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Engineering

Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

Las imágenes espectrales se han convertido en una solución fiable para la identificación y separación de múltiples señales de fluorescencia en una sola muestra y pueden distinguir fácilmente las señales de interés del fondo o la autofluorescencia. Las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación mejoran esta técnica al reducir el tiempo de adquisición de imagen necesario y, al mismo tiempo, aumentar la relación señal-ruido.

Abstract

Varias técnicas se basan en la detección de señales de fluorescencia para identificar o estudiar fenómenos o para dilucidar funciones. La separación de estas señales de fluorescencia se demostró engorrosa hasta el advenimiento de imágenes hiperespectrales, en las que las fuentes de fluorescencia pueden separarse entre sí, así como de las señales de fondo y la autofluorescencia (dado el conocimiento de su firmas). Sin embargo, las imágenes hiperespectrales tradicionales de escaneo de emisiones sufren de tiempos de adquisición lentos y bajas relaciones señal-ruido debido al filtrado necesario de excitación y luz de emisión. Se ha demostrado anteriormente que las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación reducen el tiempo de adquisición necesario y al mismo tiempo aumentan la relación señal-ruido de los datos adquiridos. Utilizando equipos disponibles comercialmente, este protocolo describe cómo ensamblar, calibrar y utilizar un sistema de microscopía de imágenes hiperespectrales de escaneo de excitación para la separación de señales de varias fuentes de fluorescencia en una sola muestra. Si bien es muy aplicable a las imágenes microscópicas de células y tejidos, esta técnica también puede ser útil para cualquier tipo de experimento que utilice fluorescencia en la que es posible variar las longitudes de onda de excitación, incluyendo pero no limitado a: imágenes químicas, aplicaciones ambientales, el cuidado de los ojos, la ciencia de los alimentos, la ciencia forense, la ciencia médica y la mineralogía.

Introduction

Las imágenes espectrales se pueden realizar de diversas maneras y se hace referencia a varios términos1,2,3,4. En general, las imágenes espectrales se refieren a datos adquiridos en al menos dos dimensiones espaciales y una dimensión espectral. Las imágenes multiespectrales e hiperespectrales se distinguen con mayor frecuencia por el número de bandas de longitud de onda o si las bandas espectrales son contiguas1. Para esta aplicación, los datos hiperespectrales se definen como datos espectrales adquiridos con bandas de longitud de onda contiguas alcanzadas por el espaciado de longitudes de onda centrales no menos de la mitad de la anchura completa a la mitad máxima (FWHM) de cada filtro de paso de banda utilizado para la excitación (es decir, 5 nm espaciado de longitud de onda central para filtros de paso de banda con anchos de banda de 14-20 nm). La naturaleza contigua de las bandas de datos permite un sobremuestreo del conjunto de datos, asegurando que se cumplan los criterios de Nyquist al muestrear el dominio espectral.

Las imágenes hiperespectrales fueron desarrolladas por la NASA en las décadasde 1970 y 1980 en conjunto con el primer satélite Landsat 5,6. La recopilación de datos de varias bandas espectrales contiguas permitió la generación de un espectro de resplandor de cada píxel. La identificación y definición del espectro de resplandor de componentes individuales permitió no sólo detectar materiales superficiales por sus espectros característicos, sino que también permitió la eliminación de señales intervinientes, como variaciones en la señal debido a condiciones atmosféricas. El concepto de detección de materiales utilizando sus espectros característicos se aplicó a los sistemas biológicos en 1996, cuando Schrock et al. utilizaron combinaciones de cinco fluoróforos diferentes y sus espectros conocidos para distinguir los cromosomas etiquetados en un proceso denominado cariotipado espectral7. Esta técnica fue elaborada en 2000 por Tsurui et al. para la toma de imágenes de fluorescencia de muestras de tejido, utilizando siete colorantes fluorescentes y descomposición de valor singular para lograr la separación espectral de cada píxel en combinaciones lineales de espectros en la referencia biblioteca8. Al igual que sus contrapartes de teledetección, la contribución de cada fluoróforo conocido se puede calcular a partir de la imagen hiperespectral, dada la información a priori del espectro de cada fluoróforo.

También se han utilizado imágeneshiperespectrales en las áreas de agricultura 9, astronomía10,biomedicina11, imágenes químicas12,aplicaciones ambientales13,atención ocular14, ciencia de los alimentos15, ciencias forenses16,17, ciencias médicas18, mineralogía19,y vigilancia20. Una limitación clave de los sistemas de imágenes hiperespectrales del microscopio de fluorescencia actual es que la tecnología de imágenes hiperespectrales estándar aísla las señales de fluorescencia en bandas estrechas por 1) primero filtrando la luz de excitación para controlar la excitación de la muestra, luego 2) filtrado adicional de la luz emitida para separar la emisión de fluorescencia en bandas estrechas que más tarde se pueden separar matemáticamente21. Filtrar tanto la iluminación de excitación como la fluorescencia emitida reduce la cantidad de señal disponible, lo que reduce la relación señal-ruido y requiere largos tiempos de adquisición. La señal baja y los largos tiempos de adquisición limitan la aplicabilidad de las imágenes hiperespectrales como herramienta de diagnóstico.

Se ha desarrollado una modalidad de imagen que hace uso de imágenes hiperespectrales pero potencia la señal disponible, reduciendo así el tiempo de adquisición necesario21,22. Esta nueva modalidad, llamada imagen hiperespectral de análisis de excitación, adquiere datos de imágenes espectrales variando la longitud de onda de excitación y recopilando una amplia gama de luz emitida. Se ha demostrado anteriormente que esta técnica produce órdenes de aumentos de magnitud en la relación señal-ruido en comparación con las técnicas de escaneo de emisiones21,22. El aumento de la relación señal-ruido se debe en gran medida al paso de banda ancho (600 nm) de luz de emisión detectada, mientras que la especificidad se proporciona filtrando sólo la luz de excitación en lugar de la emisión de fluorescencia. Esto permite que todas las luzs emitidas (para cada longitud de onda de excitación) lleguen al detector21. Además, esta técnica se puede utilizar para discriminar la autofluorescencia de etiquetas exógenas. Además, la capacidad de reducir el tiempo de adquisición debido al aumento de la señal detectable reduce el peligro de fotoblanqueo, así como permite escaneos espectrales a una velocidad de adquisición que es aceptable para la imagen de video espectral.

El objetivo de este protocolo es servir como una guía de adquisición de datos para la microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Además, se incluyen descripciones que ayudan a entender la ruta de luz y el hardware. También se describe la implementación de software de código abierto para un microscopio de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Por último, se proporcionan descripciones sobre cómo calibrar el sistema a un estándar rastreable por NIST, ajustar la configuración de software y hardware para obtener resultados precisos y desmezclar la señal detectada en contribuciones de componentes individuales.

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Protocol

1. Configuración del dispositivo

  1. Fuente de luz: seleccione una fuente de luz espectral de banda ancha con salida de alta potencia y alta colimación (se utilizó una lámpara de arco Xe de 300 W para estos estudios).
  2. Obturador (opcional): añada un obturador a la trayectoria óptica para reducir el fotoblanqueo de imágenes de lapso de tiempo.
  3. Sistema de filtro ajustable: incorpore un conjunto de ajuste mecánico y un filtro ajustable de película delgada (TFTF) configurado para habilitar el rango de excitación ajustable en longitud de onda deseado (por ejemplo, 360-485 nm).
  4. Microscopio: utilice un microscopio de fluorescencia invertido que incluya una torreta de filtro dicrromía motorizada y un controlador.
    1. Cubo de filtro de fluorescencia: ensamble un cubo de filtro de fluorescencia de paso largo. Para obtener los mejores resultados, elija un espejo dicroico y un filtro de emisión de paso largo en la misma longitud de onda para lograr una separación óptima de la excitación de la luz de emisión (por ejemplo, 495 nm).
    2. Objetivo: utilizar un objetivo apocromático adecuado para garantizar un enfoque uniforme sobre el rango de longitud de onda utilizado para el experimento (se utilizó un objetivo de agua de 60x para este estudio).
    3. Etapa automatizada (opcional): utilice una etapa automatizada para el muestreo rápido de múltiples campos de visión y/o campos muy grandes a través de la costura de imágenes. Calibrar el escenario con el objetivo y la cámara.
  5. Cámara: seleccione una cámara adecuada para lograr los requisitos de resolución espacial, sensibilidad y ruido del experimento (este sistema utilizó una cámara sCMOS de alta sensibilidad).

2. Software de adquisición

  1. Elija un paquete de software que permita un control independiente de cada componente de hardware, como Micro-Manager.
    1. Creación del archivo de configuración: el archivo de configuración es un conjunto guardado de instrumentos e instrucciones que Micro-Manager cargará para operar el hardware del sistema. Para crear un archivo de configuración, haga clic en Herramientas > Asistente para configuraciónde hardware .
      1. En el paso 1, haga clic en Crear nueva configuración > Siguiente para continuar. Tenga en cuenta que el usuario puede optar por modificar o explorar la configuración existente si ya hay una disponible.
      2. En el paso 2, examine la lista Dispositivos disponibles para encontrar los dispositivos que se pueden controlar a través de Micro-Manager, como el microscopio, la lámpara, el escenario, el obturador y la cámara. Cuando esté resaltado, haga clic en Agregar... para agregar el dispositivo a la lista de dispositivos instalados. Esto abrirá una nueva ventana.
        1. Designe la etiqueta del dispositivo en el cuadro Etiqueta. (por ejemplo, cámara sCMOS)
        2. En Valor, seleccione el puerto COM adecuado para cada dispositivo. Esto hará que aparezca una lista de propiedades del dispositivo en la parte inferior de la ventana.
        3. Deje las propiedades del dispositivo en su configuración predeterminada. Tenga en cuenta que los valores personalizados para cada propiedad de dispositivo se pueden especificar como se desee.
        4. Cuando se agregue cada dispositivo, haga clic en el botón Siguiente para continuar con el paso siguiente. Tenga en cuenta que si algún dispositivo se deja fuera o necesita ser cambiado, el archivo de configuración se puede modificar más adelante como se describe en el paso 2.1.1.1.
      3. En el paso 3, utilice los menús desplegables para seleccionar la cámara, el obturador y el escenario de enfoque predeterminados. Si desea un obturador automático, haga clic en la casilla de verificación situada debajo de la lista desplegable del escenario de enfoque. Si se conoce la dirección de enfoque de la etapa Z, selecciónela en la lista desplegable en Direcciones de enfoque del escenario (avanzadas). De lo contrario, deje el valor predeterminado como Desconocido.
      4. En el paso 4, haga doble clic en las casillas bajo el encabezado Delay [ms] para establecer los retrasos asociados con los dispositivos automatizados, como retrasos de 100 ms para la lámpara, la etapa y el obturador, y un retraso de 250 ms para que los comandos en el conjunto de ajuste mecánico tiempo de conmutación mecánica entre filtros.
      5. En el paso 5, asigne etiquetas para los dispositivos de estado. La configuración del sistema de microscopio de excitación-escaneo utiliza etiquetas en el bloque de filtro para identificar cada cubo de filtro de fluorescencia (por ejemplo, el estado 0 corresponde a la etiqueta Bright, el cubo de filtro vacío utilizado durante las imágenes de campo brillante; mientras que mientras que estado 3 corresponde a la etiqueta 495 nm y cubo de filtro dicroico personalizado de 495 nm utilizado para separar la excitación y la luz de emisión a 495 nm). Las etiquetas también se utilizan en el conjunto de ajuste mecánico para almacenar los comandos de conmutación para cada longitud de onda de excitación (por ejemplo, el estado 0 corresponde al comando de ajuste de longitud de onda de excitación de 340 nm para el conjunto de afinación mecánica).
      6. En el paso 6, haga clic en el botón Examinar situado junto al cuadro Archivo de configuración para elegir una ubicación de guardado y un nombre de archivo para el archivo de configuración. Haga clic en Finalizar para guardar el archivo de configuración.
    2. Grupos de inicio y ajustes preestablecidos: Micro-Manager puede almacenar diferentes grupos dentro de cada archivo de configuración para activar o cambiar un subconjunto del hardware. Por ejemplo, un grupo de "inicio del sistema" y una combinación preestablecida almacenarán la configuración predeterminada, como el tamaño de binning y las tasas de lectura de la cámara.
      1. Cree un grupo (por ejemplo, Sistema) haciendo clic en + en la ventana principal de la subsección Grupo.
      2. Marque cualquier uso en grupo? cuadros dentro del grupo que requerirán que se establezca un valor predeterminado (por ejemplo, binning en la cámara predeterminada asociada).
      3. Cree un nuevo ajuste preestablecido (por ejemplo, "Inicio") haciendo clic en + en la ventana principal de la subsección Ajustes preestablecidos.
      4. Cada casilla marcada en el paso 2 aparecerá como una opción preestablecida aquí. Elija un valor predeterminado que se cargará para cada casilla marcada.
    3. Grupo y ajustes preestablecidos para las longitudes de onda de excitación: Micro-Manager trata cada longitud de onda de excitación como su propio canal con su propio comando de conmutación de longitud de onda; por lo tanto, cada uno debe guardarse como su propio ajuste preestablecido.
      1. Crear un nuevo grupo que contenga un conjunto de longitudes de onda de excitación deseadas (por ejemplo, "dichroico de 495 nm")
      2. Marque la casilla del uso en el grupo? nombrada escritura de la etiqueta correspondiente al dispositivo VF-5.
      3. Cree un nuevo ajuste preestablecido con el nombre de cada longitud de onda de excitación (por ejemplo, "340 nm").
      4. Asigne a cada preajuste el nombre de propiedad y el valor preestablecido apropiados (por ejemplo, el nombre de la propiedad: "Etiqueta"; valor preestablecido: "340 nm").
    4. Herramienta de adquisición multidimensional: haga clic enAcq Multi-D.cerca de la parte superior izquierda de la ventana de Micro-Manager para abrir una herramienta personalizable para capturar una imagen de la muestra en cada longitud de onda de excitación con el clic de un solo botón. Hay varias opciones de personalización para construir la adquisición exactamente como se desee.
      1. Puntos de tiempo (no utilizados en este ejemplo): para estudios sin componente de lapso de tiempo, deje la casilla desactivada. Si se desean estudios de lapso de tiempo, marque esta casilla. Si está activada, especifique el número de veces que se realizará el resto de la configuración de adquisición en el cuadro Número. Establezca el tiempo entre adquisiciones sucesivas introduciendo la duración en el cuadro Intervalo y elija la unidad adecuada (milisegundos, segundos o minutos; normalmente segundos).
      2. Múltiples posiciones (XY; no utilizadas en este ejemplo): para estudios de una sola posición XY, deje la casilla desmarcada. Si desea varias posiciones XY, marque la casilla y haga clic en el botón Editar lista de posiciones para abrir una ventana independiente. Mueva el escenario a cada ubicación deseada y haga clic en el botón Marcar para guardar esa posición en el software. Repita el proceso hasta que se marquen todas las posiciones XY deseadas. Cierre esta ventana para continuar.
      3. Pilas Z (diapositivas; no utilizadas en este ejemplo): para estudios de una sola posición Z, deje la casilla desmarcada. Si se desean varias posiciones Z, marque la casilla. Mueva el escenario a la posición Z inicial deseada y haga clic en el botón Establecer situado junto al cuadro de inicio Z. Mueva el escenario a la posición Z final deseada y haga clic en el botón Establecer situado junto al cuadro de extremo Z. Introduzca el tamaño de paso deseado (en micras) en el cuadro de paso Z.
      4. Canales: asegúrese de que la casilla Canales esté marcada. Aquí, los canales son los nombres dados a las longitudes de onda de excitación individuales. Los "Canales" disponibles corresponden a los "Grupos" descritos en los pasos 2.1.2 y 2.1.3.
        1. Grupo: haga clic en la lista desplegable para seleccionar un grupo entre el que elegir las longitudes de onda de excitación disponibles (por ejemplo, 495 nm dichroico).
        2. Haga clic en el cuadro Mantener obturador abierto para mantener el obturador abierto entre las adquisiciones de cada canal. Tenga en cuenta que el obturador seguirá cerritando entre exploraciones espectrales sucesivas si esta casilla está marcada, suponiendo que la opción de obturador automático también esté seleccionada en la ventana principal.
      5. Haga clic en el botón Nuevo para agregar canales a la lista de adquisiciones. Tenga en cuenta que el botón Eliminar se puede utilizar para eliminar los canales que ya no se desee y que Arriba y Abajo se puede utilizar para reordenar cualquier canal seleccionado.
        1. Asegúrese de que la casilla Usar? esté seleccionada para cada longitud de onda deseada en el escaneo espectral.
        2. Configuración: haga clic en la lista desplegable en Configuración y elija la primera longitud de onda en el rango espectral deseado (por ejemplo, 340 nm).
        3. Exposición: haga doble clic en el cuadro de Exposición e introduzca el tiempo de exposición deseado para la longitud de onda seleccionada (por ejemplo, "100" para 100 ms). Consulte la sección 5 ("Adquisición de datos") para obtener sugerencias para seleccionar los tiempos de exposición adecuados.
        4. Desplazamiento Z (no aplicable en un escaneo espectral): deje este cuadro en blanco (en 0) al realizar un escaneo espectral.
        5. Z-stack: asegúrese de que esta casilla está marcada para cada longitud de onda en el rango espectral si se realiza una pila Z.
        6. Omitir P. (no aplicable en un escaneo espectral): deje este cuadro en blanco (en 0) al realizar un escaneo espectral. Tenga en cuenta que puede ser útil omitir selectivamente fotogramas en caso de que una o pocas longitudes de onda de excitación sean significativamente más potentes que otras o si las longitudes de onda de excitación individuales resultan ser especialmente fototóxicas.
        7. Color: deje este cuadro en blanco al realizar un escaneo espectral. Tenga en cuenta que los colores se pueden elegir para bandas de longitud de onda individuales para fines de visualización de datos, pero el color no es adecuado para la posterior desmezcla espectral.
        8. Repita estos pasos hasta que se añada cada longitud de onda de excitación deseada dentro del rango de exploración espectral dado.
      6. Orden de adquisición: haga clic en la lista desplegable para elegir en qué orden se realizarán las opciones anteriores (2.1.4.1-2.1.4.5). Para escaneos espectrales como el que se muestra aquí, la orden de adquisición es simplemente Canal. Tenga en cuenta que las opciones adicionales aparecen como cuadros adicionales están marcadas dentro de la herramienta Adquisición multidimensional [puntos de tiempo, Múltiples posiciones (XY) y pilas Z (cortes)] y permiten la elección de la posición o la hora primero, seguido de sector o Canal.
      7. Enfoque automático (no utilizado en este ejemplo): si se selecciona Varias posiciones (XY), hay varios estilos diferentes de enfoque automático disponibles. Haga clic en el botón Opciones y seleccione un método de enfoque automático en la lista desplegable situada junto al botón Cerrar.
      8. Resumen: revise esta ventana para ver un resumen del número de puntos de tiempo, posiciones XY, sectores Z, canales, número total de imágenes, memoria total, duración del análisis y orden de adquisición para asegurarse de que la información listada coincide con la configuración de adquisición esperada.
      9. Guardar imágenes: asegúrese de que esta casilla está marcada para guardar los datos recopilados mediante el uso de la herramienta Adquisición multidimensional.
        1. Haga clic en el botón ... junto a La raíz del directorio para elegir una raíz de directorio en la que se guardarán los archivos. Asigne un nombre a la raíz del directorio de una manera que describa los detalles relevantes del experimento (por ejemplo, GCaMP Airway Smooth Muscle Cells).
        2. Escriba un nombre en el cuadro situado junto al prefijo Name que describa la adquisición de imagen actual (por ejemplo, FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Es aconsejable crear un prefijo de nombre que identifique el campo de visión y el tiempo de exposición, así como otra información relevante como el objeto y el filtro dicoico utilizado. Tenga en cuenta que la primera pila de imágenes tomada con esta configuración se guardará con "_1" siguiendo el prefijo de nombre. Cualquier pila posterior tomada con la misma raíz de directorio y prefijo de nombre se guardará con "_n", en la que "n" es el número de veces que se ha tomado una pila con este nombre en el directorio.
        3. Haga clic en Separar archivos de imagen para asegurarse de que se guarda la imagen generada en cada longitud de onda de excitación.
      10. Guardar como: haga clic en el botón Guardar como... cerca de la parte superior derecha de la herramienta Adquisición multidimensional para guardar estos ajustes de adquisición para un uso fácil en el futuro. Tenga en cuenta que los prefijos de raíz y nombre del directorio también se guardarán.
      11. Adquirir: finalmente, haga clic en Adquirir! para comenzar a adquirir imágenes de acuerdo con la configuración de adquisición elegida anteriormente.

3. Corrección de respuesta espectral (opcional):

  1. La corrección de salida espectral se puede realizar para calibrar la respuesta espectral del sistema a un estándar conocido, como una lámpara rastreable por NIST u otro instrumento o estándar rastreable por NIST. Este paso es especialmente importante si los resultados se comparan con otros instrumentos de imagen espectral, espectrómetros o entre diferentes laboratorios. Este proceso se ha notificado detalladamente anteriormente21,23.
    1. Utilice un espectrómetro calibrado para una fuente de luz rastreable por NIST (como LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) u otro estándar rastreable por NIST para adquirir la potencia espectroradiométrica de la iluminación medida en la etapa de la muestra. Realice una corrección independiente para cada combinación de ajuste de fuente de luz, espejo dicroico y objetivo. Utilice una esfera integradora acoplada al espectrómetro para medir con precisión la iluminación gran angular desde el objetivo del microscopio.
    2. Utilice un método de integración, como la regla trapezoidal, para integrar los datos espectroradiométricos sobre longitudes de onda iluminadas. Un ancho de banda de 40 nm para la integración centrada alrededor de la longitud de onda central es suficiente para la mayoría de los filtros que tienen un ancho de banda nominal de entre 14-20 nm de ancho completo a medio máximo (FWHM). El valor integrado representa la intensidad de la iluminación espectral en cada banda de longitud de onda de excitación.
    3. Trazar la intensidad integrada de cada banda de longitud de onda en función de la longitud de onda central de excitación para permitir la visualización del perfil de intensidad de iluminación espectral.
    4. Determine la banda de longitud de onda con la intensidad integrada más baja.
    5. Normalice el perfil de intensidad de iluminación espectral dividiendo la intensidad integrada más baja por la intensidad integrada de cada banda de longitud de onda para generar un factor de corrección dependiente de la longitud de onda.

4. Preparación de muestras

  1. Prepare una muestra "en blanco" (por ejemplo, coloque un cubreobjetos de vidrio en la cámara de la celda y agregue 1 ml de tampón). Este búfer se ha descrito anteriormente24.
  2. Preparar una muestra sin etiquetar para determinar cualquier autofluorescencia de muestra (por ejemplo, colocar un cubreobjetos de vidrio que contenga células musculares lisas de las vías respiratorias no etiquetadas25,26 en la cámara celular y añadir 1 ml de tampón).
  3. Prepare una muestra separada de una sola etiqueta para cada etiqueta fluorescente utilizada en el experimento de la siguiente manera:
    1. Añadir la etiqueta mitocondrial diluida al tampón para lograr una concentración de 100 nM. Agregue este tampón al cubreobjetos que contiene las células musculares lisas de las vías respiratorias. Incubar durante 20 min a 20-25oC. Mueva el cubreobjetos a la cámara celular y agregue 1 ml de tampón. Tenga en cuenta que la concentración óptima de la etiqueta mitocondrial variará según factores como el fabricante, el color asociado y la especificidad deseada.
    2. Mueva un cubreobjetos que contenga células musculares lisas de las vías respiratorias transllenados con la sonda GCaMP27 a la cámara celular y agregue 1 ml de tampón.
  4. Prepare una o más muestras experimentales que contengan una mezcla de las etiquetas fluorescentes deseadas.
    1. Añadir 1 ml de tampón (concentración de 100 nM de etiqueta mitocondrial) a un cubreobjetos que contenga células musculares lisas de las vías respiratorias transllenas con la sonda GCaMP e incubar durante 20 minutos a 20-25 oC. Mueva el cubreobjetos a la cámara celular y agregue 1 ml de tampón.

5. Adquisición de datos:

  1. Compruebe que se seleccionan el divisor de haz dicroico adecuado (por ejemplo, cubo de filtro dicroico de 495 nm), objetivo (por ejemplo, objetivo de agua 60x) y cámara (cámara sCMOS).
  2. Cargue la muestra en el escenario.
  3. Haga doble clic en la casilla situada junto a Exposición [ms] y escriba "100" para ajustar el tiempo de exposición a 100 ms. Tenga en cuenta que el tiempo de exposición puede necesitar aumentar o disminuir dependiendo de la intensidad de fluorescencia de la muestra.
  4. Seleccione 475 nm en el menú desplegable de la ventana principal de Micro-Manager para la visualización inicial de la muestra. Tenga en cuenta que 475 nm puede no ser la longitud de onda óptima para la visualización de la muestra o determinar si se producirá una sobresaturación en toda la pila de imágenes.
  5. Haga clic en En vivo para ver el ejemplo.
    1. Haga clic en el botón de rango de visualización de intensidad automática Automático junto al histograma en la parte inferior de la ventana para llevar los valores mínimo y máximo a rangos visuales significativos.
  6. Utilice las perillas de enfoque del microscopio para centrarse en la muestra. A menudo es útil encontrar el borde de la muestra para ayudar a enfocar. La muestra se enfocará cuando las entidades de borde de la imagen aparezcan nítidas. Tenga en cuenta que puede ser necesario hacer clic en el botón Automático varias veces durante el enfoque para ayudar a ver la imagen de fluorescencia. Además, a algunos usuarios les puede resultar más fácil centrarse en la muestra si el microscopio está en modo de transmisión.
    1. Si se enfoca en modo de transmisión, por seguridad, primero asegúrese de que la fuente de luz espectral no está transmitiendo luz a los oculares antes de ajustar la trayectoria de la luz para la imagen de transmisión. También tenga en cuenta que puede haber pequeñas desviaciones entre el foco de la transmisión y las imágenes de fluorescencia. Cuando se haya alcanzado un enfoque aceptable, vuelva a configurar la ruta de luz para la fluorescencia espectral.
  7. Haga clic en Multi-D Acq. cerca de la parte superior izquierda de la ventana para abrir la herramienta Adquisición multidimensional (descrita y configurada en la sección 2).
  8. Elija un rango espectral adecuado para la adquisición espectral (por ejemplo, 360-485 nm para el filtro dicroico de 495 nm) haciendo clic en el botón Cargar... en la parte superior derecha de la ventana de herramientas Adquisición multidimensional y navegando a la configuración de excitación guardado anteriormente (en el paso 2.1.4.10). Consulte la discusión para obtener información sobre los rangos espectrales apropiados.
  9. Adquiera una imagen de fondo/en blanco que no contenga datos de fluorescencia que se utilicen para el fondo y la resta de ruido. Esto se puede realizar utilizando una muestra en blanco (paso 4.1) o navegando a una región en blanco de una muestra experimental. Como se describe en el paso 5.6, esto se logra más fácilmente al encontrar el borde de la muestra y luego colocarla de modo que el borde se centre dentro del campo de visión.
    1. Una vez que se confirmen los ajustes de adquisición y una región de fondo sea visible, haga clic en el botón Adquirir! para adquirir una pila de imágenes espectrales que contenga fondo y ruido para utilizar para la resta posterior. Cabe señalar que es probable que las muestras tengan una fluorescencia más intensa lejos del borde de la muestra. Puede ser aconsejable desplazarse por la muestra para encontrar las regiones "más brillantes" y realizar varias pilas de imágenes de prueba para determinar los tiempos de adquisición adecuados y evitar la sobreexposición.
  10. Tome una sola pila de imágenes en una región de la muestra que parece tener fluorescencia intensa para asegurarse de que ninguna combinación de longitudes de onda y que los tiempos de exposición resulten en sobreexposición.
  11. Utilice ImageJ para confirmar que ninguna longitud de onda contiene píxeles sobreexpuestos.
    1. En ImageJ, haga clic en Archivo > Importar > Secuencia de imágenes y vaya a la carpeta que contiene las imágenes espectrales tomadas en el paso 5.10. Esto abrirá una nueva ventana. Haga clic en el cuadro situado junto a Número de imágenes e introduzca el número de longitudes de onda incluidas en el escaneo espectral (por ejemplo, 26). Deje la imagen inicial y el incremento como "1". Haga clic en el botón Aceptar para continuar.
    2. Pulse M en el teclado para utilizar la función de medición de ImageJ. Asegúrese de que el número que aparece en Max no es el límite de detección superior de la cámara (por ejemplo, 65.535). Repita el proceso para cada imagen en el escaneo espectral. Tenga en cuenta que el límite de detección de la cámara depende de la propia cámara. El límite superior se muestra en la parte superior derecha del histograma en la ventana principal de MicroManager. Alternativamente, el límite superior se puede determinar abriendo una imagen en ImageJ y navegando a Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste. Haga clic en el botón Establecer en la ventana emergente resultante, introduzca un valor excesivamente grande (por ejemplo, 999.999) en el espacio en blanco junto a Valor máximo mostradoy haga clic en Aceptar para continuar. El valor máximo mostrado en el nuevo histograma debe ser el límite de detección superior de la cámara.
    3. Si alguna imagen contenía el límite de detección superior de la cámara (por ejemplo, 65.535), ajuste el tiempo de exposición de la exploración espectral para asegurarse de que la señal máxima en todo el rango espectral no exceda el rango dinámico de la cámara.
  12. Adquiera datos de imágenes espectrales de muestras sin etiquetar para determinar cualquier autofluorescencia. Adquiera el escaneo de las muestras sin etiquetar utilizando un rango de longitud de onda idéntico y ajustes de la cámara como el resto del experimento (por ejemplo, 360-485 nm a 100 ms por longitud de onda).
  13. Adquiera datos de imagen espectral de muestras de una sola etiqueta para utilizarlos como controles espectrales para crear la biblioteca espectral. Realice el escaneo de cada etiqueta utilizando un rango de longitud de onda, tiempo de exposición y ajustes de cámara idénticos. Tenga en cuenta que puede ser necesario un tiempo de adquisición más largo para algunas muestras para permitir una detección precisa del espectro de etiquetas con una contribución mínima de ruido.
  14. Realizar mediciones en una muestra experimental (por ejemplo, células musculares lisas de las vías respiratorias humanas con sonda GCaMP y etiqueta mitocondrial).
    1. Coloque un portaobjetos o un cubreobjetos que contenga la muestra experimental en el microscopio.
    2. Seleccione un campo de visión con células de tejidos debidamente etiquetadas.
    3. Adquiera los datos de imagen espectral utilizando la configuración de adquisición deseada, como se describió anteriormente.

6. Análisis de imágenes

  1. Corrija las imágenes a una respuesta espectral plana.
    1. Restar el espectro de fondo obtenido en la sección 5.9 y multiplicar por el coeficiente de corrección determinado en la sección 3.1.5. Esto se puede hacer con un script MATLAB simple o una rutina ImageJ. Un código MATLAB de resta/corrección (utilizado en este ejemplo) está disponible en el sitio web de recursos de bioimagen de la Universidad de South Alabama.
      1. Cargue el código de resta/corrección en MATLAB.
      2. En la pestaña EDITOR, haga clic en Ejecutar. Esto abrirá una nueva ventana que contiene un botón de corrección Bsq. Haga clic en el botón Corrección de Bsq para abrir otra ventana que contenga opciones para el directorio de trabajo, el archivo de fondo, el archivo de factor de corrección y la carpeta tiff no corregida.
        1. Utilice el examinar... botón junto al Directorio de trabajo para elegir la ruta de archivo donde se abrirán las ventanas posteriores. Vaya a la carpeta que contiene el espectro de fondo guardado (en formato .dat).
        2. Utilice el examinar... botón situado junto al archivo de fondo (.dat) para abrir el directorio elegido en el paso 6.1.1.2.1 y elegir el archivo de fondo deseado (en formato .dat). Haga clic en el botón Abrir para continuar.
        3. Utilice el botón Examinar... situado junto a Factor de corrección (.dat) para elegir un factor de corrección. El directorio del factor de corrección tiene como valor predeterminado la ubicación del código MATLAB principal. Si es necesario, vaya a la subcarpeta que contiene el archivo de factor de corrección (en formato .dat). Resalte el archivo de factor de corrección adecuado y haga clic en el botón Abrir para continuar.
        4. Utilice el botón Examinar... junto a Carpeta Tiff no corregida para abrir el directorio elegido en el paso 6.1.1.2.1 y elija la carpeta para la resta de fondo y la corrección de imagen (esta suele ser la carpeta Pos0 que contiene inmediatamente la materia prima espectrales). Haga clic en el botón Abrir para continuar.
        5. Haga clic en el botón Haga clic para corrección espectral. Una vez completado el procesamiento, se abrirá una ventana con el mensaje "Bsq Correction Complete". Haga clic en el botón Aceptar para continuar. Las imágenes de corrección se almacenan en una nueva carpeta denominada con la carpeta de imagen espectral sin formato original y una "_Corrected" adicional (por ejemplo, Pos0_Corrected).
  2. Genere la biblioteca espectral. Se pueden utilizar varios paquetes de software para extraer datos espectrales de imágenes, incluyendo ImageJ. Para obtener mejores resultados, normalice cada miembro final a la banda de longitud de onda de mayor intensidad determinando qué banda de longitud de onda tiene el valor más intenso y dividiendo la medida en cada banda de longitud de onda por ese valor máximo. También hay que señalar que los controles de etiqueta única generados dentro de muestras autofluorescentes necesitarán modificaciones adicionales28,29,30,31,32. Consulte el paso 6.2.4 y la discusión para obtener más información.
    1. En ImageJ, haga clic en Archivo > Importar > Secuenciade imágenes . Esto abrirá una nueva ventana. Vaya a la carpeta que contiene las imágenes espectrales corregidas. Haga doble clic en cualquier archivo de imagen de la carpeta para abrir una nueva ventana. Haga clic en el cuadro situado junto a Número de imágenes e introduzca el número de longitudes de onda incluidas en el escaneo espectral (por ejemplo, 26). Deje la imagen inicial y el incremento como "1". Haga clic en el botón Aceptar para continuar.
    2. En la ventana principal de ImageJ, haga clic en el icono Selecciones de polígono y, a continuación, utilice el puntero del ratón haciendo clic en la imagen para crear un polígono alrededor de una región que contenga datos de fluorescencia. Tenga en cuenta que puede haber pocos o ningún dato de fluorescencia en la longitud de onda inicial. Navegue a otra imagen de longitud de onda y/o utilice la herramienta de brillo/contraste (Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste > Automático) para visualizar mejor las regiones que contienen datos de fluorescencia de interés.
    3. Con el polígono dibujado, genere el perfil del eje Z haciendo clic en Imagen > Pilas > Trazarperfil del eje Z . Esto abrirá una nueva ventana. Haga clic en Guardar para guardar los datos espectrales como un archivo .csv.
    4. Realice una resta para asegurar una biblioteca espectral adecuada con etiquetas puras carentes de contaminación por autofluorescencia. Utilice la siguiente ecuación29 para aislar un espectro puro de la mezcla de una sola etiqueta y fluorescencia:
      Equation 1(1)
      Donde: Spuro es el espectro puro de la etiqueta, Smezclado es el espectro medido de la muestra contaminada con autofluorescencia, S autoFL es el espectro de autofluorescencia medido, "a" es un escalar multiplicador del espectro de autofluorescencia (entre 0 y 1; por ejemplo, 0,4) y "offset" es un desplazamiento (normalmente 0). Variar el término "a" hasta que se alcance un valor cercano a cero para la contribución aparente de la autofluorescencia. Se puede encontrar información adicional en varias publicaciones28,29,30,31,32.
  3. Descomparte los datos de imagen espectral. El paso de desmezcla generará una imagen de abundancia para cada etiqueta fluorescente, donde la abundancia es la cantidad de señal de fluorescencia relativa en la imagen de la etiqueta respectiva. Varios algoritmos de desmezcla están disponibles para su uso con ImageJ33,34,35. Además, un código MATLAB de desmezcla espectral (utilizado en este ejemplo) está disponible en el sitio web de Recursos de Bioimagen de la Universidad de South Alabama. Una visión más completa de la desmezcla espectral está disponible36.
    1. Cargue el código de desmezcla espectral en MATLAB.
    2. Edite los archivos Wavelength.mat y Library.mat para que se correspondan con las condiciones experimentales (por ejemplo, "Longitud de onda" como 360-485 en incrementos de cinco).
      NOTA: Los valores correspondientes para esas longitudes de onda deben cargarse en "Biblioteca" para cada etiqueta fluorescente (y autofluorescencia). Endmember_Name debe enumerar las etiquetas en el mismo orden que los valores de columna de "Library". Tenga en cuenta que el archivo Library.mat debe contener las variables "Library" y "Endmember_Name".
    3. En la pestaña EDITOR, haga clic en Ejecutar. Esto abrirá una nueva ventana que permite al usuario elegir un directorio. Vaya a la carpeta que contiene las imágenes espectrales que se van a desmezclar. Una vez seleccionado, se abrirá una nueva ventana.
    4. En los espacios en blanco resultantes, introduzca el nombre de la imagen (por ejemplo, HASMC con GCaMP y Mito FOV1), el número de bandas de longitud de onda (por ejemplo, 26), el número de puntos de tiempo (por ejemplo, 1) y si se desea una medición FRET (por ejemplo, n) en sus respectivos espacios en blanco. Si se selecciona "n" para FRET, deje ambos espacios en blanco de miembro final vacíos. Pulse OK para continuar, que abrirá una nueva ventana.
    5. Navegue a la carpeta que contiene el archivo Wavelength.mat. Una vez seleccionado, haga clic en Abrir para continuar, que abrirá una nueva ventana.
    6. Vaya a la carpeta que contiene el archivo Library.mat. Una vez seleccionado, haga clic en Abrir para continuar, que guardará las imágenes no mezcladas en una nueva carpeta "Sin mezclar" dentro del directorio que contiene las imágenes espectrales.
  4. Inspeccione la calidad de las imágenes espectrales no mezcladas.
    1. Abra cada imagen no mezclada para inspeccionar visualmente la distribución de los componentes puros.
      1. Compare la magnitud de la imagen de error con la de las imágenes no mezcladas (similar al paso 5.11, esto se puede hacer a través de la función de medida de ImageJ). Si la magnitud de la imagen de error es similar en magnitud a las imágenes de abundancia no mezcladas, es probable que haya señales en los datos de imagen espectral que no son contabilizadas con precisión por la biblioteca espectral y el proceso de desmezcla espectral lineal.
      2. Compare la imagen de error con las imágenes no mezcladas para ver si hay estructuras residuales no identificadas.

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Representative Results

Varios pasos importantes de este protocolo son necesarios para garantizar la recopilación de datos que son precisos y carentes de imágenes y artefactos espectrales. Omitir estos pasos puede dar lugar a datos que parezcan significativos pero que no puedan ser verificados o reproducidos con cualquier otro sistema de imágenes espectrales, anulando así efectivamente cualquier conclusión hecha con dichos datos. El principal de estos pasos importantes es la corrección de salida espectral adecuada (sección 3). El factor de corrección compensa las variaciones dependientes de la longitud de onda en la salida espectral del sistema de excitación ajustable. Esto se logra escalando longitudes de onda con excitación de alta potencia de tal manera que la potencia de iluminación óptica es comparable a las longitudes de onda con una excitación de baja potencia, logrando un perfil de excitación espectral plana. Un ejemplo de un factor de corrección inapropiado es aquel que contiene valores muy bajos (por ejemplo, <0.001) en una o más longitudes de onda, lo que indica que los valores de intensidad medidos en esas longitudes de onda deben atenuarse en gran medida para lograr una respuesta espectral plana.

La calibración del sistema a un estándar rastreable por NIST garantiza que los datos recopilados con el sistema de imágenes espectrales de análisis de excitación y exploración sean comparables a otros sistemas también calibrados a los estándares rastreables por NIST. Por lo tanto, es imperativo asegurarse de que cualquier factor de corrección ajusta los datos recopilados adecuadamente. La precisión de un factor de corrección se puede verificar con el uso de un estándar de fluorescencia, como la fluoresceína rastreable por NIST. La Figura 1 ilustra un factor de corrección adecuado e inapropiado, visualizado a través de datos gráficos e imágenes. En este caso, la salida espectral a 340 nm era prácticamente inexistente en comparación con el resto del rango espectral, resultando en un valor cercano a cero (<0.001) para prácticamente cada longitud de onda. Aplicado a la pila de imágenes, esto da como resultado valores cercanos a cero a través de la mayor parte de la pila de imágenes para la mayoría de los píxeles.

Como se indica en la sección 5, el rango de excitación, los fluoróforos seleccionados y los ajustes de adquisición pueden crear el potencial de que una o varias bandas de imagen de longitud de onda de excitación contengan píxeles sobresaturados. La Figura 2 ilustra un ejemplo en el que el tiempo de exposición se estableció demasiado tiempo para varias de las longitudes de onda de excitación, haciendo que las imágenes posteriores contengan píxeles sobresaturados. Esto es importante tener en cuenta porque, como muestra la figura, tanto las imágenes individuales como las imágenes de color falso pueden parecer visualmente dentro de rangos de intensidad aceptables.

La selección adecuada de una región de fondo para la resta también es importante para la comparación de datos entre sistemas, ya que elimina elementos de ruido de la cámara o luz perdida antes de la corrección espectral rastreable por el NIST (Figura3). A menudo resulta útil para los siguientes pasos de procesamiento de imágenes y análisis de datos para generar una imagen RGB de color falso de la pila de imágenes espectrales con el fin de visualizar las entidades espectrales dentro de la imagen. La Figura 4 muestra una imagen RGB de color falso generada por la fusión de tres bandas de longitud de onda seleccionadas (370 nm á azul, 420 nm a verde, 470 nm a rojo).

La desmezcla espectral requiere el conocimiento del perfil espectral de cada fuente de fluorescencia individual. En el caso de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación, esto se hace mediante la adquisición de pilas de imágenes espectrales para cada fluoróforo (y autofluorescencia). La figura 5 se incluye como ejemplo para elegir regiones de controles de etiqueta única para generar una biblioteca espectral. Cabe señalar que cada medición se ha normalizado a su longitud de onda pico.

Cuando se realiza correctamente, el proceso de desmezcla espectral permite la separación de una pila de imágenes espectrales en las respectivas contribuciones de cada etiqueta de fluorescencia. La Figura 6 muestra un conjunto de imágenes espectrales no mezcladas de ejemplo, con imágenes individuales para cada una de las siguientes señales: autofluorescencia de células musculares lisas de las vías respiratorias, una sonda GCaMP y una etiqueta mitocondrial. El error asociado con la desmezcla espectral también se muestra y se puede examinar para comparar los niveles de intensidad del error con los de las señales no mezcladas. Cálculo e interpretación de este error se ha discutido anteriormente37. Como se muestra en la Figura6, hay un alto error asociado con las regiones nucleares y perinucleares de las células, lo que indica que los espectros medidos de esas regiones no están bien contabilizados por los espectros de la biblioteca espectral. Una fuente potencial de error puede ser que los controles de etiqueta única para GCaMP y la etiqueta mitocondrial se prepararon utilizando células musculares lisas de las vías respiratorias, que tienen una alta autofluorescencia nativa. Por lo tanto, el GCaMP y la etiqueta mitocondrial pueden no representar espectros de miembro final puro. Además, la señal de autofluorescencia puede influir en los espectros de la biblioteca para las otras dos etiquetas de una manera que no se tuvo debidamente en cuenta, lo que resulta en un ajuste menos preciso que si las etiquetas se hubieran adquirido utilizando una línea celular con poco o ningún autofluorescencia. Además, se incluyen ejemplos para cuando hay muy pocos o demasiados componentes de una biblioteca espectral disponibles, lo que resulta en un subajuste y sobreajuste de los datos de imagen espectral, respectivamente (Figura6, Figura 7, Figura 8, Figura 9y Tabla 1).

Como se indica en la sección 6.2 y específicamente en el paso 6.2.4, los espectros "puros" recopilados a partir de células etiquetadas que también son autofluorescentes probablemente contaminarán el perfil espectral del componente puro. Como tal, se debe tener cuidado de separar los espectros puros de las etiquetas de interés de sus huéspedes autofluorescentes. La Figura 10 muestra la diferencia de desmezcla con espectros "puros" contaminados con autofluorescencia (mezclada) frente a espectros puros calculados por el método descrito en el paso 6.2.4. La diferencia se produce principalmente en la desmezcla de la señal de autofluorescencia. Sin la separación adecuada de la señal (por ejemplo, la resta de la contaminación por autofluorescencia del espectro GCaMP), la autofluorescencia y los componentes de la biblioteca GCaMP compiten por los mismos datos espectrales en cada píxel, lo que resulta en agujeros característicos u manchas oscuras en la imagen de autofluorescencia.

Figure 1
Figura 1 : Ejemplo de aplicaciones de factores de corrección inapropiados y apropiados utilizados para corregir imágenes a una respuesta espectral plana. (A) Factores de corrección inapropiados y apropiados. (B) Una imagen RGB generada con el uso del factor de corrección inapropiado en (A). (C) Una imagen RGB generada con el mismo campo de visión que (B), excepto con el uso de un factor de corrección adecuado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Ejemplos que ilustran la importancia de la configuración de adquisición adecuada. (A,B) Imágenes RGB generadas por un tiempo de adquisición adecuado (A, 100 ms) frente al mismo campo de visión con un tiempo de adquisición de saturación (B, 500 ms). Debe tenerse en cuenta que las imágenes RGB aparecen idénticas cuando son de color falso. (C) La región de interés seleccionada para topojar los valores de intensidad de las regiones más intensas de (A) y (B). (D) Valores de intensidad trazados por longitud de onda a partir de la imagen de tiempo de exposición de 100 ms (A, línea negra) y el tiempo de exposición de 500 ms (B, línea roja). Cabe señalar que las intensidades de píxeles para el tiempo de exposición de 500 ms han alcanzado el límite del rango dinámico del detector (65.535 UA) a 370 nm y no disminuyen hasta 525 nm, lo que resulta en artefacto espectral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Selección de una región de interés para la resta de fondo. (A) Una imagen de intensidad cruda y sumada a longitud de onda. (B) Regiones de la imagen seleccionada para determinar el espectro de fondo promediado por píxeles para la resta de fondo que se muestra en rojo. (C) La imagen de intensidad restado, corregida y sumada en segundo plano. (D) Color RGB de la imagen corregida (C). El proceso de generación de una imagen RGB de color falso se muestra en la Figura4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Proceso de generación de una imagen RGB de color falso. (A-C) Se seleccionaron tres bandas de longitud de onda espaciadas uniformemente a lo largo del rango de adquisición espectral para el color falso (azul a 370 nm, verde a 420 nm, rojo a 470 nm). (D) La imagen de intensidad sumada generada mediante la adición de intensidades de píxeles de todas las bandas de longitud de onda en el cubo de imagen. (E-G) Las imágenes en paneles (A-C) con sus respectivas tablas de búsqueda de color falso aplicadas. (H) La imagen fusionada resultante de (E-G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Selección de regiones de controles de etiqueta única para la generación de bibliotecas espectrales. (A) imagen RGB de color falso de la autofluorescencia celular del músculo liso de las vías respiratorias (ASM). (B) Se muestra en rojo, regiones de (A) elegidas para el componente de autofluorescencia de la biblioteca espectral. (C) células ASM de color falso RGB etiquetadas con la etiqueta mitocondrial. (D) Se muestra en rojo, regiones de (C) elegidas para el componente de etiqueta mitocondiral de la biblioteca espectral. Debido a la autofluorescencia de las células ASM localizadas cerca del núcleo, se seleccionaron pequeñas regiones lejos de los núcleos para identificar el espectro de la etiqueta mitocondrial. (E) células ASM de color falso RGB transfectó con la sonda GCaMP. (F) Las regiones de (E) seleccionadas para el componente GCaMP de la biblioteca espectral se muestran en rojo. De forma similar a (D), se seleccionaron regiones alejadas de los núcleos. (G) La biblioteca espectral obtenida de A-F, normalizada a un valor de unidad en la longitud de onda con la señal más fuerte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Ejemplo de datos de imagen no mezclados en los que se pueden visualizar las contribuciones de señal relativa no mezcladas de cada componente de biblioteca. (A-D) La abundancia no mezclada de GCaMP, etiqueta mitocondrial, autofluorescencia y término de error. (E-G) Las imágenes en paneles (A-C) con sus respectivas tablas de búsqueda de color falso aplicadas. (H) La imagen compuesta, fusionada y de color falso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 7
Figura 7 : Contribuciones de señal relativa no mezcladas, incluyendo intensidad media y porcentaje de fluorescencia total, de una biblioteca espectral correctamente definida. (A-D) La abundancia no mezclada para autofluorescencia, GCaMP, etiqueta mitocondrial y término de error. Cabe señalar que el término de error comprende menos del 10% de la señal total de fluorescencia medida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 8
Figura 8 : Contribuciones de señal relativa no mezcladas, incluida la intensidad media y el porcentaje de fluorescencia total, de una biblioteca espectral que falta un componente que se sabe que se incluye en la muestra (es decir, una biblioteca espectral subdefinida). (A-C) La abundancia no mezclada de autofluorescencia, etiqueta mitocondrial y término de error. Tenga en cuenta que la omisión de GCaMP de la biblioteca espectral ha aumentado las contribuciones de señal relativa calculadas de los componentes de la biblioteca, así como el término de error, en comparación con la Figura7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9 : Contribuciones de señal relativano no mezcladas, incluida la intensidad media y el porcentaje de fluorescencia total, de una biblioteca espectral que contiene un componente adicional que se sabe que falta en la muestra (es decir, una biblioteca espectral sobredefinida). (A-E) La abundancia no mezclada de autofluorescencia, GCaMP, etiqueta mitocondrial, etiqueta nuclear y término de error. Tenga en cuenta que la adición de una etiqueta nuclear a la biblioteca espectral ha disminuido las contribuciones de señal relativa calculadas de la autofluorescencia, en comparación con la Figura7. Además, el término de error se reduce por debajo del error de porcentaje especificado por la biblioteca espectral definida correctamente. Esto se debe a que una biblioteca sobredefinida casi siempre permitirá un mejor ajuste a los datos experimentales que una biblioteca definida correctamente, aunque las señales de abundancia para los componentes que se sabe que están ausentes de la muestra son (en realidad) artefactos de sobredefinición de la biblioteca espectral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10 : Comparación de imágenes no mezcladas cuando se utiliza una biblioteca antes y después de la resta de señal de contaminación por autofluorescencia adecuada. (A) Los espectros originales "puros" derivados de los controles de una sola etiqueta en células musculares lisas altamente autofluorescentes de las vías respiratorias antes de la resta escalada detallada en el paso 6.2.4. (B-D) Las imágenes de autofluorescencia no mezclada, GCaMP y etiquetas nucleares generadas utilizando (A) como biblioteca. (E) Los espectros puros corregidos derivados de controles de una sola etiqueta en células musculares lisas altamente autofluorescentes de las vías respiratorias después de la resta escalada. (F-H) La autofluorescencia no mezclada, GCaMP, y las imágenes de etiquetas nucleares generadas utilizando (E) como biblioteca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Intensidad media (AU)
Ajuste adecuado Subequipamiento Sobreajuste
Autofluorescencia 187 299 164
GCaMP 139 - 140
Etiqueta mitocondrial 246 318 248
Etiqueta nuclear - - 26
Error de RMS 53 126 43
Desviación estándar (AU)
Ajuste adecuado Subequipamiento Sobreajuste
Autofluorescencia 362 442 315
GCaMP 168 168
Etiqueta mitocondrial 344 388 345
Etiqueta nuclear - - 93
Error de RMS 62 126 44
Intensidad máxima (AU)
Ajuste adecuado Subequipamiento Sobreajuste
Autofluorescencia 6738 7409 6738
GCaMP 1336 - 1336
Etiqueta mitocondrial 5098 5194 5098
Etiqueta nuclear - - 1257
Error de RMS 1050 1286 910
% de fluorescencia total
Ajuste adecuado Subequipamiento Sobreajuste
Autofluorescencia 30% 40% 26%
GCaMP 22% 43% 23%
Etiqueta mitocondrial 39% - 40%
Etiqueta nuclear - - 4%
Error de RMS 8% 17% 7%

Tabla 1: Una tabla que compara el promedio, la desviación estándar y los valores máximos de intensidad de abundancia no mezclados por imagen de abundancia no mezclada de una biblioteca espectral adecuada y de bibliotecas espectrales infradefinidas o sobredefinidas, así como el porcentaje de fluorescencia total por imagen de abundancia no mezclada (la intensidad mínima de abundancia no mezclada para cada imagen siempre fue cero). Datos tomados de la Figura 7, Figura 8y Figura 9.

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Discussion

El uso óptimo de una configuración de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación comienza con la construcción de la trayectoria de luz. En particular, la elección de la fuente de luz, los filtros (ajustables y dicoicos), el método de conmutación de filtros y la cámara determinan el rango espectral disponible, la posible velocidad de escaneo, la sensibilidad del detector y el muestreo espacial. Las lámparas de arco de mercurio ofrecen muchos picos de longitud de onda de excitación, pero no proporcionan una salida espectral plana y requerirán una reducción significativa de la señal en los picos de salida para corregir los datos de imagen espectral a una respuesta rastreable por NIST38. Las fuentes de luz alternativas, como las lámparas de arco Xe y los láseres de supercontinuum de luz blanca, pueden proporcionar una salida espectral más uniforme que sea más adecuada para la excitación-escaneo de imágenes hiperespectrales38,39,40. La elección de la fuente de luz, los filtros ajustables y los filtros dicroicos determinan el rango espectral disponible. Este rango debe elegirse teniendo en cuenta cuidadosamente la información espectral deseada de la muestra experimental.

Además, se debe tener en cuenta el mecanismo de conmutación utilizado para los filtros ajustables, así como varios factores de cámara como la eficiencia cuántica, el tamaño de píxel y las velocidades de fotogramas disponibles, ya que estos factores afectarán a las velocidades de muestreo potenciales41 ,42,43. Sin embargo, todos los demás factores que son constantes, la utilización del enfoque de análisis de excitación debe proporcionar una mayor sensibilidad y la capacidad de obtener imágenes más rápidas, en comparación con la mayoría de los enfoques de imágenes espectrales de escaneo de emisiones21.

Como se señaló en la introducción, las imágenes hiperespectrales aquí se refieren a la naturaleza contigua y espectralmente superpuesta de los datos adquiridos. Como tal, las capacidades del sistema necesitan ser capaces de recopilar datos utilizando el espaciado de las longitudes de onda del centro de excitación menos de la mitad de la distancia de la FWHM de los filtros. Como se informó anteriormente, una matriz cuidadosamente elegida de filtros ajustables de película delgada permite la adquisición de datos con longitudes de onda centrales separadas 5 nm, una distancia suficiente para sobremuestrear el espectro de excitación dado filtros con FWHM de entre 14-20 nm. Este espaciado proporciona una ligera redundancia en la recopilación de datos espectrales con probablemente aumenta la precisión del proceso de desmezcla. La consideración de ambos rangos espectrales y el número mínimo necesario de canales de longitud de onda para una desmezcla precisa se han discutido previamente44,45,46. Para ello, dado el ancho de banda de estos filtros, se debe seleccionar el rango de excitación para terminar en una longitud de onda que sea algo más baja (5-10 nm más baja) que la longitud de onda de corte del divisor de hace dicroico. Esto garantizará que todo el ancho de banda de la iluminación de excitación esté por debajo de la longitud de onda de corte del divisor de haz dicroico (por ejemplo, 360-485 nm para el filtro dicoico 495) para evitar la conversación cruzada de excitación-emisión.

Se requiere software para controlar de forma independiente cada componente del hardware para lograr escaneos de imágenes espectrales de alta velocidad. El software debe ser capaz de operar el obturador, seleccionar longitudes de onda de excitación, y adquirir imágenes a velocidades suficientemente altas para cumplir con las condiciones experimentales (los requisitos exactos de frecuencia de muestreo variarán experimento, pero un objetivo de ejemplo podría ser adquirir cuatro pilas de imágenes espectrales completas por minuto). Los experimentos más complejos pueden hacer uso de múltiples espejos dicroicos, objetivos o ubicaciones XYZ. Hay una serie de paquetes de software disponibles para la adquisición de datos47,48. Micro-Manager es un software gratuito de código abierto para la automatización de microscopios que ofrece una variedad de opciones de personalización. Además, Micro-Manager incluye un panel de scripting para una personalización adicional no disponible en la interfaz de usuario principal. Por ejemplo, es posible utilizar un script personalizado para reducir el retardo de 250 ms del conmutador de filtro ajustable a 10 ms en todas las longitudes de onda de excitación, excepto las transiciones de longitud de onda en las que la rueda del filtro gira a un nuevo filtro ajustable, reduciendo la imagen efectiva tiempo por 240 ms por longitud de onda para la mayoría de las longitudes de onda. Esta personalización ha permitido la adquisición de hasta 30 longitudes de onda en menos de 4 s. Por último, Micro-Manager se puede utilizar junto con otros entornos, como MATLAB, para personalizar aún más el control de dispositivos de microscopio.

Determinar el rango de excitación espectral adecuado, el tiempo de adquisición y la longitud de onda inicial para la visualización de la muestra y la posterior adquisición de datos es muy importante. Sin embargo, el funcionamiento incorrecto de los componentes individuales del sistema puede requerir una solución de problemas adicional. Cada componente de la trayectoria óptica contribuye a los datos de imagen adquiridos. Por lo tanto, es importante verificar la respuesta espectral y la transmisión óptica de los componentes ópticos dentro de la trayectoria de la luz, especialmente si se intenta optimizar la respuesta general del sistema. Las fuentes de luz a menudo tienen ajustes de intensidad variable y pueden tener una reducción en la potencia a lo largo de la vida útil de la bombilla40. Si una muestra parece tenue, la causa puede ser la salida reducida de la fuente de luz. La función autoshutter en Micro-Manager, en nuestra experiencia, no funciona el 100% del tiempo. La falta de señal puede indicar un obturador cerrado. La longitud de onda de excitación inicial guardada en el archivo de configuración de Micro-Manager puede establecer de forma predeterminada una longitud de onda con poca o ninguna salida espectral, como el ejemplo de 340 nm que se muestra en la Figura1.

Además, no es raro elegir por error una longitud de onda de excitación que está por encima de la longitud de onda de corte del divisor de haz dicroico de paso largo, lo que resulta en una luz adicional de conversación cruzada y / o excitación que se deriva directamente a la cámara que puede potencialmente dañar el sensor de la cámara. Del mismo modo, el ajuste de la trayectoria de la luz para la imagen de transmisión puede dar lugar a la pérdida de señal a la cámara, dependiendo de la configuración del microscopio. Además, como se indica en la Figura2, la elección de la longitud de onda de excitación inicial y el tiempo de exposición para la visualización de la muestra pueden parecer apropiadas, pero en realidad dan lugar a píxeles sobresaturados en otras longitudes de onda de excitación. Este hecho no será evidente a menos que se compruebe la saturación de píxeles para cada imagen, por lo que a menudo es prudente realizar una pila de imágenes de prueba en un área de la muestra que parece contener la fluorescencia más intensa.

También vale la pena señalar que las intensidades variables pueden estar presentes en las imágenes elegidas para las regiones de fondo. Se debe tener cuidado de que estas regiones no contengan realmente datos de imagen relevantes, ya que los pasos posteriores de corrección de datos restarán esta señal de los datos de imagen adquiridos en otras regiones de la muestra. A veces es necesario utilizar los ajustes de transmisión y/o aumentar drásticamente el tiempo de exposición para comprobar que la región seleccionada para medir el fondo de la muestra no contiene ninguna muestra. Del mismo modo, las imágenes no mezcladas pueden presentarse con manchas oscuras o agujeros en la imagen de autofluorescencia. Esto puede deberse a una biblioteca incorrecta causada por la "contaminación" de autofluorescencia de las señales espectrales "puras" de células de una sola etiqueta. Esto se debe a que cualquier señal espectral "pura" recogida de una muestra que contenga autofluorescencia invariablemente contendrá algunos de los espectros de autofluorescencia en sí, incluso si en cantidades traza. Se debe tener cuidado de restar las señales de autofluorescencia de los controles de etiqueta única para garantizar una biblioteca espectral adecuada, como se describe en varias ocasiones por Mansfield et al.28,29,30, 31,32

Aunque no se ha demostrado en este artículo, el sistema de imágenes espectrales de análisis de excitación también se puede utilizar para imágenes de lapso de tiempo e imágenes en varias ubicaciones XY (o un gran campo de visión debido a la costura de imágenes) en varios planos focales. Si se desean estas opciones para un solo experimento, se debe pensar cuidadosamente en la importancia del orden de adquisición y los posibles efectos del fotoblanqueo. También vale la pena señalar que si el tiempo real tomado supera el tiempo estimado (por ejemplo, una pila de imágenes tarda 11 s en adquirir en lugar de los 10 s estimados), Micro-Manager seguirá adquiriendo el número seleccionado de puntos de tiempo y / o posiciones. Este error de cálculo puede agravarse con varios puntos de tiempo y alterar el muestreo temporal calculado, lo que podría sesgar cualquier conclusión hecha a partir de los datos.

Este ejemplo demuestra la capacidad de separar tres fuentes de fluorescencia dentro de un rango de escaneo de excitación de 145 nm. Experimentos anteriores con este sistema han sido capaces de separar hasta cinco fuentes de fluorescencia dentro del mismo rango. El tiempo necesario para esta adquisición de imágenes es inferior a 1 min, lo que es significativamente más rápido que la mayoría de los sistemas de imágenes espectrales de escaneo de emisiones. Las mejoras en la trayectoria de la luz, como el ajuste de la longitud de onda de excitación de mayor velocidad, pueden avanzar aún más esta tecnología de imagen a velocidades que son suficientes para la imagen espectral de velocidad de vídeo.

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Disclosures

Los doctores Leavesley y Rich revelan interés financiero en una empresa emergente, SpectraCyte LLC, fundada para comercializar la tecnología de imágenes espectrales.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el apoyo de NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, y el Fondo de Investigación de Cáncer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

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Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia
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Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

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