Summary
אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.
Abstract
מהכלורופלסט הן organelles בצמחים ירוקים אחראי על ביצוע מסלולים מטבוליים חיוניים רבים, ובראשם פוטוסינתזה. בתוך בתורה מהכלורופלסט, מערכת קרום תילקואיד בתים כל הפיגמנטים פוטוסינתטיים, מתחמי מרכז התגובה, ואת רוב נשאי האלקטרונים, אחראי על סינתזת ATP האור תלוי. מעל 90% של כלורופלסט חלבונים מקודד בגרעין, המתורגמת את ציטוזול, לאחר מכן לייבא לתוך כלורופלסט. תחבורה חלבון נוספת או על פני קרום תילקואיד מנצל לאחד ארבעה מסלולים טרנסלוקציה. כאן, אנו מתארים שיטה תשואה גבוהה עבור בידוד של תחבורה-מוסמך thylakoids של אפונה (אפון השדה), יחד עם תחבורה מבחני דרך שלושה תלויי-אנרגיה cpTat, cpSec1, מסלולים בתיווך cpSRP. שיטות אלה מאפשרות ניסויים הקשורים תילקואיד חלבון לוקליזציה תחבורה energetics, המנגנון של טרנסלוקציה של חלבונים על פני מחקר ביולוגי.
Introduction
כמעט את כל המכונות proteinaceous אחראי לתפקוד תקין כלורופלסט חייב להיות translocated מ ה ציטוזול1. על המעטפות כלורופלסט, חלבון סובסטרטים מיובאים דרך את translocon של הממברנה החיצונית (TOC), את translocon של הממברנה הפנימית (טיק)2. המיקוד עוד יותר תילקואיד ממברנה ו לומן מתרחשת דרך טווין ארגינין טרנסלוקציה (cpTat)3, את הפרשה (cpSec1)4, אות זיהוי החלקיקים (cpSRP)5, המסלולים ההכנסה ספונטנית6 . שיטת הבידוד לתפוקה גבוהה של פעילות פיזיולוגית מהכלורופלסט וממברנות תילקואיד יש צורך למדוד את energetics ואת קינטיקה של אירוע רוברטסונית, להבין את מנגנוני ההעברה מגוונים בכל מסלול, וכדי להתאים לשפה לסובסטרט חלבון מסוים מכל ששת התאים ברורים של כלורופלסט עניין.
בידודו של ממברנות של כלורופלסט מציע כדאי ניסיוני שליטה על גורמים סביבתיים (כגון: ריכוזי מלח ואת המצע, הנוכחות של ATP/GTP, ותנאי pH) המשפיעים על המדד של תחבורה energetics, קינטיקה. סביבה זו במבחנה הוא משאיל את עצמו חקר מכניסטית בפרטי רוברטסונית מאותן סיבות. בנוסף, בעוד תוכנה חזוי עבור לוקליזציה של כלורופלסט חלבונים השתפרה7,8, in vitro לקשרי תחבורה מבחני לספק שיטה מהירה יותר עבור אישור על מבחני פלורסנט מבוסס מיקרוסקופיה דורשים תגית פלורסנט מקודדים גנטית, צמח שינוי ו/או נוגדנים ספציפיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ומשום כלורופלסט, תילקואיד של אפונה (אפון השדה), כמו גם עבור מבחני תחבורה ממוטב עבור כל אחד המסלולים רוברטסונית תילקואיד תלויי-אנרגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חומרים הראשונית
- להשרות כ- 55 גר' אפונה 3 שעות ב- 400 מ ל מים מזוקקים ולאחר מכן לזרוע מגש פלסטיק (35 ס"מ x 20 ס"מ x 6 ס מ) בקרקע מכוסים בשכבה דקה של ורמיקוליט.
- לגדול המגש של אפונה ב- 20 ° C תחת h 12/12/כהה (50 µE/m s2) מחזור 9 עד 15 ימים.
- להכין לסובסטרט חלבון על פי שיטה מועדפת.
הערה: הכנו סובסטרטים חלבון תוך שימוש במגוון שיטות, כולל 1) במבחנה שעתוק של פלסמידים מטוהרים ואחריו תרגום באמצעות תמציות נבט חיטה או ארנב lysates רטיקולוציט בנוכחות [3H]-לאוצין או [35S]-מתיונין, 2) במבחנה תרגום באמצעות ערכת בשילוב תעתיק/תרגום כמו TnT ערכות של Promega, עם radiolabeling לעיל, ו- 3) טיהור של חלבונים overexpressed ב e. coli. רדיואקטיבי במבחנה תרגום מוצרים הם בדרך כלל מתרצה עם 50 מ מ חומצת אמינו קר לפני השימוש בתגובות תחבורה. כל השיטות האלה בדרך כלל דורש קצת אופטימיזציה לכל סובסטרט חלבון חדש. לקבלת דוגמה של מערכת בשילוב במבחנה , ראה לינג, ג'רוויס (2016)9.
2. כלורופלסט בידוד, כמת
הערה: בשלב הראשון של הכנת thylakoids הוא הבידוד של מהכלורופלסט שלם10. כל החומרים צריך להישמר קר במהלך ההכנה. Resuspension של מהכלורופלסט צריך להיות מטופל בעדינות, כמו שבירה בשלב זה קשות יכול להגביל את התשואה תילקואיד עוקבות.
- הכינו בעקבות פתרונות מראש.
- 2 x שחיקה מאגר (2xGB): 100 מ מ K-HEPES pH 7.3, 660 מ מ בסורביטול, 2 מ מ MgCl2, 2 מ מ MnCl2, 4 מ מ EDTA, BSA 0.2%.
- 2 x ייבוא מאגר (2xIB): 100 מ מ K-Tricine או K-HEPES pH 8.0, בסורביטול 660 מ מ, 8 מ"מ MgCl2.
הערה: ריכוזי MgCl2 3 מ"מ ועד 10 מ"מ שימשו ללא הבדלים הנצפה.
- הכן הדרגתי צפיפות מתמשכת על ידי צריך שתוציאו תערובת של 15 מ"ל של Percoll ו-15 מיליליטר 2xGB ב 30,900 g ברוטור זווית קבועה במשך 30 דקות ב 4 ° C עם הבלם חופש.
- הקציר כ 25 גר' אפונה בת 9-15 יום, homogenize ב 95 מ"ל של 1xGB. בלנדר עם להבי מחודדים או Polytron שימשו בהצלחה. לסנן את התערובת דרך לפחות 2 שכבות של Miracloth בתוך משפך.
הערה: הגבלת כמות רקמת גזע אינה נחוצה, אך יכול להקל את תהליך המגון, ובכך מקצר שבירה כלורופלסט שעלול להתרחש עם מיזוג ממושך. - גלולה-3000 g ברוטור דלי מתנדנדים למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend בעדינות ב 1 מ"ל של 1xGB. במכחול ייתכן הטכניקה resuspension עדין ביותר.
- בזהירות שכבה ההשעיה ירוק על גבי Percoll ההדרגתי של צנטריפוגה-8000 g ברוטור דלי מתנדנדים 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם חופש.
- בזהירות לקצור את הרצועה הירוקה התחתון המכיל מהכלורופלסט בשלמותם לתוך צינור טריים. ספין בתורה מהכלורופלסט שלם התאושש-1,800 g ברוטור דלי מתנדנדים למשך 5 דקות ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend בגדר ב- 1xIB. חזור על פעולה זו שטיפת פעם נוספת, resuspending ב- 30 מ של 1xIB בכל פעם, עם resuspension הסופית ב 1 מ"ל של 1xIB.
- לכמת תוכן כלורופיל (קלוא), מערבבים µL 10 של מהכלורופלסט resuspended באופן מלא עם 5 מ ל 80% אצטון וסינון באמצעות נייר סינון וטמן 1 (מיקרומטר 180 בעובי נומינלי). להקליט את ספיגת ב 720 nm, 663 ננומטר, 645 nm בספקטרופוטומטר ולחשב את הריכוז קלוא באמצעות הנוסחה הבאה11:
[קלוא] מ"ג/מ"ל = [40.2* (663 –720) + 101.4* (645 –720)] * 0.1 - התאם מהכלורופלסט כדי 1 מ"ג/מ"ל קלוא מקבילות עם 1xIB.
3. בידוד של Thylakoids
הערה: Thylakoids מוכנות על ידי פירוק היפוטוניק של מהכלורופלסט ללא פגע. זו מושגת על ידי חשיפת בתורה מהכלורופלסט למאגר היפוטוניק חסר בסורביטול. Thylakoids מבודד יכול לשמש assaying מכל המסלולים רוברטסונית, אך תמצית סטרומה (SE) צריך להיות גם מבודד במהלך ההכנה הזאת אם מסלולים או cpSec1 או cpSRP להיחקר.
- הכינו מבעוד מועד את הפתרונות הבאים.
- מאגר פירוק היפוטוניק: 50 מ מ K-Tricine או K-HEPES pH 8.0, 8 מ"מ MgCl2.
- 2 x מאגר גולמי משתית (עבור ריכוז של SE): 100 מ מ K-HEPES pH 8.0, בסורביטול 660 מ מ, 8 מ"מ MgCl2.
- מאגר מדגם Laemmli (עבור מרחביות עמודים, בתוספת EDTA): 125 מילימטר טריס pH 6.8, מרחביות 10%, 20% גליצרול, bromophenol 0.05 מ"ג/מ"ל כחול, 10% β-mercaptoethanol, 10 מ מ EDTA.
- אם השחזור SE אינה נחוצה, centrifuge בתורה מהכלורופלסט שלם ב- 1000 g ברוטור דלי מתנדנדים במשך 6 דקות ב 4 º C.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדי 1 מ"ג/מ"ל במאגר פירוק היפוטוניק. דגירה על קרח בחושך למשך 10 דקות, עם ערבוב מדי פעם.
- לשחזר thylakoids על-ידי צריך שתוציאו ב- 3,200 g במתנדנד דלי הרוטור במשך 8 דקות ב 4 º C. לשטוף את thylakoids פעמיים, resuspending עם 1-2 מ של פירוק מאגר בכל פעם. Resuspend עם 1 מ ל 1xIB, requantify קלוא כמו לעיל בפרוטוקול בידוד כלורופלסט.
4. תמצית סטרומה שחזור וריכוז
- אם השחזור SE נחוץ, לחלק בתורה מהכלורופלסט ללא פגע aliquots µL 600 מ ל 1.5 microcentrifuge צינורות, centrifuge כל שפופרת-1000 g ב מרביץ דלי הרוטור במשך 6 דקות 4 ° C.
הערה: אמצעי אחסון זה נוח בעת שימוש 1.5 mL microcentrifuge צינורות, אשר מסייעת למנוע הפרעה של בגדר בסופו של דבר לממברנות שיורית.- Resuspend 1 מ ג/מ ל קלוא במאגר פירוק היפוטוניק, דגירה על קרח בחושך למשך 10 דקות, כמו שלב 3.2.1.
- Centrifuge כל שפופרת ב x 3,200 g פנימה דלי הרוטור במשך 8 דקות ב 4 ° C ולהעביר את אור ירוק או צהוב supernatant הבאים כלורופלסט פירוק צינור microcentrifuge עם אמצעי אחסון שווה של 2 x מאגר משתית גולמי.
- Thylakoids עם 2 כרכים של מאגר פירוק (קירוב 0.5 מ"ג/מ"ל) וקונטה לאסוף על ידי צנטריפוגה-3,200 g במתנדנד דלי הרוטור במשך 8 דקות ב 4 º C. Resuspend כדי 1 מ"ג/מ"ל קלוא ב 1xIB על הקרח.
- צנטריפוגה משתית גולמי-42,000 g ברוטור זווית קבועה במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר שאריות ממברנות. Immunoblotting מעטפה החיצוני והפנימי חלבונים יכול לשמש כדי לאמת את טוהר תגובת שיקוע.
- לאסוף 95% נפח כל שפופרת מבלי להפריע בגדר צהוב ירוק קטן. הערה האחסון שנלקחו כל שפופרת.
- כדי להכין את תמצית מרוכזת סטרומה (SE), מאגר של supernatants שנאספו ותתרכזו פי חמש באמצעות 4 מ ל 30 kDa MWCO רכז.
הערה: SE שהוכנו באופן זה שווה ל משתית נגזר מהכלורופלסט ב- 2.5 מ"ג/מ"ל Chl. במידת הצורך, SE יכול להיות מרוכז כוחנו עד 5 מ"ג/מ"ל קלוא מקבילות. SE יהיו וצבען זהוב, צמיגה. בצנטריפוגה. המעבדה RT מקרא עם נדנוד דלי הרוטור, זה דורש כ- 10 דקות לכל mL מרוכז.
5. להעביר דרך cpTat השביל
הערה: בניגוד ' cpSec1 או cpSRP, מסלול cpTat אינה דורשת מרכיבים מסיסים או exogenously להוסיף מקורות אנרגיה; רק הכוח המניע פרוטון מונחה אור הוא הכרחי3. לכן, רק מבודדים thylakoids, המצע חלבונים דרושים עבור וזמינותו. קודמן טפסים, prOE17, prOE23, יכול גם להיות בהצלחה מועבר סובסטרטים טיפוסי הם צורות ביניים של kDa 17 (כפי שניתן לראות באיור1) ו- 23 kDa subunits של חמצן מתפתח מורכבים, iOE17, iOE23, בהתאמה. קודמן טפסים יש דו-צדדי N-מסוף מיקוד הרצף כולו, ואילו צורות ביניים יש רק את תילקואיד מיקוד רצף.
- להכין cpTat שילוב תחבורה עם 0.33 מ"ג/מ"ל קלוא thylakoids, 5 מ ATP מ מלאי מוכן 1xIB, 8 מ"מ dithiothreitol (DTT) של מניה המבושלות 1xIB, על קרח. ATP נדרש לא רק התגובה הזו אם שנערך תחת תאורה.
- תחבורה אתחול על ידי החדרת 1:30 אמצעי אחסון על-ידי אחסון המצע חלבון התחבורה מערבבים. אם המצע חלבון אינו מוכן ב- 1xIB, להכין 1:1 דילול עם 2xIB, ואז להשתמש תחילה 1:30 אמצעי אחסון על-ידי אחסון של המצע מדולל בתערובת תחבורה.
הערה: ריכוזי המצע ישתנו בהתבסס על שיטת ההכנה. בדרך כלל, ההכנות במבחנה יאפשר nanomolar לכמויות micromolar, בעוד ביטוי יאפשר micromolar לכמויות millimolar. שיטות איתור יש גם לקחת בחשבון, כמו autoradiography ו- fluorography רגישים יותר immunoblotting. - להאיר את המתלים ב- 80-100 µE/m2s של קרינה photosynthetically פעיל (PAR) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אם קינטיקה תחבורה נדרשים, מראש equilibrate מיקס thylakoids והן התגובה לטמפרטורת החדר, להאיר למשך עד 30 דקות.
- לעצור את התגובה תחבורה עם דילול 8-fold של 1xIB קר כקרח ולשחזר thylakoids על ידי צנטריפוגה-3,200 g ב- microcentrifuge עבור 5 דקות ב 4 º C.
- להסיר את המצע שיורית שהעביר לא, resuspend בגדר תילקואיד ב 120 µL של 1xIB, לעכל פרוטאינים חיצוני על-ידי תוספת של 6 µL של 2 מ"ג/מ"ל thermolysin ו 10 מ מ CaCl2 ב- 1xIB.
- דגירה התגובה פרוטאז על קרח למשך 40 דקות ולאחר מכן להרוות את פרוטאז על ידי הכפלת אמצעי האחסון עם 25 מ מ EDTA בכיכר 1xIB.
- לשחזר thylakoids על-ידי צריך שתוציאו ב- 3,200 g ב- microcentrifuge עבור 5 דקות ב 4 º C. לשטוף thylakoids התאושש ב 120 μL של 5 מ מ EDTA 1xIB, העברת צינור חדש.
- צנטריפוגה-3,200 g ב- microcentrifuge עבור 5 דקות ב 4 º C. Resuspend של אמצעי אחסון המתאים Laemmli דוגמת המאגר בתוספת 10 מ מ EDTA. נפח של 40 µL בדרך כלל מספיק כדי לזהות את המצע על ג'ל מרחביות-דף ומשמרים לדוגמה עבור ג ' לים חוזר בעת הצורך.
- מקום דגימות באמבט מים רותחים למשך 10 דקות ולנתח מאת מרחביות-דף. Autoradiography, fluorography או סופג המערבי של חלבונים שאינם ילידי הארץ או מתויג epitope שימשו בהצלחה לגילוי של חלבונים מועבר.
6. להעביר דרך מסלול cpSec1
הערה: לעבור translocon cpSec1 מחייבת את החלבון סטרומה cpSecA112,13, אשר יכול להיות רכש באמצעות ביטוי ב e. coli14,15 או ששוחזרו על ידי ריכוז משתית במהלך תילקואיד בידוד. מצע טיפוסי הוא יחידת משנה 33 kDa של החמצן מתפתח מורכבים (prOE33), כפי שניתן לראות באיור2.
- הכנת המיקס תחבורה cpSec1 עם 0.33 מ"ג/מ"ל קלוא thylakoids, SE המקביל קלוא 0.83 מ"ג/מ"ל או μg 1.5 cpSecA1 רקומביננטי, 5 מ מ ATP על הקרח, תקופת דגירה של 10 דקות. תערובת התגובה תחבורה אופייני כאן הוא 72 μL, למעלה מ μL 60 בשל תוספת SE.
- אם ייעשה שימוש cpSecA1 רקומביננטי במקום SE, להתאים מטוהרים cpSecA1 עם אמצעי אחסון שווה של 2xIB, ואז לדלל את ריכוז נוח להוסיף לתגובות תחבורה (למשל, 0.75 µg/µL).
הערה: לאחסון לטווח ארוך, cpSecA1 מאוחסן על קרח בחדר קירור מבוקר לאחר טיהור כמו לקפוא מבטל פעילות.
- אם ייעשה שימוש cpSecA1 רקומביננטי במקום SE, להתאים מטוהרים cpSecA1 עם אמצעי אחסון שווה של 2xIB, ואז לדלל את ריכוז נוח להוסיף לתגובות תחבורה (למשל, 0.75 µg/µL).
- תחבורה אתחול על ידי החדרת 1:10 אמצעי אחסון על-ידי אחסון המצע חלבון כדי התעבורה מערבבים. אם המצע חלבון אינו מוכן ב- 1xIB, להכין לדילול 1:1 עם 2xIB ולהוסיף 1:10 אמצעי אחסון על-ידי אחסון של החלבון מדולל לתערובת תחבורה.
- דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות תחת 80 – 100 µE/m2s נקוב. שוב, פעמים יותר יהיה צורך קינטיקה או מצעים מסוימים.
- לאחר טיפול קל, לדלל 8-fold עם 1xIB קר כקרח תגובות צנטריפוגה-3200 g ב- microcentrifuge עבור 5 דקות ב 4 º C.
- לטיפול עם thermolysin, להרוות עם EDTA כמו מעל 5.5 צעדים דרך 5.7.
- צנטריפוגה-3,200 g ב- microcentrifuge עבור 5 דקות ב 4 ° C, resuspend בגדר של אמצעי אחסון המתאים Laemmli דוגמת המאגר בתוספת 10 מ מ EDTA. מקום הרתחת המים הרותחים למשך 10 דקות לפני העמסה על ג'ל מרחביות-דף.
7. הכניסה דרך cpSRP השביל
הערה: השילוב בתיווך cpSRP של אור קציר חלבונים מורכבים (LHCP) ראה באיור 3 דורשת cpSRP54, cpSRP43 ו- cpFtsY16. רכיבים אלה מסופקות התגובה התחבורה דרך סטרומה תמצית מרוכזת, כמתואר עבור פרוטוקול תעבורה cpSec1.
- להכין את cpSRP תחבורה לערבב עם 0.33 מ"ג/מ"ל של ATP thylakoids, 0.83 מ"ג/מ"ל קלוא המקביל SE ו 5 מ מ קלוא על קרח, תקופת דגירה של 10 דקות.
- תחבורה אתחול על ידי החדרת 1:10 אמצעי אחסון על-ידי אחסון המצע חלבון כדי התעבורה מערבבים. אם המצע חלבון אינו מוכן ב- 1xIB, להכין לדילול 1:1 עם 2xIB ולהוסיף 1:10 אמצעי אחסון על-ידי אחסון של החלבון מדולל לתערובת תחבורה.
- דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 80 – 100 µE/m2s נקוב.
- לאחר טיפול קל, לדלל 8-fold עם 1xIB קר כקרח תגובות צנטריפוגה-3,200 g ב- microcentrifuge עבור 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 120 µL של 1xIB.
- פנקו עם thermolysin כמו לעיל בסעיפים 5.5 דרך 5.7. Thermolysin עיכול הוא הכרחי כאן להעריך אינטגרציה מוצלחים ממברנה. לשטוף thylakoids התאושש ב 120 μL של 5 מ מ EDTA 1xIB, העברת צינור חדש.
- צנטריפוגה-3,200 g ב- microcentrifuge עבור 5 דקות ב 4 ° C, resuspend בגדר שוב בתוך אמצעי אחסון המתאים מאגר x Laemmli 2 בתוספת 10 מ מ EDTA. מקום הרתחת המים הרותחים למשך 10 דקות לפני ניתוח לפי עמודים מרחביות.
הערה: שילוב של בוגרת LHCP (mLHCP) מוערך על ידי הופעתו של מוצר המוגן על-ידי פרוטאז השפלה (mLHCP-D) כ- 1.5-2 kDa קטן יותר uncleaved mLHCP17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמוד את כמות המצע הועברו בהצלחה, זה שימושי לכלול נתיבים "אחוז קלט" אחד או יותר. עבור הנתונים שיובאו להלן, שימש 10% התגובה תחבורה הסופי ללא thylakoids. זה "קלט אחוז" גם עוזר להמחיש את גודל המצע מבשר. האחוז מייצג סכום ידוע, הגדרה של המצע עם אשר כדי להשוות מועבר המצע נגד, וניתן לשנותם למעלה או למטה הדרושים באמצעות בתחילה מוכן חלבון. בנוסף, רצוי לטעון µg פחות מ-4 של קלוא המקבילים ב נתיב אחד. על 0.75 מ מ ג'לים לזיהוי להימנע הלהקה עיקום, מורחת. להלן כל סובסטרטים הוכנו, radiolabeled באמצעות במבחנה תרגום ערכות.
הובלה של iOE17 דרך מסלול cpTat
איור 1 . תחבורה של iOE17through מסלול cpTat. Fluorograph [3H]-iOE17 תחבורה assay thermolysin וטיפול של מצע שאינו מועבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
תחבורה cpTat מוצלחת של סובסטרטים Tat רוב יכול יזוהו על-ידי שינוי גודל על המחשוף של פפטיד האות N-טרמינל3. במצעים שבו אין פפטיד אות cleavable קיימת18,19, פרוטאז טיפול נדרש לחשוף את המצע שחצה את הקרום, ובכך הופכת נגיש לעיכול על ידי פרוטאז. איור 1, תחבורה iOE17 תוצאות בשינוי גודל של-2-3 kDa בין המצע הציג את בוגרת עיבוד הטופס. המצע מועבר שאינו יורד דרך הטיפול פרוטאז (ליין 4).
הובלה של prOE33 דרך מסלול cpSec1
איור 2 . הובלה של prOE33 דרך מסלול cpSec1. Autoradiograph של [35S]-prOE33 assay תחבורה באמצעות SE, מטוהרים cpSecA1, או את שניהם בו זמנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ניתן להעריך התחבורה באמצעות מסלול cpSec1 (איור 2) דרך שינוי גודל במצע בוגר אם המצע מכיל תילקואיד cleavable מיקוד אותות, וכן פרוטאז הגנה על המצע מועבר20.
שילוב של prLHCP דרך מסלול cpSRP
איור 3 . שילוב של prLHCP דרך מסלול cpSRP. Autoradiograph של [35S]-prLHCP, מערכת העיכול D-mLHCP המוצר לאחר הכניסה לתוך קרום תילקואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ניתן להעריך החדרת prLHCP לתוך קרום תילקואיד דרך השביל cpSRP דרך מערכת העיכול thermolysin. שינוי גודל של-1.5-2 kDa הוא מרמז על ההכנסה מוצלחים ממברנה כמו הקרום מגן על החלבון בוגרת uncleaved מלאה proteolysis15. איור 3, D-mLHCP המוצר המוגן על-ידי פרוטאז מוצגת באופן ברור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בידוד כלורופלסט, תילקואיד
שבירה מוגזמת עלולה לגרום ב כלורופלסט המסכן בידוד ובכך תילקואיד המסכן תשואות לאחר ההפרדה במעבר הצבע. מומלץ homogenize את הרקמה שנקטפו בעדינות על-ידי הבטחת כי כל החומר שקוע לפני המיזוג, הפועמים 15 מחזורים s ובודקים באופן מלא. אם יש צורך, להשתמש מספר סיבובים קצרים יותר של מיזוג עם פחות רקמת בכל סבב.
קירור כל החומרים אשר באים במגע עם רקמות שנקטפו מסייעת מהכלורופלסט מבודד כדי לשמור על פעילות עד כדי 2 שעות. חשוב לשמור בתורה מהכלורופלסט על קרח בחושך לאחר בידוד גם כן.
חשוב לכלול מגנזיום במאגרי פנייה thylakoids מבודדים. לא מרגישה כל כך תוצאות granal destacking ומשפיעה באופן ביקורתי את הדור של פרוטון כוח מניע על תאורה21. Thylakoids שימשו בתגובות התחבורה עד שעתיים לאחר בידוד כאשר שמר על הקרח ועל בחושך.
אופטימיזציה של תחבורה תגובות
Thylakoids מבודד ליישב במהירות, יכול לגרום מקבילות קלוא שוויוני בין תגובות. לכן, חשוב לערבב את thylakoids ביסודיות לפני השימוש, במיוחד בעת הגדרת מספר רב של דוגמאות.
מסלול תאת
תחבורה יעילה באמצעות מסלול Tat יכול להיות מופחת על רחיצת מופרז thylakoids מאז Tha4 (TatA) יכולה להיות חלקית מופק ממברנה22. במקרים כאלה, זה עוזר להפחית תילקואיד צעדים לשטוף לפני התגובה תחבורה. בנוסף, יותר תאורה פעמים יכול לשפר את זיהוי איפה סובסטרטים לקוי מועברים בתנאים טיפוסי.
מסלול cpSec1
כאשר assaying את המעבר cpSec1, הסכום של cpSecA1 ב SE מרוכז צריך לתמוך התחבורה, אבל זה תעבורה עשוי להיות חלש. תחבורה יעילה thylakoids מבודדים עשויה להועיל התוספת של cpSecA1 מטוהרים חלבונים מסוימים, למרות סטרומה מלווים ב- SE עשוי גם לסייע להגביר את היעילות של תחבורה-15. עוד, ההכנות של חלבון cpSecA1 אמורים לא לקפוא לפני שימוש בהעברה, כמו זה מקטין פעילות התחבורה. בדומה, SE קפוא הוא פחות יעיל מאשר תמצית המוכנים באופן טרי. כמו Tat התחבורה, תקופות ארוכות יותר של דגירה בתערובת התחבורה יכול לעזור עם מצעים קשה.
CpSRP השביל
בזמן בנייתו מחדש של התחבורה cpSRP באמצעות רכיבים בודדים הייתה שבוצעו23, זה נוח לספק cpSRP43, cpSRP54, והוא cpFtsY בהתנגדות SE. Thermolysin הקריטריונים המחמירים ביותר עבור אינטגרציה LHCP16, 17, אבל חילוץ אלקליין ניתן לבצע גם טוב17. בעוד מבשרי יכולים לעתים קרובות להיות קפוא המאוחסנים ב- 80 ° C לתגובות תחבורה רבים, יש להשתמש prLHCP שהוכנו על ידי במבחנה סינתזה להעברה מיד לאחר סינתזה ללא הקפאה.
אפיון של מצע הרומן למטרה מסלול
במקרים בהם השביל רוברטסונית נלקח על ידי מצע הרומן לא ידוע, רצוי לחקור תחילה אות אפשרי פפטידים סיליקו באמצעות הרצף חומצת אמינו של קודמן או טופס ביניים. מסלול cpTat דורש בדרך כלל מוטיב קונצנזוס ארגינין טווין ספציפי של פפטיד אות ו אין ATP להעברה מוצלחת תחת PAR3. בניגוד מסלול Tat, מסלול cpSec1 דורשת ATP החלבון cpSecA1. תחבורה שנכשלו בתנאים חסר רכיבים אלה מציע מסלול cpSec120. מסלול cpSRP דורש אות זיהוי החלקיק שנמצאו SE. נכשל להעביר באמצעות מטוהרים cpSecA1 ו- ATP, אבל חוסר התאום ארגינין קונצנזוס מוטיב בפפטיד האות, מציע מסלול cpSRP23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
כתב יד זה הוכן עם מימון על ידי חלוקה של מדעי הכימיה, מדעי החיים, 408 משרד האנרגיה הבסיסית, למדעי לנו מחלקת האנרגיה דרך גרנט דה-SC0017035
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C.
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
