Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

التصوير المجهري للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الضوئي الفائق الطيفي للتمييز بكفاءة بين إشارات الفلورة

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

وقد أصبح التصوير الطيفي حلاً موثوقاً به لتحديد وفصل إشارات الفلورة المتعددة في عينة واحدة، ويمكن أن يميز بسهولة بين الإشارات ذات الأهمية والخلفية أو الفلورة الذاتية. يحسن التصوير الطيفي الفائق المسح الضوئي على هذه التقنية عن طريق تقليل وقت الحصول على الصور اللازمة مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في نفس الوقت.

Abstract

وتعتمد عدة تقنيات على الكشف عن إشارات الفلورة لتحديد الظواهر أو دراستها أو توضيح الوظائف. وقد ثبت أن فصل إشارات الفلورة هذه مرهق حتى ظهور التصوير فوق الطيفي، الذي يمكن فيه فصل مصادر الفلورة عن بعضها البعض وكذلك عن إشارات الخلفية والفلورة الذاتية (نظراً للمعرفة بخصائصها الطيفية التوقيعات). ومع ذلك، فإن التصوير الطيفي الفائق المسحي للانبعاثات التقليدي يعاني من بطء أوقات الاكتساب وانخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التصفية الضرورية لكل من الإثارة وضوء الانبعاثات. وقد تبين من قبل أن التصوير الطيفي الفائق المسح يُحدِّد وقت الاكتساب اللازم مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البيانات المكتسبة في الوقت نفسه. وباستخدام المعدات المتاحة تجارياً، يصف هذا البروتوكول كيفية تجميع ومعايرة واستخدام نظام تصوير التصوير الطيفي الفائق المسح يُظهر الإثارة لفصل الإشارات عن عدة مصادر فلورسفية في عينة واحدة. في حين أن هذه التقنية تنطبق بشكل كبير على التصوير المجهري للخلايا والأنسجة، إلا أنها قد تكون مفيدة لأي نوع من التجارب التي تستخدم الفلورة التي يمكن فيها تغيير أطوال موجية الإثارة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: التصوير الكيميائي، التطبيقات البيئية، ورعاية العيون، وعلوم الأغذية، وعلم الطب الشرعي، والعلوم الطبية، والمعادن.

Introduction

يمكن إجراء التصوير الطيفي بطرق مختلفة ويشار إليه بعدةمصطلحات1و2و3و4. وبوجه عام، يشير التصوير الطيفي إلى البيانات التي تم الحصول عليها في بعدين مكانيتين على الأقل وبعد طيفي واحد. يتميز التصوير المتعدد الأطياف وفرط الطيفية في أغلب الأحيان بعدد نطاقات الطول الموجي أو ما إذا كانت النطاقات الطيفية متجاورة1. وبالنسبة لهذا التطبيق، تُعرَّف البيانات فوق الطيفية بأنها البيانات الطيفية المكتسبة بنطاقات الطول الموجي المتجاورة التي تتحقق عن طريق المباعدة بين الأطوال الموجية المركزية بما لا يقل عن نصف العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لكل مرشح تمرير شريطي يستخدم للإثارة (أي 5 نانومتر تباعد الطول الموجي مركز لمرشحات النطاق مع 14-20 نانومتر عرض النطاق). وتسمح الطبيعة المتجاورة لنطاقات البيانات بالإفراط في أخذ مجموعة البيانات، مما يكفل استيفاء معايير Nyquist عند أخذ عينات من المجال الطيفي.

وقد تم تطوير التصوير فوق الطيفي من قبل ناسا في 1970s و 1980s جنبا إلى جنب مع أول ساتل لاندسات5,6. وقد أتاح جمع البيانات من عدة نطاقات طيفية متجاورة توليد طيف إشراقة لكل بكسل. إن تحديد وتحديد طيف الإشراقة للمكونات الفردية جعل من الممكن ليس فقط الكشف عن المواد السطحية بواسطة أطيافها المميزة، بل سمح أيضاً بإزالة الإشارات المتداخلة، مثل الاختلافات في الإشارة بسبب الظروف الجوية. وقد طُبق مفهوم الكشف عن المواد باستخدام أطيافها المميزة على النظم البيولوجية في عام 1996 عندما استخدم شروك وآخرون مجموعات من خمسة فلوروفورات مختلفة وأطيافها المعروفة للتمييز بين الكروموسومات المسماة في عملية تسمى [كرّوبي] طيفيّة [كرّووبي]7. وقد تم تفصيل هذه التقنية في عام 2000 من قبل Tsurui وآخرون لتصوير الفلورة من عينات الأنسجة، وذلك باستخدام سبعة أصباغ فلورية وتحلل قيمة فريدة لتحقيق الفصل الطيفي لكل بكسل في تركيبات خطية من الأطياف في المرجع مكتبة8. وعلى غرار نظيراتها في مجال الاستشعار عن بعد، يمكن حساب مساهمة كل فلوروفور معروف من الصورة الفائقة الطيفية، مع إعطاء معلومات مسبقة عن طيف كل فلوروفور.

كما تم استخدام التصوير الطيفي الفائق في مجالات الزراعة9، علم الفلك10، الطب الحيوي11، التصوير الكيميائي12، التطبيقات البيئية13، العناية بالعين14، علوم الأغذية15، علم الطب الشرعي16،17، العلوم الطبية18، علم المعادن19، والمراقبة20. ومن القيود الرئيسية لأنظمة التصوير فوق الطيفي المجهر الفلوري الحالي أن تقنية التصوير الطيفي الفائق الطيفي القياسية تعزل إشارات الفلورة في نطاقات ضيقة بنسبة 1) أولاً تصفية ضوء الإثارة للتحكم في الإثارة العينة، ثم 2) مزيد من تصفية الضوء المنبعث لفصل انبعاث الفلورة إلى نطاقات ضيقة التي يمكن فصلها في وقت لاحق رياضيا21. يؤدي تصفية كل من إضاءة الإثارة والفلورة المنبعثة إلى تقليل مقدار الإشارة المتاحة، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويتطلب فترات اكتساب طويلة. وتحد الإشارة المنخفضة وفترات الاكتساب الطويلة من إمكانية تطبيق التصوير فوق الطيفي كأداة تشخيصية.

وقد تم تطوير طريقة التصوير التي تستخدم التصوير فوق الطيفي ولكن يعزز الإشارة المتاحة، مما يقلل من وقت الاقتناء اللازم21،22. وتكتسب هذه الطريقة الجديدة، التي تسمى التصوير الطيفي الفائق المسح للإثارة، بيانات الصورة الطيفية عن طريق تغيير طول موجة الإثارة وجمع مجموعة واسعة من الضوء المنبعث. وقد تبين من قبل أن هذه التقنية تسفر عن أوامر من الزيادات في حجم نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع تقنيات مسح الانبعاثات21،22. وتعزى الزيادة في نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير إلى النطاق الواسع (~ 600 نانومتر) من ضوء الانبعاثات المكتشف، في حين يتم توفير الخصوصية عن طريق تصفية ضوء الإثارة فقط بدلاً من انبعاث الفلورة. وهذا يسمح لجميع الضوء المنبعث (لكل موجة الإثارة) للوصول إلى كاشف21. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتمييز الفلورة الذاتية من التسميات الخارجية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تقليل وقت الاكتساب بسبب زيادة الإشارة القابلة للكشف تقلل من خطر ابيضاض الصور، كما تسمح بإجراء عمليات مسح طيفي بمعدل اكتساب مقبول للتصوير الطيفي بالفيديو.

والهدف من هذا البروتوكول هو أن يكون بمثابة دليل لاقتناء البيانات من أجل التصوير المجهري للتصوير فوق الطيفي المسحي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين الأوصاف التي تساعد على فهم مسار الضوء والأجهزة. كما يرد وصف لتنفيذ برمجيات مفتوحة المصدر للمجهر التصويري الفائق الطيفي المسحي. وأخيراً، يتم توفير أوصاف لكيفية معايرة النظام إلى معيار NIST يمكن تتبعها، وضبط إعدادات البرامج والأجهزة للحصول على نتائج دقيقة، وفك خلط الإشارة المكتشفة في مساهمات من مكونات فردية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جهاز الإعداد

  1. مصدر الضوء: حدد مصدر ضوء طيفي واسع النطاق مع خرج طاقة عالية وترتيب عالي (تم استخدام مصباح قوس يُستخدم بقوة 300 واط في هذه الدراسات).
  2. الغالق (اختياري): أضف غالقًا إلى المسار البصري لتقليل ابيضاض الصور للتصوير بالفاصل الزمني.
  3. نظام فلتر قابل للضبط: تضمين تجميع ضبط ميكانيكي وفلتر رقيق للأفلام القابلة للضبط (TFTF) تم تعيينه لتمكين نطاق الإثارة المطلوب قابل للتعديل الطول الموجي (على سبيل المثال، 360-485 نانومتر).
  4. المجهر: استخدام مجهر الفلورة المقلوبة بما في ذلك برج فلتر ثنائي الكشريك بمحركات وتحكم.
    1. مكعب فلتر الفلورة: قم بتجميع مكعب فلتر الفلورة الذي يمر طويلاً. للحصول على أفضل النتائج، اختر مرآة ثنائية اللون وفلتر انبعاثات طويل المرور على نفس الطول الموجي لتحقيق الفصل الأمثل للإثارة من ضوء الانبعاثات (على سبيل المثال، 495 نانومتر).
    2. الهدف: استخدام هدف أبوكرومي مناسب لضمان التركيز الموحد على نطاق الطول الموجي المستخدم في التجربة (تم استخدام هدف الماء 60x لهذه الدراسة).
    3. المرحلة التلقائية (اختياري): استخدم مرحلة تلقائية لأخذ عينات سريعة من مجالات عرض متعددة و/أو حقول كبيرة جدًا من خلال خياطة الصور. معايرة المرحلة مع الهدف والكاميرا.
  5. الكاميرا: حدد كاميرا مناسبة لتحقيق الدقة المكانية، والحساسية، ومتطلبات الضوضاء من التجربة (استخدم هذا النظام كاميرا sCMOS عالية الحساسية).

2 - برامجيات الاقتناء

  1. اختر حزمة برامج تسمح بالتحكم المستقل في كل مكون من مكونات الأجهزة، مثل Micro-Manager.
    1. إنشاء ملف التكوين: ملف التكوين هو مجموعة محفوظة من الأدوات والإرشادات التي سيتم تحميل Micro-Manager لتشغيل أجهزة النظام. لإنشاء ملف تكوين، انقر فوق أدوات > معالج تكوين الأجهزة.
      1. في الخطوة 1، انقر فوق إنشاء تكوين جديد > التالي للمتابعة. لاحظ أنه قد يختار المستخدم تعديل أو استكشاف التكوين الموجود إذا كان متوفراً بالفعل.
      2. في الخطوة 2، استعرض قائمة الأجهزة المتوفرة للعثور على الأجهزة التي تريد التحكم فيها من خلال Micro-Manager، مثل المجهر والمصباح والمسرح والغالق والكاميرا. عند تمييزه، انقر فوق إضافة... لإضافة الجهاز إلى قائمة الأجهزة المثبتة. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة.
        1. تعيين تسمية الجهاز في المربع تسمية. (على سبيل المثال، كاميرا sCMOS)
        2. ضمن القيمة، حدد منفذ COM المناسب لكل جهاز. سيؤدي هذا إلى ظهور قائمة بخصائص الجهاز في أسفل الإطار.
        3. اترك خصائص الجهاز في إعداداتها الافتراضية. لاحظ أنه قد يتم إدخال القيم المخصصة لكل خاصية جهاز كما هو مطلوب.
        4. عند إضافة كل جهاز، انقر فوق الزر التالي للمتابعة إلى الخطوة التالية. لاحظ أنه إذا تم ترك أية أجهزة أو تحتاج إلى تغيير، يمكن تعديل ملف التكوين لاحقاً كما هو موضح في الخطوة 2.1.1.1.
      3. في الخطوة 3، استخدم القوائم المنسدلة لتحديد مرحلة الكاميرا والغالق والتركيز الافتراضية. إذا كان الغالق التلقائي مرغوبًا فيه، فانقر على خانة الاختيار أسفل القائمة المنسدلة مرحلة التركيز البؤري. إذا كان اتجاه التركيز للمرحلة Z معروفًا، فحدده من القائمة المنسدلة ضمن اتجاهات تركيز المرحلة (المتقدمة). وإلا، اترك الافتراضي كغير معروف.
      4. في الخطوة 4، انقر نقراً مزدوجاً فوق المربعات ضمن عنوان تأخير [مللي ثانية] لتعيين التأخيرات المقترنة بالأجهزة التلقائية مثل تأخيرات 100 مللي ثانية للمصباح والمرحلة والغالق و تأخير 250 مللي ثانية للأوامر إلى تجميع الضبط الميكانيكي لحساب الميكانيكية التبديل الوقت بين المرشحات.
      5. في الخطوة 5 تعيين تسميات لأجهزة الحالة. يستخدم تكوين نظام المجهر المسح الضوئي للإثارة التسميات في كتلة الفلتر لتحديد كل مكعب فلتر الفلورة (على سبيل المثال، الدولة 0 يتوافق مع التسمية مشرق،مكعب فلتر فارغ المستخدمة أثناء التصوير حقل مشرق؛ الدولة 3 يتوافق مع التسمية 495 نانومتر والعرف 495 نانومتر مكعب مرشح dichroic المستخدمة لفصل الإثارة وضوء الانبعاثات في 495 نانومتر). وتستخدم التسميات أيضا في تجميع ضبط الميكانيكية لتخزين أوامر التبديل لكل الطول الموجي الإثارة (على سبيل المثال، الدولة 0 يتوافق مع 340 نانومتر الإثارة الطول الموجي ضبط الأمر لتجميع ضبط الميكانيكية).
      6. في الخطوة 6، انقر فوق الزر استعراض بجوار المربع ملف التكوين لاختيار حفظ الموقع واسم الملف لملف التكوين. انقر فوق إنهاء لحفظ ملف التكوين.
    2. مجموعات بدء التشغيل والإعدادات المسبقة: يمكن للمدير ة الصغرى تخزين مجموعات مختلفة داخل كل ملف تكوين لتنشيط مجموعة فرعية من الأجهزة أو تغييرها. على سبيل المثال، ستقوم مجموعة "بدء تشغيل النظام" ومجموعة الإعداد المسبق بتخزين الإعدادات الافتراضية مثل حجم الطعام ومعدلات القراءة للكاميرا.
      1. إنشاء مجموعة (على سبيل المثال، النظام) بالنقر فوق + في النافذة الرئيسية في القسم الفرعي للمجموعة.
      2. تحقق من أي استخدام في المجموعة؟ مربعات داخل المجموعة التي تتطلب قيمة افتراضية ليتم تعيينها (على سبيل المثال، تناول الطعام في الكاميرا الافتراضية المقترنة).
      3. إنشاء إعداد مسبق جديد (على سبيل المثال، "بدء التشغيل") بالنقر فوق + في النافذة الرئيسية في القسم الفرعي الإعداد المسبق.
      4. سيظهر كل مربع تم إيداعه في الخطوة 2 كخيار مسبق الإعداد هنا. اختر قيمة افتراضية ليتم تحميلها لكل مربع محدد.
    3. مجموعة والمسبقة لموجات الإثارة: مدير مايكرو يعامل كل الطول الموجي الإثارة كما قناة خاصة بها معها أمر التبديل الطول الموجي الخاصة بها؛ لذلك، يجب حفظ كل كإعداد مسبق خاص به.
      1. إنشاء مجموعة جديدة تحتوي على مجموعة من الأطوال الموجية الإثارة المطلوبة (على سبيل المثال، "495 نانومتر dichroic")
      2. تحقق من المربع استخدام في المجموعة؟ المسمى تسمية المقابلة لجهاز VF-5.
      3. إنشاء إعداد مسبق جديد يسمى لكل موجة إثارة (على سبيل المثال، "340 نانومتر").
      4. تعيين اسم الخاصية المناسبة والقيمة المسبقة (على سبيل المثال، اسم الخاصية: "التسمية"؛ قيمة الإعداد المسبق: "340 نانومتر").
    4. أداة اكتساب متعددة الأبعاد: انقر فوقمتعددة الد ACQ.بالقرب من أعلى يسار نافذة المدير الصغير لفتح أداة قابلة للتخصيص لاستخدامها لالتقاط صورة للعينة في كل الطول الموجي الإثارة بنقرة زر واحدة. هناك العديد من خيارات التخصيص لإنشاء الاكتساب تماما ً كما هو مطلوب.
      1. النقاط الزمنية (غير المستخدمة في هذا المثال): للدراسات التي لا تحتوي على مكون الفاصل الزمني، اترك المربع دون تحديد. إذا كانت دراسات الفاصل الزمني مرغوبة، حدد هذا المربع. في حالة تحديد، أدخل عدد المرات لتنفيذ باقي إعدادات الامتلاك في المربع رقم. قم بتعيين الوقت بين عمليات الشراء المتتالية عن طريق إدخال المدة في المربع الفاصل الزمني واختر الوحدة المناسبة (مللي ثانية أو ثانية أو دقائق؛ وعادة ما تكون ثانية).
      2. مواضع متعددة (XY؛ غير مستخدمة في هذا المثال): للدراسات الخاصة بموضع XY واحد، اترك المربع دون تحديد. إذا كانت مواضع XY متعددة مرغوبة، حدد المربع وانقر فوق الزر تحرير قائمة الموضع لفتح إطار منفصل. نقل المرحلة إلى كل موقع المطلوب وانقر فوق الزر وضع علامة لحفظ هذا الموقف في البرنامج. كرر حتى يتم وضع علامة على كافة مواضع XY المطلوبة. أغلق هذا الإطار للمتابعة.
      3. مكدسات Z (شرائح؛ غير مستخدمة في هذا المثال): للدراسات الخاصة بموضع Z واحد، اترك المربع دون تحديد. إذا كانت مواضع Z متعددة مرغوبة، حدد المربع. نقل المرحلة إلى الموضع Z البداية المطلوبة وانقر فوق الزر تعيين بجوار مربع بدء Z. نقل المرحلة إلى الموضع Z النهاية المطلوبة وانقر فوق الزر تعيين بجانب مربع Z-نهاية. أدخل حجم الخطوة المطلوب (بالميكرون) في المربع خطوة Z.
      4. القنوات: تأكد من تحديد مربع القنوات. هنا، القنوات هي الأسماء المعطاة لموجات الإثارة الفردية. وتتوافق "القنوات" المتاحة مع "المجموعات" الموصوفة في الخطوتين 2-1-2 و2-1-3.
        1. المجموعة: انقر فوق القائمة المنسدلة لتحديد مجموعة للاختيار من بينها الأطوال الموجية الإثارة المتاحة (على سبيل المثال، 495 نانومتر dichroic).
        2. انقر فوق المربع الاحتفاظ بفتح الغالق للحفاظ على الغالق مفتوحاً بين عمليات الاستحواذ لكل قناة. لاحظ أن الغالق سيظل مغلقاً بين عمليات المسح الطيفي المتعاقبة إذا تم تحديد هذا المربع، بافتراض تحديد خيار الغالق التلقائي أيضًا في النافذة الرئيسية.
      5. انقر فوق الزر جديد لإضافة قنوات إلى قائمة الاكتساب. لاحظ أنه يمكن استخدام الزر إزالة لإزالة أي قنوات لم تعد مرغوبة وأنه يمكن استخدام أعلى وأسفل لإعادة ترتيب أي قناة محددة.
        1. تأكد من تحديد خانة الاختيار Use؟ لكل طول موجي مرغوب فيه في الفحص الطيفي.
        2. التكوين: انقر على القائمة المنسدلة ضمن التكوين واختر الطول الموجي الأول في النطاق الطيفي المطلوب (على سبيل المثال، 340 نانومتر).
        3. التعرض: انقر نقرًا مزدوجًا على المربع ضمن التعرض وأدخل وقت التعرض المطلوب للطول الموجي المحدد (على سبيل المثال، "100" لـ 100 مللي ثانية). انظر الفرع 5 ("الحصول على البيانات") للاطلاع على اقتراحات لتحديد أوقات التعرض المناسبة.
        4. Z-offset (لا ينطبق في المسح الطيفي): اترك هذا المربع فارغاً (في 0) عند إجراء فحص طيفي.
        5. Z-المكدس: تأكد من أن يتم فحص هذا المربع لكل طول موجة في النطاق الطيفي إذا كان تنفيذ كومة Z.
        6. تخطي الأب (لا ينطبق في المسح الطيفي): اترك هذا المربع فارغاً (في 0) عند إجراء فحص طيفي. لاحظ أنه قد يكون من المفيد تخطي الإطارات بشكل انتقائي في حالة أن واحد أو عدد قليل من موجات الإثارة هي أكثر قوة بكثير من غيرها أو إذا ثبت أن الأطوال الموجية الفردية السمية الضوئية بشكل خاص.
        7. اللون: اترك هذا المربع فارغاً عند إجراء فحص طيفي. لاحظ أنه يمكن اختيار الألوان لنطاقات الطول الموجي الفردية لأغراض تصور البيانات، ولكن اللون غير مناسب للفك الطيفي اللاحق.
        8. كرر هذه الخطوات حتى يتم إضافة كل الطول الموجي الإثارة المطلوب ضمن نطاق المسح الطيفي المحدد.
      6. أمر الشراء: انقر على القائمة المنسدلة لاختيار الترتيب الذي سيتم تنفيذ الخيارات أعلاه (2.1.4.1-2.1.4.5). للمسح الطيفي مثل واحد هو مبين هنا، أمر الاستحواذ هو ببساطة قناة. لاحظ أن تظهر خيارات إضافية كمربعات إضافية يتم التحقق ضمن أداة الاكتساب متعدد الأبعاد [نقاط الوقت، مواضع متعددة (XY)، و مكدسات Z (شرائح)] والسماح باختيار إما الموضع أو الوقت أولاً، متبوعاً بشريحة أو قناه.
      7. التركيز التلقائي (غير مستخدم في هذا المثال): إذا تم تحديد مواضع متعددة (XY)، تتوفر عدة أنماط مختلفة من التركيز البؤري التلقائي. انقر فوق الزر خيارات وحدد طريقة تركيز تلقائي من القائمة المنسدلة بجانب الزر إغلاق.
      8. ملخص: راجع هذا الإطار للحصول على ملخص لعدد النقاط الزمنية، مواضع XY، شرائح Z، القنوات، العدد الإجمالي للصور، إجمالي الذاكرة، مدة المسح الضوئي، وترتيب الاكتساب لضمان تطابق المعلومات المسرودة مع إعدادات الاكتساب المتوقعة.
      9. حفظ الصور: تأكد من تحديد هذا المربع لحفظ البيانات التي تم جمعها من خلال استخدام أداة الاكتساب متعدد الأبعاد.
        1. انقر فوق ... بجوار جذر الدليل لاختيار جذر الدليل الذي سيتم حفظ الملفات فيه. اسم جذر الدليل بطريقة تصف التفاصيل ذات الصلة من التجربة (على سبيل المثال، GCaMP Airway خلايا العضلات الملساء).
        2. أدخل اسماً في المربع المجاور لبادئة الاسم الذي يصف عملية الحصول على الصورة الحالية (على سبيل المثال FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). من المستحسن إنشاء بادئة اسم تعرّف مجال العرض ووقت التعرض، بالإضافة إلى المعلومات الأخرى ذات الصلة مثل الكائن وعامل التصفية ثنائي الذرة المستخدم. لاحظ أنه سيتم حفظ مكدس الصور الأول الذي تم التقاطه باستخدام هذه الإعدادات مع "_1" بعد بادئة الاسم. سيتم حفظ أي مكدس اللاحقة التي تم التقاطها مع نفس جذر الدليل وبادئة الاسم مع "_n" الذي "n" هو عدد المرات التي تم أخذ مكدس مع هذا الاسم في الدليل.
        3. انقر فوق ملفات صور منفصلة لضمان حفظ الصورة التي تم إنشاؤها في كل الطول الموجي الإثارة.
      10. حفظ باسم: انقر فوق الزر حفظ باسم... لاحظ أنه سيتم حفظ جذر الدليل وبادئات الاسم أيضاً.
      11. الحصول على: أخيرا، انقر فوق اكتساب! لبدء الحصول على الصور وفقا لإعدادات الاكتساب المختارة أعلاه.

3- تصحيح الاستجابة الطيفية (اختياري):

  1. ويمكن إجراء تصحيح النواتج الطيفية لمعايرة الاستجابة الطيفية للنظام إلى مستوى معروف، مثل مصباح يمكن تعقبه من NIST أو معيار أو أداة أخرى يمكن تتبعها من NIST. وهذه الخطوة مهمة بصفة خاصة إذا ما قورنت النتائج بأدوات التصوير الطيفية الأخرى أو مطياف الطيف أو بين مختبرات مختلفة. تم الإبلاغ عن هذه العملية بالتفصيل سابقا21،23.
    1. استخدم مطياف معاير ًا لمصدر ضوء يمكن تعقبه لـ NIST (مثل LS-1-CAL-INT أو Ocean Optics) أو معيار آخر يمكن تتبعه من NIST للحصول على القوة الطيفية للإضاءة كما تم قياسها في مرحلة العينة. إجراء تصحيح منفصل لكل مجموعة من إعداد مصدر الضوء، مرآة ثنائية، وموضوعية. استخدم كرة دمج مقترنة بمطياف لقياس الإضاءة ذات الزاوية العريضة بدقة من هدف المجهر.
    2. استخدم طريقة تكامل، مثل القاعدة شبه المنحرفة، لدمج البيانات الطيفية على الأطوال الموجية المضيئة. عرض نطاق ترددي 40 نانومتر للتكامل تتمحور حول الطول الموجي المركز كافية لمعظم المرشحات التي لديها عرض نطاق نطاق ينصف اسمي بين 14-20 نانومتر عرض كامل في نصف الحد الأقصى (FWHM). تمثل القيمة المتكاملة شدة الإضاءة الطيفية في كل نطاق موجة إثارة.
    3. رسم الكثافة المتكاملة لكل نطاق الطول الموجي كدالة لطول موجة مركز الإثارة للسماح بالتصور للمحة كثافة الإضاءة الطيفية.
    4. تحديد نطاق الطول الموجي مع أدنى كثافة متكاملة.
    5. قم بتطبيع ملحت شدة الإضاءة الطيفية عن طريق تقسيم أدنى كثافة متكاملة حسب الكثافة المتكاملة لكل نطاق طول موجي لتوليد عامل تصحيح يعتمد على الطول الموجي.

4. إعداد عينة

  1. إعداد عينة "فارغة" (على سبيل المثال، وضع غطاء زجاجي في غرفة الخلية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت). تم وصف هذا المخزن المؤقت مسبقاً24.
  2. إعداد عينة غير مسمى لتحديد أي عينة autofluorescence (على سبيل المثال، وضع غطاء زجاجي يحتوي على خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء غير المسمى25،26 في غرفة الخلية وإضافة 1 مل من العازلة).
  3. إعداد عينة منفصلة ذات علامة واحدة لكل تسمية فلورسنت مستخدمة في التجربة على النحو التالي:
    1. إضافة تسمية الميتوكوندريا المخففة إلى المخزن المؤقت لتحقيق تركيز 100 nM. أضف هذا المخزن المؤقت إلى غطاء الغطاء الذي يحتوي على خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء. حضانة لمدة 20 دقيقة في 20-25 درجة مئوية. نقل غطاء إلى غرفة الخلية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت. لاحظ أن التركيز الأمثل لتسمية الميتوكوندريا سوف تختلف حسب عوامل مثل الشركة المصنعة، واللون المرتبط، والخصوصية المطلوبة.
    2. نقل غطاء تحتوي على خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء transfected مع التحقيق GCaMP27 إلى غرفة الخلية وإضافة 1 مل من العازلة.
  4. إعداد عينة تجريبية واحدة أو أكثر تحتوي على خليط من التسميات الفلورية المطلوبة.
    1. إضافة 1 مل من العازلة (100 تركيز NM من تسمية الميتوكوندريا) إلى غطاء يحتوي على خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء المنقولة مع التحقيق GCaMP وحضانة لمدة 20 دقيقة في 20-25 درجة مئوية. نقل غطاء إلى غرفة الخلية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت.

5- الحصول على البيانات:

  1. تحقق من أن beamsplitter ثنائي ة ثنائية الشكل (على سبيل المثال، 495 نانومتر مكعب مرشح ثنائي الأبعاد)، والهدف (على سبيل المثال، 60X هدف المياه)، والكاميرا (كاميرا sCMOS) يتم اختيارها.
  2. تحميل العينة على خشبة المسرح.
  3. انقر نقرًا مزدوجًا فوق المربع بجوار التعرض [مللي ثانية] واكتب "100" لتعيين وقت التعرض عند 100 مللي ثانية، لاحظ أن وقت التعرض قد يحتاج إلى زيادة أو إنقاص وفقًا لشدة الفلورة للعينة.
  4. حدد 475 نانومتر من القائمة المنسدلة من الإطار الرئيسي مدير صغير لعرض العينة الأولية. لاحظ أن 475 نانومتر قد لا يكون الطول الموجي الأمثل لعرض العينة أو تحديد ما إذا كان التشبع الزائد سيحدث في جميع أنحاء مكدس الصور.
  5. انقر فوق مباشر لعرض النموذج.
    1. انقر فوق زر نطاق عرض كثافة التلقائي السيارات بجوار الرسم البياني في الجزء السفلي من النافذة لجلب القيم الدنيا والقصوى في نطاقات بصرية ذات مغزى.
  6. استخدام المقابض التركيز المجهر للتركيز على العينة. غالباً ما يكون من المفيد العثور على حافة العينة للمساعدة في التركيز. سيتم تركيز العينة عندما تظهر ميزات الحافة في الصورة حادة. لاحظ أنه قد يكون من الضروري النقر فوق الزر تلقائي عدة مرات أثناء التركيز للمساعدة في عرض صورة الفلورة. بالإضافة إلى ذلك، قد يجد بعض المستخدمين أنه من الأسهل التركيز على العينة إذا كان المجهر في وضع الإرسال.
    1. إذا كان التركيز في وضع الإرسال، للسلامة، تأكد أولاً من أن مصدر الضوء الطيفي لا ينقل الضوء إلى الأعين قبل ضبط مسار الضوء لتصوير الإرسال. لاحظ أيضًا أنه قد تكون هناك انحرافات صغيرة بين تركيز صور الإرسال والفلورة. وعندما يتحقق التركيز المقبول، نعيد تكوين مسار الضوء للتصوير الطيفي الفلوري.
  7. انقر فوق Acq متعدد الد. بالقرب من أعلى يسار الإطار لفتح أداة الاكتساب متعدد الأبعاد (الموضحة والمكونة في القسم 2).
  8. اختيار نطاق طيفي مناسب للاكتساب الطيفي (على سبيل المثال، 360-485 نانومتر لفلتر ثنائي الأبعاد 495 نانومتر) بالنقر فوق الزر Load... في الجزء العلوي الأيمن من نافذة أداة الاكتساب متعددة الأبعاد والتنقل إلى إعدادات الإثارة حفظها مسبقا (في الخطوة 2.1.4.10). انظر المناقشة للحصول على معلومات بشأن النطاقات الطيفية المناسبة.
  9. الحصول على خلفية / صورة فارغة التي لا تحتوي على بيانات الفلورة لاستخدامها في الخلفية والطرح الضوضاء. يمكن تنفيذ ذلك باستخدام نموذج فارغ (الخطوة 4.1) أو عن طريق التنقل إلى منطقة فارغة من عينة تجريبية. كما هو موضح في الخطوة 5.6، يتم تحقيق هذا بسهولة عن طريق العثور على حافة العينة ثم وضعها بحيث يتم توسيط الحافة داخل مجال العرض.
    1. بمجرد تأكيد إعدادات الاكتساب وظهور منطقة خلفية، انقر فوق الزر Acquire! للحصول على كومة صور طيفية تحتوي على خلفية وضوضاء لاستخدامها للطرح لاحقًا. وتجدر الإشارة إلى أن العينات من المرجح أن يكون لها الفلورة أكثر كثافة بعيدا عن حافة العينة. قد يكون من المستحسن التحرك حول العينة للعثور على المناطق "ألمع" وإجراء عدة مكدسات صور الاختبار لتحديد أوقات الاكتساب المناسبة وتجنب التعرض المفرط.
  10. خذ كومة صورة واحدة على منطقة من العينة التي يبدو أن لديها الفلورة مكثفة لضمان عدم وجود مزيج من الأطوال الموجية وأن أوقات التعرض يؤدي إلى التعرض المفرط.
  11. استخدم ImageJ للتأكد من عدم احتواء الأطوال الموجية على بيكسلات مكشوفة.
    1. في ImageJ، انقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور وانتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور الطيفية التي تم التقاطها في الخطوة 5.10. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة. انقر فوق المربع بجوار عدد الصور وأدخل عدد الأطوال الموجية المضمنة في المسح الطيفي (على سبيل المثال، 26). ترك بداية الصورة وزيادة كـ "1". انقر فوق الزر موافق للمتابعة.
    2. اضغط على M على لوحة المفاتيح للاستفادة من وظيفة قياس ImageJ. تأكد من أن الرقم المدرج ضمن Max ليس الحد الأقصى للكشف عن الكاميرا (على سبيل المثال، 65,535). كرر لكل صورة في الفحص الطيفي. لاحظ أن حد الكشف عن الكاميرا يعتمد على الكاميرا نفسها. يتم عرض الحد العلوي في الجزء العلوي الأيمن من الرسم البياني في الإطار الرئيسي من MicroManager. بدلاً من ذلك، يمكن تحديد الحد الأعلى عن طريق فتح صورة في ImageJ والتنقل إلى الصورة > ضبط > السطوع/التباين. انقر فوق الزر تعيين في النافذة المنبثقة الناتجة، وأدخل قيمة كبيرة بشكل مفرط (على سبيل المثال، 999,999) في الفراغ بجوار الحد الأقصى للقيمة المعروضة، وانقر فوق موافق للمتابعة. يجب أن تكون القيمة القصوى المعروضة في الرسم البياني الجديد حد الكشف العلوي للكاميرا.
    3. وإذا كانت أي صور تحتوي على الحد الأعلى للكشف عن الكاميرا (على سبيل المثال، 535 65)، اضبط وقت التعرض للمسح الطيفي لضمان ألا تتجاوز الإشارة القصوى في جميع أنحاء النطاق الطيفي النطاق الدينامي للكاميرا.
  12. الحصول على بيانات الصورة الطيفية من عينات غير مسمى لتحديد أي الفلورة الذاتية. الحصول على المسح الضوئي للعينات غير المسماة باستخدام نطاق الطول الموجي متطابقة وإعدادات الكاميرا كما تبقى من التجربة (على سبيل المثال، 360-485 نانومتر في 100 مللي ثانية لكل طول موجة).
  13. الحصول على بيانات الصورة الطيفية من عينات تحمل علامة واحدة لاستخدامها كضوابط طيفية لبناء المكتبة الطيفية. إجراء المسح الضوئي لكل تسمية باستخدام نطاق الطول الموجي متطابقة، ووقت التعرض، وإعدادات الكاميرا. لاحظ أنه قد تكون هناك حاجة إلى وقت أطول للحصول على بعض العينات للسماح بالكشف الدقيق عن طيف الملصقات مع الحد الأدنى من المساهمة في الضوضاء.
  14. إجراء قياسات على عينة تجريبية (على سبيل المثال، خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء البشري مع مسبار GCaMP وتسمية الميتوكوندريا).
    1. ضع شريحة أو غطاء تحتوي على العينة التجريبية على المجهر.
    2. حدد حقل طريقة عرض مع خلايا الأنسجة المسماة بشكل مناسب.
    3. الحصول على بيانات الصورة الطيفية باستخدام إعدادات الاكتساب المطلوبة، كما هو موضح أعلاه.

6. تحليل الصور

  1. تصحيح الصور إلى استجابة طيفية مسطحة.
    1. طرح طيف الخلفية الذي تم الحصول عليه في القسم 5-9 وضربه بمعامل التصحيح المحدد في الفرع 3-1-5. يمكن القيام بذلك باستخدام برنامج نصي MATLAB بسيط أو روتين ImageJ. يتوفر رمز MATLAB للطرح/التصحيح (المستخدم في هذا المثال) على موقع موارد التصوير الحيوي لجامعة جنوب ألاباما.
      1. تحميل رمز الطرح/التصحيح في MATLAB.
      2. في علامة التبويب محرر، انقر فوق تشغيل. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة تحتوي على زر تصحيح Bsq. انقر فوق الزر تصحيح Bsq لفتح إطار آخر يحتوي على خيارات لدليل العمل وملف الخلفية وملف عامل التصحيح ومجلد tiff غير المصحح.
        1. استخدام الاستعراض... بجانب "دليل العمل" لاختيار مسار الملف حيث سيتم فتح الإطارات اللاحقة. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على طيف الخلفية المحفوظة (بتنسيق .dat).
        2. استخدام الاستعراض... بجانب ملف الخلفية (.dat) لفتح الدليل الذي تم اختياره في الخطوة 6.1.1.2.1 واختيار ملف الخلفية المطلوب (بتنسيق .dat). انقر فوق الزر فتح للمتابعة.
        3. استخدم الزر استعراض... الدليل لـ عامل التصحيح الافتراضي إلى موقع التعليمات البرمجية MATLAB الأصل. إذا لزم الأمر، انتقل إلى المجلد الفرعي الذي يحتوي على ملف عامل التصحيح (بتنسيق .dat). قم بتمييز ملف عامل التصحيح المناسب وانقر فوق الزر فتح للمتابعة.
        4. استخدم الزر استعراض... بجانب مجلد Tiff غير مصحح لفتح الدليل الذي تم اختياره في الخطوة 6.1.1.2.1 واختيار المجلد للطرح الخلفية وتصحيح الصورة (هذا عادةً المجلد Pos0 الذي يحتوي على الخام فوراً الصور الطيفية). انقر فوق الزر فتح للمتابعة.
        5. انقر فوق انقر للتصحيح الطيفي. بعد اكتمال المعالجة، سيتم فتح نافذة مع رسالة "Bsq تصحيح كاملة". انقر فوق الزر موافق للمتابعة. يتم تخزين صور التصحيح في مجلد جديد يسمى مع مجلد الصورة الطيفية الخام الأصلي و "_Corrected" إضافية (على سبيل المثال، Pos0_Corrected).
  2. إنشاء المكتبة الطيفية. ويمكن استخدام عدة مجموعات من البرامج لاستخراج البيانات الطيفية من الصور، بما في ذلك ImageJ. للحصول على أفضل النتائج، قم بتطبيع كل عضو نهاية إلى نطاق الطول الموجي من أكبر كثافة عن طريق تحديد النطاق الطول الموجي الذي له القيمة الأكثر كثافة وتقسيم القياس في كل نطاق الطول الموجي بتلك القيمة القصوى. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن عناصر التحكم ذات التسمية المفردة التي تم إنشاؤها داخل عينات الفلورسنت التلقائي ستحتاج إلى تعديلات إضافية28و29و30و31و32. انظر الخطوة 6-2-4 والمناقشة للاطلاع على التفاصيل.
    1. في ImageJ، انقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور الطيفية المصححة. انقر نقراً مزدوجاً فوق أي ملف صورة في المجلد لفتح إطار جديد. انقر فوق المربع بجوار عدد الصور وأدخل عدد الأطوال الموجية المضمنة في المسح الطيفي (على سبيل المثال، 26). ترك بداية الصورة وزيادة كـ "1". انقر فوق الزر موافق للمتابعة.
    2. في الإطار الرئيسي ImageJ، انقر فوق رمز تحديدات المضلع، ثم استخدم مؤشر الماوس بالنقر فوق الصورة لإنشاء مضلع حول منطقة تحتوي على بيانات الفلورة. لاحظ أنه قد يكون هناك القليل من البيانات الفلورية في الطول الموجي الأولي. انتقل إلى صورة طول موجة أخرى و/أو استخدم أداة السطوع/التباين (Image> ضبط > السطوع/التباين >تلقائي) لتصور المناطق التي تحتوي على بيانات الفلورة ذات الاهتمام بشكل أفضل.
    3. مع المضلع رسمها، إنشاء ملف تعريف محور Z عن طريق النقر فوق صورة > مكدسات > رسم Z-محور الشخصي. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة. انقر فوق حفظ لحفظ البيانات الطيفية كملف .csv.
    4. إجراء الطرح لضمان مكتبة الطيفية المناسبة مع تسميات نقية خالية من التلوث autofluorescence. استخدم المعادلة 29 التالية لعزل طيف نقي عن خليط من تسمية واحدة وفلورة:
      Equation 1(1)
      حيث: S نقية هو الطيف النقي من التسمية، Sمختلطة هو الطيف المقاس للعينة الملوثة autofluorescence، S autoFL هو الطيف autofluorescence قياس، "أ" هو مقياس مضاعف طيف الفلورة الذاتية (بين 0 و1؛ على سبيل المثال، 0.4)، و"الإزاحة" هو إزاحة (عادة 0). تختلف عبارة "أ" حتى يتم تحقيق قيمة شبه الصفر للمساهمة الظاهرة من autofluorescence. ويمكن الاطلاع على معلومات إضافية في العديد من المنشورات28،29،30،31،32.
  3. فك خلط بيانات الصورة الطيفية. سوف خطوة فك توليد صورة وفرة لكل تسمية الفلورسنت، حيث وفرة هو كمية إشارة الفلورة النسبية في الصورة من التسمية المعنية. تتوفر العديد من خوارزميات فك الخلط للاستخدام مع ImageJ33،34،35. بالإضافة إلى ذلك، يتوفر رمز MATLAB طيفي (يستخدم في هذا المثال) على موقع موارد التصوير الحيوي لجامعة جنوب ألاباما. وهناك نظرة عامة أشمل على فك الخلط الطيفي متاح36.
    1. قم بتحميل رمز فك الخلط الطيفي في MATLAB.
    2. تحرير ملفات Wavelength.mat وLibrary.mat لتتوافق مع الظروف التجريبية (على سبيل المثال، "الطول الموجي" كما 360-485 بزيادات من خمسة).
      ملاحظة: يجب تحميل القيم المقابلة لتلك الأطوال الموجية في "مكتبة" لكل تسمية الفلورسنت (وautofluorescence). Endmember_Name يجب سرد التسميات بنفس ترتيب قيم العمود "مكتبة". لاحظ أن الملف Library.mat يجب أن يحتوي على متغيرات "مكتبة" و "Endmember_Name".
    3. في علامة التبويب محرر، انقر فوق تشغيل. سيؤدي ذلك إلى فتح إطار جديد يسمح للمستخدم باختيار دليل. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور الطيفية لتكون غير مختلطة. بمجرد تحديده، سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة.
    4. في الفراغات الناتجة، أدخل اسم الصورة (على سبيل المثال، HASMC مع GCaMP وMito FOV1)، وعدد نطاقات الطول الموجي (على سبيل المثال، 26)، وعدد النقاط الزمنية (على سبيل المثال، 1) وما إذا كان من المرغوب في قياس FRET (على سبيل المثال، ن) في الفراغات الخاصة بكل منهما. إذا تم تحديد "n" لـ FRET، اترك كل من الفراغات العضو النهائي فارغة. اضغط "موافق" للمتابعة، والتي ستفتح نافذة جديدة.
    5. Naviagate إلى المجلد الذي يحتوي على الملف Wavelength.mat. بمجرد تحديده، انقر فوق فتح للمتابعة، والذي سيفتح نافذة جديدة.
    6. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الملف Library.mat. بمجرد تحديده، انقر فوق فتح للمتابعة، مما سيؤدي إلى حفظ الصور غير المختلطة في مجلد جديد "غير مختلط" داخل الدليل الذي يحتوي على الصور الطيفية.
  4. فحص الصور الطيفية غير المختلطة للجودة.
    1. افتح كل صورة غير مختلطة لفحص توزيع المكونات النقية بشكل مرئي.
      1. مقارنة حجم صورة الخطأ مع الصور غير المختلطة (على غرار الخطوة 5.11، يمكن أن يتم ذلك من خلال وظيفة قياس ImageJ). وإذا كان حجم صورة الخطأ مماثلاً من حيث الحجم لصور الوفرة غير المختلطة، فمن المرجح أن تكون هناك إشارات في بيانات الصورة الطيفية لا تحسبها بدقة المكتبة الطيفية والعملية الخطية للفك الطيفي.
      2. مقارنة صورة الخطأ إلى الصور غير المختلطة لمعرفة ما إذا كان هناك بنيات متبقية غير معروفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ومن الضروري اتخاذ عدة خطوات هامة من هذا البروتوكول لضمان جمع البيانات الدقيقة والخالية من التصوير والقطع الأثرية الطيفية. وقد يؤدي تخطي هذه الخطوات إلى بيانات تبدو هامة ولكن لا يمكن التحقق منها أو استنساخها مع أي نظام تصوير طيفي آخر، مما يبطل فعلياً أي استنتاجات يتم التوصل إليها باستخدام البيانات المذكورة. ومن أهم هذه الخطوات الهامة تصحيح النواتج الطيفية السليمة (القسم 3). ويعوض عامل التصحيح عن التغيرات المعتمدة على الطول الموجي في الناتج الطيفي لنظام الإثارة القابل للضبط. ويتم ذلك عن طريق توسيع الأطوال الموجية مع الإثارة عالية الطاقة بحيث تكون قوة الإضاءة البصرية قابلة للمقارنة مع الأطوال الموجية مع الإثارة القدرة المنخفضة، وتحقيق لمحة الإثارة الطيفية المسطحة. ومن الأمثلة على عامل التصحيح غير الملائم عامل يحتوي على قيم منخفضة جداً (على سبيل المثال، <0.001) في واحد أو أكثر من الأطوال الموجية، مما يشير إلى أن قيم الكثافة المقاسة بتلك الأطوال الموجية يجب أن تكون مخففة إلى حد كبير لتحقيق استجابة طيفية مسطحة.

كما تضمن معايرة النظام إلى معيار يمكن تتبعه في NIST أن تكون البيانات التي يتم جمعها باستخدام نظام التصوير الطيفي للمسح الضوئي للإثارة قابلة للمقارنة مع الأنظمة الأخرى التي يتم معايرةها أيضًا مع المعايير التي يمكن تتبعها في NIST. ولذلك، لا بد من التأكد من أن أي عامل تصحيح يعدل البيانات التي تم جمعها بشكل مناسب. يمكن التحقق من دقة عامل التصحيح باستخدام معيار الفلورة، مثل الفلورسين NIST التي يمكن تتبعها. ويوضح الشكل 1 عامل تصحيح مناسب وغير مناسب، يُصوَّر من خلال بيانات رسومية وبيانات صورية. وفي هذه الحالة، كان الناتج الطيفي عند 340 نانومتر غير موجود تقريباً مقارنة ببقية النطاق الطيفي، مما أسفر عن قيمة قريبة من الصفر (<0.001) لكل طول موجة تقريباً. يتم تطبيق هذا على مكدس الصور، وينتج عنه قيم شبه صفرية من خلال معظم مكدس الصور لمعظم وحدات البكسل.

وكما هو مذكور في القسم 5، فإن نطاق الإثارة، والفلوروفورات المختارة، وإعدادات الاقتناء قد تخلق إمكانية أن يحتوي نطاق واحد أو العديد من نطاقات صور الطول الموجي للإثارة على بيكسلات مفرطة في التشبع. ويوضح الشكل 2 مثالاً تم فيه تعيين وقت التعرض لفترة طويلة جداً بالنسبة للعديد من أطوال موجة الإثارة، مما تسبب في احتواء الصور اللاحقة على بيكسلات مفرطة في التشبع. وهذا أمر مهم أن نلاحظ لأنه، كما يبين الشكل، قد يبدو كل من الصور الفردية والصور ذات الألوان الكاذبة مرئيًا ضمن نطاقات كثافة مقبولة.

كما أن الاختيار المناسب لمنطقة الخلفية للطرح مهم أيضاً لمقارنة البيانات بين الأنظمة، حيث أنه يزيل عناصرضوضاء الكاميرا أو الضوء الضال قبل التصحيح الطيفي القابل للتتبع لـ NIST (الشكل 3). غالباً ما يكون من المفيد لمعالجة الصور اللاحقة وخطوات تحليل البيانات لتوليد صورة RGB كاذبة اللون من كومة الصورة الطيفية من أجل تصور الميزات الطيفية داخل الصورة. ويبين الشكل 4 صورة ذات ألوان زائفة RGB تم إنشاؤها عن طريق دمج ثلاثة نطاقات طول موجة مختارة (370 نانومتر = أزرق، 420 نانومتر = أخضر، 470 نانومتر = أحمر).

يتطلب فك الخلط الطيفي معرفة الملامح الطيفية لكل مصدر فلورة فردي. وفي حالة التصوير الطيفي الفائق المسح، يتم ذلك عن طريق الحصول على أكوام صور طيفية لكل فلوروفور (والفلورة الذاتية). والشكل 5 مدرج كمثال لاختيار المناطق من عناصر التحكم ذات التسمية الواحدة لإنشاء مكتبة طيفية. وتجدر الإشارة إلى أن كل قياس قد تم تطبيعه إلى الطول الموجي الذروة.

وعندما تُجرى عملية فك الخلط الطيفي بشكل صحيح، تسمح بفصل كومة الصور الطيفية إلى مساهمات كل منها من كل تسمية فلورية. ويبين الشكل 6 مثالاً على مجموعة الصور الطيفية غير المختلطة، مع صور فردية لكل إشارة من الإشارات التالية: الفلورة الذاتية لخلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء، ومسبار GCaMP، وتسمية الميتوكوندريا. كما يظهر الخطأ المرتبط بفك الخلط الطيفي ويمكن فحصه لمقارنة مستويات شدة الخطأ بمستويات شدة الإشارات غير المختلطة. وقد نوقش حساب وتفسير هذا الخطأ سابقا37. وكما هو مبين في الشكل6، هناك خطأ كبير يرتبط بالمناطق النووية والمناطق المحيطة بالأسلحة النووية في الخلايا، مما يشير إلى أن الأطياف المقاسة لتلك المناطق لا يُحسبها جيداً الأطياف في المكتبة الطيفية. قد يكون أحد مصادر الخطأ المحتملة أن عناصر التحكم أحادية التسمية لGCaMP وتسمية الميتوكوندريا تم إعدادها باستخدام خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء، والتي لديها الفلورة الأصلية عالية. وبالتالي، قد لا يمثل GCaMP وتسمية الميتوكوندريا أطياف عضو النهائي النقي. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤثر إشارة الفلورة الذاتية على أطياف المكتبة للتسميات الأخرى بطريقة لم يتم حسابها بشكل صحيح، مما يؤدي إلى تركيب أقل دقة مما لو تم الحصول على التسميات باستخدام خط خلية مع القليل إلى لا الفلورة الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين أمثلة على الوقت الذي تتوفر فيه مكونات قليلة جداً أو كثيرة جداً من المكتبة الطيفية، مما يؤدي إلى نقص في تركيب بيانات الصورة الطيفية ومدى الإفراط فيها، على التوالي (الشكل 6، الشكل 7، الشكل8، الشكل 9 والجدول1).

وكما لوحظ في القسم 6-2 والخطوة 6-2-4 على وجه التحديد، فإن الأطياف "النقية" التي يتم جمعها من الخلايا المسماة التي هي أيضاً الفلورسنت الذاتي من المرجح أن تلوث التشكيل الجانبي الطيفي للمكون النقي. على هذا النحو، ينبغي الحرص على فصل الأطياف النقية من تسميات الفائدة من المضيفين الفلورسنت. ويبين الشكل 10 الفرق بين فك الاختلاط والأطياف "النقية" الملوثة بالفلورة الذاتية (المختلطة) مقابل الأطياف النقية المحسوبة بالأسلوب الموصوف في الخطوة 6-2-4. يحدث الفرق بشكل رئيسي في فك خلط إشارة الفلورة الذاتية. بدون فصل إشارة مناسب (على سبيل المثال، طرح التلوث الذاتي من طيف GCaMP)، تتنافس مكونات مكتبة الفلورة الذاتية وGCaMP على نفس البيانات الطيفية في كل بكسل، مما يؤدي إلى ثقوب مميزة أو بقع داكنة في صورة الفلورة الذاتية.

Figure 1
الشكل 1 مثال على تطبيقات عوامل التصحيح غير الملائمة والمناسبة المستخدمة لتصحيح الصور إلى استجابة طيفية مسطحة. (أ) رسم عوامل تصحيح غير مناسبة ومناسبة. (B) صورة RGB تم إنشاؤها باستخدام عامل التصحيح غير المناسب في (A). (C) صورة RGB تم إنشاؤها بنفس مجال العرض مثل (B)، باستثناء استخدام عامل تصحيح مناسب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 الأمثلة التي توضح أهمية إعدادات الاكتساب المناسبة. (ألف،باء) صور RGB التي تم إنشاؤها بواسطة وقت اكتساب مناسب (A، 100 مللي ثانية) مقابل نفس مجال العرض مع وقت اكتساب مشبع (B، 500 مللي ثانية). تجدر الإشارة إلى أن صور RGB تبدو متطابقة عندما تكون ملونة زائفة. (ج) المنطقة ذات الاهتمام المختارة لمسح قيم الكثافة من المناطق الأكثر كثافة من (أ) و (ب). (D) قيم الكثافة المرسومة لكل طول موجة من صورة وقت التعرض 100 مللي ثانية (A، الخط الأسود) و500 مللي ثانية وقت التعرض (B، الخط الأحمر). وتجدر الإشارة إلى أن كثافة البكسل لوقت التعرض 500 مللي ثانية قد وصلت إلى الحد الأقصى للنطاق الديناميكي للكاشف (535 65 من الاتحاد الأفريقي) عند 370 نانومتر ولا تنخفض حتى 525 نانومتر، مما يؤدي إلى قطع أثرية طيفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 اختيار منطقة ذات أهمية للطرح في الخلفية. (أ) صورة خام، الطول الموجي، كثافة. (B) مناطق الصورة المحددة لتحديد طيف الخلفية متوسط بكسل للطرح الخلفية هو مبين باللون الأحمر. (C) صورة الكثافة التي تم طرحها وتصحيحها وتلخيصها في الخلفية. (D) تلوين RGB للصورة المصوبة (C). تظهر عملية إنشاء صورة ملونة زائفة RGB في الشكل 4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 عملية إنشاء صورة ملونة زائفة RGB: (ألف-جيم) وقد اختيرت ثلاثة نطاقات طول موجة متباعدة بالتساوي في جميع أنحاء نطاق الاكتساب الطيفي للتلوين الكاذب (الأزرق = 370 نانومتر، والأخضر = 420 نانومتر، والأحمر = 470 نانومتر). (D) صورة الكثافة الموجزة التي تم إنشاؤها عن طريق إضافة كثافات البكسل من جميع نطاقات الطول الموجي في مكعب الصورة. (E-G) يتم تطبيق الصور الموجودة في اللوحات (A-C) مع جداول البحث ذات الألوان الكاذبة الخاصة بها. (H) الصورة المدمجة الناتجة عن (E-G). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 : اختيار المنطقة لعناصر التحكم ذات التسمية المفردة لتوليد المكتبة الطيفية. (A)RGB صورة ملونة كاذبة من العضلات الملساء مجرى الهواء (ASM) الخلية autofluorescence. (ب) يظهر باللون الأحمر، ومناطق (أ) تم اختيارها لمكون الفلورة الذاتية للمكتبة الطيفية. (C) RGB خلايا ASM كاذبة اللون المسمى مع تسمية الميتوكوندريا. (د) يظهر باللون الأحمر، ومناطق (C) تم اختيارها لمكون التسمية الميتوشونديرال للمكتبة الطيفية. ونظراً للفلورة الذاتية لخلايا ASM المترجمة بالقرب من النواة، تم اختيار مناطق صغيرة بعيدة عن النوى لتحديد طيف تسمية الميتوكوندريا. (E) RGB خلايا ASM كاذبة اللون transfected مع التحقيق GCaMP. (F) تظهر المناطق (E) المختارة لمكون GCaMP من المكتبة الطيفية باللون الأحمر. على غرار (D)، تم اختيار مناطق بعيدة عن النوى. (G) المكتبة الطيفية التي تم الحصول عليها من A-F، تطبيع إلى قيمة الوحدة في الطول الموجي مع أقوى إشارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 6
الشكل 6 : مثال على بيانات الصورة غير المختلطة التي يمكن فيها تصور مساهمات إشارة نسبية غير مختلطة من كل مكون مكتبة. (ألف-دال) وفرة غير مختلطة من GCaMP، تسمية الميتوكوندريا، autofluorescence، ومصطلح الخطأ. (E-G) يتم تطبيق الصور الموجودة في اللوحات (A-C) مع جداول البحث ذات الألوان الكاذبة الخاصة بها. (H) المركب، المدمجة، صورة ملونة كاذبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 7
الشكل 7 : مساهمات إشارة نسبية غير مختلطة، بما في ذلك متوسط الكثافة والنسبة المئوية من إجمالي الفلورة، من مكتبة طيفية محددة بشكل صحيح. (ألف-دال) وفرة غير مختلطة للفلورة الذاتية، GCaMP، تسمية الميتوكوندريا، ومصطلح الخطأ. وتجدر الإشارة إلى أن مصطلح الخطأ يشمل أقل من 10٪ من إجمالي إشارة الفلورة المقاسة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 8
الشكل 8 مساهمات الإشارات النسبية غير المختلطة، بما في ذلك متوسط الكثافة والنسبة المئوية من إجمالي الفلورة، من مكتبة طيفية تفتقر إلى مكون معروف بإدراجه في العينة (أي مكتبة طيفية غير محددة). (ألف-جيم) وفرة غير مختلطة من autofluorescence، تسمية الميتوكوندريا، ومصطلح الخطأ. وتجدر الإشارة إلى أن إغفال GCaMP من المكتبة الطيفية قد زاد من مساهمات الإشارة النسبية المحسوبة من مكونات المكتبة وكذلك مصطلح الخطأ، عند مقارنتها بالشكل 7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9 مساهمات الإشارات النسبية غير المختلطة، بما في ذلك متوسط الكثافة والنسبة المئوية من إجمالي الفلورة، من مكتبة طيفية تحتوي على مكون إضافي معروف بأنه مفقود في العينة (أي مكتبة طيفية محددة أكثر من الدرجة). (ألف-هاء) وفرة غير مختلطة من الفلورة الذاتية، GCaMP، تسمية الميتوكوندريا، التسمية النووية، ومصطلح الخطأ. لاحظ أن إضافة علامة نووية إلى المكتبة الطيفية قد خفضت مساهمات الإشارة النسبية المحسوبة من الفلورة الذاتية، بالمقارنة مع الشكل 7. وعلاوة على ذلك، ينخفض مصطلح الخطأ إلى ما دون نسبة الخطأ المحددة من قبل المكتبة الطيفية المحددة بشكل صحيح. ويرجع ذلك إلى أن المكتبة المعرفة بشكل كبير سوف تسمح دائما ً تقريباً بملاءمة أفضل للبيانات التجريبية من مكتبة محددة بشكل صحيح، على الرغم من أن إشارات الوفرة للمكونات المعروفة بأنها غائبة عن العينة هي (في الواقع) قطع أثرية من الإفراط في تعريف مكتبة الطيفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10 : مقارنة الصور غير المختلطة عند استخدام مكتبة قبل وبعد الطرح إشارة التلوث autofluorescence السليم. (أ) الأطياف "النقية" الأصلية المستمدة من عناصر التحكم أحادية التسمية في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء الفلوري التلقائي للغاية قبل الطرح المُسجّل المفصل في الخطوة 6-2-4. (باء-دال) الصور الذاتية غير المختلطة، GCaMP، والصور التسمية النووية التي تم إنشاؤها باستخدام (A) كمكتبة. (E) الأطياف النقية المصححة المستمدة من ضوابط أحادية التسمية في خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء autofluorescent للغاية بعد الطرح تحجيم. (واو-H) الصور الذاتية غير المختلطة، GCaMP، والصور التسمية النووية التي تم إنشاؤها باستخدام (E) كمكتبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

متوسط الكثافة (الاتحاد الأفريقي)
المناسب المناسب التجهيزات الناقصة الإفراط في التجهيزات
الفلورة الذاتية 187 299 164
في 2012 139 - 140
تسمية الميتوكوندريا 246 318 248
التسمية النووية - - 26
خطأ في RMS 53 126 43
الانحراف المعياري (AU)
المناسب المناسب التجهيزات الناقصة الإفراط في التجهيزات
الفلورة الذاتية 362 442 315
في 2012 168 168
تسمية الميتوكوندريا 344 388 345
التسمية النووية - - 93
خطأ في RMS 62 126 44
الحد الأقصى للكثافة (AU)
المناسب المناسب التجهيزات الناقصة الإفراط في التجهيزات
الفلورة الذاتية 6738 7409 6738
في 2012 1336 - 1336
تسمية الميتوكوندريا 5098 5194 5098
التسمية النووية - - 1257
خطأ في RMS 1050 1286 910
النسبة المئوية من مجموع الفلورة
المناسب المناسب التجهيزات الناقصة الإفراط في التجهيزات
الفلورة الذاتية 30% 40% 26%
في 2012 22% 43% 23%
تسمية الميتوكوندريا 39% - 40%
التسمية النووية - - 4%
خطأ في RMS 8% 17% 7%

الجدول 1: جدول يقارن بين قيم كثافة الوفرة المتوسطة والانحراف المعياري والحد الأقصى لشدة الوفرة غير المختلطة لكل صورة وفرة غير مختلطة من مكتبة طيفية مناسبة ومن مكتبات طيفية محددة أو محددة بشكل زائد، وكذلك النسبة المئوية لمجموع الفلورة لكل صورة وفرة غير مختلطة (الحد الأدنى من كثافة وفرة غير مختلطة لكل صورة كان دائما صفر). البيانات المأخوذة من الشكل 7والشكل 8والشكل 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يبدأ الاستخدام الأمثل لإعداد التصوير فوق الطيفي المسح يُظهر ببناء مسار الضوء. وعلى وجه الخصوص، فإن اختيار مصدر الضوء، والمرشحات (القابلة للضبط وثنائية الديكروويك)، وطريقة تبديل الفلاتر، والكاميرا تحدد النطاق الطيفي المتاح، وسرعة المسح المحتملة، وحساسية الكاشف، وأخذ العينات المكانية. تقدم مصابيح قوس الزئبق العديد من قمم الطول الموجي للإثارة ولكنها لا توفر مخرجاً طيفياً مسطحاً وستتطلب تخفيضاً كبيراً للإشارة عند قمم المخرجات لتصحيح بيانات الصورة الطيفية مرة أخرى إلى استجابة يمكن تتبعها من NIST38. مصادر الضوء البديلة، مثل مصابيح قوس Xe وأشعة الليزر فائقة السلسلة الخفيفة البيضاء، قد توفر خرجطي أكثر توحيدًا مناسبًا للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الفائق الطيفية للإثارة38و39و40. تحديد مصدر الضوء، والمرشحات القابلة للضبط، والمرشحات ثنائية الشهي تحديد النطاق الطيفي المتاح. وينبغي اختيار هذا النطاق مع النظر بعناية في المعلومات الطيفية المطلوبة للعينة التجريبية.

بالإضافة إلى ذلك، ينبغي إيلاء الاعتبار لآلية التحويل المستخدمة لمرشحات القابلة للضبط، فضلا عن عوامل الكاميرا المختلفة مثل كفاءة الكم، وحجم بكسل، ومعدلات الإطار المتاحة، لأن هذه العوامل سوف تؤثر على معدلات أخذ العينات المحتملة41 ،42،43. ومع ذلك، فإن جميع العوامل الأخرى التي تكون ثابتة، واستخدام نهج المسح الضوئي للإثارة ينبغي أن يوفر حساسية متزايدة والقدرة على التصوير بشكل أسرع، مقارنة بمعظم نُهُج التصوير الطيفي للمسح بالانبعاثات21.

وكما لوحظ في المقدمة، يشير التصوير الطيفي الفائق هنا إلى الطبيعة المتجاورة والمتداخلة طيفيا للبيانات المكتسبة. وعلى هذا النحو، فإن قدرات النظام تحتاج إلى أن تكون قادرة على جمع البيانات باستخدام تباعد الأطوال الموجية مركز الإثارة أقل من نصف المسافة من FWHM من المرشحات. وكما ذُكر سابقاً، فإن مجموعة مختارة بعناية من مرشحات القابلة للضبط ذات اللفير الرقيق تسمح بالحصول على البيانات مع أطوال موجية مركزية متباعدة بمسافة 5 نانومتر، وهي مسافة تكفي للإفراط في تقدير طيف الإثارة الذي يعطى مرشحات مع FWHM تتراوح بين 14-20 نانومتر. وهذا التباعد يعطي فائضا طفيفا في جمع البيانات الطيفية مع احتمال زيادة دقة عملية فك الخلط. وقد نوقش النظر في كل من النطاقات الطيفية والحد الأدنى اللازم من قنوات الطول الموجي للفك الدقيق في الحالات44و45و46. ولهذه الغاية، وبالنظر إلى عرض نطاق هذه المرشحات، ينبغي اختيار نطاق الإثارة لينتهي عند طول موجة أقل إلى حد ما (أقل من 5-10 نانومتر) من الطول الموجي المقطوعة لbeamsplitter ثنائي الشهي. وهذا يضمن أن عرض النطاق الترددي بأكمله للإضاءة الإثارة هو أقل من الطول الموجي قطع من beamsplitter dichroic (على سبيل المثال، 360-485 نانومتر لمرشح 495 dichroic) لتجنب الإثارة الانبعاثات عبر الحديث.

مطلوب برنامج للتحكم بشكل مستقل في كل مكون من مكونات الأجهزة لتحقيق التصوير الطيفي عالي السرعة. يجب أن يكون البرنامج قادرا على تشغيل مصراع، واختيار الأطوال الموجية الإثارة، والحصول على الصور بسرعات عالية بما فيه الكفاية لتلبية الظروف التجريبية (متطلبات معدل العينة الدقيقة سوف تختلف التجربة، ولكن قد يكون الهدف المثال للحصول على أربعة مكدسات الصور الطيفية الكاملة في الدقيقة الواحدة). قد تستفيد التجارب الأكثر تعقيدًا من المرايا أو الأهداف أو مواقع XYZ المتعددة. هناك عدد من حزم البرامج المتاحة للحصول على البيانات47،48. Micro-Manager هو برنامج مفتوح المصدر مجاني لأتمتة المجهر الذي يقدم مجموعة متنوعة من خيارات التخصيص. وعلاوة على ذلك، يتضمن Micro-Manager لوحة برمجة نصية للتخصيص الإضافي غير متوفر داخل واجهة المستخدم الرئيسية. على سبيل المثال، من الممكن استخدام برنامج نصي مخصص لتقليل تأخير 250 مللي ثانية من مبدل الفلتر القابل للضبط إلى 10 مللي ثانية في جميع الأطوال الموجية للإثارة باستثناء انتقالات الطول الموجي التي تدور فيها عجلة الفلتر إلى مرشح جديد قابل للضبط، مما يقلل من التصوير الفعال الوقت بنسبة 240 مللي ثانية في الطول الموجي لمعظم الأطوال الموجية. وقد سمح هذا التخصيص الحصول على ما يصل إلى 30 الطول الموجي في أقل من 4 s. وأخيرا، يمكن تشغيل مايكرو مدير جنبا إلى جنب مع بيئات أخرى، مثل MATLAB، لمزيد من تخصيص التحكم في جهاز المجهر.

ومن المهم جداً تحديد نطاق الإثارة الطيفية المناسبة، ووقت الاكتساب، والطول الموجي الأولي لعرض العينات والحصول على البيانات اللاحقة. ومع ذلك، قد تتطلب عملية غير صحيحة من مكونات النظام الفردية مزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يساهم كل مكون من مكونات المسار البصري في بيانات الصورة التي تم الحصول عليها. ومن ثم، من المهم التحقق من الاستجابة الطيفية والبث البصري للمكونات البصرية داخل مسار الضوء، لا سيما إذا كان يحاول تحسين استجابة النظام عموما. مصادر الضوء غالبا ما يكون إعدادات كثافة متغير ة وقد يكون انخفاض في السلطة على مدى عمر لمبة40. إذا ظهرت عينة خافتة، قد يتم تقليل السبب الإخراج من مصدر الضوء. وظيفة autoshutter في مايكرو مدير، في تجربتنا، لا تعمل 100٪ من الوقت. قد يشير عدم وجود إشارة إلى مصراع مغلق. قد يكون الطول الموجي الإثارة الأولي المحفوظة داخل ملف تكوين Micro-Manager افتراضيًا إلى طول موجة مع إخراج طيفي قليل أو معدوم، مثل المثال 340 نانومتر الموضح في الشكل 1.

بالإضافة إلى ذلك، فإنه ليس من غير المألوف أن تختار عن طريق الخطأ الطول الموجي الإثارة التي هي فوق الطول الموجي قطع من beamsplitter dichroic تمرير طويل، مما أدى إلى مزيد من الحديث المتبادل و / أو ضوء الإثارة يجري تحويلها مباشرة إلى الكاميرا التي قد يحتمل أن تلحق الضرر بمستشعر الكاميرا. وبالمثل، قد يؤدي ضبط مسار الضوء لتصوير الإرسال إلى فقدان الإشارة إلى الكاميرا، اعتماداً على تكوين المجهر. وعلاوة على ذلك، وكما هو مبين في الشكل2، قد يبدو اختيار الطول الموجي للإثارة الأولية ووقت التعرض لعرض العينة مناسباً ولكنه يؤدي في الواقع إلى بيكسلات مفرطة في الطول الموجي للإثارة. لن تكون هذه الحقيقة واضحة ما لم يتم التحقق من تشبع البكسل لكل صورة، لذلك غالباً ما يكون من الحكمة إجراء مكدس صورة اختبار على منطقة من العينة التي يبدو أنها تحتوي على الفلورة الأكثر كثافة.

ومن الجدير بالذكر أيضا أن الكثافات المتغيرة قد تكون موجودة في الصور المختارة لمناطق الخلفية. وينبغي الحرص على ضمان ألا تحتوي هذه المناطق في الواقع على بيانات صور ذات صلة، لأن خطوات تصحيح البيانات اللاحقة ستطرح هذه الإشارة من بيانات الصورة التي تم الحصول عليها في مناطق أخرى في العينة. من الضروري في بعض الأحيان استخدام إعدادات الإرسال و/أو زيادة وقت التعرض بشكل كبير للتحقق من أن المنطقة المختارة لقياس خلفية العينة لا تحتوي في الواقع على أي عينة. وبالمثل، قد تقدم الصور غير المختلطة مع البقع الداكنة أو الثقوب في صورة الفلورة الذاتية. وقد يكون ذلك بسبب مكتبة غير سليمة ناجمة عن "تلوث" الإشارات الطيفية "النقية" من الخلايا ذات العلامات الفردية. ويرجع ذلك إلى أن أي إشارة طيفية "نقية" يتم جمعها من عينة تحتوي على الفلورة الذاتية ستحتوي دائماً على بعض أطياف الفلورة الذاتية نفسها، حتى ولو كانت بكميات ضئيلة. وينبغي الحرص على طرح إشارات الفلورة الذاتية من الضوابط ذات العلامات الوحيدة لضمان وجود مكتبة طيفية مناسبة، على النحو الذي وصفه مانسفيلد وآخرون فيعدة مناسبات،28و29و30، 31،32

على الرغم من عدم إثباته في هذه المقالة، يمكن أيضًا استخدام نظام التصوير الطيفي للتصوير بالفاصل الزمني والتصوير عبر مواقع XY متعددة (أو حقل رؤية كبير بسبب خياطة الصور) في عدة طائرات محورية. إذا كانت هذه الخيارات مرغوبة لتجربة واحدة، ينبغي التفكير بعناية في أهمية أمر الاقتناء والآثار المحتملة للتبييض الضوئي. ومن الجدير بالذكر أيضا أنه إذا تجاوز الوقت الفعلي الذي يستغرقه الوقت المقدر (على سبيل المثال، يستغرق مكدس الصور 11 ق للحصول على أكثر من 10 ق المقدرة)، سوف يستمر المدير الصغير في الحصول على العدد المحدد من النقاط الزمنية و/أو المراكز. ويمكن أن يتفاقم سوء التقدير هذا مع نقاط زمنية متعددة ويغير أخذ العينات الزمنية المحسوبة، مما قد يؤدي إلى انحراف أي استنتاجات يتم التوصل إليها من البيانات.

يوضح هذا المثال القدرة على فصل ثلاثة مصادر من الفلورة ضمن نطاق المسح الضوئي 145 نانومتر. وقد تمكنت التجارب السابقة التي أجريت باستخدام هذا النظام من فصل ما يصل إلى خمسة مصادر للفلورة ضمن النطاق نفسه. والوقت اللازم لاقتناء هذه الصورة أقل من دقيقة واحدة، وهو أسرع بكثير من معظم نظم التصوير الطيفي للمسح الضوئي للانبعاثات. قد تعمل التحسينات في مسار الضوء، مثل ضبط الطول الموجي للإثارة بسرعة أعلى، على زيادة تعزيز تقنية التصوير هذه إلى سرعات كافية للتصوير الطيفي بمعدل الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتور ليفسلي وريتش يكشفان عن اهتمام مالي في شركة ناشئة، SpectraCyte LLC، تأسست لتسويق تكنولوجيا التصوير الطيفي.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم من NSF 1725937، وNIH P01HL066299، وNIH R01HL058506، وNIH S10OD020149، وNIH UL1 TR001417، وNIH R01HL137030، AHA 18PRE34060163، وصندوق أبراهام ميتشل لبحوث السرطان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

Tags

الهندسة، العدد 150، الطيفي الفائق، التحليل الطيفي، الإثارة، الفلورة، الفحص المجهري، الفلورة الذاتية، التصوير، فلتر قابل للضبط، فيلم رقيق
التصوير المجهري للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الضوئي الفائق الطيفي للتمييز بكفاءة بين إشارات الفلورة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deal, J., Britain, A., Rich, T.,… More

Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter