Summary
Мы представляем здесь протоколы изоляции высокодоходные физиологически активных тилакоидов и анализов транспортного белка для хлоропластов Твин аргинин транслокация (cpTat), секреторную (cpSec1) и сигнал признания частиц (cpSRP) пути.
Abstract
Хлоропластов являются органеллы в зеленых растений, ответственная за проведение многочисленных важнейших метаболических путей, прежде всего фотосинтеза. В хлоропластах тилакоидной мембраны системы дома фотосинтетических пигментов, реакция центра комплексов и большинство носителей электронов, а отвечает за синтез АТФ светозависимой. Свыше 90% белков хлоропласта кодируются в ядре, переведены в цитозоле и впоследствии импортирован хлоропластов. Дальнейший перенос белков в или поперек тилакоидной мембраны использует один из четырех транслокации пути. Здесь мы описываем высокодоходный метод для изоляции транспорта компетентных тилакоидов из гороха (Pisum sativum), наряду с транспорта анализов через три энергии зависимой cpTat, cpSec1 и cpSRP опосредованного пути. Эти методы позволяют эксперименты, касающиеся тилакоидных белков локализации, энергетика, транспорт и механизмы транслокации белка через биологические мембраны.
Introduction
Почти все из белковых техники отвечает за надлежащее хлоропласта функция должна перемещен из цитозоль1. В хлоропласте конверты белковых субстратов импортируются через translocon внешней мембраны (TOC) и translocon внутренняя мембрана (TIC)2. Дальнейшей ориентации тилакоидной мембраны и Люмене происходит через Твин аргинин транслокация (cpTat)3, секреторную (cpSec1)4, сигнал признание частиц (cpSRP)5и спонтанное вставки пути6 . Метод для изоляции высокодоходные физиологически активных хлоропластов и тилакоидной мембраны для измерения энергетики и кинетика транслокации события, чтобы понять различные транспортные механизмы в каждом пути и для локализации особое белкового субстрата, представляющие интерес для любого из шести отдельных отсеков хлоропластов.
Изоляция мембраны из хлоропласта предлагает более экспериментальный контроль над экологических факторов (например, концентрации соли и субстрат, присутствие СПС/гтп и рН условий), которые влияют на измерение энергетики транспорта и Кинетика. Эта среда в vitro поддается исследованию механистический деталей транслокации по тем же причинам. Кроме того хотя интеллектуального программного обеспечения для локализации хлоропласта белков улучшилась7,8, в пробирке анализов транспорта обеспечивают быстрый метод для подтверждения над микроскопии основанные флуоресцентные анализов требуют генетически закодированный флуоресцентные метки, трансформации растений и/или специфических антител. Здесь мы представляем протоколы хлоропластов и тилакоидов изоляции от горох (Pisum sativum), а также для транспорта анализов, оптимизированы для каждого пути транслокации энергии зависимых тилакоидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. первоначальные материалы
- Замочите приблизительно 55 г гороха на 3 часа в 400 мл дистиллированной воды и затем посеять в пластиковый лоток (35 см x 20 см x 6 см) в почве, покрытые тонким слоем вермикулита.
- Растут лоток горох при 20 ° C под 12/12 h Светлый/темный (50 µE/м2с) цикл для 9-15 дней.
- Подготовьте белкового субстрата согласно предпочтительный метод.
Примечание: Мы подготовили белковых субстратов с помощью различных методов, в том числе 1) в vitro транскрипция от очищенные плазмид следуют перевод, экстракты зародышей пшеницы или кролик ретикулоцитов лизатов присутствии [3H]-лейцина или [35S]-метионина, 2) в vitro перевод с использованием спаренных транскрипция/перевод комплекта как TnT комплекты от Promega, с выше, radiolabeling и 3) очистки гиперэкспрессия белка в E. coli. Радиоактивные в vitro перевод продуктов обычно угасает с 50 мм холодной аминокислоты до использования в реакциях транспорта. Каждый из этих методов обычно требует некоторых оптимизации для каждой новой белкового субстрата. Пример системы спаренные в пробирке , см Лин и Джарвис (2016)9.
2. хлоропласта изоляции и количественная оценка
Примечание: Первый шаг в подготовке тилакоидов является изоляция нетронутыми хлоропластов10. Все материалы должны храниться холодной во время подготовки. Ресуспендирования хлоропластов должны обрабатываться нежно, как обрыв на этом шаге может серьезно ограничить последующие тилакоидов урожайности.
- Подготовьте следующие решения заранее.
- 2 x шлифовальные буфера (2xGB): 100 мм K-HEPES рН 7.3, сорбитол 660 мм, 2 мм MgCl2, 2 НКД2, 4 мм ЭДТА, 0,2% BSA.
- 2 x буфер импорта (2xIB): 100 мм K-Трицин или K-HEPES рН 8,0, сорбитол 660 мм, 8 мм MgCl2.
Примечание: Концентрации MgCl2 от 3 мм до 10 мм были использованы без заметных различий.
- Подготовьте градиент постоянной плотности центрифугированием смесь 15 мл Percoll и 15 мл 2xGB на 30900 g в фиксированный угол ротора 30 мин при температуре 4 ° C с тормозом выкл.
- Урожай примерно в 25 г гороха, 9-15 день старого и гомогенизации в 95 мл 1xGB. Успешно используется блендер с заточенные лезвия или Политрон. Отфильтруйте эту смесь через по крайней мере 2 слоя Miracloth в воронку.
Примечание: Ограничивая количество стволовых ткани не является необходимым, но может облегчить процесс гомогенизации, тем самым уменьшая хлоропласта поломки, которые могут произойти с длительной смешивания. - Пелле на 3000 g в размахивая ведро ротор за 5 мин при температуре 4 ° C и нежно ресуспензируйте в 1 мл 1xGB. Кисть может быть наиболее щадящим технику ресуспендирования.
- Тщательно слой зеленый подвеска на вершине Percoll градиент и центрифуги на 8000 g в размахивая ротор ведро 10 мин при температуре 4 ° C с тормозом выкл.
- Тщательно урожай Нижняя зеленая полоса, содержащие нетронутыми хлоропластов в свежий трубку. Спина восстановленные нетронутыми хлоропластов в 1800 g в размахивая ведро ротор за 5 мин при температуре 4 ° C, удалить супернатант и нежно ресуспензируйте гранулы в 1xIB. Повторите этот шаг мыть еще раз, resuspending в 30 мл 1xIB каждый раз, с окончательной ресуспендирования в 1 мл 1xIB.
- Для количественного определения содержания хлорофилла (ХЛ), Смешайте 10 мкл полностью ресуспензированы хлоропластов с 5 мл ацетона 80% и процеживают через фильтр-бумаги ватман 1 (номинальная толщина 180 мкм). Запись поглощения в 720 Нм, 663 Нм и 645 Нм в спектрофотометр и рассчитать концентрации Chl, используя следующие формулы11:
Мг/мл [Chl] = [40.2* (663 –720) + 101.4* (645 –720)] * 0.1 - Отрегулируйте хлоропластов до 1 мг/мл Chl эквиваленты с 1xIB.
3. изоляция тилакоидов
Примечание: Тилакоидов готовятся гипотонический лизис нетронутыми хлоропластов. Это достигается путем разоблачения хлоропластов гипотонический буфер не хватает сорбитол. Изолированных тилакоидов может использоваться для assaying любого из путей транслокации, но стромальные экстракт (SE) должны также быть изолированы в ходе этой подготовки если cpSec1 или cpSRP пути должны быть расследованы.
- Заранее подготовьте следующие решения.
- Гипотонический буфера Lysis: 50 мм K-Трицин или K-HEPES рН 8,0, 8 мм MgCl2.
- 2 x сырой буфер стромы (для концентрации SE): 100 мм K-HEPES рН 8,0, сорбитол 660 мм, 8 мм MgCl2.
- Буфер Лэмли образца (для SDS-PAGE, с ЭДТА): 125 мм трис pH 6.8, SDS 10%, 20% глицерина, 0,05 мг/мл бромфеноловый синий, 10% β-меркаптоэтанол, 10 мм ЭДТА.
- При необходимости восстановления SE центрифуга нетронутыми хлоропластов в 1000 g в размахивая ротор ведро 6 мин при 4 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте до 1 мг/мл в гипотонический буфера Lysis. Инкубируйте на льду в темноте за 10 мин, с случайного смешивания.
- Восстановить тилакоидов центрифугированием при 3200 g в свинге ведро ротор для 8 мин при 4 ° C. Вымойте тилакоидов дважды, resuspending с 1-2 мл буфера lysis каждый раз. Ресуспензируйте с 1 мл 1xIB и requantify Chl как выше в протоколе изоляции хлоропластов.
4. стромальные экстракт восстановления и концентрация
- При необходимости восстановления SE, разделите нетронутыми хлоропластов 600 мкл аликвоты в 1,5 мл пробирок microcentrifuge и центрифуги каждой трубы на 1000 g в свинге ведро ротор за 6 мин при 4 ° C.
Примечание: Этот объем является удобным при использовании microcentrifuge 1.5 мл пробирок, что помогает предотвратить нарушение возможного гранулы для остаточного мембраны.- Ресуспензируйте до 1 мг/мл Chl гипотонический литического буфера и инкубировать на льду в темноте за 10 мин, как в шаге 3.2.1.
- Центрифуга для каждой трубы на 3200 x g в свинге ведро ротор для 8 мин при температуре 4 ° C и передать новой microcentrifuge трубки с равным объемом 2 x сырой буфер стромы светло зеленый или желтый супернатанта следующие хлоропласта lysis.
- Вымойте тилакоидов с 2 тома буфера lysis (аппроксимирующей 0.5 мг/мл) и собрать центрифугированием при 3200 g в свинге ведро ротор для 8 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте Chl 1 мг/мл в 1xIB на льду.
- Центрифуга сырой стромы на 42000 g в фиксированный угол ротора 30 мин при 4 ° C для удаления остаточного мембраны. Immunoblotting для наружной и внутренней конверт белков может использоваться для проверки чистоты супернатант.
- Соберите 95% от объема от каждой трубы не нарушая Малый Пелле желто зеленый. Обратите внимание на объем, взяты из каждой трубы.
- Подготовить концентрированный экстракт стромы (SE), бассейн собранных supernatants и сосредоточиться, пять раз с помощью 4 мл 30 кДа MWCO концентратор.
Примечание: SE, подготовленный таким образом эквивалентен стромы, производный от хлоропласты на 2,5 мг/мл КХЛ. При необходимости, SE может быть сосредоточено в десять раз 5 мг/мл Chl эквиваленты. SE будет золотистого цвета и вязкой. В лаборатории легенда RT центрифуги с качающимся ротором ведро это требует около 10 мин на мл концентрированный.
5. транспорт через cpTat пути
Примечание: В отличие от cpSec1 или cpSRP, cpTat путь не требует растворимых компонентов или экзогенно добавлены источников энергии; только свет driven Протон движущей силой является необходимым3. Таким образом только изолированных тилакоидов и субстрат белков требуются для assay. Типичные субстратов промежуточных форм 17 кДа (как показано на рис. 1) и 23 кДа субблоков кислорода развивается комплекс, iOE17 и iOE23, соответственно, но предшественник формы, prOE17 и prOE23, может также успешно перевозиться. Предшественник формы имеют весь двудольных N-терминальный таргетинга последовательность, в то время как промежуточные формы имеют только тилакоидов ориентации последовательности.
- Подготовка смеси cpTat транспорта с 0,33 мг/мл Chl Тилакоиды, 5 мм СПС со склада в 1xIB и Дитиотреитол (DTT) 8 мм со склада в 1xIB, на льду. СПС не строго необходим для этой реакции, если под освещение.
- Инициировать транспорта путем введения 1:30 объем, объем субстрата белка в транспорте смесь. Если белок субстрат не подготовлен в 1xIB, подготовьте разрежения с 2xIB во-первых, затем использовать 1:30 объем, объем разреженных субстрата в структуре транспорта 1:1.
Примечание: Концентрации субстрата будут различаться в зависимости от метода приготовления. Как правило в пробирке препаратов позволит наномолярных всех сумм, в то время как гиперэкспрессия позволит для всех millimolar сумм. Методы обнаружения должны также рассматриваться, как авторадиографии и флюорография более чувствительны, чем immunoblotting. - Пролейте свет подвеска в 80-100 µE/м2с фотосинтетически активной радиации (PAR) для 10 мин при комнатной температуре. Если кинетики транспорта требуются, заранее сбалансировать тилакоидов и реакция смесь до комнатной температуры и освещения для до 30 мин.
- Остановка транспорта реакции с пищеводный разрежения ледяной 1xIB и восстановить тилакоидов центрифугированием при 3200 g в microcentrifuge 5 мин при 4 ° C.
- Удаление остаточного субстрата, которые не были доставлены, Ресуспензируйте тилакоидов Пелле в 120 мкл 1xIB и дайджест внешних белков путем добавления 6 мкл 2 мг/мл thermolysin и 10 мм CaCl2 в 1xIB.
- Инкубировать протеазы реакции на льду для 40 мин и затем погасить протеазы, удваивая объем с 25 мм ЭДТА, подготовленный в 1xIB.
- Восстановить тилакоидов центрифугированием при 3200 g в microcentrifuge 5 мин при 4 ° C. Вымойте восстановленные тилакоидов в 120 мкл 5 мм ЭДТА в 1xIB и передачи новой трубки.
- Центрифуга на 3200 g в microcentrifuge 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте в соответствующий объем буфер Лэмли образца с 10 мм ЭДТА. Объем 40 мкл, как правило, достаточно для обнаружения субстрата на геля SDS-PAGE и сохраняет образца для повтора гелей при необходимости.
- Поместите образцы в кипящей водяной бане в течение 10 минут и анализировать, SDS-PAGE. Авторадиографии, флюорография или Западный blotting неместных или меткой epitope белков успешно использовались для обнаружения перевозимых белков.
6. транспорт через cpSec1 пути
Примечание: Транспорт через cpSec1 translocon требует стромальные белка cpSecA112,13, которые могут быть приобретены через гиперэкспрессия в E. coli14,15 или восстановлен путем сосредоточения стромы во время изоляции тилакоидов. Типичная субстрата является 33 кДа Субблок развивается комплекс кислорода (prOE33), как показано на рисунке 2.
- Подготовка смеси cpSec1 транспорта с 0,33 мг/мл Chl Тилакоиды, эквивалентные SE Chl 0,83 мг/мл или 1,5 мкг рекомбинантных cpSecA1, и 5 мм АТФ на льду и проинкубируйте втечение 10 мин. Типичный транспорт реакционную смесь здесь — 72 мкл, вверх от 60 мкл из-за того SE.
- Если рекомбинантных cpSecA1 будет использоваться вместо SE, отрегулируйте очищенный cpSecA1 с равным объемом 2xIB, а затем разбавляют до удобной концентрации для добавления транспорта реакций (например, 0,75 мкг/мкл).
Примечание: Для длительного хранения, cpSecA1 хранится на льду в контролируемых, охлажденных комнате после очистки как замораживание отменяет действие.
- Если рекомбинантных cpSecA1 будет использоваться вместо SE, отрегулируйте очищенный cpSecA1 с равным объемом 2xIB, а затем разбавляют до удобной концентрации для добавления транспорта реакций (например, 0,75 мкг/мкл).
- Инициировать транспорта путем введения 1:10 объем, объем субстрата белка к транспорту смесь. Если белок субстрат не подготовлен в 1xIB, подготовить разбавления 1:1 с 2xIB и добавить 1:10 объем, объем разреженных белка в структуре транспорта.
- Инкубировать реакции при комнатной температуре за 10 мин под 80 – 100 µE/м2с НОМИНАЛЬНОЙ. Опять же более длительное время может оказаться необходимым кинетики или определенные субстраты.
- После светолечение, разбавить спецавтотехнике с ледяной 1xIB и центрифуги реакций на 3200 g в microcentrifuge 5 мин при 4 ° C.
- Лечения с thermolysin и утолить с ЭДТА, как выше в 5.5 шаги через 5,7.
- Центрифуга на 3200 g в microcentrifuge 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в соответствующий объем буфер Лэмли образца с 10 мм ЭДТА. Место в кипящей водяной бане в течение 10 минут перед погрузкой на геля SDS-PAGE.
7. вставки через cpSRP пути
Примечание: CpSRP опосредованной интеграции света уборки комплекс белков (LHCP) показано на рисунке 3 требует cpSRP54, cpSRP43 и cpFtsY16. Эти компоненты поставляются в реакции транспорта через концентрированный экстракт стромы, как описано для транспортного протокола, cpSec1.
- Подготовка cpSRP транспортировки смеси с 0,33 мг/мл Chl Тилакоиды, 0,83 мг/мл Chl эквивалент SE и 5 мм АТФ на льду и проинкубируйте втечение 10 мин.
- Инициировать транспорта путем введения 1:10 объем, объем субстрата белка к транспорту смесь. Если белок субстрат не подготовлен в 1xIB, подготовить разбавления 1:1 с 2xIB и добавить 1:10 объем, объем разреженных белка в структуре транспорта.
- Инкубируйте реакции при комнатной температуре за 10 мин в 80 – 100 µE/м2с НОМИНАЛЬНОЙ.
- После светолечение, разбавить спецавтотехнике с ледяной 1xIB и центрифуги реакций на 3200 g в microcentrifuge 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 120 мкл 1xIB.
- Лечения с thermolysin как выше в разделах 5.5 через 5,7. Здесь Thermolysin пищеварение необходим для оценки интеграции успешных мембраны. Вымойте восстановленные тилакоидов в 120 мкл 5 мм ЭДТА в 1xIB и передачи новой трубки.
- Центрифуга на 3200 g в microcentrifuge 5 минут при температуре 4 ° C и снова Ресуспензируйте гранулы в соответствующий объем 2 x Laemmli буфера, дополнена 10 мм ЭДТА. Место в кипящей водяной бане 10 минут до анализа SDS-PAGE.
Примечание: Интеграция зрелых LHCP (mLHCP) оценивается появление протеаз защищенные деградации продукта (mLHCP-D) примерно 1,5-2 кДа меньше, чем uncleaved mLHCP17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы оценить количество субстрата успешно доставлены, полезно включить один или более полос «процент ввода». Для данных, представленных ниже был использован 10% окончательного транспорта реакции без тилакоидов. Этот «процент ввода» также помогает визуализировать Размер субстрата прекурсоров. Процент представляет собой известный, определенный объем субстрата с которым сравнить перевозимых подложкой против и можно вычислить по маштабу вверх или вниз, необходимых с использованием первоначально подготовленный белка. Кроме того желательно загрузить менее 4 µg Chl эквивалентов в одном Лейн на гелях полиакриламида 0,75 мм во избежание группы деформации и мазать. Все субстраты ниже были подготовлены и radiolabeled с помощью в vitro перевода комплектов.
Транспорт iOE17 через cpTat пути
Рисунок 1 . Транспорт из iOE17through cpTat путь. Флюорограф [3H]-iOE17 транспорта пробирного и thermolysin обращения не перевозить субстрата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Успешно cpTat транспорта большинства ТАТ субстратов могут быть обнаружены размер сдвига после расщеплением пептидных сигнал N-стержня3. В субстратах, где не горные сигнала пептид существует18,19протеазы лечение требуется раскрыть подложкой, которая пересекла мембраны, тем самым став недоступными для пищеварения, протеазы. На рисунке 1транспорта iOE17 результаты в смену размер примерно 2-3 кДа между введено субстрата и зрелые обрабатываются формы. Non перевозимых субстрат разлагается через протеазы лечения (пер. 4).
Транспорт prOE33 через cpSec1 пути
Рисунок 2 . Перевозка prOE33 через cpSec1 пути. Авторадиография [35S]-prOE33 транспорт пробирного используя SE, очищенный cpSecA1 или оба одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Транспорт через cpSec1 пути (рис. 2) может оцениваться через размер сдвиг в зрелых субстрата если подложка содержит горные тилакоидов ориентация сигнала, а также протеазы защиты перевозимых субстрата20.
Интеграция prLHCP через cpSRP пути
Рисунок 3 . Интеграция prLHCP через cpSRP пути. Авторадиография [35S]-prLHCP и пищеварение на продукт mLHCP-d после вставки в тилакоидной мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Включение prLHCP в тилакоидной мембраны через cpSRP пути может оцениваться через thermolysin пищеварение. Сдвиг размер примерно 1,5-2 кДа является показателем успешной мембраны вставки как мембрана защищает uncleaved Зрелые белки от полного протеолиза15. На рисунке 3хорошо видна протеаз защищенный продукт mLHCP-D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изоляция хлоропластов и тилакоидов
Чрезмерная поломки может привести в бедных хлоропласта изоляции и, таким образом, бедных тилакоидов выход после разделения в градиенте. Это лучше для гомогенизации собранного ткань мягко путем обеспечения того, чтобы все материалы погружен до смешивания и пульсирует в 15 s циклов до полной гомогенизации. При необходимости используйте несколько коротких раундов смешивания с меньше ткани в каждом раунде.
Холодильные все материалы, которые вступают в контакт с заготовленной ткани помогает изолированных хлоропластов сохранять активность до 2 часов. Важно сохранить хлоропласты на льду в темноте после изоляции также.
Важно включить магния в буферах, обратившись изолированных тилакоидов. Не это приводит к granal разборки штабелей и критически сказывается на поколения Протон движущей силой после освещения21. Тилакоиды использовались в реакциях транспорта 2 часов после изоляции при хранении на льду и в темноте.
Оптимизация транспортных реакции
Изолированных тилакоидов урегулировать быстро и может привести к неравной Chl эквивалентов между реакций. Таким образом важно перемешать тщательно перед использованием, особенно при настройке большое количество образцов тилакоидов.
ТАТ путь
Эффективности перевозок через ТАТ пути можно уменьшить на чрезмерное стирки тилакоидов с Tha4 (Тата) может быть частично извлеченные из мембраны22. В таких случаях это полезно для уменьшения тилакоидов мыть шаги до транспорта реакции. Кроме того больше освещения раз может улучшить обнаружение, где субстратов плохо переносятся при нормальных условиях.
CpSec1 путь
Когда опробование путь cpSec1, количество cpSecA1 в концентрированной SE должны поддерживать транспорт, но что транспорта может быть слабым. Эффективный транспорт в изолированных тилакоидов могут воспользоваться добавлением очищенный cpSecA1 для определенных белков, хотя стромальные сопровождающим в SE может также помочь увеличить эффективность транспорта15. Кроме того препараты cpSecA1 белка не должны быть заморожены до использования транспорта, как это уменьшает транспортной деятельности. Аналогично замороженные SE является менее эффективным, чем свеже-приготовленный экстракт. Как Tat транспорта длительный инкубационный период в структуре транспорта может помочь с трудным субстратов.
CpSRP путь
Хотя восстановление cpSRP транспорта с использованием отдельных компонентов осуществляется23, это удобно поставить cpSRP43, cpSRP54, и cpFtsY с SE. Thermolysin сопротивления наиболее строгие критерии для LHCP интеграции16, 17, но экстрагирования могут выполняться как хорошо17. Хотя прекурсоры могут часто заморожены и температуре-80 ° C для многих реакций транспорта, prLHCP, подготовленный в vitro синтеза должны использоваться для перевозки сразу же после синтеза без замерзать.
Характеристика Роман субстрата в ориентации путь
В тех случаях, когда неизвестен путь транслокации, принятые Роман субстрат рекомендуется сначала расследовать возможные сигнал пептидов в silico используя аминокислотной последовательности прекурсоров или промежуточной формы. CpTat путь обычно требует аргинин консенсуса мотив конкретной близнецов в пептидной сигнал и не АТФ для успешной перевозки под пар3. В отличие от ТАТ путь путь cpSec1 требует АТФ и cpSecA1 белков. Сбой транспорта в условиях, не имея эти компоненты предлагает путь cpSec120. CpSRP путь требует, что частицы распознавания сигнала в SE. Failed транспорта с использованием очищенной cpSecA1 и АТФ, но отсутствие консенсуса мотив близнецов аргинина в сигнал пептида, предлагает пути cpSRP23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот манускрипт был подготовлен при финансовой поддержке Отдела химических наук, наук о земле и Biosciences, 408 Управление основных энергетических наук Департамента энергетики США через Grant де-SC0017035
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C.
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
