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Genetics

इष्टतम गुणसूत्र स्थान का निर्धारण (ओं) एक डीएनए तत्व के लिए एक उपंयास Transposon-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग कर ई कोलाई में

Published: September 11, 2017 doi: 10.3791/55946
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

Summary

यहां, एक गैर की एक transposon-मध्यस्थता यादृच्छिक प्रविष्टि की सत्ता में डीएनए तत्व कोडिंग के लिए अपनी इष्टतम गुणसूत्र स्थिति को हल किया गया था ।

Abstract

एक दिया डीएनए तत्व की इष्टतम गुणसूत्र स्थिति (ओं) था/transposon द्वारा निर्धारित किया गया था यादृच्छिक फिटनेस चयन द्वारा पीछा सम्मिलन । जीवाणुओं में आनुवांशिक तत्व के कार्य पर आनुवांशिक सन्दर्भ के प्रभाव का आंकलन करना कठिन हो सकता है । टोपोलॉजिकल प्रभाव सहित कई तंत्र, पड़ोसी जीन से हस्तक्षेप transcriptional, और/या प्रतिकृति से संबंधित जीन खुराक, एक दिया आनुवंशिक तत्व के समारोह को प्रभावित कर सकते हैं । यहाँ, हम ई कोलाई के गुणसूत्र में एक डीएनए तत्व के यादृच्छिक एकीकरण परमिट और सबसे अनुकूल एक साधारण विकास प्रतियोगिता प्रयोग का उपयोग स्थानों का चयन एक विधि का वर्णन । विधि यादृच्छिक प्रविष्टि के एक अच्छी तरह से वर्णित transposon आधारित प्रणाली का लाभ लेता है, विकास लाभ, एक प्रक्रिया है कि आसानी से प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए समायोज्य है द्वारा फिटर क्लोन (एस) की एक चयन के साथ युग्मित । फिटर क्लोन (ओं) की प्रकृति एक जटिल बहु-क्लोनल जनसंख्या पर पूरे जीनोम अनुक्रमण द्वारा या चयनित क्लोनों की तेजी से पहचान के लिए आसान जीन घूमना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । यहां, गैर कोडिंग डीएनए क्षेत्र DARS2, जो ई. कोलाईमें गुणसूत्र प्रतिकृति की दीक्षा को नियंत्रित करता है, एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । DARS2 का फ़ंक्शन प्रतिकृति से संबंधित जीन खुराक से प्रभावित होने के लिए जाना जाता है; करीब DARS2 डीएनए प्रतिकृति के मूल करने के लिए हो जाता है, और अधिक सक्रिय हो जाता है । DARS2 बेतरतीब ढंग से एक DARS2-हटाए गए तनाव के गुणसूत्र में डाला गया था । परिणामी क्लोनों युक्त व्यक्तिगत सम्मिलन थे और पीढ़ियों के सैकड़ों के लिए एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा । अंत में, फिटर क्लोन विशेषता और मूल DARS2 स्थान के करीब निकटता में डाला DARS2 शामिल करने के लिए पाया गया.

Introduction

किसी भी आनुवंशिक तत्व का कार्य जीनोम में उसके स्थान से प्रभावित हो सकता है. बैक्टीरिया में, यह मुख्य रूप से हस्तक्षेप से पड़ोसी जीन की प्रतिलिपि द्वारा परिणाम, स्थानीय डीएनए टोपोलॉजी, और/या प्रतिकृति से जुड़े जीन खुराक । विशेष रूप से, डीएनए प्रतिकृतिकरण और अलगाव की प्रक्रिया को नियंत्रित कर रहे हैं, कम से कम भाग में, गैर द्वारा कोडिंग गुणसूत्र क्षेत्रों1, और इन क्षेत्रों के उचित कार्य जीनोमिक स्थान पर निर्भर करता है/ ई. कोलाईमें, उदाहरण dif साइट, बहन गुणसूत्र संकल्प2के लिए आवश्यक हैं; KOPS दृश्यों, गुणसूत्र अलगाव के लिए आवश्यक3; और डेटा, DARS1, और DARS2 क्षेत्रों, उचित गुणसूत्र प्रतिकृति नियंत्रण के लिए आवश्यक (नीचे; 4). हम एक यादृच्छिक स्थानांतरण, चयन, और किसी भी आनुवंशिक तत्व के इष्टतम आनुवंशिक संदर्भ के निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए विधि वर्तमान, DARS2 गैर कोडिंग क्षेत्र के अध्ययन के द्वारा यहां उदाहरण ।

ई. कोलाई में, DnaA एक प्रतिकृति मूल में डीएनए कतरा खोलने के लिए जिंमेदार सर्जक प्रोटीन है, oriC, और helicase DnaB5,6,7की भर्ती के लिए । DnaA एएए के अंतर्गत आता है+ (यानी, ATPases विविध गतिविधियों के साथ जुड़े) प्रोटीन और दोनों एटीपी और ADP समान उच्च समानताएं5के साथ बांध कर सकते हैं । DnaAएटीपी चोटियों के स्तर पर दीक्षा8, जहां DnaAएटीपी रूपों oriC पर एक multimer है कि डीएनए द्वैध9खोलने से चलाता है । दीक्षा के बाद, oriC के लिए अस्थाई रूप से उपलब्ध कराया है पुनः के लिए एक SeqA प्रोटीन के बंधन को शामिल तंत्र द्वारा ज़ब्ती के कारण दीक्षा के लिए hemimethylated oriC10,11। ज़ब्ती के दौरान, DnaAएटीपी के स्तर पर कम से कम दो तंत्र से कम है: DnaA (रिदा)12,13 और डेटाके विनियामक निष्क्रियता-आश्रित DnaAएटीपी hydrolysis (DDAH)14 ,15. दोनों रिदा और DDAH DnaAएटीपी के रूपांतरण को बढ़ावा देने के लिए DnaAADP। दीक्षा के एक नए दौर से पहले, DnaAADP फिर से सक्रिय है विशिष्ट DnaA पर DnaAएटीपी -reएक्टिवेट अनुक्रम (डारों): DARS1 और DARS216,17। गुणसूत्र डेटा, DARS1,और DARS2 क्षेत्रों गैर कोडिंग कर रहे है और एक निगरानी तरह तरीके में कार्य करने के लिए DnaAएटीपी/DnaAADP रूपांतरण मिलाना । इन क्षेत्रों, प्रतिकृति के मूल के बाहर स्थित, या तो निष्क्रियण (डेटाके लिए एक DnaA परिसर के असेंबली सक्षम करें; 14) या सक्रियण (DARS1 और DARS2; १७) च्या DnaA. किसी कक्ष में DARS2 हटाना सामूहिक दोहरीकरण समय को परिवर्तित नहीं करता है लेकिन एसिंक्रोनस प्रतिकृति दीक्षा15,16,18में परिणाम । हालांकि, DARS2-कमी कोशिकाओं एक फिटनेस लागत अमीर माध्यम में दोनों निरंतर वृद्धि प्रतियोगिता के दौरान या माउस आंत में औपनिवेशीकरण की स्थापना के दौरान एक अंयथा isogenic wildtype की तुलना में18है । यह इंगित करता है कि asynchrony/मूल एकाग्रता में भी मामूली परिवर्तन बैक्टीरियल फिटनेस पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है । ई. कोलाईमें, वहां एक चयनात्मक को गुणसूत्र समरूपता (यानी, दो लगभग बराबर लंबाई प्रतिकृति शस्त्र) बनाए रखने के दबाव है19। डेटा, DARS1, और DARS2 क्षेत्रों में सभी ई. कोलाई उपभेदों में oriC के लिए एक ही रिश्तेदार दूरी है18अनुक्रम, गुणसूत्र आकार में बड़े बदलाव के बावजूद ।

यहां, हम ई. कोलाई के DARS2 क्षेत्र गुणसूत्र स्थिति (ओं) को अपने समारोह के लिए इष्टतम की पहचान के लिए एक उदाहरण के रूप में उपयोग करें । DARS2 NKBOR transposon में डाला गया था, और परिणामी NKBOR::DARS2 transposon बाद में MG1655 ΔDARS2के जीनोम में बेतरतीब ढंग से डाला । हम इस प्रकार कोशिकाओं का एक संग्रह उत्पंन, प्रत्येक रखने DARS2 गुणसूत्र पर एक अलग स्थान पर रखा । एक इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोग, जहां संग्रह में सभी कोशिकाओं और परित एक अनुमानित ७०० पीढ़ियों के लिए पौंड में लगातार वृद्धि के दौरान एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा, प्रदर्शन किया गया था । प्रतियोगिता प्रयोग के परिणाम पर नजर रखी थी/दक्षिणी दाग, आसान जीन घूमना, और पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग कर निर्धारित (WGS; चित्र 1) । आसान जीन घूमना द्वारा हल अंत बिंदु क्लोन सेल चक्र मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विशेषता थे. एक प्रवाह cytometric विश्लेषण में, सेल आकार, डीएनए सामग्री, और दीक्षा synchrony कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लिए मापा जा सकता है । प्रवाह cytometry के दौरान, एकल कोशिकाओं के प्रवाह के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के एक प्रकाश बीम गुजरता है दाग डीएनए है, जो एक साथ photomultipliers द्वारा पंजीकृत है कि उत्सर्जित प्रतिदीप्ति, डीएनए सामग्री का एक उपाय है, बशर्ते कि इकट्ठा उत्तेजित कोशिकाओं के डीएनए के लिए दाग रहे हैं । आगे-बिखरी रोशनी का उपाय है सेल मास20।

इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोग हम यहां मौजूद आनुवंशिक तत्व के गुणसूत्र स्थिति और जीनोमिक संदर्भ के महत्व से संबंधित सवालों के पते के लिए प्रयोग किया जाता है । विधि निष्पक्ष और प्रयोग करने में आसान है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. Transposon लाइब्रेरी का संग्रह

< p class = "jove_content" > नोट: गुणसूत्र DARS2 लोकस में क्लोन किया गया था मिनी तमिलनाडु 10 -आधारित Transposon, NKBOR (on pNKBOR) < सुप वर्ग = "xref" > 21 , जिसके परिणामस्वरूप NKBOR:: DARS2 (pJFM1) । pNKBOR ऑनलाइन प्राप्त किया जा सकता है < सुप class = "xref" > 22 . pNKBOR एक R6K आधारित आत्महत्या वेक्टर है जिसकी आवश्यकता है फलत प्रोटीन & #960; for प्रतिकृति < सुप class = "xref" > 23 . प्लाज्मिड pJFM1 इसलिए एक ई. कोलाई तनाव में दोहराने के लिए सक्षम है ( जैसे, Dh5 & #945; & #955; पीर) गुणसूत्र पीर जीन की एक प्रति युक्त. हालांकि, जब pJFM1 पीर की कमी wildtype MG1655 में तब्दील हो गया है, pJFM1 नहीं दोहराने, कनमीसिन के यादृच्छिक निवेशन द्वारा उत्पंन प्रतिरोधी क्लोनों के चयन के लिए अग्रणी:: NKBOR DARS2 जीवाणु गुणसूत्र में । सादगी के लिए, इन DARS2 सम्मिलन के रूप में संदर्भित कर रहे हैं. See < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ कार्यप्रणाली की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति के लिए.

  1. तैयार electrocompetent MG1655 & #916; DARS2 में सक्रिय रूप से बढ़ते कोशिकाओं से (LB) ३७ पर उगाया & #176; C < सुप वर्ग = "Lysogeny" > 24 xref.
  2. Electroporate pJFM1 electrocompetent MG1655 & #916; DARS2 , अनुसार गोंजालेस एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > 24
    1. Add 1 & #181; pJFM1 के g लए (1 & #181; l का जल) को ४० & #181; l के electrocompetent ई. कोलाई MG1655 & #916; DARS2 और इस मिश्रण को पूर्व-सर्द, बाँझ ०.२-सेमी गैप cuvette पर ट्रान्सफर करें. electroporation कक्ष में cuvette संमिलित करें । Electroporate पर 18 केवी, ५०० & #937;, व 25 & #181; च; समय स्थिरांक ~ ५.० ms होना चाहिए, और कोई arcing नहीं होनी चाहिए ।
    2. जल्दी से एक 15 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब के लिए पूर्व गर्म पौंड शोरबा और हस्तांतरण के 1 मिलीलीटर में reसस्पैंड द्वारा बैक्टीरियल निलंबन ठीक हो ।
    3. ३७ & #176 पर वातित वृद्धि की स्थिति के तहत, एंटीबायोटिक चयन के बिना 30 मिनट, के लिए सी के तहत गर्मी से कोशिकाओं को ठीक करने दें । प्लेट पर जीवाणु पौंड आगर प्लेटों के साथ पूरक ५० & #181; छ/एमएल कनमीसिन और मशीन पर ३७ & #176; ग रात भर.
  3. electroporation से कालोनियों की गिनती: एक कॉलोनी एक गुणसूत्र transposon लन के बराबर मानी जाती है.
    नोट: कालोनियों की गणना आंखों से या कॉलोनी काउंटर के साथ की जा सकती है । कालोनियों की संख्या व्युत्क्रम औसत दूरी प्रत्येक क्लोन के गुणसूत्र में स्थित transposons अलग करने के लिए आनुपातिक है ।
  4. प्रत्येक प्लेट के लिए पौंड शोरबा के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सभी कालोनियों से धो; पौंड शोरबा की 1 मिलीलीटर के लिए बंद धो पर्याप्त होना चाहिए ~ १००,००० कालोनियों । फिर से एक ही £ शोरबा के 1 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए बैक्टीरियल एकाग्रता में वृद्धि । पूल सभी कालोनियों में एक ही ५० एमएल ट्यूब
  5. भंवर ट्यूब और शुरू सामग्री फ्रीज (टी = 0) । इसे फ्रीज करने के लिए, बर्फ पर ५०% ग्लिसरॉल की 1 मिलीलीटर के साथ सेल सस्पेंशन की 1 मिलीलीटर मिलाएं । 10 मिनट के लिए बर्फ सूखी ट्यूबों स्थानांतरण । एक बार संस्कृतियों के जम जाने पर उन्हें एक-८० & #176; सी फ्रीजर में ट्रांसफर कर दें.
    नोट: इस चरण में ५०,००० CFU/mL की एक ंयूनतम कक्ष एकाग्रता अपेक्षित है ।
< p class = "jove_title" > 2. प्रतियोगिता प्रयोग पौंड में

  1. गल transposon पुस्तकालय से-८० & #176; ग पर बर्फ । pipetting.
    2. द्वारा मिश्रण
  2. Transfer १०० & #181; transposon लाइब्रेरी के एल ए 15 एमएल टेस्ट ट्यूब में पौंड की 10 मिलीलीटर ।
  3. बढ़ती कोशिकाओं, वातित द्वारा निरंतर मिलाते हुए (२५० rpm), के लिए 8 ज पर ३७ & #176; ग टू स्टेशनरी फेज ( यानी, ओडी ६०० = ~ ४.०). इन मापदंडों को विभिंन विकास परिस्थितियों में समायोजित करें, जैसा कि वांछित ।
  4. ताजा गर्म मध्यम हर ~ 10 पीढ़ियों में निरंतर स्थानांतरण द्वारा बैक्टीरियल आबादी का प्रचार । इसे 10 & #181 स्थानांतरित करके; पिछले स्टेशनरी चरण संस्कृति के एल ताजा पौंड के 10 मिलीलीटर और एक और 8 घंटे के लिए स्थिर चरण ( यानी, आयुध डिपो ६०० = ~ ४.०) के लिए बढ़ रहा है ।
    नोट: के रूप में शुरू और अंत ऑप्टिकल घनत्व एक ही हैं, एक १,०००-गुना कमजोर पड़ने से मेल खाती है ~ विकास के 10 पीढ़ियों (2 10 = १,०२४) । बैक्टीरियल आबादी या तो सीधे ताजा गर्म माध्यम में प्रचारित किया जा सकता है या 0-4 & #176 पर बचाया; सी (बर्फ पर) और अगले दिन प्रचारित । पौंड यहां इस्तेमाल के रूप में संभव के रूप में कम एक समय के रूप में कई सेलुलर दोहरीकरण सुनिश्चित करने के लिए (एक दोहरीकरण समय करीब 22 मिनट) ।
  5. प्रतियोगिता के प्रत्येक १०० पीढ़ियों के बाद, पांच 1 मिलीलीटर नमूनों को बचाने के लिए-८० & #176; C (चरण ३.३ में वर्णित के रूप में).
  6. यदि व्यक्तिगत transposon सम्मिलन वाले कक्षों के बीच फिटनेस अंतर छोटे होने की अपेक्षा की जाती है, तो प्रतिस्पर्धा की अवधि लंबी रखें; यहाँ, ७०० पीढ़ियों (टी = ७००) का इस्तेमाल किया गया.
< p class = "jove_title" > 3. दक्षिणी दाग विश्लेषण समय के साथ प्रतियोगिता प्रयोग पर नजर रखने के लिए

  1. दक्षिणी दाग के लिए जांच की तैयारी (1-NKBOR के केबी अनुभाग) पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया प्रदर्शन (पीसीआर) प्रवर्धन विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat and NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. में ९८ & #176; ग के लिए 30 एस के लिए प्रारंभिक विकार । उसके बाद, ९८ & #176; c के लिए 10 s, ६० & #176; c के लिए 30 s, और ७२ & #176; c के लिए ४५ s पर ३५ चक्र निष्पादित करें । अंतिम विस्तार के लिए, 10 min.
      के लिए ७२ & #176; C का उपयोग करें नोट: पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट एक शुद्ध pNKBOR प्लाज्मिड < सुप वर्ग = "xref" > २१ .
    2. लेबल परिणामी पीसीआर अंश with [& #945;-32P] dATP रैंडम प्राइमरी प्रणाली का प्रयोग, स्मिथ के अनुसार < सुप वर्ग = "xref" > २५ .
  2. के अनुसार कुल सेलुलर डीएनए तैयार करना L & #248; bner-Olesen और वॉन Freiesleben < सुप वर्ग = "xref" > 26 t = 0 और चयनित समय अंक तक t = ७०० प्रतियोगिता का अनुमानित पीढ़ियों.
  3. डाइजेस्ट के साथ कुल सेलुलर डीएनए Pvu मैं, जो ब्याज के क्षेत्र से युक्त NKBOR में कटौती एक बार केवल एक क्षेत्र में जांच के द्वारा कवर नहीं; Pvu की 1 इकाई मैं पूरी तरह से पचाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 1 & #181; जी सब्सट्रेट डीएनए का.
    नोट: जांच विभिंन लंबाई के गुणसूत्र डीएनए के साथ साथ, सम्मिलन साइट पर निर्भर करता है, transposon के हिस्से वाले अंशों को पहचान लेंगे ।
  4. एक दक्षिणी दाग प्रदर्शन ०.७% agarose जेल का उपयोग L & #248 के अनुसार; bner-Olesen और वॉन Freiesleben < सुप वर्ग = "xref" > २६ .
< p class = "jove_title" > 4. फिटर क्लोनों की पहचान

  1. उपयोग आसान जीन घूमना, के रूप में हैरिसन एट अल. द्वारा वर्णित < सुप क्लास = "xref" > 27 , एक क्लोन से DARS2 सम्मिलन साइटों की पहचान करने के लिए (पौंड प्लेटों पर पृथक) प्रतियोगिता के ७०० अनुमानित पीढ़ियों के बाद; दक्षिणी दाग पर अधिक बैंड, और अधिक अलग करने के लिए सभी transposon सम्मिलन कवर की जरूरत है । पीसीआर टेम्पलेट के लिए जीनोमिक डीएनए को अलग
    1. । ५० & युक्त एक पौंड आगर प्लेट पर फैले बैक्टीरिया #181; जी/एमएल कनमीसिन और गर्मी में ३७ & #176; सी रातोंरात । ३७ पर पौंड शोरबा में रातोंरात एक कालोनियों बढ़ो & #176; ग और बाद में 20 & #181 का अंतरण; l में २०० & #181; autoclaved आसुत जल के एल (या डीएनए शुद्धि का उपयोग करें, चरण ३.२ में के रूप में) ।
      1. भंवरे ते मिश्रण. १०० & #176 पर मिश्रण गर्मी 10 मिनट के लिए सी और 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर केंद्रापसारक । सेल lysate पर सेव-20 & #176; c भविष्य के उपयोग के लिए.
    2. डिजाइन तीन नेस्टेड प्राइमरों के transposon के भीतर ऐनी करने के लिए (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 पीसीआर रणनीति के एक ग्राफिक प्रतिनिधित्व के लिए).
      नोट: नेस्टेड प्राइमरों डिजाइनिंग यह सुनिश्चित करना चाहिए कि नेस्टेड प्राइमर 3 ज्ञात 5 & #39 के निकटतम है, transposon डीएनए के अंत, नेस्टेड प्राइमरों 2 और 1 के बाद । नेस्टेड प्राइमरी 3 और 5 & #39 के बीच की रिक्ति; ज्ञात टी के अंतransposon डीएनए अज्ञात डीएनए (विशिष्ट गुणसूत्र transposon प्रविष्टि साइट को खोजने के लिए) के लिए जाना जाता डीएनए से एक दृश्य के माध्यम से पढ़ने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. NKBOR के लिए निंनलिखित नेस्टेड प्राइमरों का इस्तेमाल किया गया: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, और pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg । ज्ञात प्रतिबंध एंजाइमों की मांयता साइटों युक्त यादृच्छिक प्राइमर भी इस्तेमाल कर रहे हैं । एक परिणाम को सुनिश्चित करने के लिए, एक से कम दो अलग यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करना चाहिए । प्रतिबंध एंजाइमों के लिए प्रतिबंध साइटों ( उदा., Sau 3AI और हिन dIII) को 3 & #39 पर स्थित होना चाहिए; अंत और इससे पहले दस यादृच्छिक कुर्सियां ताकि 5 & #39;-NNNNNNNNNNGATC-3 & #39; र 5 & #39;-NNNNNNNNNNAAGCTT-3 & #39; द प्राइमर्स हैं जिसमें एक Sau 3AI साइट (GATC) और एक हिन dIII साइट (AAGCTT), क्रमशः, जहां N = a, T, G, या C.
    3. जीनोमिक डीएनए के २०० एनजी का उपयोग 20 & #181; L पीसीआर रिएक्शन. ९८ पर मशीन & #176; ग के लिए 30 एस के लिए प्रारंभिक विकार । ९८ पर 25 चक्र प्रदर्शन & #176; ग फॉर 30 एस, ५० & #176; सी फॉर 15 एस, और ७२ & #176; c for 4 min. अंतिम विस्तार के लिए, 10 मिनट के लिए ७२ & #176; C का उपयोग करें प्राइमरी जोड़े नेस्टेड प्राइमरी 1 से मिलकर और यादृच्छिक प्राइमरों में से एक ।
    4. का प्रयोग प्राइमरी जोड़े नेस्टेड प्राइमर 2 और दूसरा प्रवर्धन से एक ही यादृच्छिक प्राइमर से मिलकर, एक टेंपलेट के रूप में अपनी पिछली प्रतिक्रिया के 1 & #181; L का उपयोग कर ।
    5. दोहराएँ प्राइमरी जोड़े नेस्टेड प्राइमरी 3 और एक ही यादृच्छिक प्राइमर से मिलकर के साथ कदम 4.1.4.
    6. एक १.५% agarose जेल पर अंतिम पीसीआर प्रतिक्रिया से उत्पादों को चलाने और ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग । श्रेणी 100-800 बीपी में एक बैंड बाहर कट और किसी भी व्यावसायिक डीएनए जेल निकालने किट का उपयोग कर डीएनए को अलग निर्माता & #39 के अनुसार; s दिशा । डीएनए को फिर से सस्पेंड कर 15 & #181; पानी के ल L
      नोट: सावधानी । Ethidium ब्रोमाइड विषाक्त है और देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए.
    7. अनुक्रम पिछले चरण (चरण 4.1.6) में पृथक, अनुक्रमण प्राइमर के रूप में नेस्टेड प्राइमर 3 के साथ, एक वाणिज्यिक प्रदाता पर सैंज अनुक्रमण का उपयोग कर ।
  2. परफॉर्म WGS.
    1. प्रतियोगिता प्रयोग के दौरान एकत्र किए गए चुनिंदा नमूनों से निकाले गए कुल डीएनए पर WGS प्रदर्शन, जैसा कि Frimodt द्वारा वर्णित है-M & #248; ller एट अल < सुप वर्ग = "xref" > 4 .
  3. प्रदर्शन अनुक्रमण विश्लेषण.
    1. संरेखित मीन्स-end पढ़ता करने के लिए १५० Ns निरंतर करने के लिए NKBOR, af 310136.1 १,९०४ & #8230; २,२०४ Bowtie2 < सुप वर्ग का उपयोग कर = "xref" > 28 के बीच एक अंतराल के साथ बीज उपस्ट्रिंग (S, 1, 1.15) और अधिकतम संख्या में अस्पष्ट वर्ण (L, 0, 0.9).
    2. का चयन करें संरेखित पढ़ता है और फिर दोनों MG1655 रेफरी को फिर से संरेखित । nc_ 000913.3 और NKBOR जीबी | AF310136 प्रयोग blastN < सुप वर्ग = "xref" > 29
    3. स्थानांतरण लन पदों पर जंक्शनों पर MG1655-NKBOR.
< p class = "jove_title" > 5. फ्लो Cytometry

  1. के लिए नमूने एकत्र Cytometry.
    1. एक संस्कृति को संतुलित करने के लिए इसे घातीय वृद्धि के चरण में कम से कम 10 पीढ़ियों के लिए बनाए रखने । आयुध डिपो ६०० की जांच करें और सुनिश्चित करें कि यह ०.३ से अधिक कभी नहीं ।
    2. प्रवाह नमूनों के दो प्रकार इकट्ठा ।
      1. For मोरोक्कन-रनआउट, 1 मिलीलीटर संस्कृति का अंतरण 15 एमएल ट्यूब युक्त 30 & #181; L के मोरोक्कन-CEF (३०० & #181; g/मब रिफैंपिसिन और ३६ & #181; छ/एमएल cephalexin में भंग १२.५ mM NaOH) । यह ३७ & #176 पर छोड़ दो; ग के लिए कम से 4 ज के झटकों का.
        नोट: रिफैंपिसिन परोक्ष रूप से समाप्ति के लिए जारी रखने के लिए प्रतिकृति के चल रहे दौर के लिए अनुमति देते हुए गुणसूत्र प्रतिकृति की दीक्षा ब्लॉकों । Cephalexin कोशिका विभाजन को रोकता है, जो प्रतिकृति में परिणाम रनआउट (मोरोक्कन-रनआउट) और पूरी तरह से प्रतिरूपित गुणसूत्रों के साथ कोशिकाओं का संचय । पूरी तरह से प्रतिरूपित गुणसूत्रों की संख्या रिफैंपिसिन के साथ उपचार के समय मूल की संख्या के बराबर है और cephalexin < सुप वर्ग = "xref" > 20 .
      2. EXP-नमूना के लिए, तेजी से बढ़ती संस्कृति के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण करने के लिए एक १.५-ml ट्यूब पर बर्फ.
  2. निम्नानुसार कक्षों को ठीक करें. फसल १५,००० पर 5 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं 4 & #176; C. १०० में गोली reसस्पेंड & #181; L बर्फ की ठंड 10 मिमी Tris पीएच ७.५ और बर्फ के 1 मिलीलीटर-ठंड ७७% इथेनॉल जोड़ें । नमूनों को 4 & #176; C तक use.
    3. पर संग्रहीत करें
  3. इस प्रकार के रूप में कोशिकाओं दाग । हार्वेस्ट 100-300 & #181; 15 मिनट के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा स्थिर कोशिकाओं के एल । supernatant निकालें और १३० में गोली reसस्पेंड & #181; L के & #34;D न दाग समाधान & #34; (९० & #181; g/मब mithramycin, 20 & #181; छ/मिलि ethidium ब्रोमाइड, 10 mM MgCl 2 , और 10 मिमी Tris पीएच ७.५) । बर्फ पर और अंधेरे में नमूने रखो; नमूने 10 मिनट के बाद प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।
    नोट: ethidium ब्रोमाइड और mithramycin से इतर DNA दाग का भी उपयोग किया जा सकता है < सुप class = "xref" > 30 , < सुप class = "xref" > 31 .
  4. सेल प्रति मूल निर्धारित करते हैं, सापेक्ष कोशिका द्रव्यमान, और सापेक्ष डीएनए सामग्री प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा.
    1. प्रदर्शन प्रवाह cytometry, जैसा कि पहले बताया गया < सुप वर्ग = "xref" > ३२ . रन मोरोक्कन-रनआउट और EXP-नमूने का उपयोग कर प्रवाह cytometer निर्माता & #39; s निद . mithramycin-और ethidium ब्रोमाइड-सना हुआ कोशिकाओं के लिए, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ३९५ और ४४० एनएम का उपयोग करें और ५६५ एनएम के ऊपर प्रतिदीप्ति इकट्ठा ।
      1. सापेक्ष कोशिका द्रव्यमान और सापेक्षिक डीएनए सामग्री का निर्धारण करने के लिए, एकल-पैरामीटर को अग्रेषित करने के लिए EXP-नमूने चलाएं-प्रकाश स्कैटर बनाम कक्ष संख्या हिस्टोग्राम और प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम सेल संख्या हिस्टोग्राम ३०,००० की घटनाओं की एक ंयूनतम के लिए सेल सिग्नल के संगत ।
      2. उपयोग आगे-बिखरे हुए प्रकाश एकल-पैरामीटर वितरण औसत सापेक्ष कोशिका द्रव्यमान मापने के लिए.
        नोट: आगे-बिखरे प्रकाश औसत सेल मास का एक उपाय है < सुप वर्ग = "xref" > २० .
      3. औसत डीएनए सामग्री को मापने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता एकल-पैरामीटर वितरण का उपयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > २० .
      4. औसत डीएनए सामग्री के अनुपात के रूप में डीएनए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए औसत सेल जन < सुप वर्ग = "xref" > २० .
    2. प्रति कोशिका उत्पत्ति की संख्या निर्धारित करते हैं ।
      1. रन मोरोक्कन-रनआउट नमूने एकल-पैरामीटर प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम कक्ष संख्या प्राप्त करने के लिए ३०,००० सेल संकेत करने के लिए संगत घटनाओं की एक ंयूनतम के लिए हिस्टोग्राम ।
      2. प्रत्येक कोशिका में गुणसूत्रों की संख्या का निर्धारण करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता एकल-पैरामीटर वितरण का उपयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > २० .
  5. गणना asynchrony सूचकांक (ऐ.)
    1. की गणना एअर इंडिया द्वारा बताए अनुसार L & #248; bner-Olesen एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > ३२ , मोरोक्कन-रनआउट नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता एकल पैरामीटर वितरण का उपयोग करना और सूत्र ऐ = (f3 + f5 + f6 + f7)/(f2 + f4 + f8), जहां fx पूरी तरह से दोहराया गुणसूत्रों की एक्स संख्या के साथ अंश कोशिकाओं है । विचार चलाउने एसिंक्रोनस जब एक & #62; ०.१.

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Representative Results

एक दक्षिणी दाग को सत्यापित करने के लिए किया गया था कि DARS2 transposon लाइब्रेरी (t = 0) में गुणसूत्र भर में अनियमित रूप से वितरित किया गया था और यह कि फिटर क्लोन समय के साथ जारी रहेगा । दक्षिणी ब्लाट डीएनए पर प्रदर्शन किया गया प्रारंभिक transposon पूल से (टी = 0 पर) और हर अनुमानित १०० बाहर प्रतियोगिता के ७०० पीढ़ियों के (चित्रा 3) । यहां, प्रत्येक समय बिंदु से कुल सेलुलर डीएनए Pvuमैं प्रतिबंध एंजाइम, transposon NKBOR में कटौती के लिए जाना जाता है के साथ पचा गया था::DARS2 एक बार ही जांच से कवर नहीं क्षेत्र में । दक्षिणी ब्लाट एक रेडियोधर्मी लेबल डीएनए NKBOR के भाग के पूरक के साथ जांच की थी । के रूप में चित्रा 3से देखा, प्रारंभिक DARS2 पूल (टी = 0) अलग बैंड है, जो पता चलता है कि DARS2 गुणसूत्र भर में बेतरतीब ढंग से डाला गया था अभाव । समय के साथ, एक पैटर्न उभरा जहां DARS2 क्लोनों के प्रारंभिक बड़े पूल केवल एक या कुछ कायम DARS2 क्लोन में विकसित (चित्रा 3; टी = 0 टी = ७०० के लिए) ।

दिखाए गए उदाहरण में, प्रतियोगिता प्रयोग से DARS2 सम्मिलन साइटें WGS और आसान जीन चलने का उपयोग करके पहचानी गईं. यहां, WGS (टी = 0) और ३००, ४०० के बाद, और प्रतियोगिता के ७०० पीढ़ियों के बाद शुरू पूल से सम्मिलन साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ध्यान दें कि वर्तमान गहरी sequencing में कवरेज t = 0 पर सम्मिलन साइट्स की एक पूर्ण मैपिंग के लिए अपर्याप्त था; हालांकि, यह सम्मिलन की कुल संख्या का एक प्रतिनिधि सबसेट देता है. WGS दक्षिणी ब्लाट परिणाम (यानी, फिटर DARS2 क्लोन के चयन) की पुष्टि की, wildtype DARS2 गुणसूत्र स्थान के करीब सभी DARS2 सम्मिलन के लगभग ९८% के साथ समाप्त (DARS2 क्लोन आईआर और क्लोन rppH), जबकि शेष 2% गुणसूत्र पर कहीं थे (चित्रा 4) । यह दृढ़ता से पता चलता है कि wildtype स्थिति DARS2 फ़ंक्शन के लिए इष्टतम है । टी = ४०० में, एक प्रविष्टि विपरीत प्रतिकृति बांह पर wildtype DARS2 स्थिति (चित्रा 4) के रूप में oriC करने के लिए एक लगभग समान दूरी के साथ पाया गया था, लेकिन इस प्रविष्टि ७०० पीढ़ियों के बाद बरामद नहीं किया गया था । इस प्रकार, प्रतिकृति-संबद्ध जीन खुराक इष्टतम स्थिति के लिए एक निर्धारक नहीं हो सकता ।

आसान जीन घूमना एकल क्लोन में प्रतियोगिता के ७०० अनुमानित पीढ़ियों के बाद पृथक DARS2 सम्मिलन साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यहां, दो DARS2 प्रविष्टि उपर्युक्त साइटों (DARS2 क्लोन आईआर और क्लोन rppH) की पहचान की गई । आसान जीन घूमना केवल 20 क्लोन पर किया गया था, और यह बताता है कि क्यों सभी DARS2 सम्मिलन साइटों WGS में मैप की पहचान नहीं थे । DARS2-कमी कोशिकाओं पहले asynchrony में प्रतिकृति आरंभ करने के लिए और wildtype कोशिकाओं के सापेक्ष मूल एकाग्रता में कमी करने के लिए दिखाए गए थे4,16,17, 18. हम इसलिए दो चयनित उपभेदों (DARS2 क्लोन आईआर और क्लोन rppH) के लिए डीएनए प्रतिकृति और सेलुलर मूल सामग्री की दीक्षा में synchrony को हल करने के लिए प्रवाह cytometry का इस्तेमाल किया, जो दोनों ही मामलों में, wildtype को बहाल किया गया स्तर (चित्र 5) । DARS2 की एक प्रति रखने के एक तनाव का एक प्रतिनिधि उदाहरण के टर्मिनस में स्थित (चित्रा 5ई) दिखाया गया है । यहां, टर्मिनस में एक DARS2 तत्व की उपस्थिति synchrony या सेलुलर मूल सामग्री wildtype स्तर तक बहाल नहीं करता है, जबकि चयनित DARS2 क्लोन आईआर और rppH करते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : कार्यप्रणाली सिंहावलोकन । कार्यप्रणाली की योजनाबद्ध प्रस्तुति की । गुणसूत्र DARS2 क्षेत्र मिनी तमिलनाडुमें 10 pNKBOR पर क्लोन है, pJFM1 का निर्माण । pJFM1 ई. कोलाई MG1655 ΔDARS2, जो ई. कोलाई DARS2 MG1655Δके गुणसूत्र पर तमिलनाडु10 से जुड़े DARS2 के एक यादृच्छिक सम्मिलन ट्रिगर में तब्दील हो गया है । लगभग ७०,००० क्लोन, एक अलग गुणसूत्र DARS2 प्रविष्टि युक्त प्रत्येक, परित और ३७ डिग्री सेल्सियस पर पौंड शोरबा में एक दूसरे के खिलाफ सीधे प्रतिस्पर्धा कर रहे थे । पौंड शोरबा में प्रत्यक्ष प्रतियोगिता प्रयोग एक अनुमानित ७०० पीढ़ियों, जहां एक नमूना प्रत्यक्ष प्रतियोगिता के प्रत्येक १०० पीढ़ियों के लिए अलग था के लिए प्रदर्शन किया गया । कुल डीएनए प्रत्येक पृथक नमूना से निकाला गया था और दक्षिणी सोख्ता और WGS द्वारा DARS2 सम्मिलन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : आसान जीन चलने की ग्राफिक प्रस्तुति। यह आंकड़ा एक अज्ञात डीएनए अनुक्रम यादृच्छिक प्राइमर और नेस्टेड प्राइमरों 1, 2, और 3 के लिए भड़काना साइटों के साथ एक ज्ञात अनुक्रम के निकट के एक जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट दिखाता है । तीन क्रमिक प्रवर्धनों के परिणाम तीन डिजाइन नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग किया नीचे सचित्र हैं । अंतिम उत्पाद (3 दौर से) नेस्टेड प्राइमर 3 का उपयोग कर अनुक्रम है । यह आंकड़ा हैरिसन एट अल से अनुकूलित किया गया था । 27. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3 : दक्षिणी ब्लाट NKBOR के लिए जांच की । एक DARS2की कमी तनाव में DARS2 निवेशन के दक्षिणी दाग विश्लेषण । जीनोमिक डीएनए प्रत्यक्ष प्रतियोगिता के हर ~ १०० पीढ़ियों से निकाले, टी = 0 पर शुरू और ७०० पीढ़ियों में समाप्त, Pvuमैं और जेल-fractionated के साथ पचा रहे थे । ब्लाटर एक NKBOR जांच के साथ संकरित था ( प्रोटोकॉलदेखें) । टी प्रतियोगिता की पीढ़ियों की संख्या को इंगित करता है । यह आंकड़ा Frimodt-Møller एट अल से अनुकूलित किया गया था । 4. HMW और LMW उच्च आणविक वजन और कम आणविक वजन डीएनए, क्रमशः कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : समाधान के ग्राफिक प्रतिनिधित्वईडी ने ΔDARS2में transposon सम्मिलन स्थलों का. oriC, डाटा, DARS1, DARS2, और terC के पदों को दर्शाया गया है । DARS2 सम्मिलन साइटों ΔDARS2 में टी = 0 (काली पट्टियां), t = ४०० (प्रकाश नीली सलाखों), टी = ५०० (लाल सलाखों), और टी = ७०० (हरी सलाखों), पूर्ण जीनोम अनुक्रमण द्वारा हल. यह आंकड़ा DNAPlotter३३ का उपयोग कर बनाया गया था और Frimodt-Møller एट अल से अनुकूलित किया गया था । 4. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5 : प्रतिनिधि प्रवाह cytometry transposon आसान जीन टी = ७०० पर चलने से पाया साइटों के हिस्टोग्राम । कोशिकाओं ०.२% ग्लूकोज, 10 µ g/एमएल thiamine, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.५% casamino एसिड के साथ पूरक अब न्यूनतम मध्यम में उगाया गया । Wildtype और ΔDARS2 क्रमशः ए और बी में दिखाए जाते हैं । wildtype तनाव MG1655 के डेरिवेटिव मूल लोकस पर DARS2 से रहित है और इसके बजाय हल DARS2 साइट transposon, IR, और टर्मिनस (rrpH) में terC की एक प्रति ले सी, डी में दिखाया गया है, और ई, क्रमश. यह आंकड़ा Frimodt-Møller एट अल से अनुकूलित किया गया था । 4 एक सेल चक्र विसंगति (terC) में परिणाम है कि एक DARS2 स्थान दिखाने के लिए या कि wildtype phenotype(rrpH, IR) पुनर्स्थापित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां इस्तेमाल किया पद्धति राज्य के अत्याधुनिक तकनीकों का लाभ लेता है एक आनुवंशिक तत्व के इष्टतम जीनोमिक स्थिति के बारे में एक कठिन सवाल का जवाब । आनुवंशिक तत्व के यादृच्छिक सम्मिलन (transposon द्वारा मध्यस्थता) क्लोन के हजारों की तेजी से और आसान संग्रह है, जो तब एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा करने के लिए जांच की आनुवंशिक तत्व (यानी की इष्टतम स्थिति के लिए चयन किया जा सकता है सक्षम बनाता है , फिटर क्लोन).

यहां, DARS2 मिनी-तमिलनाडु10आधारित transposon, NKBOR में डाला गया था । transposon का चुनाव सम्मिलन साइटों के बहाव के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. कई अलग transposons transposon-निर्देशित सम्मिलन-साइट अनुक्रमण (TraDIS) प्रयोगों, मिनी-तमिलनाडु5Km2३४ और अधिक लोकप्रिय विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया गया है, Himar मैं मेरिनर transposon३५, ३६ (इस की एक ताजा समीक्षा के लिए, वान Opijnen और Camilli३६) देखें । हम DARS2के ७०,००० प्रारंभिक यादृच्छिक सम्मिलन के लिए उद्देश्य है, जो MG1655 जीनोम में लगभग एक DARS2 प्रविष्टि एवर्ट ६५ बीपी देता है । यह आसानी से कम या एकत्र कालोनियों के प्रारंभिक पूल में वृद्धि के द्वारा समायोजित किया जा सकता है ।

यहां, हम पौंड बैच संस्कृतियों में निरंतर स्थानांतरण के लिए चुना है, लेकिन प्रतियोगिता प्रयोग भी एक अलग माध्यम में या विभिंन परिस्थितियों में किया जा सकता है, एक chemostat३७का उपयोग कर सहित । इसके अलावा, इस प्रक्रिया को oxidative, परासरणी, या एंटीबायोटिक तनाव जैसे विभिंन तनावों सहित पसंद की किसी भी स्थिति को समायोजित संशोधित किया जा सकता है । समय के साथ बनाए रखने के क्लोन की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, एक कर सकते हैं कम से कम तीन बातें: WGS; transposon अनुक्रमण (तमिलनाडु-Seq); या, यहां के रूप में, एक दक्षिणी दाग । अंत में, आसान जीन घूमना कुछ क्लोन पर किया जा सकता है, आगे लाभ के साथ कि transposon प्रविष्टि साइटों एकल क्लोन में पहचाने जाते हैं, ऐसी है कि विशिष्ट प्रविष्टि साइट के प्रभाव phenotypically विश्लेषण किया जा सकता है ।

phenotypic परख के चुनाव के लिए एक प्रतियोगिता प्रयोग के परिणाम का मूल्यांकन जांच क्षेत्र पर निर्भर करता है । हम प्रवाह cytometry, जो एक शक्तिशाली तरीका है कोशिका-चक्र जीवाणुओं के मापदंडों को मापने के लिए इस्तेमाल किया । यहाँ, प्रवाह cytometry से पता चला कि चयनित गुणसूत्र स्थिति (ओं) के DARS2, (यानी, DARS2 सम्मिलन wildtype DARS2 स्थिति के करीब) प्रतिकृति दीक्षा के सही नियमन के परिणामस्वरूप ( यानी, synchrony और डीएनए एकाग्रता). इष्टतम गुणसूत्र स्थिति (ओं) के लिए DARS2 के कारण भाग में उचित प्रतिकृति-संबद्ध जीन खुराक और भाग में अनुकूल स्थानीय जीनोमिक वातावरण है कि DARS2 समारोह4के लिए महत्वपूर्ण है के कारण चुना गया ।

यहां, एक गैर कोडिंग डीएनए तत्व की जांच की थी, लेकिन यह पसंद के किसी भी कोडन क्षेत्र को विस्तारित किया जा सकता है । एक ताजा अध्ययन में पाया गया कि जीन अभिव्यक्ति के स्तर विविध ~ ३००-गुना, गुणसूत्र पर अपनी स्थिति पर निर्भर करता है, प्रतिकृति के लिए स्पष्ट संबंध के बिना-संबद्ध जीन खुराक३८. दृष्टिकोण यहां वर्णित एक विशेष जीन के जीनोमिक स्थान के बीच संबंधों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि दे सकता है, अपनी transcriptional गतिविधि, और संबंधित स्वास्थ्य लाभ । इस सिद्धांत में जीनोमिक पदों के चयन के साथ सहायता कर सकता है, एक दिया जीन है, जो बारी में ब्याज की नई इंजीनियरिंग के लिए हो सकता है, संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए सुधार उपभेदों के मजबूत अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी ।

क्योंकि ई. कोलाई सीमित intergenic क्षेत्रों३९शामिल हैं, transposon सम्मिलन, ज्यादातर मामलों में, जीन बाधित (ओं). यह कभी भी झूठी सकारात्मक जहां फिटर क्लोन (एस) प्रश्न में आनुवंशिक तत्व की इष्टतम गुणसूत्र स्थिति के कारण नहीं चुना जाता है बना सकते हैं, बल्कि इसलिए कि एक जीन बाधित है-जो, अंय तरीकों से, के दौरान एक फिटनेस लाभ प्रदान करता है प्रतियोगिता प्रयोग4.

इस पद्धति का लाभ लेता है एक आसान उपयोग transposon प्रणाली है, जहां चुनाव के किसी भी क्षेत्र यादृच्छिक स्थानों पर एकीकृत किया जा सकता है । डिजाइन प्रतियोगिता प्रयोग के लिए शुद्ध विकास के अलावा अंय चयन बलों के किसी भी संख्या में शामिल संशोधित किया जा सकता है, के रूप में यहां देखा । सेटअप भी विशुद्ध रूप से तमिलनाडु पर आधारित होना संशोधित किया जा सकता है-Seq, जो WGS से सम्मिलन साइटों की एक बड़ी अनुक्रमण संकल्प पैदावार, यहाँ इस्तेमाल किया. इस निष्पक्ष दृष्टिकोण स्पष्ट रोमांचक नई सुविधाओं के लिए इस प्रकार में अब तक विलक्षण जीवों, जो दिखा सकता है कि आम प्रवृत्तियों Eubacteria के गुणसूत्र संगठन में मौजूद करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों के पास वित्तीय हित की कोई होड़ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक नोवो Nordisk फाउंडेशन, Lundbeck फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया, और डेनमार्क के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (DNRF120) बैक्टीरियल तनाव प्रतिक्रिया और हठ (बसप) के लिए केंद्र के माध्यम से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

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References

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आनुवंशिकी मुद्दा १२७ यादृच्छिक transposon प्रविष्टि पूल संस्कृति प्रतियोगिता इष्टतम जीनोमिक संदर्भ पूरे जीनोम अनुक्रमण आसान जीन घूमना सेल चक्र विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा
इष्टतम गुणसूत्र स्थान का निर्धारण (ओं) एक डीएनए तत्व के लिए एक उपंयास Transposon-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग कर <em>ई कोलाई</em> में
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Frimodt-Møller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Løbner-Olesen, A. Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach. J. Vis. Exp. (127), e55946, doi:10.3791/55946 (2017).

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