Summary
선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.
Abstract
엽록체는 녹색 식물 수많은 필수 대사 경로, 수행에 대 한 책임에서 세포 특히 광합성. 엽록체, 내 thylakoid 막 시스템 모든 광합성 안료, 반응 센터 복합물, 및 전자 통신 사업자의 대부분 이며 빛 종속 ATP 합성에 대 한 책임. 엽록체 단백질의 90% 이상 핵에서 인코딩, cytosol, 번역 이며 이후에 엽록체를 가져올. 추가 단백질 전송 또는 thylakoid 막에 걸쳐 4 전 경로 중 하나를 사용합니다. 여기, 우리 3 에너지 종속 cpTat, cpSec1, 및 cpSRP 중재 경로 통해 전송 분석 함께 완두콩 (Pisum sativum)에서 전송 유능한 thylakoids의 격리에 대 한 높은 수확량 메서드를 설명합니다. 이러한 메서드를 실험 생물학 막에 걸쳐 thylakoid 단백질 지 방화, 교통에 너 지론, 그리고 단백질 전 좌의 메커니즘에 관련 된 사용.
Introduction
배치할 기계 적절 한 엽록체 기능에 대 한 책임의 거의 모든 cytosol1translocated 해야 합니다. 엽록체 봉투에서 단백질 기판의 외부 막 (TOC) translocon와 내부 막 (TIC)2의 translocon를 통해 가져올 수 있습니다. 더는 thylakoid에 타겟팅 막과 루멘 트윈 아르기닌 전 (cpTat)3,4분 비 (cpSec1), 신호 승인 입자 (cpSRP)5, 그리고 자발적인 삽입 경로6 통해 발생 . 순수 활성 엽록체 및 thylakoid 막의 높은 수율 격리에 대 한 메서드는 필요한에 너 지론과 전 이벤트, 각 통로에 다양 한 전송 메커니즘을 이해 하 고 지역화의 활동을 측정 하는 엽록체의 6 가지 구획에 관심의 특정 단백질 기질.
더 나은 실험 제어 전송에 너 지론의 측정에 영향을 주는 환경 요인 (예: 소금, 기질 농도, pH 조건과 ATP/GTP의 존재)를 제공 하는 엽록체에서 막의 분리 및 속도 론입니다. 이 체 외에서 환경에 빌려준다 전 좌의 기계적 세부 탐사 같은 이유로. 또한, 엽록체 단백질의 지역화에 대 한 예측 소프트웨어7,8개선 했다, 하는 동안 전송 분석 생체 외에서 제공 확인에 대 한 더 빠른 방법 현미경-기반 형광 분석을 인코딩된 유전자 형광 태그, 공장 변환 및 특정 항 체를 필요 합니다. 여기, 엽록체 및 thylakoid 격리 완두콩 (Pisum sativum)에서 뿐만 아니라 에너지 의존 thylakoid 전 좌 통로의 각각에 최적화 된 전송 분석 실험 프로토콜 선물이.
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Protocol
1. 초기 자료
- 완두콩의 약 55 g 400 ml 증류수, 3 시간 담근 다 고 다음 플라스틱 쟁반에 뿌리 다 (35 cm x 20 cm x 6 cm) 질 석의 얇은 층으로 덮여 토양에.
- 9 ~ 15 일에 대 한 12/12 h 명암 (50 µE/m2s) 주기에서 20 ° C에서 완두콩의 트레이 성장.
- 선호 하는 방법에 따라 단백질 기질을 준비 합니다.
참고: 우리는 다양 한 1 등 하는 방법 사용 하 여 단백질 기판 준비) 순화 된 플라스 미드에서 녹음 방송 생체 외에서 다음 밀 배아 추출 물 또는 토끼 reticulocyte lysates [3H]의 존재를 사용 하 여 번역-신 또는 [35S]-메티오닌, 2) TnT 같은 결합 된 전사/번역 키트를 사용 하 여 체 외에서 번역 Promega radiolabeling 위에서, 함께 그리고 3에서 키트) 대장균에 overexpressed 단백질의 정화. 번역 제품 방사성 체 외에 일반적으로 50 m m 감기 아미노산 전송 반응에서 사용 하기 전에 침묵 된다. 이러한 각 메서드는 일반적으로 각 새로운 단백질 기질에 대 한 몇 가지 최적화를 필요합니다. 결합 된 생체 외에서 시스템의 예, 링 및 자비스 참조 (2016)9.
2. 엽록체 절연 및 정량화
참고: thylakoids의 준비의 첫 번째 단계는 그대로 엽록체10의 격리. 모든 재료 준비 하는 동안 차가운 유지 되어야 한다. 엽록체의 물의 Resuspension이이 단계에서 파손 이후 thylakoid 수율 제한할 수로 부드럽게 처리 되어야 합니다.
- 다음 솔루션을 미리 준비 합니다.
- 2 분쇄 버퍼 (2xGB) x: 100 mM HEPES K pH 7.3 660 m m sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0.2 %BSA.
- 가져오기 버퍼 (2xIB) x 2: 100 m m K-Tricine 또는 K HEPES pH 8.0, sorbitol 660 m m, 8 m m MgCl2.
참고: MgCl2 3 m m에서 10mm까지 농도 현저한 차이 없이 사용 되었습니다.
- Percoll의 15 mL와 4 ° C에서 30 분 동안 고정된 각도 터에서 30,900 g 에 2xGB의 15 mL의 혼합물 브레이크 centrifuging 여 연속 밀도 그라디언트를 준비 합니다.
- 9 월 15 일 오래 된 완두콩의 약 25 g을 수확 하 고 1xGB의 95 mL에 균질. 날카롭게 블레이드와 함께 믹서 기 또는 Polytron는 성공적으로 사용 되었습니다. 퍼 널에서 Miracloth의 2 층을 통해이 혼합물을 필터링 합니다.
참고: 줄기 조직의 양을 제한 필요 하지 않습니다 하지만 수 있습니다 쉽게 균질 화 과정, 장시간 혼합 된 발생할 수 있는 엽록체 파손을 줄일. - 4 ° C에서 5 분에 대 한 진동 물통 회전자에서 3000 g 에서 펠 릿과 1xGB의 1 mL에 부드럽게 resuspend. 그림 붓은 가장 부드러운 물의 resuspension 기술 있을 수 있습니다.
- 신중 하 게 떨어져 브레이크 Percoll 그라데이션 및 4 ° C에서 10 분에 대 한 진동 물통 회전자에 8000 g 에서 원심 분리기 녹색 정지 레이어.
- 조심 스럽게 수확 신선한 관으로 그대로 엽록체를 포함 하는 낮은 녹색 밴드. 4 ° C에서 5 분에 대 한 진동 물통 회전자에 1800 g 에서 복구 된 그대로 엽록체를 회전 하 고, 삭제는 상쾌한 부드럽게 펠 릿 1xIB에 resuspend. 이 세척 단계 한 번 더, 1xIB의 30 mL에 resuspending와 1xIB의 1 mL에 마지막 물의 resuspension 때마다, 반복 합니다.
- 엽록소 (Chl) 콘텐츠를 계량, 완전히 resuspended 엽록체의 10 µ L 80% 아세톤 및 Whatman 1 필터 종이 (공칭 두께 180 µ m)을 통해 필터의 5 mL와 혼합 한다. 720에서 흡 광도 기록 nm, 663 nm와 645 nm는 분 광 광도 계에 사용 하 여 다음 수식11Chl 농도 계산:
[Chl] mg/mL = [40.2* (는663 -720) + 101.4* (645 -720)] * 0.1 - 1 mg/mL 1xIB와 Chl 등가물에 엽록체를 조정 합니다.
3입니다. Thylakoids의 격리
참고: Thylakoids 그대로 엽록체의 침투성 세포에 의해 준비 된다. 이 소형 버퍼 sorbitol 부족에 엽록체를 노출 하 여 이루어집니다. 격리 된 thylakoids 전 좌 통로 시 금에 사용할 수 있습니다 하지만 stromal 추출 (SE) 또한 격리 되어야이 준비 하는 동안 cpSec1 또는 cpSRP 경로 조사 하는 경우.
- 다음 솔루션을 미리 준비 합니다.
- 침투성 세포의 용 해 버퍼: 50 m m K-Tricine 또는 K HEPES 산도 8.0, 8 m m MgCl2.
- 2 원유 기질 버퍼 (SE의 농도)에 대 한 x: 100 mM HEPES K pH 8.0, sorbitol 660 m m, 8 m m MgCl2.
- (페이지에 대 한 SDS-EDTA와 보충) Laemmli 샘플 버퍼: 125 mM Tris pH 6.8, 10 %SDS, 20% 글리세롤, 0.05 mg/mL bromophenol 블루, 10% β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.
- SE 복구 필요 하지 않은 경우 원심 그대로 엽록체에서 4 ° c.에 6 분에 대 한 진동 물통 회전자에 1000 g
- 삭제는 상쾌한 고 침투성 세포의 용 해 버퍼에 1 mg/mL를 resuspend. 가끔 혼합과 10 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.
- 4 ° c.에 8 분 통 터 스윙에 3200 g 에서 centrifuging 여 thylakoids를 복구 각 시간에 세포의 용 해 버퍼의 1 ~ 2 mL와 resuspending thylakoids 두 번 씻는 다. 1xIB의 1 mL와 resuspend 그리고 엽록체 격리 프로토콜에서 위에 Chl를 requantify.
4. 실질 추출 복구 및 농도
- SE 복구 필요한 경우 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 600 µ L aliquots에 그대로 엽록체를 분할 하 고 각 관 4 ° c.에 6 분 통 터 스윙에서 1000 g 에서 원심
참고:이 볼륨은 편리한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하는 경우 잔여 세포 막에 대 한 최종 펠 릿의 소요를 방지 하는 데 도움이.- 1 mg/mL Chl 침투성 세포의 용 해 버퍼에서를 resuspend 하 고 단계 3.2.1에서 10 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.
- 각 관에 4 ° C에서 8 분 통 터 스윙 3200 x g 에서 원심 하 고 원유 기질 버퍼 x 2의 동등한 양 가진 새로운 microcentrifuge 튜브에는 가벼운 녹색 또는 노란색 표면에 뜨는 다음 엽록체 세포를 전송.
- Thylakoids (가깝게 0.5 mg/mL)는 세포의 용 해 버퍼의 2 양으로 세척 및 4 ° c.에 8 분 통 터 스윙에 3200 g 에서 원심 분리 하 여 수집 1 mg/ml Chl 얼음에 1xIB에 resuspend.
- 42000 g 잔류 막 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 고정된 각도 터에서에서 원유 기질 원심 외부 및 내부 봉투 단백질을 위한 Immunoblotting는 상쾌한의 순도 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.
- 작은 노란색-녹색 펠 렛을 방해 하지 않고 각 관에서 볼륨의 95%를 수집 합니다. 각 관에서 가져온 볼륨 note
- 집중된 stromal 추출 (SE)를 준비 하려면 수집된 supernatants 수영장 그리고 배 4 mL 30 kDa MWCO 집중 장치를 사용 하 여 집중.
참고:이 방식으로 준비 하는 SE는 2.5 mg/mL Chl.에서 엽록체에서 파생 된 기질 필요한 경우 SE 5 mg/mL Chl 등가물을 10 배 집중 될 수 있습니다. SE 색상에 황금과 점도 있을 것입니다. 진동 물통 회전자와 랩의 전설 RT 원심 분리기에이 집중 하는 mL 당 약 10 분 필요 합니다.
5. cpTat 통로 통해 전송
참고: cpSec1 또는 cpSRP, 달리 cpTat 통로 수용 성 구성 요소를 요구 하지 않는다 또는 것 추가 에너지 소스; 빛 주도 양성자 동기 힘만 필요한3입니다. 따라서만 고립 된 thylakoids 및 기질 단백질 분석 결과 대 한 필요는. 전형적인 기판은 ( 그림 1에서 보이는) 것과 같이 17 kDa의 중간 형태와 산소 진화 복합물, iOE17 및 iOE23, 23 kDa subunits 각각, 그러나 전조 폼, prOE17 및 prOE23, 또한 수송 될 수 있다 성공적으로. 중간 형태는 시퀀스를 대상으로 하는 thylakoid만 동안 선구자 형태는 전체이 분 N 터미널 대상 시퀀스를, 있다.
- Chl thylakoids, 1xIB, 및 1xIB, 얼음에 주식에서 8 m m dithiothreitol (DTT)에 주식에서 5mm ATP cpTat 전송 혼합 0.33 mg/mL를 준비 합니다. 조명 아래에서 실시 하는 경우 ATP 엄격 하 게이 반응을 위한 필요 하지 않습니다.
- 1시 30분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 전송에서 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 희석 먼저, 다음 사용 하 여 1:30 볼륨으로 볼륨 희석된 기판의 전송 조합에 1: 1을 준비.
참고: 기판의 농도 준비 방법에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 생체 외에서 준비 overexpression micromolar millimolar 금액에 대 한 허용 됩니다 nanomolar micromolar 금액을 허용 합니다. Autoradiography와 fluorography는 immunoblotting 보다 더 민감한, 검출 방법 또한 고려 되어야 한다. - 실 온에서 10 분 동안 photosynthetically 활성 방사선 (파)의 80-100 µE/m2s 정지 밝히는. 전송 속도 론 필요한 경우 미리 두 thylakoids equilibrate 그리고 반응 실내 온도에 혼합 하 고 30 분 최대 조명.
- 얼음 처럼 차가운 1xIB의 원죄 희석와 전송 반응을 중지 및 4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 원심 분리 하 여 thylakoids를 복구
- 잔여 기판 이송 하지가 제거 하 고 1xIB의 120 µ L에서 thylakoid 펠 릿 resuspend 2 mg/mL thermolysin와 10mm CaCl2 1xIB에서의 6 µ L의 추가 의해 외부 단백질을 소화.
- 40 분 동안 얼음에 효소 반응 품 어 그리고 25 mM EDTA 1xIB에 있는 볼륨을 두 배로 protease를 끄다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuging 여 thylakoids를 복구 1xIB에 새로운 튜브에 5 mM EDTA의 120 μ에 복구 된 thylakoids를 씻어.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 원심 10 mM EDTA와 보충 Laemmli 샘플 버퍼의 적절 한 볼륨에서 resuspend. 40 µ L의 볼륨은 일반적으로 충분히 SDS 페이지 젤에 기판 감지 하 고 필요한 경우 반복 젤에 대 한 샘플을 보존.
- 10 분 동안 끓는 물 욕조에 샘플을 놓고 SDS-PAGE로 분석 합니다. Autoradiography, fluorography, 또는 비-네이티브 또는 피토 프 태그 단백질의 서 부 럽 수송된 단백질의 탐지를 위해 성공적으로 사용 되어 왔습니다.
6. cpSec1 통로 통해 전송
참고: cpSec1 translocon 통해 전송 필요 stromal 단백질 cpSecA112,13, 대장균14,15 overexpression 통해 조달 하거나 기질을 집중 하 여 복구할 수 있는 동안 thylakoid 격리. 그림 2에서 보듯이 전형적인 기판 (prOE33), 복잡 한 진화 하는 산소의 33 kDa 소 단위입니다.
- Chl thylakoids, 0.83 mg/mL Chl 해당 SE 또는 재조합 cpSecA1, 그리고 5mm 얼음, ATP의 1.5 μ g 0.33 mg/mL cpSec1 전송 믹스를 준비 하 고 10 분 동안 품 어. 여기는 일반적인 전송 반응 혼합물 때문에 SE 추가 60 μ에서 72 μ, 최대입니다.
- 재조합 cpSecA1 SE 대신 사용 됩니다, 순화 cpSecA1 2xIB의 동일한 볼륨을 조정할 경우 전송 반응 (예를 들어, 0.75 µ g / µ L)에 추가 하는 편리한 농도에 희석.
참고: 긴 기간 저장을 위해 cpSecA1에 저장 된 제어, 냉장 실에 얼음으로 정화 후 동결 곧 활동.
- 재조합 cpSecA1 SE 대신 사용 됩니다, 순화 cpSecA1 2xIB의 동일한 볼륨을 조정할 경우 전송 반응 (예를 들어, 0.75 µ g / µ L)에 추가 하는 편리한 농도에 희석.
- 1시 10분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 수송 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 1:1 희석을 준비 하 고 전송에 1:10 희석된 단백질의 볼륨으로 볼륨을 추가.
- 아래 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어 80-100 µE/m2의파. 다시 말하지만, 긴 시간 활동 또는 특정 기판에 대 한 필요할 수 있습니다.
- 가벼운 치료 후 희석 8-fold microcentrifuge 4 ° c.에 5 분에서 3200 g 에서 얼음 처럼 차가운 1xIB 및 원심 분리기 반응
- Thermolysin와 함께 취급 하 고 5.7 통해 단계 5.5에서 이상으로 EDTA와 끄다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuge 고 Laemmli 샘플 버퍼 10 mM EDTA와 보충의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 resuspend. SDS 페이지 젤에 로딩 하기 전에 10 분 동안 물 목욕을 끓는 장소.
7입니다. 삽입 cpSRP 통로 통해
참고: cpSRP54, cpSRP43, 및 cpFtsY16빛 수확 하는 복잡 한 단백질 (LHCP) 그림 3의 cpSRP 중재 통합 필요 합니다. 이러한 구성 요소는 cpSec1 전송 프로토콜에 대 한 설명 된 대로 집중된 stromal 추출 통해 전송 반응에 제공 됩니다.
- cpSRP을 준비 얼음에 0.33 mg/mL Chl thylakoids, 0.83 mg/mL Chl 해당 SE, 그리고 5mm ATP 혼합을 수송 하 고 10 분 동안 품 어.
- 1시 10분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 수송 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 1:1 희석을 준비 하 고 전송에 1:10 희석된 단백질의 볼륨으로 볼륨을 추가.
- 80-100 µE/m2의파에에서 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어.
- 가벼운 치료 후 희석 8-fold microcentrifuge 4 ° c.에서 5 분에 3, 200 g 에 얼음 처럼 차가운 1xIB 및 원심 분리기 반응 상쾌한 삭제 하 고 1xIB의 120 µ L에 펠 릿을 resuspend.
- 섹션 5.7 통해 5.5 이상으로 thermolysin와 함께 취급 합니다. Thermolysin 소화 성공적인 막 통합을 평가 하기 위해 여기 필요 하다. 1xIB에 새로운 튜브에 5 mM EDTA의 120 μ에 복구 된 thylakoids를 씻어.
- 4 ° C에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuge 고 10mm EDTA로 보완 하는 2 x Laemmli 버퍼의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 다시 resuspend. 끓는 SDS 페이지 분석 전에 10 분 동안 물을 욕조에 배치 합니다.
참고: 성숙한 LHCP (mLHCP)의 통합 저하 효소 보호 제품 (mLHCP-D)의 외관에 의해 평가 약 1.5-2 kDa uncleaved mLHCP17보다 작은.
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Representative Results
성공적으로 수송 하는 기판의 크기를 측정 하기 위해 하나 이상의 "백분율 입력" 차선을 포함 하도록 유용 합니다. 아래 제시 하는 데이터에 대 한 마지막 전송 반응 없이 thylakoids의 10% 사용 되었다. 이 "백분율 입력" 또한 전조 기판의 크기를 시각화 하는 데 도움이. 비율에 대 한 수송 비교 기판에는 기판의 알려진, 정의 된 금액을 나타내고 단백질 준비 필요한 사용 하 여 처음으로 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 또한, 그것은 0.75 m m polyacrylamide 젤을 피하기 위해 밴드를 휘게 하 고 번짐에 하나의 차선에서 Chl 등가물의 미만 4 µ g를 로드 하는 것이 좋습니다. 모든 기판 아래 준비 했다 하 고 생체 외에서 번역 키트를 사용 하 여 방사선.
CpTat 통로 통해 iOE17의 전송
그림 1 . IOE17through의 cpTat 경로 전송 합니다. [3H] Fluorograph-수송 비 기판의 iOE17 전송 분석 결과 및 thermolysin 치료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
대부분의 문신 기판의 성공적인 cpTat 전송 크기 변화는 N 맨끝 신호 펩 티 드3의 분열에 의해 감지할 수 있습니다. 기판 아무 쪼갤 신호 펩 티 드 있는18,19, 효소 치료 함으로써는 효소에 의해 소화에 액세스할 수 없게 되는 막 넘어 기판 공개 해야 합니다. 그림 1에서 도입된 된 기질과 성숙 사이 약 2-3 kDa의 크기 변화에 iOE17 결과의 전송 양식 처리. 비 수송 기질 효소 치료 (4 차선)를 통해 저하 됩니다.
CpSec1 통로 통해 prOE33의 전송
그림 2 . CpSec1 통로 통해 prOE33의 수송입니다. [35S] autoradiograph-prOE33 전송 분석 결과 동시에 SE, 순화 cpSecA1, 또는 둘 다를 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
CpSec1 통로 (그림 2)를 통해 전송 기판 이송된 기판20의 효소 보호 뿐만 아니라 신호를 대상으로 쪼갤 thylakoid 있으면 성숙 기판의 크기 변화를 통해 평가할 수 있습니다.
CpSRP 통로 통해 prLHCP의 통합
그림 3 . CpSRP 통로 통해 prLHCP의 통합입니다. [35S] autoradiograph-prLHCP와 thylakoid 막에 삽입 후 제품 mLHCP-D를 소화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
PrLHCP의 cpSRP 통로 통해 thylakoid 막에 삽입 thermolysin 소화를 통해 평가할 수 있습니다. 약 1.5-2 kDa 크기 변화의 완전 한 베이스15에서 uncleaved 성숙한 단백질을 보호 하는 막으로 성공적인 막 삽입의 나타내는 것입니다. 그림 3에서는 효소 보호 제품 mLHCP-D 명확 하 게 표시 됩니다.
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Discussion
엽록체 및 Thylakoid 절연
과도 한 파손 될 수 있습니다 가난한 엽록체에서 격리 하 고 따라서 가난한 thylakoid에서에서 분리 후 항복. 그것은 모든 재료 혼합 및 완전히 무 균 때까지 15 s 사이클에서 펄스 전에 침수는 함으로써 부드럽게 수확된 조직 균질 최고의. 필요한 경우 여러 개의 짧은 라운드의 각 라운드에서 적은 조직으로 혼합 사용 합니다.
수확된 조직을 접촉 하는 모든 자료를 냉동 2 시간 최대 활동을 유지 하기 위해 고립 된 엽록체 수 있습니다. 그것은 또한 격리 후 어둠 속에서 얼음에 엽록체를 유지 하는 것이 중요입니다.
그것은 고립 된 thylakoids를 접촉 하는 버퍼에 마그네슘을 포함 하도록 중요 합니다. 이렇게 하지 않는 granal destacking 귀착되 고 비판적으로 조명21위에 양성자 동기 힘의 생성을 영향을 줍니다. Thylakoids 전송 반응에서 2 시간 후에 절연 어둠 속에서 얼음에 보관 하는 경우에 사용 되어 왔습니다.
전송 반응 최적화
격리 된 thylakoids 빠르게 정착 하 고 불평등 Chl 상응 반응 사이에서 발생할 수 있습니다. 이와 같이, 그것은 철저 하 게 샘플의 큰 숫자를 설정 하는 경우에 특히, 사용 하기 전에 thylakoids를 혼합 하는 것이 중요.
문신 통로
문신 경로 통해 전송 효율 Tha4 이후는 thylakoids의 과도 한 세척에 감소 될 수 있다 (타 타) 막22에서 부분적으로 추출 될 수 있다. 이러한 경우에 전송 반응 이전 thylakoid 세척 단계를 줄이기 위해 도움이 됩니다. 또한, 긴 조명 시간 기판은 일반적인 조건에서 수송 제대로 감지를 개선할 수 있습니다.
CpSec1 경로
CpSec1 통로 시 금 때 전송 약한 있을 수 있습니다 하지만 그 집중된 SE에 cpSecA1의 양을 전송, 지원 해야 합니다. 격리 된 thylakoids에 효율적인 교통 수 있습니다 SE stromal 보호자도 전송15의 효율성을 증가 도움이 될 수 있지만 특정 단백질에 대 한 정화 cpSecA1의 추가 혜택을. 또한, cpSecA1 단백질의 준비 해야 하지 동결 전송, 사용 전에이 전송 활동을 줄일 수 없습니다. 마찬가지로, 냉동된 SE 갓된 추출 보다 덜 효과적 이다. 문신 전송에서 전송 믹스에 더 이상 부 화 기간 어려운 기판 도울 수 있습니다.
CpSRP 경로
개별 구성 요소를 사용 하 여 cpSRP 전송의 재구성 수행된23동안 cpSRP43, cpSRP54, 제공 하는 편리와 SE Thermolysin 저항 cpFtsY는 LHCP 통합16에 대 한 가장 엄격한 기준 17, 그러나 알칼리 성 추출 잘17으로 수행할 수 있습니다. 선구자 자주 동결 하 고 많은 전송 반응-80 ° C에서 저장 수 있습니다, 하는 동안 시험관에서 합성에 의해 준비 하는 prLHCP 동결 없이 합성 후 즉시 전송에 대 한 사용 되어야 한다.
소설 기판의 특성의 경로 대상으로
어디 새로운 기판에 의해 촬영 전 좌 통로 알의 경우, 그것은 먼저 가능한 신호 펩 티 드에서 실리콘에 선구자 또는 중간 형태로의 아미노산 시퀀스를 사용 하 여 조사 하는 것이 좋습니다. CpTat 통로 일반적으로 파3에서 성공적인 전송에 대 한 신호 펩 티 드에 아무 ATP 특정 트윈 아르기닌 합의 모티프를 필요합니다. 문신 통로 달리 cpSec1 통로 ATP와 cpSecA1 단백질을 요구 한다. 이러한 구성 요소 부족 조건에서 실패 한 전송 cpSec1 통로20를 제안 합니다. CpSRP 통로 순화 cpSecA1와 ATP를 사용 하 여 전송 하지만 신호 펩 티 드에 트윈 아르기닌 합의 모티프의 부족 cpSRP 통로23신호 승인 입자 SE 실패에서 발견 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 원고는 화학 과학의 부, Geosciences, 생물 과학, 미국 에너지 부 통해 부여 드-SC0017035의 기본적인 에너지 과학의 408 사무실에 의해 자금으로 준비 된
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
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