Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

Published: September 11, 2017 doi: 10.3791/55946
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

Summary

Здесь мощность transposon опосредованной случайные вставки элемента-кодирования ДНК использовался для разрешения его оптимального хромосомные положения.

Abstract

Оптимальной хромосомных позиции данного элемента ДНК была/были определены transposon опосредованной случайные вставки после отбора фитнес. В бактерии влияние генетических контекста на функции генетического элемента может быть трудно оценить. Ряд механизмов, включая топологических эффекты, транскрипционный анализ помехи от соседних генов, и/или репликации связанных генов дозировки, может повлиять на функции данного генетического элемента. Здесь мы описываем метод, который позволяет случайных интеграции элемента ДНК в хромосоме Escherichia coli и выберите наиболее благоприятных мест, с помощью простого роста конкуренции эксперимент. Этот метод принимает преимущество хорошо описано на базе transposon системы случайные вставки, в сочетании с выбором приспособленных clone(s) роста преимущество, процедура, которая легко регулируются для экспериментальной потребности. Характер приспособленных clone(s) может определяться всего генома на сложных мульти клоновых населения или легко гена, ходьба для быстрой идентификации отдельных клонов. Здесь без кодирования ДНК региона DARS2, которая контролирует инициации репликации хромосомы в E. coli, был использован в качестве примера. Функция DARS2 , как известно, быть затронуты дозировка репликации связанных генов; ближе DARS2 получает происхождения репликации ДНК, тем более активной становится. DARS2 случайно был вставлен в хромосоме DARS2-исключить деформации. Результирующая клоны, содержащие отдельные вставки были объединены и соревновались друг с другом для сотни поколений. Наконец приспособленных клоны были характерны и содержит DARS2 вставлены в непосредственной близости от первоначального места DARS2 .

Introduction

Функцию любого генетического элемента могут быть затронуты его расположение в геноме. В бактерии это главным образом результатом вмешательства по транскрипции соседних генов, местные ДНК топологии или репликации связанных генов дозировка. В частности процесс репликации ДНК и сегрегации находятся под контролем, по крайней мере в части, некодирующих хромосомных регионов1и правильного функционирования этих регионов зависит геномной местоположение/контекста. В E.coli, примерами являются сайт НСВРС , необходимые для сестра хромосомы резолюции2; КОПС последовательности, необходимые для хромосома сегрегации3; данных, DARS1и DARS2 регионов, требуется для надлежащей репликации хромосомных управления (ниже; 4). Мы представляем метод, позволяющий для случайного перемещения, выбора и определения оптимального генетических контекста любого данного генетического элемента, здесь свидетельствует исследование некодирующих региона DARS2 .

В E. coli, DnaA отвечает инициатор белка для открытия на одной репликации происхожденияОричстренге дна и для найма helicase DnaB5,6,7. DnaA принадлежит к AAA+ (т.е., ATPases, связанные с различными мероприятиями) белки и можно привязать АТФ и АДФ с аналогичными высокой работоспособностью5. УровеньАТФ DnaA пики на начало8, где DnaAСПС образует multimer на Орич что вызывает ДНК дуплекс открытия9. После посвящения Орич производится механизм связывания белка SeqA, чтобы hemimethylated временно недоступен для повторного запуска из-за поглощения Орич10,11. Во время связывания, уровень DnaAАТФ снижается, по крайней мере два механизма: регулирования инактивации DnaA (RIDA)12,13 и данных-зависимых DnaAСПС гидролиз (DDAH)14 ,15. Рида и DDAH способствуют преобразование DnaAСПС DnaAADP. До нового раунда посвящения, DnaAADP повторную активацию с DnaAАТФ в специфических последовательностей реактивации DnaA (DARS): DARS1 и DARS216,17. Хромосомная данных, DARS1и DARS2 регионах некодирующих и действовать шаперонов как для модуляции DnaAАТФ/DnaAADP взаимное преобразование. Эти районы, расположенные за пределами происхождения репликации, чтобы Ассамблея DnaA комплекс либо инактивация (данные; 14) или активации (DARS1 и DARS2; 17) из DnaA. Удаление DARS2 в клетке не меняет массы удвоение время, но результаты асинхронной репликации начало15,16,18. Однако DARS2-дефицит клетки имеют фитнес стоимость по сравнению с иначе isogenic wildtype во время обоих непрерывного роста конкуренции в богатой среде или создания колонизации кишечника мыши18. Это означает, что даже незначительные изменения в концентрации асинхронности/происхождения имеют негативное воздействие на бактериальных фитнес. В E. coliсуществует селективного давления для поддержания хромосома симметрии (т.е. два почти одинаковой длины оружия репликации)19. Данных, DARS1и DARS2 регионы имеют же относительное расстояние до Орич всех E. coli штаммов виртуализированных18, несмотря на большие различия в размер хромосомы.

Здесь мы используем DARS2 региона кишечной палочки в качестве примера для выявления хромосомных положении(ях), оптимальный для его функции. DARS2 был вставлен в NKBOR transposon и результирующая NKBOR::DARS2 transposon, впоследствии вставлены случайно в геном MG1655 ΔDARS2. Таким образом, мы создали коллекцию ячеек, каждый обладающий DARS2 размещены в другом месте на хромосоме. В vitro конкуренции эксперимент, где все клетки в коллекции были объединены и соревновались друг с другом во время непрерывного роста в LB для примерно 700 поколений, была выполнена. Итоги конкурса эксперимента мониторинг/определялся с помощью Южная помарка, легко гена ходьбу и всего генома (РГ; Рисунок 1). Концевой клоны, решаются ходьба легко гена характеризовались проточной цитометрии для оценки параметров клеточного цикла. В анализе гранулярных потока размер ячейки, содержание ДНК и инициации синхронии может измеряться для большого числа клеток. При проточной цитометрии, поток одиночных клеток проходит луч света соответствующей длины волны для возбуждения окрашенных ДНК, которая затем одновременно зарегистрирована в photomultipliers, которые собирают испускаемого флуоресценции, мера содержания ДНК, условии клетки витражи для ДНК. Рассеянном свете является мерой массы клеток20.

В vitro конкуренции эксперимент, который мы представляем здесь используется для решения вопросов, касающихся важности хромосомных позиции и геномных контексте генетического элемента. Метод объективной и легко в использовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Коллекция библиотеки Transposon

Примечание: хромосомном локусе DARS2 был клонирован в мини-Tn 10-на основе transposon, NKBOR (на pNKBOR) 21, что приводит к NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR можно получить онлайн 22. pNKBOR — на основе R6K самоубийства вектор, который требует инициатор белка π для репликации 23. Поэтому плазмида pJFM1 способен воспроизвести в штамм E. coli (например, Dh5α, Пир λ), содержащий копию хромосомных генов Пир. Однако, когда pJFM1 преобразуется в пир недостаточным wildtype MG1655, pJFM1 не может реплицировать, приводит к выбору канамицин устойчивостью клонов, порожденных случайных вставок NKBOR:: DARS2 в бактериальной хромосоме. Для простоты они называются DARS2 вставки. Смотрите Рисунок 1 для схематическое изложение методологии.

  1. Δ electrocompetent MG1655 подготовить DARS2 от активно растущих клеток в Lysogeny бульон (LB) выросли на 37 ° C 24.
  2. Electroporate pJFM1 в electrocompetent MG1655 Δ DARS2, согласно Гонсалес и др. 24
    1. Добавить 1 мкг pJFM1 (в 1 мкл воды) до 40 мкл electrocompetent E. coli MG1655 Δ DARS2 и передать эту смесь предварительно охлажденных, стерильные разрыв 0,2 см кювета. Вставьте кювета в зале электропорации. Electroporate в 18 кв, 500 Ω и 25 МКФ; Постоянная времени должно быть ~5.0 мс, и дуги не должно происходить.
    2. Быстро восстановить бактериальных подвеска, resuspending в 1 мл подогретым LB отвара и передачи в 15 мл пробирку.
    3. Позволяют восстановить путем инкубации пористый роста условиях при 37 ° C за 30 минут, без антибиотика выбора ячейки. Пластина бактерий на плиты агара LB дополнена 50µg/мл канамицин и инкубировать при 37 ° C ночь и.
  3. Подсчета колоний от электропорации: одна колония считается равным одной вставки хромосомных transposon.
    Примечание: Колонии могут быть отнесены на глаз или с счетчиком колонии. Количество колоний пропорциональна среднее расстояние, разделяющее транспозоны, расположенный в хромосоме каждого клона.
  4. Добавить 1 мл LB отвара для каждой пластины и смыть все колонии; 1 мл LB отвара должно быть достаточно для смыть ~ 100000 колоний. Повторное использование же 1 мл LB отвара для увеличения бактериальных концентратов. Объединить всех колоний в том же Тюбик 50 мл.
  5. Вихревой трубе и заморозить Пуск материала (t = 0). Чтобы заморозить, смешайте 1 мл суспензии клеток с 1 мл 50% глицерина на льду. Передача трубки сухим льдом за 10 мин. После замораживания культур, перенести их в морозильник-80 ° С.
    Примечание: На данном этапе ожидается концентрации клеток как минимум 50000 кое/мл.

2. Конкурс эксперимент в LB

  1. оттепели transposon библиотеки от-80 ° C на льду. Микс, закупорить.
  2. Передачи 100 мкл transposon библиотеки до 10 мл фунтов в 15 мл пробирку.
  3. Рост клеток, пористый, постоянно встряхивая (250 об/мин), за 8 ч при 37 ° C для стационарной фазы (то есть, ОД 600 = ~ 4.0). Настроить эти параметры для роста различных условий, по желанию.
  4. Распространение бактериальной населения путем непрерывной передачи в свежие подогретую среднего каждые ~ 10 поколений. Сделать это путем передачи 10 мкл культуры предыдущих стационарной фазы до 10 мл свежего фунтов и расти еще 8 ч для стационарной фазы (то есть, ОД 600 = ~ 4.0).
    Примечание: Как начало и конец оптической плотности совпадают, кратное разрежения соответствует ~ 10 поколений роста (2 10 = 1024). Бактериальная популяция можно либо передаются непосредственно в свежие подогретую среднего или сохранены на 0-4 ° C (на льду) и распространяются на следующий день. LB здесь используется для обеспечения как много клеточных удвоений в кратчайшие сроки (удвоение время недалеко от 22 min).
  5. После каждого 100 поколений конкуренции, сохранить пять образцов 1 мл-80 ° c (как описано в шаге 3.3).
  6. Если Фитнес различия между ячейками, содержащими вставок отдельных transposon, как ожидается, будет небольшой, сохранить продолжительность конкурса долго; здесь, 700 поколений (t = 700) были использованы.

3. Южный блот анализ следить за конкуренции эксперимент над времени

  1. подготовить зонд для южных блот (раздел 1-kb NKBOR), выполняя полимеразной цепной реакции (ПЦР) усиление с помощью конкретных грунты: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat и NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. Инкубировать на 98 ° C за 30 s для первоначального денатурации. Затем выполните 35 циклов на 98 ° C 10 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 45 s. Для окончательного расширения, используйте 72 ° C для 10 мин
      Примечание: Шаблон для реакции PCR был очищенный pNKBOR плазмиды 21.
    2. Ярлык фрагмента результирующего ПЦР с [α - 32P] dATP, с использованием системы случайного праймера, согласно Смит 25.
  2. Подготовить общее клеточной ДНК согласно Løbner-Олесен и фон Freiesleben 26 t = 0 и отдельных пунктов до t = 700, по оценкам поколений конкуренции.
  3. Дайджест всего клеточной ДНК с Pvu я, который режет NKBOR, содержащие региона интерес один раз только в регионе, не охватываемых зонд; 1 единица Pvu я может использоваться для полностью дайджест 1 мкг субстрат ДНК.
    Примечание: Датчик распознает фрагменты, содержащие часть transposon, наряду с хромосомной ДНК различных длин, в зависимости от вставки сайт.
  4. Выполнять Южная помарка, используя 0,7% агарозном геле согласно Løbner-Олесен и фон Freiesleben- 26.

4. Выявление сильнейших клонов

  1. легко гена использования ходить, как описано в Харрисон и др. 27, для выявления DARS2 вставки сайты из одного клонов (изолированные на тарелках LB) после 700 оценкам поколений конкуренции; больше полос на Южная помарка, больше изолирует необходимы для покрытия всех вставок transposon.
    1. Изолировать genomic дна PCR шаблона. Распространение бактерий на плите агар LB содержащие 50 мкг/мл канамицин и инкубировать и при 37 ° C на ночь. Расти одной колонии на ночь в LB отвара при 37 ° C и впоследствии перевести 20 мкл в 200 мкл газобетона дистиллированной воды (или использовать ДНК очистки, как в шаге 3.2).
      1. Vortex смешивать. Нагреть смесь на 100 ° C, в 10 мин и центрифуги на Макс скорость на 5 мин, за исключением клеток lysate при-20 ° C для использования в будущем.
    2. Дизайн три вложенных Праймеры для отжига в пределах transposon выбора (см. рис. 2 для графического представления стратегии ПЦР).
      Примечание: Проектирование вложенных грунты следует обеспечить, что вложенные грунт 3 находится ближе всего к известным 5 ' конец transposon ДНК, следуют вложенных грунтовки 2 и 1. Расстояние между вложенными грунт 3 и 5 ' конец известных transposon ДНК должно быть достаточно для сквозного последовательности из известных ДНК неизвестных ДНК (чтобы найти конкретные хромосомных transposon вставки сайт). Для NKBOR были использованы следующие вложенные грунты: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg и pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Используются также случайных праймеров, содержащие признание сайты известных энзимов ограничения. Для обеспечения результата, следует использовать по крайней мере два различных случайных праймеров. Ограничение места для энзимов ограничения (e.g.,Sau 3AI и Хин dIII) должны быть расположены на 3 ' конец и предшествует десяти случайных баз так что 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' и 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' являются праймеры содержащие САУ 3AI сайта (GATC) и Хин dIII сайта (AAGCTT), соответственно, где N = A, T, G или C.
    3. Использование 200 ng геномной ДНК в 20 мкл реакции PCR. Инкубируйте на 98 ° C за 30 s для первоначального денатурации. Выполнение 25 циклов в 98 ° C за 30 s, 50 ° C 15 s и 72 ° C на 4 мин. Для окончательного расширения, используйте 72 ° C для 10 минут использования грунтовки пар состоящий из вложенных грунтовка 1 и один из случайных праймеров.
    4. Использовать грунт пары состоящие из вложенных 2 праймера и же случайные грунт от второго амплификация, используя 1 мкл своей предыдущей реакции как шаблон.
    5. Повторите шаг 4.1.4 парами грунт, состоящий из вложенных грунт 3 и же случайного праймера.
    6. Запуск продуктов из окончательной реакции PCR на 1,5% агарозном геле и пятно бромидом ethidium. Вырезать полосы в диапазоне 100-800 bp и изолировать ДНК, используя любой коммерческой ДНК гель, извлечение комплект по заявлению производителя ' направлении. Ресуспензируйте ДНК в 15 мкл воды.
      Примечание: осторожно. Бромид ethidium токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
    7. Последовательности группы, изолированные на предыдущем шаге (шаг 4.1.6), с вложенными грунт 3 как последовательность праймера, используя Сэнгер секвенирования коммерческого поставщика.
  2. Выполняют WGS.
    1. Выполнить РГ на ДНК извлеченные из всего выбранных образцов, собранных в ходе конкуренции эксперимента, как описано в Frimodt-Моллер et al 4.
  3. Анализ последовательности.
    1. Выровнять паре конец читает 150 НС, прилегающих к NKBOR, AF310136.1 1,904 … 2204, используя Bowtie2 28 с интервалом между семян подстрок (S, 1, 1.15) и максимальное количество неоднозначных символов (L 0, 0,9).
    2. Выберите соответствие читает и затем повторно выравнивать к обоим MG1655 ref | NC_000913.3 и NKBOR gb | AF310136 с использованием blastN 29
    3. назначить транспонирования позиции вставки на перекрестках MG1655-NKBOR.

5. Проточная цитометрия

  1. собирать образцы для проточной цитометрии.
    1. Баланс каждой культуры, поддерживая его в фазе экспоненциального роста по крайней мере 10 поколений. Проверьте ОД 600 и убедитесь, что он никогда не превышает 0,3.
    2. Собирать два типа потока проб.
      1. На риф биение, передачи 1 мл культуры 15 мл, содержащих 30 мкл риф-CEF (300 мкг/мл рифампицин и цефалексин 36 мкг/мл, растворенных в 12,5 мм NaOH). Оставить его при 37 ° C для минимум 4 часа тряски.
        Примечание: Рифампицин косвенно блокирует инициации репликации хромосомы, позволяя при этом для текущего раунда репликации продолжать прекращения. Цефалексин предотвращает деление клеток, что приводит к репликации биение (RIF-биение) и накопления клеток с полностью реплицированные хромосомы. Количество полностью реплицированных хромосом равен числу происхождения во время лечения с рифампицин и цефалексин- 20.
      2. EXP - пример передачи 1 мл экспоненциально растущей культуры до 1,5 мл на ДВС.
  2. Исправить клетки следующим образом. Урожай клетки центрифугированием на 15000 x g 5 мин на 4 ° C. Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл ледяной 10 мм трис рН 7,5 и добавьте 1 mL ледяной 77% этанола. Хранить образцы на 4 ° C до использования.
  3. Пятно следующим клетки. Урожай 100-300 мкл фиксированные клетки центрифугированием на 15000 x g 15 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 130 мкл " окрашивание ДНК раствор " (90 мкг/мл mithramycin, 20 бромид ethidium мкг/мл, 10 мм 2 MgCl и 10 мм трис pH 7.5). Поместите образцы на льду и в темноте; образцы готовы для анализа потока cytometry после 10 мин
    Примечание: Другие ДНК пятна чем бромид ethidium и mithramycin также может быть использоваться 30 , 31.
  4. Определить происхождение клеток, относительная масса, и относительное содержание ДНК путем анализа потока цитометрии.
    1. Выполнения проточной цитометрии, как описано выше 32. Риф биение и EXP-образцы с использованием потока цитометр производитель ' s инструкции . Для mithramycin - и ethidium бромид окрашенных клеток, использовать возбуждение волн 395 и 440 Нм и собирать флуоресценции выше 565 Нм.
      1. Для определения относительной массы и относительной ДНК содержимое ячейки, запуска EXP-образцы для получения одного параметра вперед свет разброс против ячейку число гистограмм и интенсивности флуоресценции против ячейки номер гистограммы для минимум 30 000 событий соответствующий сигнал клетки.
      2. Использование рассеянном сингл параметр распределения света для измерения средней относительной ячейки Массачусетс
        Примечание: Рассеянном свете является мерой Средняя ячейка массы 20.
      3. Использование флуоресценции интенсивности одного параметра распределений для измерения средней ДНК контент- 20.
      4. Получения концентрации ДНК как отношение среднего содержания ДНК в среднем клетки массы 20.
    2. Определить количество происхождение в клетку.
      1. Бежать риф биение образцы для получения интенсивности флуоресценции сингл параметр против сотовый номер гистограммы для минимум 30 000 событий, соответствующий сигнал клетки.
      2. Использование флуоресценции интенсивности одного параметра распределений для определения числа хромосом в каждой ячейке 20.
  5. Рассчитать индекс асинхронности (Ai).
    1. Calculate ии, как описано в Løbner-Олесен и др. 32, используя дистрибутивов один параметр интенсивности флуоресценции риф биение образцов и формула Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 f4 + f8), где fx является фракция клетки с x количество полностью реплицированные хромосомы. Рассмотреть возможность посвящения асинхронных когда A > 0.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Южная помарка было сделано, чтобы убедиться, что DARS2 был распространен случайным образом хромосомы в библиотеке transposon (t = 0) и что со временем будет сохраняться приспособленных клонов. Южная помарка была выполнена на ДНК, извлеченные из первоначального transposon бассейн (при t = 0) и каждый примерно 100 из 700 поколений конкурса (рис. 3). Здесь было всего клеточной ДНК каждой точки время переваривается с Pvuэнзима ограничения, известный для резки transposon NKBOR::DARS2 один раз только в регионе, не охватываемых зонд. Южная помарка был исследован с радиоактивно помечены фрагмент ДНК дополняет частью NKBOR. Как видно из рис. 3, первоначальный DARS2 бассейн (t = 0) не хватает различных банд, которые показывает, что DARS2 был случайно включен всей хромосомы. Со временем картина где первоначальный большой бассейн DARS2 клонов превратился только одного или нескольких упорствуя DARS2 клонов (рис. 3; t = 0 до t = 700).

В этом примере показано DARS2 вставки сайты от конкуренции эксперимента были определены с использованием WGS и легко гена пешком. Здесь, РГ была использована для выявления вставки сайты от запуск пула (t = 0) и после 300, 400 и 700 поколений конкуренции. Обратите внимание, что освещение в настоящий глубокий последовательности недостаточно для полного сопоставления вставки объектов в t = 0; Однако это дает представитель подмножество общее количество вставок. WGS подтвердил Южная помарка результат (то есть, подбор сильнейший DARS2 клонов), заканчивая приблизительно 98% всех DARS2 вставки близко к wildtype DARS2 хромосомных местоположение (DARS2 Клон ИК и клон rppH), в то время как оставшиеся 2% были в другом месте на хромосоме (рис. 4). Это наводит на мысль что wildtype позиция является оптимальным для функции DARS2 . При t = 400, операция вставки была найдена на противоположной рукой репликации с почти идентичными расстояние до Орич как wildtype DARS2 положение (рис. 4), но этот вставки не была восстановлена после 700 поколений. Таким образом репликация связанных генов дозировка не может быть единого определитель для оптимальной позиции.

Пешком легко гена была использована для выявления DARS2 вставки сайты в одной клоны, изолированные после 700 оценкам поколений конкуренции. Здесь были определены два DARS2 вставки сайтов, упомянутых выше ( rppHIRDARS2 клон и клон). Пешком легко гена было сделано только на 20 клонов, и это объясняет, почему все DARS2 вставки, сайты, сопоставленный в РГ не были определены. DARS2-дефицит клетки были показаны ранее инициировать репликацию в асинхронности и иметь снижение концентрации происхождения по отношению к wildtype клеток4,16,17, 18. Мы поэтому используется проточной цитометрии для разрешения синхронности в инициации репликации и сотовых происхождения содержание ДНК для двух отдельных штаммов (DARS2 клон ИК и клон rppH), которые, в обоих случаях были восстановлены wildtype уровни (рис. 5). Представитель пример штамма, обладающих одной копии DARS2 расположен в конечной показан (5 рисунокE). Здесь, присутствие DARS2 элемента в конечной не синхронно или восстановить сотовой происхождения содержание wildtype уровней, в то время как выбранный DARS2 клоны ИК и rppH делать.

Figure 1
Рисунок 1 : Обзор методологии. Схематическое представление методологии. Хромосомная региона DARS2 клонирован в mini Tn10 на pNKBOR, создавая pJFM1. pJFM1 превращается в E. coli MG1655 ΔDARS2, который вызывает случайные вставки DARS2 связан с Tn10 на хромосоме E. coli MG1655 ΔDARS2. Около 70000 клоны, каждый из которых содержит различные хромосомных DARS2 вставки, были объединены и непосредственно конкурировали друг с другом в LB отвара при 37 ° C. Эксперимент прямой конкуренции в LB отвара была исполнена для примерно 700 поколений, где образец был выделен для каждого 100 поколений прямой конкуренции. Общая ДНК извлеченные из каждого изолированного образца и используемых WGS Южный blotting и идентификации DARS2 вставки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Графическое представление пешком легко гена. Этот рисунок иллюстрирует шаблон геномной ДНК неизвестных последовательности ДНК, прилегающих к известной последовательности с сайтами грунтовки для случайного праймера и вложенные грунтовки 1, 2 и 3. Результаты трех последовательных амплификаций, выполняются три разработан вложенных праймеры приводятся ниже. Конечного продукта (от 3-й раунд) применяется с помощью вложенных грунт 3. Эта цифра была адаптирована из Харрисон и др. 27. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Южная помарка зондируемой для NKBOR. Южная помарка анализ DARS2 вставок в DARS2-дефицит штамма. Геномная ДНК извлечено от каждого поколения ~ 100 прямой конкуренции, начиная с t = 0 и заканчивая 700 поколений, были переваривается с Pvuя и гель фракционированный. Пятно было гибридизированных с NKBOR зонд (см. протокол). t указывает количество поколений конкуренции. Эта цифра была адаптирована из Frimodt-Мёллер и др. 4. HMW и LMW являются высокомолекулярный вес и низкий молекулярный вес ДНК, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Графическое представление метоЭд transposon вставки сайтов в ΔDARS2. Позиции Орич, указаны данные, DARS1, DARS2 и terC . DARS2 вставки сайтов в ΔDARS2 при t = 0 (черные полосы), t = 400 (светло синие столбики), t = 500 (красные столбики) и t = 700 (зеленые бары), решена путем полного генома. Этот показатель был сделан с использованием DNAPlotter33 и был адаптирован от Frimodt-Моллер et al. 4. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Представитель потока цитометрии гистограммы transposon узлов, найденных при ходьбе легко гена при t = 700. Клетки были выращены в AB минимальный средний с 0,2% раствор глюкозы, 10 мкг/мл тиамина и 0,5% кислот casamino в 37 ° C. Wildtype и ΔDARS2 указаны в A и B, соответственно. Производные wildtype штамма MG1655 лишена DARS2 на оригинальные Локус и вместо проведения копию DARS2 на решена transposon сайта rrpH, ИК и конечной (terC) указаны в C, D и E, соответственно. Эта цифра была адаптирована из Frimodt-Мёллер и др. 4 чтобы показать место DARS2 , что результаты в клеточный цикл аномалия (terC) или что восстанавливает wildtype фенотип(rrpH, IR). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методология, используемая здесь преимущества методов ответить трудный вопрос относительно оптимального геномной положение генетического элемента. Случайные вставки генетического элемента, (при посредничестве transposon) позволяет быстро и легко коллекция из тысяч клонов, которые затем могут быть сделаны конкурировать друг с другом, чтобы выбрать для оптимального положения элемента исследуемого генетических (т.е. приспособленных клон).

Здесь, DARS2 был вставлен в мини Tn10-на основе transposon, NKBOR. Выбор transposon имеет важное значение для вниз по течению анализа сайтов вставок. В экспериментах последовательности (TraDIS) transposon направленных вставки сайт, например мини Tn5км234 и более популярным выбором, химар были использованы несколько различных транспозонов Маринер transposon35, 36 (для недавнего обзора этого, увидеть Ван Opijnen и Камилли36). Мы нацелены на 70000 первоначальный случайных вставок DARS2, который дает примерно DARS2 вставки Эверт 65 bp в геном MG1655. Это легко может корректироваться путем уменьшения или увеличения первоначальный пул колоний собраны.

Здесь мы выбрали для непрерывной передачи в LB пакетного культур, но эксперимент конкуренции также могут быть выполнены в другой среде или в различных условиях, в том числе с использованием chemostat37. Кроме того процедура может быть изменен для размещения каких-либо условий выбора, в том числе различных напряжений, например окислительного, осмотической или антибиотик стресса. Чтобы проверить наличие сохраняющихся клонов с течением времени, можно сделать по крайней мере три вещи: WGS; transposon последовательности (Tn-Seq); или, как здесь, Южные помарки. Наконец легко пешком гена может быть сделано на несколько клонов, с последующим преимуществом, что transposon вставки сайты идентифицируются в одном клоны, таким образом, что влияние конкретных вставки сайт могут анализироваться фенотипически.

Выбор фенотипического анализа для оценки результатов эксперимента конкуренции зависит от исследуемого региона. Мы использовали проточной цитометрии, который является мощным методом измерения параметров цикла клетки бактерий. Здесь проточной цитометрии показали, что выбранный хромосомных позиции(й) DARS2, (то есть, DARS2 вставки близко к wildtype DARS2 позицию) привели к правильного регулирования (инициации репликации то есть, синхронность и концентрации ДНК). Оптимальное хромосомных позиции(й) для DARS2 были выбраны в части должной дозировке надлежащей репликации связанных генов и частично из-за благоприятной местной окружающей среды геномной, которая имеет важное значение для функции DARS2 4.

Здесь элемент-кодирования ДНК было проведено расследование, но это может быть расширена для любой кодирвоания выбора. Недавнее исследование показало, что уровень экспрессии генов разнообразны ~ 300-fold, в зависимости от ее позиции на хромосоме, без четких корреляций для репликации связанных генов дозировка38. Подход, описанный здесь может дать важные понимание взаимосвязи между геномной расположение определенного гена, транскрипционный анализ деятельности и добротность преимущество. В теории это может помочь с выбором геномной позиций, ведущих к сильнее выражение данного гена, который в свою очередь может представлять интерес для инженерных новые, улучшенные штаммов для производство рекомбинантных белков.

Потому что E. coli содержит ограниченное intergenic регионов39, transposon вставки в большинстве случаев, нарушит gene(s). Это иногда может создавать ложных срабатываний, где приспособленных clone(s) не выбран благодаря оптимальной хромосомных положение генетического элемента в вопросе, но скорее потому, что нарушается ген - который, другими способами, обеспечивает преимущества фитнес во время Конкурс эксперимент4.

Это методология принимает преимущество системы easy-to-use transposon, где любой регион выбора может быть интегрированы наугад местах. Дизайн конкурс эксперимент может быть изменен включить любое количество выделения сил помимо чистого роста, как показано здесь. Программа установки также могут быть изменены основываться исключительно на Tn-Seq, который дает большее разрешение последовательности вставки сайтов чем WGS, используемый здесь. Это непредвзятый подход следует использовать для выяснения новые захватывающие возможности таким образом далеко uncharacterized организмов, которые могут показать, что общие тенденции существуют в хромосомном Организации эубактерии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют не конкурирующие финансового интереса.

Acknowledgments

Авторы были финансируемых за счет грантов из Ново Нордиск фонд, Фонд Lundbeck и датский национальный исследовательский фонд (DNRF120) через центр для бактериальных реакции на стресс и настойчивость (BASP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
  2. Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
  3. Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
  4. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
  5. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
  6. Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
  7. Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
  8. Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
  9. Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
  10. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
  11. Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
  12. Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
  13. Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
  14. Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
  15. Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
  16. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
  17. Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
  18. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
  19. Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
  20. Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
  21. Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
  22. SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
  23. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  24. Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
  26. Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
  27. Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
  28. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  29. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  30. Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
  31. Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
  32. Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
  33. Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
  34. Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
  35. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  36. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  37. Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
  38. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).

Tags

Генетика выпуск 127 случайных transposon вставки бассейн культуры конкуренции оптимальный геномной контексте всего генома легко гена ходьба анализ клеточного цикла подачей cytometry
Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в <em>Escherichia coli</em> с помощью Роман Transposon опосредованный подход
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frimodt-Møller, J., Charbon,… More

Frimodt-Møller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Løbner-Olesen, A. Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach. J. Vis. Exp. (127), e55946, doi:10.3791/55946 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter