Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.

Abstract

Mehrere Techniken basieren auf dem Nachweis von Fluoreszenzsignalen, um Phänomene zu identifizieren oder zu untersuchen oder Funktionen aufzuklären. Die Trennung dieser Fluoreszenzsignale erwies sich bis zum Aufkommen der hyperspektralen Bildgebung als umständlich, bei der Fluoreszenzquellen voneinander sowie von Hintergrundsignalen und Autofluoreszenz getrennt werden können (angesichts der Kenntnis ihrer spektralen Unterschriften). Die traditionelle hyperspektrale Bildgebung beim Emissionsscannen leidet jedoch unter langsamen Erfassungszeiten und niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen aufgrund der notwendigen Filterung sowohl von Anregungs- als auch von Emissionslicht. Es wurde bereits gezeigt, dass die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen die erforderliche Erfassungszeit reduziert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Daten erhöht. Mit kommerziell erhältlichen Geräten beschreibt dieses Protokoll, wie ein hyperspektrales Mikroskopkopiesystem für die Anregung, das Scannen von Hyperspektralbildern zusammenbaut, kalibriert und verwendet wird, um Signale von mehreren Fluoreszenzquellen in einer einzigen Probe zu trennen. Obwohl diese Technik für die mikroskopische Bildgebung von Zellen und Geweben sehr anwendbar ist, kann sie auch für jede Art von Experiment mit Fluoreszenz nützlich sein, bei dem es möglich ist, Anregungswellenlängen zu variieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: chemische Bildgebung, Umweltanwendungen, Augenpflege, Lebensmittelwissenschaft, Forensik, Medizin und Mineralogie.

Introduction

Spektrale Bildgebung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden und wird durch mehrere Begriffe1,2,3,4bezeichnet. Im Allgemeinen bezieht sich die Spektralbildgebung auf Daten, die in mindestens zwei räumlichen Dimensionen und einer Spektraldimension erfasst wurden. Multispektrale und hyperspektrale Bildgebung unterscheiden sich am häufigsten durch die Anzahl der Wellenlängenbänder oder ob die Spektralbänder zusammenhängend sind1. Für diese Anwendung werden hyperspektrale Daten definiert als Spektraldaten, die mit zusammenhängenden Wellenlängenbändern erfasst werden, die durch den Abstand der mittleren Wellenlängen erreicht werden, nicht weniger als die Hälfte der vollen Breite bei halbmaximaler Breite (FWHM) jedes Bandpassfilters, der für die Anregung verwendet wird (d. h. 5 nm Wellenlängenabstand für Bandpassfilter mit 14-20 nm Bandbreiten). Die Kontinuität der Datenbänder ermöglicht ein Oversampling des Datensatzes, wodurch sichergestellt wird, dass die Nyquist-Kriterien beim Sampling der Spektraldomäne erfüllt sind.

Hyperspektrale Bildgebung wurde von der NASA in den 1970er und 1980er Jahren in Verbindung mit dem ersten Landsat-Satelliten5,6entwickelt. Das Sammeln von Daten aus mehreren zusammenhängenden Spektralbändern ermöglichte die Erzeugung eines Strahlungsspektrums jedes Pixels. Die Identifizierung und Definition des Strahlungsspektrums einzelner Komponenten ermöglichte es, Oberflächenmaterialien nicht nur anhand ihrer charakteristischen Spektren zu erkennen, sondern auch intervenierende Signale, wie z.B. Schwankungen des Signals durch atmosphärischen Bedingungen. Das Konzept der Detektion von Materialien anhand ihrer charakteristischen Spektren wurde 1996 auf biologische Systeme angewandt, als Schröck et al. Kombinationen von fünf verschiedenen Fluorophoren und ihren bekannten Spektren verwendeten, um markierte Chromosomen in einem Prozess zu unterscheiden, der als spektrale Karyotypisierung7. Diese Technik wurde im Jahr 2000 von Tsurui et al. für die Fluoreszenzbildgebung von Gewebeproben ausgearbeitet, wobei sieben fluoreszierende Farbstoffe und Singularwertzersetzung verwendet wurden, um eine spektrale Trennung jedes Pixels in lineare Kombinationen von Spektren in der Referenzzuteilung zu erreichen. Bibliothek8. Ähnlich wie ihre Fernerkundungs-Gegenstücke kann der Beitrag jedes bekannten Fluorophors aus dem hyperspektralen Bild berechnet werden, wobei a priori Informationen über das Spektrum jedes Fluorophors gegeben sind.

Hyperspektrale Bildgebung wurde auch in den Bereichen Landwirtschaft9, Astronomie10, Biomedizin11, chemische Bildgebung12, Umweltanwendungen13, Augenpflege14, Lebensmittelwissenschaft15, Forensische Wissenschaft16,17, medizinische Wissenschaft18, Mineralogie19, und Überwachung20. Eine wesentliche Einschränkung der aktuellen hyperspektralen Bildgebungssysteme des Fluoreszenzmikroskops besteht darin, dass die standardmäßige hyperspektrale Bildgebungstechnologie Fluoreszenzsignale in schmalen Bändern isoliert, indem sie zuerst das Anregungslicht filtert, um die Anregung der Probe zu steuern, 2) weitere Filterung emittiertes Licht, um die Fluoreszenzemission in schmale Bänder zu trennen, die später mathematisch getrennt werden können21. Durch das Filtern sowohl der Anregungsbeleuchtung als auch der emittierten Fluoreszenz wird die Menge des verfügbaren Signals reduziert, was das Signal-Rausch-Verhältnis senkt und lange Erfassungszeiten erfordert. Das niedrige Signal und die langen Erfassungszeiten begrenzen die Anwendbarkeit der hyperspektralen Bildgebung als Diagnostisches Werkzeug.

Es wurde eine bildgebende Modalität entwickelt, die hyperspektrale Bildgebung nutzt, aber das verfügbare Signal steigert und dadurch die erforderliche Erfassungszeit21,22reduziert. Diese neue Modalität, die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen genannt wird, erfasst spektrale Bilddaten, indem sie die Anregungswellenlänge variiert und ein breites Spektrum emittierten Lichts sammelt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Technik im Vergleich zu Emissionsscantechniken21,22Größenordnungen im Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses ist weitgehend auf den weiträumigen (ca. 600 nm) von Emissionslicht, der erkannt wird, während spezifität durch Filterung nur des Anregungslichts anstelle der Fluoreszenzemission gewährleistet wird. Dadurch erreicht das gesamte emittierte Licht (für jede Anregungswellenlänge) den Detektor21. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Autofluoreszenz von exogenen Etiketten zu unterscheiden. Darüber hinaus reduziert die Möglichkeit, die Erfassungszeit durch erhöhtes nachweisbares Signal zu reduzieren, die Gefahr von Photobleichungen und ermöglicht Spektralscans mit einer Erfassungsrate, die für die spektrale Video-Bildgebung akzeptabel ist.

Ziel dieses Protokolls ist es, als Datenerfassungsleitfaden für die anregend-scannende hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zu dienen. Darüber hinaus sind Beschreibungen enthalten, die helfen, den Lichtpfad und die Hardware zu verstehen. Ebenfalls beschrieben ist die Implementierung von Open-Source-Software für ein anregendes hyperspektrales Bildgebungsmikroskop. Schließlich werden Beschreibungen bereitgestellt, wie das System auf einen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert, Software- und Hardwareeinstellungen für genaue Ergebnisse angepasst und das erkannte Signal in Beiträge einzelner Komponenten entgemischt werden kann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Geräteeinrichtung

  1. Lichtquelle: Wählen Sie eine Breitband-Spektrallichtquelle mit hoher Leistung und hoher Kollimation (für diese Studien wurde eine 300 W Xe Lichtbogenlampe verwendet).
  2. Shutter (optional): Fügen Sie einen Verschluss zum optischen Pfad hinzu, um die Photobleichung für die Zeitraffer-Bildgebung zu reduzieren.
  3. Tunable Filtersystem: verfügen über eine mechanische Tuning-Baugruppe und einen Dünnschicht-Tunable-Filter (TFTF), um den gewünschten wellenlängenverstellbaren Anregungsbereich (z. B. 360-485 nm) zu ermöglichen.
  4. Mikroskop: Verwenden Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten dichroitischen Filterrevolver und einem Controller.
    1. Fluoreszenzfilterwürfel: Einen Langpass-Fluoreszenzfilterwürfel montieren. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wählen Sie einen dichroitischen Spiegel und einen Langpass-Emissionsfilter bei derselben Wellenlänge, um eine optimale Trennung der Anregung von Emissionslicht (z. B. 495 nm) zu erreichen.
    2. Ziel: Verwenden Sie ein geeignetes apochromatisches Ziel, um einen gleichmäßigen Fokus über den für das Experiment verwendeten Wellenlängenbereich zu gewährleisten (für diese Studie wurde ein 60-faches Wasserobjektiv verwendet).
    3. Automatisierte Phase (optional): Verwenden Sie eine automatisierte Stufe für die schnelle Abtastung mehrerer Sichtfelder und/oder sehr großer Felder durch Bildnähte. Kalibrieren Sie die Bühne mit dem Objektiv und der Kamera.
  5. Kamera: Wählen Sie eine geeignete Kamera aus, um die räumlicheAuflösung, Empfindlichkeit und Geräuschanforderungen des Experiments zu erreichen (dieses System nutzte eine hochempfindliche sCMOS-Kamera).

2. Akquisitionssoftware

  1. Wählen Sie ein Softwarepaket aus, das eine unabhängige Steuerung jeder Hardwarekomponente ermöglicht, z. B. Micro-Manager.
    1. Erstellen der Konfigurationsdatei: Die Konfigurationsdatei ist ein gespeicherter Satz von Instrumenten und Anweisungen, die Micro-Manager für den Betrieb der Systemhardware lädt. Um eine Konfigurationsdatei zu erstellen, klicken Sie auf Extras > Hardwarekonfigurations-Assistent.
      1. Klicken Sie in Schritt 1 auf Neue Konfiguration erstellen > Weiter, um fortzufahren. Beachten Sie, dass der Benutzer die vorhandene Konfiguration ändern oder untersuchen kann, wenn eine bereits verfügbar ist.
      2. Durchsuchen Sie in Schritt 2 die Liste Verfügbare Geräte, um die Geräte zu finden, die über Micro-Manager gesteuert werden sollen, z. B. Mikroskop, Lampe, Bühne, Verschluss und Kamera. Wenn diese Taste hervorgehoben ist, klicken Sie auf die... , um das Gerät zur Liste der installierten Geräte hinzuzufügen. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet.
        1. Legen Sie die Bezeichnung des Geräts im Feld Label fest. (z.B. sCMOS-Kamera)
        2. Wählen Sie unter Wertden entsprechenden COM-Port für jedes Gerät aus. Dadurch wird eine Liste der Geräteeigenschaften am unteren Rand des Fensters angezeigt.
        3. Belassen Sie die Geräteeigenschaften bei den Standardeinstellungen. Beachten Sie, dass benutzerdefinierte Werte für jede Geräteeigenschaft wie gewünscht eingegeben werden können.
        4. Wenn jedes Gerät hinzugefügt wird, klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Beachten Sie, dass die Konfigurationsdatei, wenn Geräte nicht mehr oder geändert werden müssen, später geändert werden kann, wie in Schritt 2.1.1.1 beschrieben.
      3. Verwenden Sie in Schritt 3 die Dropdown-Menüs, um die Standardkamera, den Auslöser und die Fokusstufe auszuwählen. Wenn Auto-Shutter gewünscht wird, klicken Sie auf das Kontrollkästchen unter der Dropdown-Liste der Fokusstufe. Wenn die Fokusrichtung der Z-Stufe bekannt ist, wählen Sie sie aus der Dropdown-Liste unter Stage focus directions (advanced)aus. Andernfalls belassen Sie den Standardwert als Unbekannt.
      4. Doppelklicken Sie in Schritt 4 auf die Felder unter der Überschrift Verzögerung [ms], um Verzögerungen im Zusammenhang mit den automatisierten Geräten festzulegen, z. B. Verzögerungen von 100 ms für Lampe, Bühne und Verschluss und eine Verzögerung von 250 ms für Befehle an die mechanische Abstimmungsbaugruppe, um die mechanische Schaltzeit zwischen Filtern.
      5. Weisen Sie in Schritt 5 Beschriftungen für die Statusgeräte zu. Die Konfiguration für das Anregungs-Scanning-Mikroskopsystem verwendet Etiketten im Filterblock, um jeden Fluoreszenzfilterwürfel zu identifizieren (z.B. entspricht Zustand 0 der Bezeichnung Bright, dem leeren Filterwürfel, der bei der Lichtfeld-Bildgebung verwendet wird; während Zustand 3 entspricht dem Etikett 495 nm und dem kundenspezifischen 495 nm dichroitischen Filterwürfel, der zur Trennung von Anregungs- und Emissionslicht bei 495 nm verwendet wird. Etiketten werden auch in der mechanischen Stimmeinheit verwendet, um die Schaltbefehle für jede Anregungswellenlänge zu speichern (z.B. entspricht Zustand 0 dem 340 nm Anregungswellenlängenabstimmungsbefehl für die mechanische Stimmeinheit).
      6. Klicken Sie in Schritt 6 auf die Schaltfläche Durchsuchen neben dem Feld Konfigurationsdatei, um einen Speicherort und Dateinamen für die Konfigurationsdatei auszuwählen. Klicken Sie auf Fertig stellen, um die Konfigurationsdatei zu speichern.
    2. Startgruppen und Voreinstellungen: Micro-Manager kann verschiedene Gruppen in jeder Konfigurationsdatei speichern, um eine Teilmenge der Hardware zu aktivieren oder zu ändern. Beispielsweise werden in einer Gruppe "Systemstart" und einer voreingestellten Kombination Standardeinstellungen wie Binning-Größe und Ausleseraten für die Kamera gespeichert.
      1. Erstellen Sie eine Gruppe (z. B. System), indem Sie im Hauptfenster im Unterabschnitt Gruppe auf + klicken.
      2. Überprüfen Sie jede Verwendung in Gruppe? Innerhalb der Gruppe, für die ein Standardwert festgelegt werden muss (z. B. Binning in der zugehörigen Standardkamera).
      3. Erstellen Sie eine neue Voreinstellung (z. B. "Start"), indem Sie im Hauptfenster im Unterabschnitt Voreinstellung auf + klicken.
      4. Jedes In Schritt 2 aktivierte Kontrollkästchen wird hier als voreingestellte Option angezeigt. Wählen Sie einen Standardwert aus, der für jedes kontrollkästchen geladen werden soll.
    3. Gruppe und Presets für Anregungswellenlängen: Micro-Manager behandelt jede Anregungswellenlänge als eigenen Kanal mit eigenem Wellenlängenschaltbefehl; Daher muss jeder als seine eigene Voreinstellung gespeichert werden.
      1. Erstellen Sie eine neue Gruppe, die einen Satz gewünschter Anregungswellenlängen enthält (z. B. "495 nm dichroic")
      2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Verwenden in Gruppe? mit dem Namen Label, das dem VF-5-Gerät entspricht.
      3. Erstellen Sie eine neue Voreinstellung, die für jede Anregungswellenlänge benannt ist (z. B. "340 nm").
      4. Weisen Sie jeder Voreinstellung den entsprechenden Eigenschaftsnamen und voreingestellten Wert zu (z. B. Eigenschaftsname: "Label"; voreingestellter Wert: "340 nm").
    4. Mehrdimensionales Erfassungstool: klicken Sie aufMulti-D Acq.in der Nähe der oberen linken Seite des Micro-Manager-Fensters, um ein anpassbares Werkzeug zu öffnen, das zum Erfassen eines Bildes der Probe bei jeder Anregungswellenlänge mit einem Klick auf eine einzelne Schaltfläche verwendet werden kann. Es gibt mehrere Anpassungsoptionen, um die Erfassung genau wie gewünscht zu konstruieren.
      1. Zeitpunkte (in diesem Beispiel nicht verwendet): Lassen Sie das Kontrollkästchen für Studien ohne Zeitrafferkomponente deaktiviert. Wenn Zeitrafferstudien gewünscht werden, aktivieren Sie dieses Kontrollkästchen. Wenn diese Option aktiviert ist, geben Sie die Anzahl der Einstellungen für die Ausführung der restlichen Erfassungseinstellungen in das Feld Nummer ein. Legen Sie die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Erfassungen fest, indem Sie die Dauer in das Feld Intervall eingeben, und wählen Sie die richtige Einheit (Millisekunden, Sekunden oder Minuten; in der Regel Sekunden).
      2. Mehrere Positionen (XY; in diesem Beispiel nicht verwendet): Lassen Sie das Kästchen für Studien einer einzelnen XY-Position deaktiviert. Wenn mehrere XY-Positionen gewünscht werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Position bearbeiten, um ein separates Fenster zu öffnen. Verschieben Sie die Bühne an jede gewünschte Position, und klicken Sie auf die Schaltfläche Markieren, um diese Position in der Software zu speichern. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle gewünschten XY-Positionen markiert sind. Schließen Sie dieses Fenster, um fortzufahren.
      3. Z-Stacks (Folien; in diesem Beispiel nicht verwendet): Lassen Sie das Kästchen für Studien einer einzelnen Z-Position unaktiviert. Wenn mehrere Z-Positionen gewünscht werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen. Bewegen Sie die Bühne in die gewünschte Anfangs-Z-Position und klicken Sie auf die Schaltfläche Set neben dem Z-Start-Feld. Bewegen Sie die Bühne in die gewünschte End-Z-Position, und klicken Sie auf die Schaltfläche Festlegen neben dem Z-Ende-Feld. Geben Sie die gewünschte Schrittgröße (in Mikrometern) in das Feld Z-Schritt ein.
      4. Kanäle: Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Kanäle aktiviert ist. Hier sind Kanäle die Namen, die den einzelnen Anregungswellenlängen gegeben werden. Die verfügbaren "Kanäle" entsprechen den in den Schritten 2.1.2 und 2.1.3 beschriebenen "Gruppen".
        1. Gruppe: Klicken Sie auf die Dropdown-Liste, um eine Gruppe auszuwählen, aus der verfügbare Anregungswellenlängen ausgewählt werden sollen (z. B. 495 nm dichroitische).
        2. Klicken Sie auf das Feld Shutter öffnen halten, um den Verschluss zwischen den Erfassungen für jeden Kanal offen zu halten. Beachten Sie, dass sich der Verschluss zwischen aufeinanderfolgenden Spektralscans immer noch schließt, wenn dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, vorausgesetzt, die Autoshutter-Option ist auch im Hauptfenster ausgewählt.
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu, um Kanäle zur Erfassungsliste hinzuzufügen. Beachten Sie, dass die Schaltfläche Entfernen verwendet werden kann, um nicht mehr erwünschte Kanäle zu entfernen, und dass Nach oben und unten verwendet werden kann, um einen ausgewählten Kanal neu anzuordnen.
        1. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Verwenden? für jede gewünschte Wellenlänge im Spektralscan aktiviert ist.
        2. Konfiguration: Klicken Sie auf die Dropdown-Liste unter Konfiguration und wählen Sie die erste Wellenlänge im gewünschten Spektralbereich (z. B. 340 nm).
        3. Belichtung: Doppelklicken Sie auf das Feld unter Belichtung und geben Sie die gewünschte Belichtungszeit für die gewählte Wellenlänge ein (z. B. "100" für 100 ms). Unter Abschnitt 5 ("Datenerfassung") finden Sie Vorschläge zur Auswahl geeigneter Belichtungszeiten.
        4. Z-Offset (gilt nicht bei einem Spektralscan): Lassen Sie dieses Feld leer (bei 0), wenn Sie einen Spektralscan durchführen.
        5. Z-Stack: Stellen Sie sicher, dass dieses Kontrollkästchen für jede Wellenlänge im Spektralbereich aktiviert ist, wenn Sie einen Z-Stack ausführen.
        6. Fr. überspringen (gilt nicht bei einem Spektralscan): Lassen Sie dieses Feld leer (bei 0), wenn Sie einen Spektralscan durchführen. Beachten Sie, dass es nützlich sein kann, Frames selektiv zu überspringen, falls eine oder wenige Anregungswellenlängen deutlich stärker sind als andere oder wenn sich einzelne Anregungswellenlängen als besonders phototoxisch erweisen.
        7. Farbe: Lassen Sie dieses Feld leer, wenn Sie einen Spektralscan durchführen. Beachten Sie, dass Farben für einzelne Wellenlängenbänder für Datenvisualisierungszwecke ausgewählt werden können, die Farbe jedoch für das nachfolgende Spektral-Unmixen ungeeignet ist.
        8. Wiederholen Sie diese Schritte, bis jede gewünschte Anregungswellenlänge innerhalb des angegebenen Spektralscanbereichs hinzugefügt wird.
      6. Akquiseauftrag: Klicken Sie auf die Dropdown-Liste, um auszuwählen, in welcher Reihenfolge die oben genannten Optionen (2.1.4.1-2.1.4.5) ausgeführt werden. Bei Spektralscans, wie hier gezeigt, ist der Erfassungsauftrag einfach Kanal. Beachten Sie, dass zusätzliche Optionen angezeigt werden, wenn zusätzliche Kontrollkästchen im Werkzeug Multidimensionale Erfassung aktiviert sind [Zeitpunkte, mehrere Positionen (XY) und Z-Stacks (Slices)] und die Wahl der Position oder der Zeit zuerst ermöglicht, gefolgt von einem Slice oder bett.
      7. Autofokus (in diesem Beispiel nicht verwendet): Wenn mehrere Positionen (XY) ausgewählt sind, stehen verschiedene Stile der Autofokussierung zur Verfügung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Optionen, und wählen Sie eine Autofokus-Methode aus der Dropdown-Liste neben der Schaltfläche Schließen aus.
      8. Zusammenfassung: Überprüfen Sie dieses Fenster auf eine Zusammenfassung der Anzahl der Zeitpunkte, XY-Positionen, Z-Slices, Kanäle, Gesamtzahl der Bilder, Gesamtspeicher, Scandauer und Erfassungsreihenfolge, um sicherzustellen, dass die aufgeführten Informationen den erwarteten Erfassungseinstellungen entsprechen.
      9. Bilder speichern: Stellen Sie sicher, dass dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, um die gesammelten Daten mithilfe des Werkzeugs Multi-Dimensional Acquisition zu speichern.
        1. Klicken Sie auf die ... Schaltfläche neben Verzeichnisstamm, um einen Verzeichnisstamm auszuwählen, in dem die Dateien gespeichert werden sollen. Benennen Sie den Verzeichnisstamm so, dass relevante Details des Experiments beschrieben werden (z. B. GCaMP Airway Smooth Muscle Cells).
        2. Geben Sie einen Namen in das Feld neben dem Präfix Name ein, das die aktuelle Bildaufnahme beschreibt (z. B. FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Es ist ratsam, ein Namenspräfix zu erstellen, das das Sichtfeld und die Belichtungszeit sowie andere relevante Informationen wie das verwendete Objekt und den dichroitischen Filter identifiziert. Beachten Sie, dass der erste Image-Stack, der mit diesen Einstellungen aufgenommen wurde, mit "_1" nach dem Namenspräfix gespeichert wird. Jeder nachfolgende Stapel, der mit demselben Verzeichnisstamm- und Namenspräfix aufgenommen wurde, wird mit "_n" gespeichert, wobei "n" die Häufigkeit ist, mit der ein Stack mit diesem Namen im Verzeichnis aufgenommen wurde.
        3. Klicken Sie auf Bilddateien trennen, um sicherzustellen, dass das bei jeder Anregungswellenlänge generierte Bild gespeichert wird.
      10. Speichern unter: Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern unter... in der rechten oberen Form des Multi-Dimensional Acquisition-Tools, um diese Erfassungseinstellungen für eine einfache zukünftige Verwendung zu speichern. Beachten Sie, dass auch die Verzeichnisstamm- und Namenspräfixe gespeichert werden.
      11. Erwerben: schließlich klicken Sie auf die Acquire! , um mit dem Erfassen von Bildern gemäß den oben gewählten Aufnahmeeinstellungen zu beginnen.

3. Spektrale Reaktionskorrektur (optional):

  1. Die Spektralausgangskorrektur kann durchgeführt werden, um die spektrale Reaktion des Systems auf einen bekannten Standard zu kalibrieren, z. B. eine NIST-nachverfolgbare Lampe oder einen anderen NIST-nachverfolgbaren Standard oder ein anderes NIST-rückverfolgbares Gerät. Dieser Schritt ist besonders wichtig, wenn die Ergebnisse mit anderen spektralen Bildgebungsinstrumenten, Spektrometern oder zwischen verschiedenen Laboratorien verglichen werden. Dieser Prozess wurde bereits ausführlich berichtet21,23.
    1. Verwenden Sie ein Spektrometer, das auf eine NIST-nachverfolgbare Lichtquelle (z. B. LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) oder einen anderen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert ist, um die spektroradiometrische Leistung der Beleuchtung zu erfassen, wie sie in der Probenphase gemessen wurde. Führen Sie eine separate Korrektur für jede Kombination aus Lichtquelleneinstellung, dichroitischem Spiegel und Objektiv durch. Verwenden Sie eine mit dem Spektrometer gekoppelte integrierende Kugel, um die Weitwinkelbeleuchtung vom Mikroskopobjektiv aus genau zu messen.
    2. Verwenden Sie eine Integrationsmethode, z. B. die Trapezregel, um die spektroradiometrischen Daten über beleuchtete Wellenlängen zu integrieren. Eine 40 nm Bandbreite für die Integration zentriert um die mittlere Wellenlänge ist ausreichend für die meisten Filter, die eine nenne Bandbreite zwischen 14-20 nm volle Breite bei halbmaximum (FWHM) haben. Der integrierte Wert stellt die Intensität der spektralen Beleuchtung bei jedem Anregungswellenlängenband dar.
    3. Zeichnen Sie die integrierte Intensität jedes Wellenlängenbandes als Funktion der Anregungszentrumswellenlänge, um eine Visualisierung des Spektralbeleuchtungsintensitätsprofils zu ermöglichen.
    4. Bestimmen Sie das Wellenlängenband mit der niedrigsten integrierten Intensität.
    5. Normalisieren Sie das Intensitätsprofil der spektralen Beleuchtung, indem Sie die niedrigste integrierte Intensität durch die integrierte Intensität jedes Wellenlängenbandes dividieren, um einen wellenlängenabhängigen Korrekturfaktor zu erzeugen.

4. Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie eine "leere" Probe vor (z. B. einen Glasdeckel in die Zellkammer legen und 1 ml Puffer hinzufügen). Dieser Puffer wurde zuvor24beschrieben.
  2. Bereiten Sie eine unbeschriftete Probe vor, um jede Proben-Autofluoreszenz zu bestimmen (z. B. einen Glasdeckel mit unbeschrifteten, glatten Muskelzellen der Atemwege25,26 in die Zellkammer legen und 1 ml Puffer hinzufügen).
  3. Bereiten Sie für jedes im Experiment verwendete Fluoreszenzetikett eine separate, einetikettierte Probe wie folgt vor:
    1. Fügen Sie verdünnte mitochondriale Etikett zu Puffer, um eine 100 nM Konzentration zu erreichen. Fügen Sie diesen Puffer dem Deckelschlupf hinzu, der glatte Muskelzellen der Atemwege enthält. 20 min bei 20-25 °C inkubieren. Bewegen Sie den Coverslip in die Zellenkammer und fügen Sie 1 ml Puffer hinzu. Beachten Sie, dass die optimale Konzentration des mitochondrialen Etiketts je nach Hersteller, zugehöriger Farbe und gewünschter Spezifität variiert.
    2. Bewegen Sie einen Coverslip mit atemwegsglatten Muskelzellen, die mit der GCaMP-Sonde27 transfiziert wurden, in die Zellkammer und fügen Sie 1 ml Puffer hinzu.
  4. Bereiten Sie eine oder mehrere Versuchsproben vor, die eine Mischung der gewünschten Fluoreszenzetiketten enthalten.
    1. Fügen Sie 1 ml Puffer (100 nM Konzentration mitochondriale Etikett) zu einem Deckschrutsch mit Atemwegsglatten Muskelzellen, die mit der GCaMP-Sonde transfiziert und inkubieren für 20 min bei 20-25 °C. Bewegen Sie den Coverslip in die Zellenkammer und fügen Sie 1 ml Puffer hinzu.

5. Datenerfassung:

  1. Prüfen Sie, ob der richtige dichroitische Strahlteiler (z. B. 495 nm dichroiischer Filterwürfel), objektiv (z. B. 60x Wasserobjektiv) und Kamera (sCMOS-Kamera) ausgewählt sind.
  2. Laden Sie das Sample auf die Bühne.
  3. Doppelklicken Sie auf das Feld neben Belichtung [ms] und geben Sie "100" ein, um die Belichtungszeit auf 100 ms einzustellen. Beachten Sie, dass die Belichtungszeit je nach Fluoreszenzintensität der Probe möglicherweise erhöht oder verringert werden muss.
  4. Wählen Sie 475 nm aus dem Dropdown-Menü des Micro-Manager-Hauptfensters für die erste Beispielanzeige aus. Beachten Sie, dass 475 nm möglicherweise nicht die optimale Wellenlänge für die Probenanzeige oder die Bestimmung ist, ob eine Übersättigung im gesamten Bildstapel auftritt.
  5. Klicken Sie auf Live, um das Beispiel anzuzeigen.
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche automatischer Intensitätsanzeigebereich Auto neben dem Histogramm am unteren Rand des Fensters, um die minimalen und maximalen Werte in aussagekräftige visuelle Bereiche zu bringen.
  6. Verwenden Sie die Fokusknöpfe des Mikroskops, um sich auf die Probe zu konzentrieren. Es ist oft nützlich, den Rand der Stichprobe zu finden, um bei der Fokussierung zu helfen. Das Beispiel wird fokussiert, wenn die Kanten-Features im Bild scharf erscheinen. Beachten Sie, dass es erforderlich sein kann, während der Fokussierung mehrmals auf die Auto-Schaltfläche zu klicken, um das Fluoreszenzbild anzuzeigen. Darüber hinaus können einige Benutzer es einfacher finden, sich auf die Probe zu konzentrieren, wenn sich das Mikroskop im Übertragungsmodus befindet.
    1. Wenn Sie sich im Übertragungsmodus aus Sicherheitsgründen fokussieren, stellen Sie zunächst sicher, dass die spektrale Lichtquelle kein Licht auf die Okulare überträgt, bevor Sie den Lichtpfad für die Transmissionsbildgebung anpassen. Beachten Sie auch, dass es kleine Abweichungen zwischen dem Fokus der Übertragung und Fluoreszenzbildern geben kann. Wenn ein akzeptabler Fokus erreicht wurde, konfigurieren Sie den Lichtpfad für die spektrale Fluoreszenzbildgebung neu.
  7. Klicken Sie auf den Multi-D Acq. oben links im Fenster, um das Werkzeug Multidimensional Acquisition zu öffnen (beschrieben und konfiguriert in Abschnitt 2).
  8. Wählen Sie einen geeigneten Spektralbereich für die spektrale Erfassung (z.B. 360-485 nm für den 495 nm dichroitischen Filter), indem Sie auf die Schaltfläche Laden... oben rechts im Werkzeugfenster Multi-Dimensional Acquisition klicken und zu den Anregungseinstellungen navigieren. zuvor gespeichert (in Schritt 2.1.4.10). Weitere Informationen zu geeigneten Spektralbereichen finden Sie in der Diskussion.
  9. Erfassen Sie ein Hintergrund-/Leerbild, das keine Fluoreszenzdaten enthält, die für die Hintergrund- und Rauschsubtraktion verwendet werden können. Dies kann mit einem leeren Beispiel (Schritt 4.1) oder durch Navigieren zu einem leeren Bereich einer experimentellen Probe durchgeführt werden. Wie in Schritt 5.6 beschrieben, wird dies am einfachsten erreicht, indem die Kante der Probe gefunden und dann so positioniert wird, dass die Kante innerhalb des Sichtfeldes zentriert ist.
    1. Sobald die Erfassungseinstellungen bestätigt wurden und ein Hintergrundbereich sichtbar ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Acquire!, um einen Spektralbildstapel zu erhalten, der Hintergrund und Rauschen enthält, der später für die Subtraktion verwendet werden soll. Es sei darauf hingewiesen, dass Proben wahrscheinlich eine intensivere Fluoreszenz afern vom Rand der Probe haben. Es kann ratsam sein, sich über die Probe zu bewegen, um die "hellsten" Bereiche zu finden und mehrere Testabbildstapel durchzuführen, um geeignete Erfassungszeiten zu bestimmen und Überbelichtung zu vermeiden.
  10. Nehmen Sie einen einzelnen Bildstapel auf einem Bereich der Probe, der eine intensive Fluoreszenz zu haben scheint, um sicherzustellen, dass keine Kombination von Wellenlängen und Belichtungszeiten zu einer Überbelichtung führen.
  11. Verwenden Sie ImageJ, um zu bestätigen, dass keine Wellenlängen überbelichtete Pixel enthalten.
    1. Klicken Sie in ImageJ auf Datei > Importieren > Bildsequenz, und navigieren Sie zu dem Ordner, der die spektralen Bilder enthält, die in Schritt 5.10 aufgenommen wurden. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet. Klicken Sie auf das Feld neben Anzahl der Bilder und geben Sie die Anzahl der Wellenlängen ein, die im Spektralscan enthalten sind (z. B. 26). Lassen Sie das Startbild und das Inkrement als "1". Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um fortzufahren.
    2. Drücken Sie M auf der Tastatur, um die Messfunktion von ImageJ zu nutzen. Stellen Sie sicher, dass die unter Max aufgeführte Nummer nicht die obere Erkennungsgrenze der Kamera ist (z. B. 65.535). Wiederholen Sie dies für jedes Bild im Spektralscan. Beachten Sie, dass die Erkennungsgrenze der Kamera von der Kamera selbst abhängt. Die obere Grenze wird oben rechts im Histogramm im Hauptfenster von MicroManager angezeigt. Alternativ kann die obere Grenze durch Öffnen eines Bildes in ImageJ und Navigieren zu Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrastbestimmt werden. Klicken Sie im resultierenden Popup-Fenster auf die Schaltfläche Festlegen, geben Sie einen zu großen Wert (z. B. 999.999) in das Leerzeichen neben Maximal angezeigter Wertein, und klicken Sie auf OK, um fortzufahren. Der im neuen Histogramm angezeigte Maximalwert sollte die obere Erkennungsgrenze der Kamera sein.
    3. Wenn Bilder die obere Erfassungsgrenze der Kamera enthielten (z. B. 65.535), passen Sie die Belichtungszeit des Spektralscans an, um sicherzustellen, dass das maximale Signal im gesamten Spektralbereich den Dynamikbereich der Kamera nicht überschreitet.
  12. Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus nicht beschrifteten Proben, um eine Autofluoreszenz zu bestimmen. Erfassen Sie den Scan für die nicht beschrifteten Proben mit einem identischen Wellenlängenbereich und Kameraeinstellungen wie den Rest des Experiments (z. B. 360-485 nm bei 100 ms pro Wellenlänge).
  13. Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus einbeschrifteten Samples, die als Spektralsteuerelemente zum Erstellen der Spektralbibliothek verwendet werden sollen. Führen Sie den Scan für jedes Etikett mit einem identischen Wellenlängenbereich, Belichtungszeit und Kameraeinstellungen durch. Beachten Sie, dass für einige Proben möglicherweise eine längere Erfassungszeit erforderlich ist, um eine genaue Erkennung von Etikettenspektrumen mit minimalem Geräuschbeitrag zu ermöglichen.
  14. Führen Sie Messungen an einer experimentellen Probe durch (z. B. glatte Muskelzellen der menschlichen Atemwege mit GCaMP-Sonde und mitochondrialem Etikett).
    1. Legen Sie einen Dia oder Einen Deckelzettel mit der Versuchsprobe auf das Mikroskop.
    2. Wählen Sie ein Sichtfeld mit entsprechend beschrifteten Gewebezellen aus.
    3. Erfassen Sie die Spektralbilddaten mit den gewünschten Erfassungseinstellungen, wie oben beschrieben.

6. Bildanalyse

  1. Korrigieren Sie Bilder auf eine flache spektrale Reaktion.
    1. Subtrahieren Sie das in Abschnitt 5.9 erhaltene Hintergrundspektrum und multiplizieren Sie es mit dem in Abschnitt 3.1.5 ermittelten Korrekturkoeffizienten. Dies kann mit einem einfachen MATLAB-Skript oder einer ImageJ-Routine erfolgen. Ein SUBtraktions-/Korrektur-MATLAB-Code (in diesem Beispiel verwendet) ist auf der Website der University of South Alabama Bioimaging Resources verfügbar.
      1. Laden Sie den Subtraktions-/Korrekturcode in MATLAB.
      2. Klicken Sie auf der Registerkarte EDITOR auf Ausführen. Dadurch wird ein neues Fenster mit einer Bsq-Korrekturschaltfläche geöffnet. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bsq-Korrektur, um ein anderes Fenster zu öffnen, das Optionen für Arbeitsverzeichnis, Hintergrunddatei, Korrekturfaktordatei und nicht korrigierten Tiff-Ordner enthält.
        1. Durchsuchen verwenden... Schaltfläche neben Working Directory, um den Dateipfad auszuwählen, in dem nachfolgende Fenster geöffnet werden. Navigieren Sie zu dem Ordner, der das gespeicherte Hintergrundspektrum enthält (im .dat-Format).
        2. Durchsuchen verwenden... Schaltfläche neben Hintergrunddatei (.dat), um das in Schritt 6.1.1.2.1 gewählte Verzeichnis zu öffnen und die gewünschte Hintergrunddatei (im .dat-Format) auszuwählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen, um fortzufahren.
        3. Verwenden Sie die Schaltfläche Durchsuchen... neben Korrekturfaktor (.dat), um einen Korrekturfaktor auszuwählen. Das Verzeichnis für den Korrekturfaktor ist standardmäßig der Speicherort des übergeordneten MATLAB-Codes. Navigieren Sie ggf. zum Unterordner, der die Korrekturfaktordatei enthält (im .dat-Format). Markieren Sie die richtige Korrekturfaktordatei, und klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen, um fortzufahren.
        4. Verwenden Sie die Schaltfläche Durchsuchen... neben Uncorrected Tiff Folder, um das in Schritt 6.1.1.2.1 ausgewählte Verzeichnis zu öffnen und den Ordner für die Hintergrundsubtraktion und Bildkorrektur auszuwählen (dies ist in der Regel der Pos0-Ordner, der sofort den Rohformat enthält). Spektralbilder). Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen, um fortzufahren.
        5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Klicken für Spektralkorrektur. Nach Abschluss der Verarbeitung wird ein Fenster mit der Meldung "Bsq Correction Complete" geöffnet. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um fortzufahren. Die Korrekturbilder werden in einem neuen Ordner mit dem ursprünglichen rohen Spektralbildordner und einem zusätzlichen "_Corrected" (z.B. Pos0_Corrected) gespeichert.
  2. Generieren Sie die Spektralbibliothek. Mehrere Softwarepakete können verwendet werden, um Spektraldaten aus Bildern zu extrahieren, einschließlich ImageJ. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, normalisieren Sie jedes Endmitglied auf das Wellenlängenband mit der größten Intensität, indem Sie bestimmen, welches Wellenlängenband den intensivsten Wert hat, und die Messung bei jedem Wellenlängenband durch diesen Maximalwert dividieren. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass Ein-Label-Kontrollen, die in autofluoreszierenden Proben erzeugt werden, zusätzliche Modifikationen erfordern28,29,30,31,32. Siehe Schritt 6.2.4 und Diskussion für Details.
    1. Klicken Sie in ImageJ auf Datei > Importieren > Bildsequenz. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet. Navigieren Sie zu dem Ordner mit den korrigierten Spektralbildern. Doppelklicken Sie auf eine beliebige Bilddatei im Ordner, um ein neues Fenster zu öffnen. Klicken Sie auf das Feld neben Anzahl der Bilder und geben Sie die Anzahl der Wellenlängen ein, die im Spektralscan enthalten sind (z. B. 26). Lassen Sie das Startbild und das Inkrement als "1". Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um fortzufahren.
    2. Klicken Sie im ImageJ-Hauptfenster auf das Polygonauswahlsymbol, und verwenden Sie dann den Mauszeiger, indem Sie auf das Bild klicken, um ein Polygon um einen Bereich zu erstellen, der Fluoreszenzdaten enthält. Beachten Sie, dass es in der ursprünglichen Wellenlänge möglicherweise wenig bis gar keine Fluoreszenzdaten gibt. Navigieren Sie zu einem anderen Wellenlängenbild und/oder verwenden Sie das Helligkeits-/Kontrastwerkzeug (Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast > Auto), um Bereiche mit fluoreszenzhaltigen Fluoreszenzdaten besser zu visualisieren.
    3. Wenn das Polygon gezeichnet ist, generieren Sie das Profil der Z-Achse, indem Sie auf Bild > Stapel > Z-Achsenprofilzeichnen klicken. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet. Klicken Sie auf Speichern, um die Spektraldaten als CSV-Datei zu speichern.
    4. Führen Sie eine Subtraktion durch, um eine korrekte Spektralbibliothek mit reinen Etiketten ohne Autofluoreszenzkontamination sicherzustellen. Verwenden Sie die folgende Gleichung29, um ein reines Spektrum aus der Mischung aus ein Etikett und Fluoreszenz zu isolieren:
      Equation 1(1)
      Wo: Srein ist das reine Spektrum des Etiketts, Sgemischt ist das gemessene Spektrum der Mit Autofluoreszenz kontaminierten Probe, S autoFL ist das gemessene Autofluoreszenzspektrum, "a" ist ein Skalar Multiplikator des Autofluoreszenzspektrums (zwischen 0 und 1; z.B. 0,4) und "Offset" ist ein Offset (normalerweise 0). Variieren Sie den Begriff "a", bis ein Nahe Nullwert für den scheinbaren Beitrag der Autofluoreszenz erreicht wird. Weitere Informationen finden Sie in mehreren Veröffentlichungen28,29,30,31,32.
  3. Unmixen Sie die Spektralbilddaten. Der Unmixing-Schritt erzeugt für jedes Fluoreszenzetikett ein Häufigkeitsbild, wobei die Häufigkeit die Menge des relativen Fluoreszenzsignals im Bild vom jeweiligen Etikett ist. Für die Verwendung mit ImageJ33,34,35stehen mehrere Unmixing-Algorithmen zur Verfügung. Darüber hinaus ist ein spektrales Unmixing von MATLAB-Code (in diesem Beispiel verwendet) auf der Website der University of South Alabama Bioimaging Resources verfügbar. Einen umfassenderen Überblick über die Spektral-Unmixing finden Sie36.
    1. Laden Sie den spektralen Unmixing-Code in MATLAB.
    2. Bearbeiten Sie die Dateien Wavelength.mat und Library.mat, um den experimentellen Bedingungen (z. B. "Wavelength" als 360-485 in Schritten von fünf) zu entsprechen.
      HINWEIS: Die entsprechenden Werte für diese Wellenlängen sollten für jedes fluoreszierende Etikett (und die Autofluoreszenz) in "Bibliothek" geladen werden. Endmember_Name sollte die Beschriftungen in der gleichen Reihenfolge wie die Spaltenwerte von "Library" auflisten. Beachten Sie, dass die Datei Library.mat sowohl die Variablen "Library" als auch "Endmember_Name" enthalten sollte.
    3. Klicken Sie auf der Registerkarte EDITOR auf Ausführen. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet, in dem der Benutzer ein Verzeichnis auswählen kann. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die zu nicht gemischten Spektralbilder enthält. Nach der Auswahl wird dadurch ein neues Fenster geöffnet.
    4. Geben Sie in die resultierenden Rohlinge den Bildnamen (z.B. HASMC mit GCaMP und Mito FOV1), die Anzahl der Wellenlängenbänder (z.B. 26), die Anzahl der Zeitpunkte (z.B. 1) und ob eine FRET-Messung (z.B. n) in ihren jeweiligen Rohlingen gewünscht wird. Wenn "n" für FRET ausgewählt ist, lassen Sie beide End-Member-Leerzeichen leer. Drücken Sie OK, um fortzufahren, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird.
    5. Navigieren Sie in den Ordner, der die Datei Wavelength.mat enthält. Sobald sie ausgewählt ist, klicken Sie auf Öffnen, um fortzufahren, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird.
    6. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die Datei Library.mat enthält. Sobald Sie die Option Ausgewählt haben, klicken Sie auf Öffnen, um fortzufahren, wodurch die nicht gemischten Bilder in einem neuen Ordner "Unmixed" im Verzeichnis mit den Spektralbildern gespeichert werden.
  4. Prüfen Sie die ungemischten Spektralbilder auf Qualität.
    1. Öffnen Sie jedes ungemischte Bild, um die Verteilung reiner Komponenten visuell zu überprüfen.
      1. Vergleichen Sie die Größe des Fehlerbildes mit der der nicht gemischten Bilder (ähnlich wie in Schritt 5.11 kann dies über die Measurefunktion von ImageJ erfolgen). Wenn die Größe des Fehlerbildes in der Größe der ungemischten Überflussbilder ähnlich ist, ist es wahrscheinlich, dass es Signale in den Spektralbilddaten gibt, die nicht genau durch die Spektralbibliothek und den linearen spektralen Unmixprozess berücksichtigt werden.
      2. Vergleichen Sie das Fehlerbild mit den nicht gemischten Bildern, um festzustellen, ob nicht identifizierte Reststrukturen vorhanden sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mehrere wichtige Schritte aus diesem Protokoll sind notwendig, um die Sammlung von Daten sicherzustellen, die sowohl genau als auch ohne Bildgebung und spektrale Artefakte sind. Das Überspringen dieser Schritte kann dazu führen, dass Daten signifikant erscheinen, aber nicht mit einem anderen spektralen Bildgebungssystem überprüft oder reproduziert werden können, wodurch alle Schlussfolgerungen, die mit diesen Daten gemacht wurden, effektiv zunichte gemacht werden. Zu diesen wichtigen Schritten gehört vor allem die richtige Spektralausgangskorrektur (Abschnitt 3). Der Korrekturfaktor kompensiert wellenlängenabhängige Schwankungen der Spektralleistung des abstimmbaren Anregungssystems. Dies wird erreicht, indem Wellenlängen mit hoher Leistungserregung so skaliert werden, dass die optische Beleuchtungsleistung mit Wellenlängen mit geringer Leistung vergleichbar ist und ein flaches spektrales Anregungsprofil erreicht. Ein Beispiel für einen unangemessenen Korrekturfaktor ist ein Faktor, der sehr niedrige Werte (z. B. <0.001) bei einer oder mehreren Wellenlängen enthält, was darauf hinweist, dass die bei diesen Wellenlängen gemessenen Intensitätswerte stark abgeschwächt werden müssen, um eine flache Spektralantwort zu erreichen.

Die Kalibrierung des Systems nach einem NIST-nachverfolgbaren Standard stellt sicher, dass die mit dem Anregungs-Scanning-Spektralbildgebungssystem gesammelten Daten mit anderen Systemen vergleichbar sind, die ebenfalls nach NIST-nachverfolgbaren Standards kalibriert sind. Daher muss unbedingt sichergestellt werden, dass jeder Korrekturfaktor die gesammelten Daten angemessen anpasst. Die Genauigkeit eines Korrekturfaktors kann mit einem Fluoreszenzstandard, wie z. B. NIST-rückverfolgbarem Fluorescein, überprüft werden. Abbildung 1 zeigt einen geeigneten und unangemessenen Korrekturfaktor, der durch grafische und Bilddaten visualisiert wird. In diesem Fall war die Spektralleistung bei 340 nm im Vergleich zum Rest des Spektralbereichs praktisch nicht vorhanden, was zu einem Nahe-Null-Wert (<0,001) für praktisch jede Wellenlänge führte. Auf den Bildstapel angewendet ergibt dies für die meisten Pixel nahezu Nullwerte durch die meisten Bildstapel.

Wie in Abschnitt 5 angegeben, können der Anregungsbereich, ausgewählte Fluorophore und Erfassungseinstellungen das Potenzial erzeugen, dass ein oder mehrere Anregungswellenlängen-Bildbänder übersättigte Pixel enthalten. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel, in dem die Belichtungszeit für mehrere der Anregungswellenlängen zu lang eingestellt wurde, wodurch die nachfolgenden Bilder übersättigte Pixel enthalten. Dies ist wichtig zu beachten, da, wie die Abbildung zeigt, sowohl die einzelnen Bilder als auch die falsch gefärbten Bilder visuell innerhalb akzeptabler Intensitätsbereiche erscheinen können.

Eine angemessene Auswahl eines Hintergrundbereichs für die Subtraktion ist auch für den Datenvergleich zwischen Systemen wichtig, da es Elemente von Kamerageräuschen oder Streulicht vor der NIST-nachverfolgbaren Spektralkorrektur entfernt (Abbildung 3). Es ist oft hilfreich für nachfolgende Bildverarbeitungs- und Datenanalyseschritte, um ein RGB-Falschbild des Spektralbildstapels zu generieren, um Spektralfeatures innerhalb des Bildes zu visualisieren. Abbildung 4 zeigt ein RGB-Falschbild, das durch Zusammenführen von drei ausgewählten Wellenlängenbändern erzeugt wird (370 nm = blau, 420 nm = grün, 470 nm = rot).

Das spektrale Unmixen erfordert Kenntnisse über das Spektralprofil jeder einzelnen Fluoreszenzquelle. Im Falle der Anregung-Scanning hyperspektrale Bildgebung, dies geschieht durch die Erfassung von spektralen Bildstapelfür jedes Fluorophor (und Autofluoreszenz). Abbildung 5 ist als Beispiel für die Auswahl von Regionen aus Steuerelementen mit nur einer Beschriftung enthalten, um eine Spektralbibliothek zu generieren. Es sollte beachtet werden, dass jede Messung auf ihre Maximale Wellenlänge normalisiert wurde.

Bei korrekter Verarbeitung ermöglicht der spektrale Unmixprozess die Trennung eines Spektralbildstapels in die jeweiligen Beiträge von jedem Fluoreszenzetikett. Abbildung 6 zeigt ein Beispiel für ein ungemischtes Spektralbildset mit individuellen Bildern für jedes der folgenden Signale: Atemwegs-Glattemuskelzell-Autofluoreszenz, eine GCaMP-Sonde und ein mitochondriales Etikett. Der Fehler im Zusammenhang mit der spektralen Unmischung wird ebenfalls angezeigt und kann untersucht werden, um die Intensitätsstufen des Fehlers mit denen der ungemischten Signale zu vergleichen. Berechnung und Interpretation dieses Fehlers wurde bereits zuvor diskutiert37. Wie in Abbildung 6dargestellt, gibt es hohe Fehler im Zusammenhang mit den kerntechnischen und perinuklearen Regionen der Zellen, was darauf hindeutet, dass die gemessenen Spektren dieser Regionen nicht gut von den Spektren in der Spektralbibliothek berücksichtigt werden. Eine mögliche Fehlerquelle könnte sein, dass die Ein-Label-Kontrollen für GCaMP und das mitochondriale Etikett mit atemwegsglatten Muskelzellen hergestellt wurden, die eine hohe native Autofluoreszenz aufweisen. Daher stellen das GCaMP und das mitochondriale Etikett möglicherweise keine reinen Endmemberspektren dar. Darüber hinaus kann das Autofluoreszenzsignal die Bibliotheksspektren für die beiden anderen Etiketten in einer Weise beeinflussen, die nicht ordnungsgemäß berücksichtigt wurde, was zu einer weniger genauen Anpassung führt, als wenn die Etiketten mit einer Zelllinie mit wenig bis gar keiner Autofluoreszenz. Darüber hinaus sind Beispiele für den Fall enthalten, dass zu wenige oder zu viele Komponenten einer Spektralbibliothek verfügbar sind, was zu einer Unter- bzw. Überanpassung der Spektralbilddaten führt (Abbildung 6, Abbildung 7, Abbildung 8, Abbildung 9und Tabelle 1).

Wie in Abschnitt 6.2 und speziell Schritt 6.2.4 erwähnt, werden "reine" Spektren, die aus markierten Zellen gesammelt werden, die auch autofluoreszierend sind, wahrscheinlich das Spektralprofil für die reine Komponente kontaminieren. Daher sollte darauf geachtet werden, die reinen Spektren der Etiketten von ihren autofluoreszierenden Hosts zu trennen. Abbildung 10 zeigt den Unterschied zwischen dem Unmixen mit "reinen" Spektren, die mit Autofluoreszenz (gemischt) kontaminiert sind, im Vergleich zu reinen Spektren, die nach dem in Schritt 6.2.4 beschriebenen Verfahren berechnet werden. Der Unterschied tritt hauptsächlich beim Entmischen des Autofluoreszenzsignals auf. Ohne ordnungsgemäße Signaltrennung (z. B. Subtraktion der Autofluoreszenzkontamination aus dem GCaMP-Spektrum) konkurrieren die Autofluoreszenz- und GCaMP-Bibliothekskomponenten um die gleichen Spektraldaten in jedem Pixel, was zu charakteristischen Löchern oder dunklen Flecken führt. im Autofluoreszenzbild.

Figure 1
Abbildung 1 : Beispielanwendungen für unangemessene und geeignete Korrekturfaktoren, die verwendet werden, um Bilder auf eine flache spektrale Reaktion zu korrigieren. (A) Unangemessene und geeignete Korrekturfaktoren geplottet. (B) Ein RGB-Bild, das unter Verwendung des unangemessenen Korrekturfaktors in (A) erzeugt wird. (C) Ein RGB-Bild, das mit demselben Sichtfeld wie (B) erzeugt wird, außer mit der Verwendung eines geeigneten Korrekturfaktors. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Beispiele, die die Bedeutung geeigneter Erfassungseinstellungen veranschaulichen. (A,B) RGB-Bilder, die durch eine angemessene Erfassungszeit (A, 100 ms) im Vergleich zum gleichen Sichtfeld mit einer sättigenden Erfassungszeit (B, 500 ms) generiert werden. Es sollte beachtet werden, dass die RGB-Bilder identisch erscheinen, wenn sie falsch gefärbt sind. (C) Die Region von Interesse, die ausgewählt wurde, um Intensitätswerte aus den intensivsten Regionen (A) und (B) zu vermessen. (D) Geplottete Intensitätswerte pro Wellenlänge aus dem Belichtungszeitbild von 100 ms (A, schwarze Linie) und 500 ms Belichtungszeit (B, rote Linie). Es sollte beachtet werden, dass die Pixelintensitäten für die Belichtungszeit von 500 ms die Grenze des Dynamikbereichs des Detektors (65.535 AE) bei 370 nm erreicht haben und sich erst um 525 nm verringern, was zu einem spektralen Artefakt führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Auswahl einer Region von Interesse für Hintergrundsubtraktion. (A) Ein rohes, wellenlängensumsumsames Intensitätsbild. (B) Bereiche des Bildes, das ausgewählt wurde, um das pixelgemittelte Hintergrundspektrum für die rot dargestellte Hintergrundsubtraktion zu bestimmen. (C) Das Hintergrundsubtrahierte, korrigierte und summierte Intensitätsbild. (D) Eine RGB-Färbung des korrigierten Bildes (C). Der Prozess der Erzeugung eines RGB-Falschbildes ist in Abbildung 4dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Prozess der Generierung eines RGB-Falsekolbildes. (A-C) Drei Wellenlängenbänder, die gleichmäßig im spektralen Erfassungsbereich verteilt sind, wurden für die Falschfärbung ausgewählt (blau = 370 nm, grün = 420 nm, rot = 470 nm). (D) Das summierte Intensitätsbild, das durch Hinzufügen von Pixelintensitäten aus allen Wellenlängenbändern im Bildwürfel erzeugt wird. (E-G) Die Bilder in Panels (A-C) mit ihren jeweiligen False-Color-Look-up-Tabellen angewendet. (H) Das resultierende zusammengeführte Bild von (E-G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Regionsauswahl von Einzelbeschriftungssteuerelementen für die Generierung von Spektralbibliotheken. (A) RGB falsch gefärbtes Bild der Atemwegs-Glattmuskel (ASM) Zell-Autofluoreszenz. (B) Rot dargestellte Bereiche von (A) für die Autofluoreszenzkomponente der Spektralbibliothek ausgewählt. (C) RGB falsch gefärbte ASM-Zellen, die mit der mitochondrialen Beschriftung beschriftet sind. (D) Rot dargestellte Bereiche von (C) für die mitochondirale Beschriftungskomponente der Spektralbibliothek ausgewählt. Aufgrund der Autofluoreszenz der ASM-Zellen, die in der Nähe des Kerns lokalisiert sind, wurden kleine Regionen weit von den Kernen ausgewählt, um das mitochondriale Etikettenspektrum zu identifizieren. (E) RGB falsch gefärbte ASM-Zellen, die mit der GCaMP-Sonde transfiziert wurden. (F) Die für die GCaMP-Komponente der Spektralbibliothek ausgewählten Regionen von (E) sind rot dargestellt. Ähnlich wie (D) wurden Regionen aaway von den Kernen ausgewählt. (G) Die spektrale Bibliothek aus A-F erhalten, normalisiert auf einen Wert der Einheit bei der Wellenlänge mit dem stärksten Signal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 6
Abbildung 6 : Beispiel für ungemischte Bilddaten, bei denen ungemischte relative Signalbeiträge aus jeder Bibliothekskomponente visualisiert werden können. (A-D) Die ungemischte Fülle von GCaMP, mitochondriale Etikett, Autofluoreszenz, und Fehlerbegriff. (E-G) Die Bilder in Panels (A-C) mit ihren jeweiligen False-Color-Look-up-Tabellen angewendet. (H) Das zusammengesetzte, zusammengeführte, falsch farbige Bild. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 7
Abbildung 7 : Ungemischte relative Signalbeiträge, einschließlich der mittleren Intensität und des Prozentsatzes der Gesamtfluoreszenz, aus einer richtig definierten Spektralbibliothek. (A-D) Die ungemischte Häufigkeit für Autofluoreszenz, GCaMP, mitochondriale Bezeichnung und Fehlerbegriff. Es sei darauf hingewiesen, dass der Fehlerbegriff weniger als 10 % des gemessenen gesamten Fluoreszenzsignals umfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 8
Abbildung 8 : Ungemischte relative Signalbeiträge, einschließlich der mittleren Intensität und des Prozentsatzes der Gesamtfluoreszenz, aus einer Spektralbibliothek fehlt eine Komponente, von der bekannt ist, dass sie in die Stichprobe einbezogen wird (d. h. eine unterdefinierte Spektralbibliothek). (A-C) Die ungemischte Fülle von Autofluoreszenz, mitochondriale Bezeichnung und Fehlerbegriff. Beachten Sie, dass das Weglassen von GCaMP aus der Spektralbibliothek die berechneten relativen Signalbeiträge der Bibliothekskomponenten sowie den Fehlerbegriff im Vergleich zu Abbildung 7erhöht hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9 : Ungemischte relative Signalbeiträge, einschließlich der mittleren Intensität und des Prozentsatzes der Gesamtfluoreszenz, aus einer Spektralbibliothek, die eine zusätzliche Komponente enthält, von der bekannt ist, dass sie in der Stichprobe fehlt (d. h. eine überdefinierte Spektralbibliothek). (A-E) Die ungemischte Fülle von Autofluoreszenz, GCaMP, mitochondriale Kennzeichnung, nukleare Kennzeichnung, und Fehlerbegriff. Beachten Sie, dass die Hinzufügung eines nuklearen Etiketts zur Spektralbibliothek die berechneten relativen Signalbeiträge aus der Autofluoreszenz im Vergleich zu Abbildung 7verringert hat. Darüber hinaus wird der Fehlerbegriff unter den prozentualen Fehler verringert, der von der ordnungsgemäß definierten Spektralbibliothek angegeben wird. Dies liegt daran, dass eine überdefinierte Bibliothek fast immer eine bessere Anpassung an die experimentellen Daten ermöglicht als eine richtig definierte Bibliothek, obwohl Überflusssignale für Komponenten, von denen bekannt ist, dass sie in der Stichprobe fehlen, (in Wirklichkeit) Artefakte sind, die die Spektralbibliothek. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10 : Vergleich von ungemischten Bildern bei Verwendung einer Bibliothek vor und nach der richtigen Autofluoreszenzkontamination Signalsubtraktion. (A) Die ursprünglichen "reinen" Spektren, die von den Ein-Label-Kontrollen in stark autofluoreszierenden Atemwegsglatten-Muskelzellen abgeleitet sind, vor der skalierten Subtraktion, die in Schritt 6.2.4 beschrieben ist. (B-D) Die ungemischten Autofluoreszenz-, GCaMP- und Nuklearetikettenbilder, die unter Verwendung (A) als Bibliothek generiert wurden. (E) Die korrigierten reinen Spektren, die von Ein-Label-Steuerungen in stark autofluoreszierenden Atemwegs-glatten Muskelzellen nach skalierter Subtraktion abgeleitet werden. (F-H) Die ungemischten Autofluoreszenz-, GCaMP- und Nuklearetikettenbilder, die unter Verwendung (E) als Bibliothek generiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Mittlere Intensität (AU)
Proper Fitting Unterbau Overfitting
Autofluoreszenz 187 299 164
GCaMP 139 - 140
Mitochondriallabel 246 318 248
Nuklearlabel - - 26
RMS-Fehler 53 126 43
Standardabweichung (AU)
Proper Fitting Unterbau Overfitting
Autofluoreszenz 362 442 315
GCaMP 168 168
Mitochondriallabel 344 388 345
Nuklearlabel - - 93
RMS-Fehler 62 126 44
Maximale Intensität (AU)
Proper Fitting Unterbau Overfitting
Autofluoreszenz 6738 7409 6738
GCaMP 1336 - 1336
Mitochondriallabel 5098 5194 5098
Nuklearlabel - - 1257
RMS-Fehler 1050 1286 910
% der Gesamtfluoreszenz
Proper Fitting Unterbau Overfitting
Autofluoreszenz 30% 40% 26%
GCaMP 22% 43% 23%
Mitochondriallabel 39% - 40%
Nuklearlabel - - 4%
RMS-Fehler 8% 17% 7%

Tabelle 1: Eine Tabelle, in der die durchschnittlichen, Standardabweichungs- und maximalen ungemischten Häufigkeitsintensitätswerte pro ungemischtem Häufigkeitsbild aus einer richtigen Spektralbibliothek und aus unterdefinierten oder überdefinierten Spektralbibliotheken sowie der Prozentsatz der Gesamtfluoreszenz pro ungemischtes Überflussbild (die minimale ungemischte Häufigkeitsintensität für jedes Bild war immer Null). Daten aus Abbildung 7, Abbildung 8und Abbildung 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die optimale Nutzung einer hyperspektralen Bildgebung scannt mit der Konstruktion des Lichtweges. Insbesondere die Wahl der Lichtquelle, Filter (tunable und dichroic), Filter-Switching-Methode und Kamera bestimmen den verfügbaren Spektralbereich, mögliche Scangeschwindigkeit, Detektorempfindlichkeit und räumliche Probenahme. Quecksilberlichtbogenlampen bieten viele Anregungswellenlängenspitzen, bieten jedoch keinen flachen Spektralausgang und erfordern eine signifikante Signalreduktion an den Ausgangsspitzen, um die Spektralbilddaten zurück zu einem NIST-nachverfolgbaren Ansprechen zu korrigieren38. Alternative Lichtquellen, wie Xe-Lichtbogenlampen und Weißlicht-Superkontinuumlaser, können eine gleichmäßigere Spektralausgabe bieten, die besser für die Anregungs-Scanning-Hyperspektral-Bildgebung38,39,40geeignet ist. Die Wahl der Lichtquelle, der abstimmbaren Filter und der dichroitischen Filter bestimmt den verfügbaren Spektralbereich. Dieser Bereich sollte unter sorgfältiger Berücksichtigung der gewünschten Spektralinformationen der Versuchsprobe gewählt werden.

Darüber hinaus sollte der Fürdiebefiltermechanismus verwendete Schaltmechanismus sowie verschiedene Kamerafaktoren wie Quanteneffizienz, Pixelgröße und verfügbare Bildraten berücksichtigt werden, da diese Faktoren potenzielle Abtastraten beeinflussen41 ,42,43. Alle anderen Faktoren, die konstant sind, sollten jedoch die Nutzung des Anregungs-Scanning-Ansatzes eine erhöhte Empfindlichkeit und die Fähigkeit zu einer schnelleren Bildgebung bieten, im Vergleich zu den meisten emissionsscannenden Spektral-Bildgebungsansätzen21.

Wie in der Einleitung erwähnt, bezieht sich die hyperspektrale Bildgebung hier auf die zusammenhängende und spektral überlappende Natur der erfassten Daten. Daher müssen die Fähigkeiten des Systems in der Lage sein, Daten mit Abständen von Anregungszentrumswellenlängen zu sammeln, die weniger als die Hälfte des Abstands des FWHM der Filter betragen. Wie bereits berichtet, ermöglicht ein sorgfältig ausgewähltes Array von dünnschicht-tunablen Filtern die Datenerfassung mit mittleren Wellenlängen im Abstand von 5 nm, ein Abstand, der ausreicht, um das Anregungsspektrum, das Filter mit FWHM zwischen 14-20 nm erhält, zu übersampeln. Ein solcher Abstand führt zu einer leichten Redundanz bei der Spektraldatenerfassung, wobei die Genauigkeit des Unmixing-Prozesses wahrscheinlich erhöht wird. Berücksichtigung der beiden Spektralbereiche und der notwendigen Mindestanzahl von Wellenlängenkanälen für eine genaue Unmischung wurden zuvor44,45,46diskutiert. Zu diesem Zweck sollte angesichts der Bandbreite dieser Filter der Anregungsbereich so gewählt werden, dass er mit einer Wellenlänge endet, die etwas niedriger ist (5-10 nm niedriger) als die Cut-off-Wellenlänge des dichroitischen Strahlteilers. Dadurch wird sichergestellt, dass die gesamte Bandbreite der Anregungsbeleuchtung unterhalb der Grenzwellenlänge des dichroitischen Strahlteilers liegt (z.B. 360-485 nm für den 495 dichroitischen Filter), um Anregungs-Emissions-Cross-Talk zu vermeiden.

Software zur unabhängigen Steuerung jeder Komponente der Hardware, um Hochgeschwindigkeits-Spektral-Bildgebungsscans zu erzielen, ist erforderlich. Die Software sollte in der Lage sein, den Verschluss zu bedienen, Anregungswellenlängen auszuwählen und Bilder mit ausreichend hohen Geschwindigkeiten zu erfassen, um experimentelle Bedingungen zu erfüllen (genaue Anforderungen an die Abtastrate variieren Das Experiment, aber ein Beispielziel könnte sein, vier zu erfassen kompletten Spektralbildstapel pro Minute). Komplexere Experimente können mehrere dichroitische Spiegel, Ziele oder XYZ-Standorte verwenden. Es gibt eine Reihe von Softwarepaketen für die Datenerfassung47,48. Micro-Manager ist eine kostenlose Open-Source-Software für die Mikroskopautomatisierung, die eine Vielzahl von Anpassungsmöglichkeiten bietet. Darüber hinaus enthält Micro-Manager ein Skriptbedienfeld für zusätzliche Anpassungen, die in der Hauptbenutzeroberfläche nicht verfügbar sind. Beispielsweise ist es möglich, die 250 ms Verzögerung des abstimmbaren Filtermischers auf 10 ms bei allen Anregungswellenlängen zu reduzieren, mit Ausnahme der Wellenlängenübergänge, bei denen sich das Filterrad zu einem neuen abstimmbaren Filter dreht, wodurch die effektive Bildgebung reduziert wird. 240 ms pro Wellenlänge für die meisten Wellenlängen. Diese Anpassung hat die Erfassung von bis zu 30 Wellenlängen in weniger als 4 s ermöglicht. Schließlich kann Micro-Manager zusammen mit anderen Umgebungen wie MATLAB betrieben werden, um die Steuerung von Mikroskopgeräten weiter anzupassen.

Die Bestimmung des richtigen spektralen Anregungsbereichs, der Erfassungszeit und der Anfangswellenlänge für die Probenanzeige und die anschließende Datenerfassung ist sehr wichtig. Ein fehlerhafter Betrieb einzelner Komponenten des Systems kann jedoch eine weitere Fehlerbehebung erfordern. Jede Komponente des optischen Pfads trägt zu den erfassten Bilddaten bei. Daher ist es wichtig, die spektrale Reaktion und optische Übertragung optischer Komponenten innerhalb des Lichtpfades zu überprüfen, insbesondere wenn sie versuchen, die Gesamtreaktion des Systems zu optimieren. Lichtquellen haben oft variable Intensitätseinstellungen und können eine Leistungsminderung über die Lebensdauer der Glühbirne40haben. Wenn eine Probe abzweige erscheint, kann die Ursache eine reduzierte Ausgabe von der Lichtquelle sein. Die Autoshutter-Funktion in Micro-Manager funktioniert unserer Erfahrung nach nicht 100% der Zeit. Fehlendes Signal kann auf einen geschlossenen Verschluss hinweisen. Die anfängliche Anregungswellenlänge, die in der Konfigurationsdatei von Micro-Manager gespeichert ist, kann standardmäßig auf eine Wellenlänge mit geringem oder keinem Spektralausgang eingestellt werden, wie z. B. das in Abbildung 1gezeigte Beispiel 340 nm .

Darüber hinaus ist es nicht ungewöhnlich, dass man irrtümlich eine Anregungswellenlänge wählt, die über der Grenzwellenlänge des langdurchlassenden dichroitischen Strahlteilers liegt, was dazu führt, dass zusätzliches Quergespräch und/oder Anregungslicht direkt zur Kamera geschoben wird, was den Kamerasensor beschädigen. Ebenso kann die Einstellung des Lichtwegs für die Transmissionsbildgebung zu signalverlust an der Kamera führen, abhängig von der Konfiguration des Mikroskops. Darüber hinaus kann, wie in Abbildung 2angegeben, die Wahl der anfänglichen Anregungswellenlänge und belichtungszeit für die Probenbetrachtung angemessen erscheinen, aber tatsächlich zu übersättigten Pixeln bei anderen Anregungswellenlängen führen. Diese Tatsache wird nicht offensichtlich sein, es sei denn, die Pixelsättigung wird für jedes Bild überprüft, daher ist es oft ratsam, einen Testbildstapel auf einem Bereich der Probe durchzuführen, der die intensivste Fluoreszenz zu enthalten scheint.

Es ist auch erwähnenswert, dass variable Intensitäten in Bildern vorhanden sein können, die für Hintergrundregionen ausgewählt wurden. Es sollte darauf geachtet werden, dass diese Regionen keine relevanten Bilddaten enthalten, da nachfolgende Datenkorrekturschritte dieses Signal dann von den Bilddaten subtrahieren, die in anderen Regionen der Stichprobe erfasst wurden. Manchmal ist es notwendig, die Übertragungseinstellungen zu verwenden und/oder die Belichtungszeit drastisch zu erhöhen, um zu überprüfen, ob der für die Messung des Probenhintergrunds ausgewählte Bereich tatsächlich keine Probe enthält. In ähnlicher Weise können ungemischte Bilder mit dunklen Flecken oder Löchern im Autofluoreszenzbild vorhanden sein. Dies kann auf eine unsachgemäße Bibliothek zurückzuführen sein, die durch die Autofluoreszenz "Kontamination" der "reinen" Spektralsignale von einmarkierten Zellen verursacht wird. Dies liegt daran, dass jedes "reine" Spektralsignal, das aus einer Probe mit Autofluoreszenz gesammelt wird, ausnahmslos einen Teil der Autofluoreszenzspektren selbst enthält, selbst wenn es sich um Spurenmengen handelt. Es sollte darauf geachtet werden, Autofluoreszenzsignale von den einbeschrifteten Steuerungen zu subtrahieren, um eine ordnungsgemäße Spektralbibliothek zu gewährleisten, wie sie von Mansfield et al.28,29,30 mehrfach beschrieben wurde. 31,32

Obwohl in diesem Artikel nicht nachgewiesen, kann das Spektralbildsystem für das Anregungsscannen auch für Zeitraffer-Bildgebung und Bildgebung über mehrere XY-Positionen (oder ein großes Sichtfeld aufgrund von Bildnähten) in mehreren Brennebenen verwendet werden. Wenn diese Optionen für ein einzelnes Experiment gewünscht werden, sollte sorgfältig über die Bedeutung der Erfassungsreihenfolge und mögliche Auswirkungen der Photobleaching nachgedacht werden. Es ist auch erwähnenswert, dass Micro-Manager weiterhin die ausgewählte Anzahl von Zeitpunkten und/oder Positionen erhält, wenn die tatsächlich in Anspruch genommene Zeit die geschätzte Zeit überschreitet (z. B. ein Bildstapel benötigt 11 s, um sie zu erwerben, anstatt der geschätzten 10 s). Diese Fehlkalkulation kann sich mit mehreren Zeitpunkten verdichten und die berechnete zeitliche Stichprobenerhebung ändern, wodurch möglicherweise alle Schlussfolgerungen aus den Daten verzerrt werden.

Dieses Beispiel zeigt die Möglichkeit, drei Fluoreszenzquellen innerhalb eines Erregungssbereichs von 145 nm zu trennen. Frühere Experimente mit diesem System konnten bis zu fünf Fluoreszenzquellen innerhalb desselben Bereichs trennen. Die für diese Bildaufnahme benötigte Zeit beträgt weniger als 1 min, was deutlich schneller ist als die meisten emissionsscannenden Spektralbildsysteme. Verbesserungen des Lichtpfads, wie z. B. die Abstimmung der Wellenlängen mit höherer Geschwindigkeit, können diese Bildgebungstechnologie auf Geschwindigkeiten voranbringen, die für die Spektralbildgebung mit Videorate ausreichen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Drs. Leavesley und Rich geben finanzielles Interesse an einem Start-up-Unternehmen, SpectraCyte LLC, bekannt, das gegründet wurde, um die spektrale Bildgebungstechnologie zu kommerzialisieren.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die Unterstützung von NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 und dem Abraham Mitchell Cancer Research Fund würdigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

Tags

Engineering Ausgabe 150 Hyperspektral Spektroskopie Anregung Fluoreszenz Mikroskopie Autofluoreszenz Bildgebung tunable Filter Dünnschicht
Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deal, J., Britain, A., Rich, T.,… More

Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter