-fractionné. La tache a été hybridée avec un NKBOR sonde (voir le protocole). t indique le nombre de générations de la concurrence. Ce chiffre a été adapté de Frimodt-Møller et al. 4. HMW et FPM sont respectivement de poids moléculaire élevé et faible poids moléculaire, l’ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Représentation graphique de resolvEd transposon insertions sites dans ΔDARS2. Les positions des oriC, données, DARS1, DARS2 et terC sont indiqués. Sites d’insertion DARS2 dans ΔDARS2 à t = 0 (barres noires), t = 400 (barres bleues lumineuses), t = 500 (barres rouges) et t = 700 (barres vertes), réglé par le séquençage complet du génome. Ce chiffre a été effectué à l’aide de DNAPlotter33 et a été adapté de Frimodt-Møller et al. 4. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Histogrammes de cytométrie en flux représentatif du transposon sites trouvés en marchant de la simple gène à t = 700. Cellules sont cultivées dans un milieu minimal AB additionné de 0,2 % de glucose, 10 thiamine µg/mL et 0,5 % d’acides casamino à 37 ° C. Type sauvage et ΔDARS2 sont présentées dans A et B, respectivement. Dérivés de la souche de type sauvage MG1655 dépourvu de DARS2 le locus original et plutôt transportant une copie de DARS2 dans le transposon résolu site rrpH, IR et le terminus (terC) sont indiquées en C, D et E, respectivement. Ce chiffre a été adapté de Frimodt-Møller et al. 4 pour indiquer un emplacement DARS2 qui se traduit par une anomalie du cycle cellulaire (terC) ou qui restaure le phénotype de type sauvage(rrpH, IR). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La méthodologie utilisée ici tire profit de l’état-of-the-art techniques pour répondre à une question difficile au sujet de la position optimale de génomique d’un élément génétique. L’insertion au hasard de l’élément génétique (véhiculée par le transposon) active la collecte rapide et facile de milliers de clones, qui ensuite peuvent être faites à affronter pour sélectionner la position optimale de l’élément génétique étudiée (par exemple le clone plus fort).

Ici, DARS2 a été insérée dans le mini-Tn10-basé de transposon, NKBOR. Le choix du transposon est important pour l’analyse en aval des sites d’insertions. Les transposons plusieurs différents ont été utilisés dans des expériences de séquençage (TraDIS) axés sur le transposon-chantier d’insertion, tels que mini-AMT5Km234 et le choix le plus populaire, le Hammar je Mariner transposon35, 36 (pour un examen récent de ceci, voir van Opijnen et Camilli36). Nous nous sommes efforcés pour 70 000 insertions aléatoires initiale de DARS2, qui donne environ une insertion DARS2 evert 65 bp dans le génome de MG1655. Cela peut facilement être ajusté en diminuant ou augmentant le pool initial des colonies collectées.

Ici, nous avons opté pour des transferts continues dans les cultures en batch LB, mais l’expérience de la concurrence peut aussi être effectuée dans un milieu différent ou dans des conditions différentes, notamment en utilisant un chemostat37. En outre, la procédure peut être modifiée pour tenir compte des conditions de choix, y compris divers stress, tels que le stress oxydatif, osmotique ou antibiotiques. Pour vérifier la présence de clones persistants au fil du temps, on peut faire au moins trois choses : groupes de travail ; séquençage de transposons (Tn-Seq) ; ou, comme en l’espèce, une tache méridionale. Enfin, simple gène marche peut être fait sur quelques clones, avec l’avantage supplémentaire que sites d’insertion de transposon sont identifiées dans clones unique, tel que l’effet du site d’insertion spécifiques peut être phénotypiquement analysé.

Le choix du test phénotypique d’évaluer les résultats d’une expérience de compétition dépend de la région étudiée. Nous avons utilisé cytométrie en flux, qui est une méthode puissante pour mesurer les paramètres du cycle cellulaire des bactéries. Ici, l’écoulement cytometry a révélé que l’ou les positions chromosomique sélectionnée de DARS2, (c.-à-d., les insertions DARS2 près de la position de DARS2 de type sauvage) a entraîné la régulation correcte de (initiation de la réplication c'est-à-dire, synchronie et la concentration d’ADN). Les positions chromosomiques optimales pour DARS2 ont été choisies en partie dû au dosage des gènes d’associées à la réplication correcte et en partie en raison de l’environnement favorable de génomique local important pour DARS2 fonction4.

Ici, un élément d’ADN non codant a été l’objet d’une enquête, mais cela peut être étendu à n’importe quelle région codante de choix. Une étude récente a montré que le niveau de l’expression génique variait ~ 300 fois, fonction de sa position sur le chromosome, sans effacer corrélation associées à la réplication des gènes dosage38. L’approche décrite ici pourrait donner un aperçu important de la relation entre la génomique localisation d’un gène particulier, son activité transcriptionnelle et l’avantage de remise en forme associé. En théorie cela pourrait aider à la sélection des postes génomiques, conduisant à la plus forte expression d’un gène donné, qui à son tour, pourrait être d’intérêt pour l’ingénierie des souches amélioré pour la production de protéines recombinantes.

Comme e. coli contient des régions intergéniques limitée39, insertions de transposon perturbera, dans la plupart des cas, un ou des gènes. Cela peut parfois créer de faux positifs où les clone(s) plus forts n’est pas sélectionnés en raison de la position chromosomique optimale de l’élément génétique en question, mais plutôt parce qu’un gène est perturbé - qui, autrement, fournit un avantage de remise en forme au cours de la concours expérience4.

Cette méthodologie tire profit d’un système easy-to-use transposon, où n’importe quelle région de choix peut être intégré au hasard des lieux. L’expérience de compétition conçu peut être modifié pour inclure un nombre quelconque de sélection des forces autres que la croissance pure, comme on le voit ici. Le programme d’installation peut également être modifiée pour être purement basé sur AMT-Seq, ce qui donne une plus grande résolution de séquençage des sites d’insertions que WGS, utilisé ici. Cette approche impartiale devrait servir à élucider les nouvelles fonctionnalités intéressantes dans les organismes non caractérisés jusqu'à présent, qui pourraient montrer que les tendances communes existant dans l’organisation chromosomique des eubactéries.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrente.

Acknowledgments

Les auteurs ont été financés par des subventions de la Novo Nordisk Foundation, la Fondation de Lundbeck et le Danish National Research Foundation (DNRF120) via le centre de réponse au Stress bactérien et persistance (BASP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

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References

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