Summary
Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.
Abstract
Chloroplasten zijn de organellen in groene planten verantwoordelijk voor de uitvoering van talrijke onontbeerlijke metabolische pathways, vooral fotosynthese. Binnen de chloroplasten, het thylakoïde membraan systeem herbergt alle de fotosynthetische pigmenten, reactie center complexen en het merendeel van de elektron-vervoerders, en is verantwoordelijk voor de licht-afhankelijke ATP-synthese. Meer dan 90% van chloroplast eiwitten zijn gecodeerd in de kern, vertaald in het cytosol en vervolgens geïmporteerd in de chloroplast. Verdere eiwit vervoer in of over het membraan thylakoïde maakt gebruik van een van de vier trajecten van de translocatie. Hier beschrijven we een hoog rendement methode voor isolatie van vervoer-bevoegde ze uit erwten (Pisum sativum), samen met vervoer testen door middel van de drie energie-afhankelijke cpTat, cpSec1 en cpSRP-gemedieerde trajecten. Deze methoden kunnen experimenten met betrekking tot thylakoïde eiwit lokalisatie, vervoer energetics en de mechanismen van de translocatie van de eiwitten in biologische membranen.
Introduction
Bijna alle van de eiwithoudende machine verantwoordelijk voor goede chloroplast functie moet worden translocated van het cytosol1. Op de chloroplast enveloppen, worden eiwit substraten geïmporteerd door middel van de translocon van het buitenste membraan (TOC) en de translocon van het binnenste membraan (TIC)2. Verder richt aan de thylakoïde membraan en lumen vindt plaats via de twin arginine translocatie (cpTat)3, de secretoire (cpSec1)4, het signaal erkenning deeltje (cpSRP)5en de spontane invoeging trajecten6 . Een methode voor de hoog rendement isolatie van fysiologisch actief chloroplasten en thylakoïde membranen is nodig voor het meten van de energetics en kinetiek van een translocatie-evenement, om te begrijpen van de mechanismen van de divers vervoer in elk traject, en te lokaliseren een bepaalde eiwitten substraat van belang zijn voor een van de zes verschillende compartimenten van de chloroplast.
Het isolement van de membranen van de chloroplast biedt beter experimentele controle over omgevingsfactoren (zoals zout en substraat concentraties, de aanwezigheid van ATP/GTP en pH-omstandigheden) die invloed hebben op de waardering van vervoer energetics en kinetiek. Deze in vitro -omgeving leent zich voor de verkenning van mechanistische details voor translocatie om dezelfde redenen. Bovendien, terwijl Voorspellende software voor lokalisatie van chloroplast eiwitten verbeterd7,8, bieden in vitro vervoer testen een snellere methode voor bevestiging over microscopie gebaseerde fluorescerende testen die vereisen een genetisch gecodeerde fluorescerende tag, plant transformatie en/of specifieke antilichamen. Hier presenteren we protocollen voor chloroplast en thylakoïde isolatie van erwten (Pisum sativum), alsmede voor vervoer assays geoptimaliseerd voor elk van de energie-afhankelijke thylakoïde translocatie trajecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. initiële materialen
- Geniet van ongeveer 55 gram erwten voor 3 uur in 400 mL gedestilleerd water, en dan zaaien in een kunststof dienblad (35 cm x 20 cm x 6 cm) in bodem bedekt met een dun laagje vermiculiet.
- Groeien de lade van erwten bij 20 ° C onder de 12/12 h (50 µE/m2s) licht/donker cyclus voor 9 tot 15 dagen.
- Eiwit substraat volgens een voorkeur voor te bereiden.
Opmerking: Wij hebben bereid proteïne substraten met behulp van een verscheidenheid van methoden, met inbegrip van 1) in vitro transcriptie van gezuiverde plasmiden gevolgd door vertaling met behulp van tarwekiemen extracten of konijn Retikulocyt lysates in aanwezigheid van [3H]-leucine of [35S]-methionine, 2) in vitro vertaling met behulp van een gekoppelde transcriptie/vertaling kit zoals de TnT kits van Promega, met radiolabeling zoals hierboven, en 3) zuivering van overexpressie eiwit in E. coli. Radioactieve in vitro vertaling producten zijn over het algemeen uitgeblust met 50 mM koude aminozuur voorafgaand aan gebruik in vervoer reacties. Elk van deze methoden vereist normaliter wat optimalisatie voor elke nieuwe eiwit-substraat. Zie voor een voorbeeld van een systeem van gekoppelde in vitro , Ling en Jarvis (2016)9.
2. chloroplast isolatie en kwantificering
Opmerking: De eerste stap in de voorbereiding van thylakoiden is het isolement van intact chloroplasten10. Alle materialen moeten koud worden gehouden tijdens de voorbereiding. Resuspensie van chloroplasten moet voorzichtig, worden behandeld als breuk bij deze stap kan latere thylakoïde opbrengst ernstig beperken.
- Naar aanleiding van oplossingen vooraf te bereiden.
- 2 x slijpen Buffer (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7,3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2% BSA.
- 2 x importeren Buffer (2xIB): 100 mM K-Tricine of K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
Opmerking: Concentraties van MgCl2 variërend van 3 mM tot 10 mM zijn gebruikt zonder waarneembare verschillen.
- Bereid een continue dichtheid verloop door centrifugeren van een mengsel van Percoll 15 mL en 15 mL 2xGB 30,900 g in de rotor van een vaste hoek voor 30 min bij 4 ° C met de rem af.
- Oogst ongeveer 25 g van 9-15 dagen oude erwten en meng in 95 mL 1xGB. Een blender met aangescherpte bladen of een Polytron hebben met succes gebruikt. Filteren dit mengsel door ten minste 2 lagen van Miracloth in een trechter.
Opmerking: Beperking van de hoeveelheid weefsel van de stengel is niet nodig maar kan vereenvoudigen het proces van homogenisering, waardoor chloroplast breuk die bij langdurige mengen optreden kan. - Pellet op 3000 g in een swingende emmer rotor voor 5 min bij 4 ° C, en zachtjes resuspendeer in 1 mL 1xGB. Een penseel wellicht de meest zachte resuspensie techniek.
- Laag zorgvuldig de groene schorsing bovenop de Percoll verloop en centrifuge op 8.000 g in een swingende emmer rotor voor 10 min bij 4 ° C met de rem af.
- Zorgvuldig oogst de lagere groene band met intact chloroplasten in een verse buis. Draai de herstelde intact chloroplasten bij 1800 g in een swingende emmer rotor voor 5 min bij 4 ° C, verwijder het supernatant en zachtjes resuspendeer de pellet in 1xIB. Herhaal deze wassen stap eens te meer resuspending in 30 mL 1xIB telkens met de definitieve hersuspensie in 1 mL van 1xIB.
- Om te kwantificeren chlorofyl (Chl) inhoud, meng 10 µL van volledig geresuspendeerde chloroplasten met 5 mL 80% aceton en filteren door filterpapier Whatman 1 (nominale dikte 180 µm). Opnemen van de absorptie bij 720 nm, 663 nm en 645 nm in een spectrofotometer en bereken de concentratie van de Chl met behulp van de volgende formule11:
[Chl] mg/mL = [40.2* (een663 – een720) + 101.4* (een645 – een720)] * 0.1 - Chloroplasten tot 1 mg/mL Chl equivalenten met 1xIB aanpassen.
3. isolatie van ze
Opmerking: Ze zijn bereid door hypotone lysis van intact chloroplasten. Dit wordt bereikt door de chloroplasten aan een hypotone buffer ontbreekt sorbitol bloot te leggen. Geïsoleerde ze kan worden gebruikt voor het analyseren van de translocatie-trajecten, maar stromale extract (SE) moet ook worden geïsoleerd tijdens deze voorbereiding als cpSec1 of cpSRP trajecten moeten worden onderzocht.
- Bereiden van tevoren de volgende oplossingen.
- Hypotone Lysis-buffermengsel: 50 mM K-Tricine of K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.
- 2 x ruwe Stroma Buffer (voor concentratie van SE): 100 mM K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
- Laemmli monster Buffer (voor SDS-pagina, aangevuld met EDTA): 125 mM Tris pH 6.8, SDS 10%, 20% glycerol, 0,05 mg/mL bromophenol blauw, 10% β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.
- Als SE herstel niet nodig is, centrifugeer de intact chloroplasten bij 1.000 g in een swingende emmer rotor voor 6 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer tot 1 mg/mL in hypotone Lysis-buffermengsel. Incubeer op ijs in het donker gedurende 10 minuten, onder af en toe omzwenken.
- Ze herstellen door centrifugatie bij 3.200 g in swingende emmer rotor voor 8 min bij 4 ° C. De ze twee keer, resuspending met 1 tot 2 mL lysisbuffermengsel telkens wassen. Resuspendeer met 1 mL van 1xIB en requantify Chl als boven in het protocol van de isolatie chloroplast.
4. stromale Extract herstel en concentratie
- Als SE herstel noodzakelijk is, verdelen de intact chloroplasten in 600 µL aliquots in 1,5 mL microcentrifuge buizen en centrifugeer elke buis bij 1.000 g in swingende emmer rotor voor 6 min bij 4 ° C.
Opmerking: Dit volume is handig bij het gebruik van 1,5 mL microcentrifuge buizen, die helpt bij het voorkomen van verstoring van de uiteindelijke pellet voor residuele membranen.- Resuspendeer tot 1 mg/mL Chl in hypotone Lysis-buffermengsel en incubeer op ijs in het donker voor 10 min, zoals in stap 3.2.1.
- Centrifugeer elke buis bij 3200 x g in swingende emmer rotor voor 8 min bij 4 ° C en de licht groene of gele supernatant volgende chloroplast lysis overbrengen in een nieuwe microcentrifuge-buis met een gelijk volume 2 x ruwe Stroma Buffer.
- Wassen ze met 2 delen van lysis buffer (onderlinge aanpassing van 0,5 mg/mL) en verzamelen door centrifugeren bij 3.200 g in swingende emmer rotor voor 8 min bij 4 ° C. Resuspendeer tot 1 mg/mL Chl in 1xIB op het ijs.
- Centrifugeer ruwe stroma op 42.000 g in de rotor van een vaste hoek voor 30 min bij 4 ° C tot het verwijderen van de resterende membranen. Immunoblotting voor uiterlijke en innerlijke envelop eiwitten kan worden gebruikt om te controleren of de zuiverheid van de bovendrijvende substantie.
- 95% van het volume van elke buis verzamelen zonder verstoring van de kleine geel-groen-pellet. Opmerking het volume onttrokken aan elke buis.
- Ter voorbereiding van het geconcentreerde stromale extract (SE), de verzamelde supernatants samen en concentreren vijfvoudige met behulp van een 4 mL 30 kDa MWCO concentrator.
Opmerking: SE voorbereid op deze wijze is gelijk aan het stroma afgeleid van chloroplasten bij 2,5 mg/mL Chl. Indien nodig, kan de SE worden geconcentreerd tien keer 5 mg/mL Chl equivalenten. SE zullen gouden kleur en viskeus. In het lab legende RT centrifuge met swingende emmer rotor, vereist dit ongeveer 10 minuten per mL geconcentreerd.
5. vervoer door middel van het cpTat traject
Opmerking: In tegenstelling tot de cpSec1 of de cpSRP, de cpTat-pathway hoeft niet oplosbare componenten of exogenously toegevoegd energiebronnen; slechts licht gestuurde proton stuwende kracht nodig3 is. Daarom alleen geïsoleerde thylakoiden en substraat eiwit nodig zijn voor de bepaling. Typische substraten zijn tussenliggende vormen van de 17 kDa (zoals te zien in Figuur 1) en 23 kDa subeenheden van zuurstof evoluerende complex, iOE17 en iOE23, respectievelijk, maar voorloper formulieren, prOE17 en prOE23, kunnen ook met succes vervoerd worden. Voorloper formulieren hebben bipartiete N-terminale targeting reeks, terwijl tussenliggende vormen alleen de thylakoïde gericht op volgorde.
- Voorbereiden cpTat totale vervoerspakket met 0,33 mg/mL Chl ze, 5 mM ATP uit een voorraad bereid in 1xIB en 8 mM dithiothreitol (DTT) uit een voorraad bereid in 1xIB, op ijs. ATP is niet strikt noodzakelijk is voor deze reactie als uitgevoerd onder verlichting.
- Starten vervoer door de invoering van 1:30 volume door de volume substraat eiwit in het vervoer mengen. Als substraat eiwit niet bereid is in 1xIB, bereiden een 1:1 verdunnen met 2xIB eerst, vervolgens 1:30 volume door de volume van de verdunde substraat gebruiken in het totale vervoerspakket.
Opmerking: Concentraties van substraat zal variëren afhankelijk van de methode van de voorbereiding. Meestal, in vitro preparaten zal zorgen voor nanomolar micromolar bedragen, terwijl overexpressie voor micromolar millimolar bedragen zorgen zal. Detectiemethoden moeten ook worden overwogen, zoals autoradiografie en fluorography gevoeliger dan immunoblotting zijn. - Verlichten van de suspensie in de 80-100 µE/m2s van fotosynthetische actieve straling (PAR) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Als vervoer kinetiek vereist zijn, vooraf equilibreer ze zowel reactie mix op kamertemperatuur en verlichting voor maximaal 30 min.
- Stop de vervoer-reactie met een 8-fold verdunning van ijskoude 1xIB en ze te herstellen door middel van centrifugeren bij 3.200 g in microcentrifuge voor 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder Residuele substraat dat niet heeft zijn vervoerd, resuspendeer de pellet thylakoïde in 120 µL van 1xIB en externe eiwit verteren door toevoeging van 6 µL van 2 mg/mL thermolysin en 10 mM CaCl2 in 1xIB.
- Incubeer de protease-reactie op het ijs gedurende 40 minuten, en vervolgens de protease doven door een verdubbeling van het volume met 25 mM EDTA bereid in 1xIB.
- Ze herstellen door centrifugatie bij 3.200 g in een microcentrifuge voor 5 min bij 4 ° C. Wassen herstelde ze in 120 μL van 5 mM EDTA in 1xIB en overdracht aan een nieuwe buis.
- Centrifugeer bij 3.200 g in een microcentrifuge voor 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer in een juiste hoeveelheid Laemmli monster Buffer aangevuld met 10 mM EDTA. Een volume van 40 µL is meestal genoeg om sporen van substraat op een SDS-pagina gel en conserveert monster voor herhaling gels wanneer dat nodig is.
- Leg monsters in een kokend waterbad voor 10 min en analyseren door SDS-PAGE. Autoradiografie, fluorography, of het westelijke bevlekken van uitheemse of epitoop-gelabelde proteïnen heb met succes gebruikt voor detectie van vervoerde eiwitten.
6. vervoer door middel van het cpSec1 traject
Opmerking: Vervoer door de translocon van de cpSec1 vereist de stromale eiwit cpSecA112,13, die kunnen worden aangeschaft via overexpressie in E. coli14,15 of hersteld door zich te concentreren stroma tijdens thylakoïde isolatie. Een typische substraat is de 33 kDa subeenheid van de zuurstof evoluerende complex (prOE33), zoals te zien in Figuur 2.
- Bereid de cpSec1 totale vervoerspakket met 0,33 mg/mL Chl ze, 0,83 mg/mL Chl gelijkwaardig SE of 1,5 μg van recombinante cpSecA1 en 5 mM ATP op ijs, en incubeer gedurende 10 min. Een typische vervoer reactiemengsel hier is 72 μL, omhoog van 60 μL als gevolg van de toevoeging van de SE.
- Als recombinant cpSecA1 zal worden gebruikt in plaats van de SE, aanpassen van gezuiverde cpSecA1 met een gelijk volume 2xIB, dan verdund tot een geschikte concentratie toe te voegen aan de vervoer-Reacties (bijvoorbeeld 0,75 µg/µL).
Opmerking: Voor lange termijn opslag, cpSecA1 is opgeslagen op het ijs in een gecontroleerde, gekoelde kamer na zuivering als bevriezing schaft activiteit.
- Als recombinant cpSecA1 zal worden gebruikt in plaats van de SE, aanpassen van gezuiverde cpSecA1 met een gelijk volume 2xIB, dan verdund tot een geschikte concentratie toe te voegen aan de vervoer-Reacties (bijvoorbeeld 0,75 µg/µL).
- Starten vervoer door de invoering van 1:10 volume door de volume substraat eiwitten aan het vervoer mengen. Als substraat eiwit niet bereid is in 1xIB, maak een verdunning van 1:1 met 2xIB en 1:10 volume door de volume van de verdunde eiwit toevoegen aan het totale vervoerspakket.
- Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten onder 80 – 100 µE/m2s PAR. Nogmaals, langere tijden nodig kunnen zijn voor kinetiek of bepaalde substraten.
- Na licht behandeling, Verdun 8-fold met ijskoude 1xIB en centrifuge reacties bij 3200 g in microcentrifuge voor 5 min bij 4 ° C.
- Behandelen met thermolysin en doven met EDTA als hierboven in stappen 5.5 via 5.7.
- Centrifugeer bij 3.200 g in microcentrifuge voor 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellet in een juiste hoeveelheid Laemmli monster Buffer aangevuld met 10 mM EDTA. Plaats in kokend waterbad gedurende 10 minuten vóór het laden op SDS-pagina gel.
7. inbrengen door middel van het cpSRP traject
Opmerking: De cpSRP-gemedieerde integratie van licht oogsten van complexe eiwitten (LHCP) te zien in Figuur 3 vereist cpSRP54, cpSRP43 en cpFtsY16. Deze onderdelen worden geleverd tot de reactie van de vervoer door middel van geconcentreerde stromale extract, zoals beschreven voor het cpSec1 transportprotocol.
- Bereiden van het cpSRP vervoer mix met 0,33 mg/mL Chl ze, Chl gelijkwaardig SE 0,83 mg/mL en 5 mM ATP op ijs en incubeer gedurende 10 min.
- Starten vervoer door de invoering van 1:10 volume door de volume substraat eiwitten aan het vervoer mengen. Als substraat eiwit niet bereid is in 1xIB, maak een verdunning van 1:1 met 2xIB en 1:10 volume door de volume van de verdunde eiwit toevoegen aan het totale vervoerspakket.
- Incubeer reactie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in de 80-100 µE/m2s PAR.
- Na licht behandeling, Verdun 8-fold met ijskoude 1xIB en centrifuge reacties bij 3.200 g in microcentrifuge voor 5 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 120 µL van 1xIB.
- Behandelen met thermolysin als hierboven in de punten 5.5 via 5.7. Thermolysin spijsvertering is hier noodzakelijk te beoordelen van succesvolle membraan integratie. Wassen herstelde ze in 120 μL van 5 mM EDTA in 1xIB en overdracht aan een nieuwe buis.
- Centrifugeer bij 3.200 g in microcentrifuge voor 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellet opnieuw in een passende omvang van 2 x Laemmli buffer aangevuld met 10 mM EDTA. Plaats in kokend waterbad gedurende 10 minuten vóór de analyse door SDS-PAGE.
Opmerking: Integratie van volwassen LHCP (mLHCP) wordt beoordeeld door de verschijning van een protease-beschermd afbraakproduct (mLHCP-D) ongeveer 1,5-2 kDa kleiner is dan de uncleaved mLHCP17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te meten de hoeveelheid substraat met succes vervoerd, is het nuttig om één of meer "percentage input" rijstroken. Voor de gegevens hieronder, werd 10% van de reactie van de uiteindelijke vervoer zonder ze gebruikt. Deze "percentage input" helpt ook om het visualiseren van de grootte van het substraat voorloper. Het percentage vertegenwoordigt van een bekende, omschreven hoeveelheid substraat waarmee op vergelijk vervoerd ondergrond tegen en omhoog of omlaag kan worden geschaald als eiwit nodig met behulp van aanvankelijk bereid. Daarnaast is het raadzaam om te laden van minder dan 4 µg Chl equivalenten in een enkele rijstrook op 0,75 mm polyacrylamide gels te vermijden band kromtrekken en smeren. Alle substraten hieronder waren voorbereid en radiolabeled met behulp van in vitro vertaling kits.
Vervoer van iOE17 via cpTat traject
Figuur 1 . Vervoer van iOE17through de cpTat-pathway. Fluorograph van [3H]-iOE17 vervoer assay en thermolysin behandeling van niet-vervoerd substraat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Succesvolle cpTat vervoer van meeste Tat substraten kan worden gedetecteerd door een verschuiving van de grootte van de splitsing van de N-terminale signaal peptide3. In substraten waar geen cleavable signaal peptide18,19 bestaat, is protease behandeling vereist voor het onthullen van het substraat dat het membraan, waardoor hij niet toegankelijk zijn voor de spijsvertering door de protease gekruist. In Figuur 1verwerkt vervoer van iOE17 leidt tot een verschuiving van de grootte van ongeveer 2-3 kDa tussen de geïntroduceerde substraat en de volwassen vorm. Non-vervoerd substraat is aangetast door een protease behandeling (lane 4).
Vervoer van prOE33 via cpSec1 traject
Figuur 2 . Vervoer van prOE33 via cpSec1 traject. Autoradiograph [35S]-prOE33 vervoer assay met behulp van SE, gezuiverde cpSecA1 of beide tegelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Vervoer via de weg van de cpSec1 (Figuur 2) kan worden geëvalueerd door middel van een verschuiving van de grootte van de volwassen substraat als het substraat bevat een cleavable thylakoïde targeting signaal, evenals protease bescherming van vervoerde substraat20.
Integratie van prLHCP via cpSRP traject
Figuur 3 . Integratie van prLHCP via cpSRP traject. Autoradiograph [35S]-prLHCP en de spijsvertering aan het product mLHCP-D na inbrengen in het thylakoïde membraan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Inbrengen van prLHCP in het membraan van de thylakoïde via de cpSRP-pathway kan worden geëvalueerd door thermolysin spijsvertering. Een verschuiving van de grootte van ongeveer 1.5-2 kDa is kenmerkend voor succesvolle membraan invoeging als de membraan de uncleaved volwassen proteïne van volledige proteolyse15 beschermt. In Figuur 3is de protease-beschermd product mLHCP-D duidelijk zichtbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chloroplast en thylakoïde isolement
Buitensporige breuk kan resulteren in slechte chloroplast isolatie en dus slechte thylakoïde opbrengst na scheiding in het verloop. Het is best om het homogeniseren van het geoogste weefsel voorzichtig door ervoor te zorgen dat al het materiaal voor het mengen en pulserende in 15 s-cycli totdat volledig gehomogeniseerd wordt ondergedompeld. Gebruik indien nodig meerdere kortere rondes van mengen met minder weefsel in elke ronde.
Alle materialen die in contact geoogste weefsel komen koel helpt geïsoleerde chloroplasten behouden activiteit omhoog tot 2 uur. Het is belangrijk om te houden van de chloroplasten op ijs in het donker na isolatie evenals.
Het is cruciaal dat magnesium in buffers geïsoleerde ze contact opnemen. Niet te doen leidt tot granal ontstapelen en kritisch is van invloed op de generatie van proton motive force op verlichting21. Ze hebben opgebruikt in vervoer reacties tot 2 uur na isolatie op ijs en in het donker bewaard.
Optimaliseren van Transport reacties
Geïsoleerde ze regelen snel en kan leiden tot ongelijke Chl equivalenten tussen reacties. Als zodanig is het belangrijk om te mengen de ze grondig voorafgaand aan het gebruiken, vooral bij het opzetten van een groot aantal monsters.
Het traject van Tat
Transport efficiency door middel van de Tat-traject kan worden verminderd op overmatig wassen van de ze sinds Tha4 (TatA) kan gedeeltelijk worden geëxtraheerd uit de membraan-22. In dergelijke gevallen is het handig om thylakoïde wassen stappen voorafgaand aan het vervoer reactie. Bovendien kunnen langere tijden van verlichting detectie wanneer substraten slecht worden vervoerd onder normale omstandigheden verbeteren.
Het cpSec1 traject
Wanneer het analyseren van de cpSec1-pathway, moet het bedrag van cpSecA1 in geconcentreerde SE vervoer, steun maar dat vervoer mogelijk zwakke. Efficiënt vervoer in de geïsoleerde ze kan profiteren van de toevoeging van gezuiverde cpSecA1 voor bepaalde eiwitten, hoewel stromale chaperones in SE kunnen ook helpen met het vergroten van de efficiëntie van het vervoer15. Verder, preparaten van cpSecA1 eiwit moeten niet worden bevroren voorafgaand aan gebruik in het vervoer, aangezien dit vervoersactiviteit vermindert. Ook is bevroren SE minder doeltreffend dan vers bereide extract. Zoals in Tat vervoer, kunnen langere incubatie in de totale vervoerspakket helpen met moeilijke ondergronden.
Het cpSRP traject
Hoewel reconstructie van een cpSRP-vervoer met behulp van afzonderlijke componenten uitgevoerd23, is het handig om het leveren van cpSRP43, cpSRP54, en cpFtsY met SE. Thermolysin weerstand is de meest stringente criteria voor LHCP integratie16, 17, maar alkalische extractie kan worden uitgevoerd als goed17. Hoewel precursoren kunnen vaak worden bevroren en bij-80 ° C voor veel reacties van het vervoer opgeslagen, moet prLHCP bereid door in vitro synthese worden gebruikt voor vervoer onmiddellijk na synthese zonder bevriezing.
Karakterisering van een roman substraat is gericht op traject
In gevallen waar het traject van de translocatie genomen door een roman substraat onbekend is, is het raadzaam om eerst onderzoeken mogelijke signaal peptiden in silico met behulp van het aminozuur opeenvolging van de voorloper of tussenvorm. De cpTat-pathway vereist meestal een specifieke twin arginine consensus motief in de peptide signaal en geen ATP voor succesvolle vervoer onder PAR3. In tegenstelling tot de Tat-traject vereist de cpSec1-pathway ATP en het eiwit cpSecA1. Mislukte vervoer in omstandigheden die deze componenten ontbreekt suggereert het cpSec1 traject20. De cpSRP-pathway vereist dat het signaal erkenning deeltje gevonden in de Failed SE. vervoer met behulp van gezuiverde cpSecA1 en ATP, maar een gebrek aan twin arginine consensus motief in de signaal-peptide, stelt de cpSRP route23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit manuscript was bereid met financiering door de Division of Chemical Sciences, Geowetenschappen en Biosciences, 408 Office van de basiswetenschappen van de energie van het ons ministerie van energie door middel van Grant DE-SC0017035
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
