我们描述了在行为小鼠中利用光遗传学和电生理记录技术选择性操控海马θ振荡（5-10 Hz）的方法。节律性同步的效果通过局部场电位进行监测。结合光遗传学与药理遗传学抑制手段，可研究海马同步活动的传出效应。
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本文内容
摘要
摘要
大量关于神经网络振荡与行为之间关系以及跨脑区神经元放电组织的数据，迫切需要开发新工具以选择性地操控脑节律。本文介绍一种将投射特异性光遗传学与细胞外电生理记录相结合的方法，可在自由活动的小鼠中高保真地控制海马θ振荡（5–10 Hz）。该光遗传性同步化具有高度特异性，其机制在于将通道视紫红质-2（ChR2）靶向定位至内侧隔核中的GABA能神经元群体——这类神经元在海马θ振荡的产生中起关键作用，并在海马内局部同步激活一部分抑制性隔核传入纤维。通过同步记录CA1区各层的局部场电位（LFP）和/或神经元放电活动，可验证光遗传节律控制的有效性。利用这一易于实施的实验体系，我们展示了多种光遗传刺激方案在诱导θ振荡以及调控其频率和规律性方面的有效性。最后，将θ节律控制与投射特异性抑制相结合，可用于研究特定传出脑区对海马同步化信息的读取方式。
引言
哺乳动物的神经元活动由网络振荡协调，这些振荡有助于脑区内部及脑区之间的信息传递1,2,3,4。脑节律包括从极慢（< 0.8 Hz）到超快（> 200 Hz）频率范围内的各种振荡。大量证据表明，网络振荡参与多种脑功能，包括认知功能5,6,7,8,9,10、先天行为11,12，以及帕金森病和癫痫等神经精神疾病13,14,15。因此，选择性且时间上精确操控网络振荡的实验方法，对....
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方案
使用10至25周龄的PV-Cre基因敲入雄性小鼠59。小鼠饲养于标准动物设施条件下，维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环。所有实验操作均遵循国家和国际指南，并经当地卫生主管部门批准 （北莱茵-威斯特法伦州自然保护、环境与消费者保护局）。
1. 病毒注射
- 在整个实验过程中，遵循生物安全指南60穿戴实验服、外科口罩、发网和两副手套。
- 用无菌手术刀或剪刀将管路切割至约1米长度，插入泵的注射器固定块中并固定。
- 使用注射器将硅油完全填充至导管中。
- 检查管路中是否出现气泡。若观察到气泡，请再次用油重新填充管路。
- 将柱塞固定到推块上。
- 缓慢推动推进器，使其朝向注射器固定块移动，直至柱塞尖端接触管路。
- 将推杆尖端插入管路中，并通过选择以低速自动向前移动推进块 "灌注" 在命令窗口中设置较低的输注速率（例如，500 nL/min）直至到达注射器固定块。
- 准备注射针头（34G）。
- 使用连接切割盘的精密钻机/研磨机进行清晰切割，移除针座。如有必要，使用针头清除新切割表面的金属残留物。
- 将毛细管（3-4 cm 长....
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结果
如第1节所述，将ChR2靶向定位至MS中GABA能细胞的过程如图所示 图 2A. 通过植入CA1区上方的光纤对背侧海马中MS GABA能细胞的轴突进行光遗传学刺激，可在同侧（图2B）以及对侧半球（图2C）。theta振荡可能以不同效率被光遗传学刺激所同步图 3A），其有效性在每个记录时段内通过刺激频率附近的相对θ波局部场电位功率进行计算， 即，同步保真度（图3B。同步保真度高于 0.3， 即，约80%的记录时段中观察到该现象，高于自发性暗光记录中的情况。非θ频率的光刺激效果较差（图3C).
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讨论
在此，我们介绍了一种广泛适用的方法，用于在行为动物中诱导并引发海马θ振荡。该方法可为研究θ节律在信息处理和行为中的功能提供帮助。该方法的关键要素包括：（1）选择合适的视蛋白，并将ChR2靶向定位至海马中的MS细胞轴突；（2）植入式光纤-电极阵列组件具备稳定的光学与电学特性，以确保在行为小鼠中持续进行光刺激和局部场电位（LFP）记录；（3）在θ频率下施加适量的光照；（4） 事后检验 量化节律同步的保真度，以及(5) 光电伪迹的控制。
第一个要点的主要注意事项是进行安全的病毒注射，同时避免损伤位于内侧的静脉丛。该步骤若手术操作不当，可能降低注射成功率，并可能延迟结果的获取。应考虑视蛋白的动力学特性，例如ChR2（激活时间：2 ms，失活时间：9 ms65）。第二个要点要求在植入前控制光传输的保真度以及记录电极的阻抗，通常还需及时制备额外的植入装置以提高实验成功率。
第三个考虑因素在旨在进行大规模环路操控的光遗传学实验中较为常见，涉及光源和光学连接，通过直径为100 .......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Maria Gorbati在数据分析方面的专业帮助，以及Jennifer Kupferman对稿件的评论。本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG；Exc 257 NeuroCure，TK和AP；优先计划1665，1799/1-1(2)，海森堡计划，1799/2-1，AP）、德国-以色列科学基金会（German-Israeli Foundation for Scientific Research and Development，GIF；I-1326-421.13/2015，TK）以及人类前沿科学计划（Human Frontier Science Program，HFSP；RGY0076/2012，TK）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PV-Cre 小鼠 | 杰克逊实验室 | B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 手术 | |||
| 立体定位仪 | David Kopf Instruments，Tujunga，美国加利福尼亚州 | Model 963 | 超精密小型动物立体定位仪 |
| 钻头，0.8 mm | Bijoutil，Allschwil，瑞士 | 49080HM | |
| 0.01–1 ml 注射器 | Braun，Melsungen，德国 | 9161406V | |
| Sterican 套管 | Braun | 26 G，0.45×25 mm BL/LB | |
| 精细锋利剪刀 | Fine Science Tools Inc.，Vancouver，加拿大 | 14060-09 | |
| 镊子 | Fine Science Tools Inc. | 11210-10 | Dumont AA - 环氧涂层镊子 |
| 钝头不锈钢剪刀 | Fine Science Tools Inc. | 14018-14 | |
| 焊接站 | Weller Tools GmbH，Besigheim，德国 | WSD 81 | |
| 红霉素 | Rotexmedica GmbH，Trittau，德国 | PZN: 10823932 | 1g 注射用溶液粉末 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 光遗传学 | |||
| Hamilton 泵 | PHD Ultra，Harvard Apparatus，Holliston，美国马萨诸塞州 | model 703008 | 带推拉机制的 PHD Ultra 注射泵 |
| Hamilton 5 µL 注射器，26 规 | PHD Ultra，Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
| Hamilton 5 µL 推杆 | PHD Ultra，Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
| 管路 | Fisher Scientific，Pittsburgh，美国 | PE 20 | 内径 0.38 mm (.015")，外径 1.09 mm (.043") |
| Sterican 套管 | Braun，Melsungen，德国 | 27 G，25×0.40 mm，钝头 | |
| 精密钻/磨机 | Proxxon，Wecker，卢森堡 | fbs 240/e | |
| 切割盘 | Proxxon | NO 28812 | |
| Cre 依赖性通道视紫红质 | 宾夕法尼亚大学载体中心，费城，美国宾夕法尼亚州 | AV-1-18917P | 构建名称：AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato，滴度：1.42×10¹³ vg/ml |
| Cam 激酶依赖性盐视紫红质 | 宾夕法尼亚大学载体中心 | AV-1-26971P | 构建名称：eNpHR3.0，AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH，滴度：2.08×10¹² vg/ml |
| 多模光纤 | ThorLabs，Dachau，德国 | FG105LCA | 0.22 NA，低-OH，Ø105 µm 芯径，400–2400 nm |
| 陶瓷插针套管 | Precision Fiber Products，Milpitas，美国加利福尼亚州 | CFLC126 | 陶瓷 LC 多模套管，内径 126 µm |
| 抛光纸 | Thorlabs | LF3D | 6" × 6" 金刚石研磨（抛光）片 |
| 功率计 | Thorlabs | PM100D | 紧凑型功率和能量计主机，数字 4" LCD 显示屏 |
| 多模光纤耦合器 | Thorlabs | FCMM50-50A-FC | 1×2 多模耦合器，50:50 分光比，50 µm GI 光纤，FC/PC 接口 |
| 光纤跳线 | Thorlabs | FG105LCA CUSTOM-MUC | 定制，3 米长，带保护套管，套管：FT030，连接器 1：FC/PC，连接器 2：1.25 mm (LC) 陶瓷插针 |
| 套筒 | Precision Fiber Products，Milpitas，美国加利福尼亚州 | ADAL1 | 用于 Ø1.25 mm (LC/PC) 插针的陶瓷分体式对接套筒 |
| 473 nm DPSS 激光器 | Laserglow Technologies，Toronto，加拿大安大略省 | R471005FX | LRS-0473 系列 |
| 593 nm DPSS 激光器 | Laserglow Technologies | R591005FX | LRS-0594 系列 |
| MC_Stimulus II | Multichannel Systems，Reutlingen，德国 | STG 4004 | |
| 阻抗调节模块 | Neural microTargeting worldwide，Bowdoin，美国 | ICM | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 电生理学 | |||
| 钨丝 | California Fine Wire Company，Grover Beach，美国加利福尼亚州 | CFW0010954 | 40 µm，99.95% |
| 毛细管 | Optronics | 1068150020 | 内径：100.4 µm |
| Omnetics 纳米连接器 | Omnetics Connector Corporation，Minneapolis，美国 | A79038-001 | |
| 螺钉 | Bilaney，Düsseldorf，德国 | 00-96x1/16 | 不锈钢 |
| 硅胶探针 | NeuroNexus Technologies，Ann Arbor，美国密歇根州 | B32 | |
| 前置放大器头级 | Neuralynx，Bozeman，美国蒙大拿州 | HS-8 | 微型前置放大器头级，单位增益 |
| 导电银漆 | Conrad electronics，德国 | 530042 | |
| 液体助焊剂 | Felder GMBH Löttechnik，Oberhausen，德国 | Lötöl ST | DIN EN 29454.1，3.2.2.A (F-SW 11) |
| LED | Neuralynx | HS-LED-Red-omni-10V | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| MATLAB | Mathworks，Natick，美国马萨诸塞州 | ||
| MC_Stimulus 软件 | Multichannel Systems | ||
| 神经生理学数据管理器 | NDManager，http://neurosuite.sourceforge.net | ||
| Klusters | http://neurosuite.sourceforge.net，Hazan 等，2006 | ||
| 记录系统软件 | Neuralynx | Cheetah | https://neuralynx.com/software/cheetah |
| 多通道数据分析软件 | Cambridge Electronic Design Limited，Cambridge，英国 | Spike2 |
参考文献
- Salinas, E., Sejnowski, T. J. Correlated neuronal activity and the flow of neural information. Nat Rev Neurosci. 2 (8), 539-550 (2001).
- Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Cannon, J., et al.
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