Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Возбуждение-сканирование гиперспектральной микроскопии изображений для эффективной дискриминации сигналов флуоресценции

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

Спектральная визуализация стала надежным решением для идентификации и разделения множественных сигналов флуоресценции в одном образце и может легко отличить сигналы интереса от фона или автофлюоресценции. Экзитс-сканирующая гиперспектральная визуализация улучшает эту технику, уменьшая необходимое время приобретения изображения, одновременно увеличивая соотношение сигнала к шуму.

Abstract

Некоторые методы полагаются на обнаружение сигналов флуоресценции для выявления или изучения явлений или для выяснения функций. Разделение этих сигналов флуоресценции было доказано громоздким до появления гиперспектральной визуализации, в которой источники флуоресценции могут быть отделены друг от друга, а также от фоновых сигналов и автофлуоресценции (с учетом знаний об их спектральной подписей). Тем не менее, традиционные, выбросов сканирования гиперспектральной визуализации страдает от медленного времени приобретения и низкие соотношения сигнала к шуму из-за необходимой фильтрации как возбуждение и выброс света. Ранее было показано, что гиперспектральная визуализация, сканирующая возбуждение, сокращает необходимое время приобретения, одновременно увеличивая соотношение сигнала к шуму приобретенных данных. Используя коммерчески доступное оборудование, этот протокол описывает, как собирать, калибровать и использовать систему микроскопии гиперспектральной визуализации, сканирующую возбуждение, для отделения сигналов от нескольких источников флуоресценции в одном образце. Хотя этот метод очень применим к микроскопической визуализации клеток и тканей, он также может быть полезен для любого типа эксперимента с использованием флуоресценции, в которой можно изменять длины волн возбуждения, включая, но не ограничиваясь: химическую визуализацию, экологических приложений, ухода за глазами, пищевой науки, судебной науки, медицинской науки и минералогии.

Introduction

Спектральная визуализация может быть выполнена различными способамии упоминается несколькими терминами 1,2,3,4. В целом спектральная визуализация относится к данным, полученным по крайней мере в двух пространственных измерениях и одном спектральном измерении. Многоспектральные и гиперспектральные изображения чаще всего различаются по количеству полос длин волн или же спектральные полосы смежные1. Для этого приложения гиперспектральные данные определяются как спектральные данные, полученные с смежными полосами длины волны, достигнутые путем интервала длины центральной волны не менее половины полной ширины на половину максимум (FWHM) каждого фильтра bandpass, используемого для возбуждения (т.е. 5 нм интервал длины центральной волны для фильтров полоспаса с пропускной способностью 14-20 нм). Смежный характер диапазонов данных позволяет перебирать набор данных, гарантируя, что критерии Nyquist удовлетворяются при выборке спектрального домена.

Гиперспектральная визуализация была разработана НАСА в 1970-х и 1980-х годах в сочетании с первым спутником Landsat5,6. Сбор данных из нескольких смежных спектральных полос позволил понять спектр сияния каждого пикселя. Выявление и определение спектра сияния отдельных компонентов позволило не только обнаружить поверхностные материалы по их характерным спектрам, но и позволило удалить промежуточные сигналы, такие как вариации сигнала из-за атмосферных условий. Концепция обнаружения материалов с использованием их характерных спектров была применена к биологическим системам в 1996 году, когда Шрёк и др. использовали комбинации пяти различных фторофоров и их известных спектров, чтобы различать помеченные хромосомы в процессе, называемом спектральный кариотипирование7. Этот метод был разработан в 2000 году Tsurui et al. для флуоресценции изображений образцов тканей, используя семь флуоресцентных красителей и разложение единственного значения для достижения спектрального разделения каждого пикселя на линейные комбинации спектров в справке библиотека8. Подобно их коллегам дистанционного зондирования, вклад каждого известного фторфора может быть рассчитан на основе гиперспектрального изображения, учитывая априори информацию спектра каждого фторофра.

Гиперспектральная визуализация также была использована в областях сельского хозяйства9, астрономия10, биомедицина11, химическая визуализация12, экологические приложения13, уход за глазами14, пищевая наука15, судебно-медицинской экспертизы16,17, медицинской науки18, минералогии19, и наблюдения20. Ключевым ограничением текущего флуоресцентного микроскопа гиперспектральных систем визуализации является то, что стандартная технология гиперспектральной визуализации изолирует сигналы флуоресценции в узких диапазонах на 1) сначала фильтрации возбуждания света для контроля образца возбуждения, то 2) дальнейшая фильтрация излучаемого света, чтобы отделить излучение флуоресценции в узкие полосы, которые позже могут быть отделены математически21. Фильтрация как возбуждения освещения и испускаемых флуоресценции уменьшает количество доступного сигнала, что снижает соотношение сигнала к шуму и требует длительного времени приобретения. Низкий сигнал и длительное время приобретения ограничивают применимость гиперспектральной визуализации в качестве диагностического инструмента.

Была разработана методика визуализации, которая использует гиперспектральную визуализацию, но повышает доступный сигнал, тем самым уменьшая необходимое время приобретения21,22. Эта новая модальность, называемая гиперспектральной визуализацией, сканирующей возбуждающие возбуждение, приобретает спектральные данные изображений, изменяя длину волны возбуждения и собирая широкий спектр излучаемого света. Ранее было показано, что этот метод дает порядки величины увеличивается в сигнал к шуму соотношение по сравнению с методами сканирования выбросов21,22. Увеличение соотношения сигнала к шуму в значительной степени обусловлено широкой полосой (600 нм) обнаруженного светового света, в то время как специфичность обеспечивается путем фильтрации только света возбуждения вместо флуоресценционного излучения. Это позволяет всем излучаемым светом (для каждой длины волны возбуждения) достичь детектора21. Кроме того, этот метод может быть использован для дискриминирования автофлюоресценции от экзогенных меток. Кроме того, способность сократить время приобретения за счет увеличения обнаруживаемого сигнала снижает опасность фотоотбеления, а также позволяет спектрального сканирования со скоростью приобретения, что является приемлемым для спектральной видеосъемки.

Цель этого протокола заключается в том, чтобы служить в качестве руководства по сбору данных для экзит-сканирующей микроскопии гиперспектральной визуализации. Кроме того, включены описания, которые помогают понять световой путь и аппаратное обеспечение. Также описана реализация программного обеспечения с открытым исходным кодом для микроскопа гиперспектральной визуализации, сканирующего возбуждение. Наконец, приводятся описания того, как откалибровать систему в стандарт NIST- traceable, настроить настройки программного и аппаратного обеспечения для точных результатов и не смешивать обнаруженный сигнал в вклады отдельных компонентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Настройка устройства

  1. Источник света: выберите широкодиапазонный спектральный источник света с высокой мощностью и высокой коллимацией (для этих исследований использовалась дуговая лампа 300 Вт Xe).
  2. Затвор (необязательно): добавьте затвор к оптическому пути, чтобы уменьшить фотоотбеление для замедленного изображения.
  3. Tunable фильтровальная система: включите механическую сборку тюнинга и тонкопленочный настраиваемый фильтр (TFTF), позволяющий обеспечить желаемый диапазон возбуждения, регулируемый длиной волны (например, 360-485 нм).
  4. Микроскоп: используйте перевернутый флуоресценционный микроскоп, включающий моторизованную дихротический фильтр башни и контроллера.
    1. Куб флуоресцентного фильтра: соберите длиннопроходной кубик флуоресценции фильтра. Для достижения наилучших результатов выберите дихроическое зеркало и фильтр для длительного прохода на одной волне для достижения оптимального отделения возбуждения от излучения (например, 495 нм).
    2. Цель: использовать соответствующую апохроматической цели для обеспечения равномерного внимания на диапазоне длин волн, используемых для эксперимента (60x цель воды была использована для этого исследования).
    3. Автоматизированная стадия (необязательно): использовать автоматизированный этап для быстрой выборки нескольких полей зрения и/или очень больших полей через прошивание изображений. Калибровать сцену с целью и камерой.
  5. Камера: выберите соответствующую камеру для достижения пространственного разрешения, чувствительности и шумовых требований эксперимента (эта система использовала камеру sCMOS с высокой чувствительностью).

2. Программное обеспечение для приобретения

  1. Выберите программный пакет, позволяющий осуществлять независимый контроль над каждым аппаратным компонентом, например Micro-Manager.
    1. Создание файла конфигурации: файл конфигурации представляет собой сохраненный набор инструментов и инструкций, которые Micro-Manager будет загружать для работы оборудования системы. Чтобы создать файл конфигурации, нажмите Инструменты
      1. В шаге 1, нажмите Создать новую конфигурацию Обратите внимание, что пользователь может изменить или изучить существующую конфигурацию, если она уже доступна.
      2. В шаге 2 просмотрите список доступных устройств, чтобы найти устройства для управления с помощью Micro-Manager, таких как микроскоп, лампа, сцена, затвор и камера. При выделении щелкните Добавить... кнопка для добавления устройства в список установленных устройств. Это откроет новое окно.
        1. Обозначьте этикетку устройства в поле Label. (например, камера SCMOS)
        2. Под значением выберите подходящий порт COM для каждого устройства. Это приведет к тому, что в нижней части окна появится список свойств устройств.
        3. Оставьте свойства устройства в настройках по умолчанию. Обратите внимание, что пользовательские значения для каждого свойства устройства могут быть введены по желанию.
        4. При добавлении каждого устройства нажмите кнопку Next, чтобы продолжить следующий шаг. Обратите внимание, что если какие-либо устройства не будут исключены или нуждаются в изменении, файл конфигурации может быть изменен позже, как описано в шаге 2.1.1.1.
      3. В шаге 3 используйте выпадающие меню, чтобы выбрать камеру по умолчанию, затвор и этап фокусировки. Если автозатвор нонпов, щелкните чек-бокс ниже списка выпадающих на стадию фокуса. Если известно направление фокусировки этапа, выберите его из списка выпадающих направлений в соответствии с направлениями фокусировки этапов (продвинутые). В противном случае оставьте значение по умолчанию как неизвестное.
      4. В шаге 4, дважды щелкните коробки под задержкой »мс» заголовок установить задержки, связанные с автоматизированными устройствами, такими как задержки 100 мс для лампы, стадии и затвора, и 250 мс задержки для команд на механическую сборку настройки для учета механическое время переключения между фильтрами.
      5. В шаге 5 назначаем метки для государственных устройств. Конфигурация для системы микроскопа с сканированием возбуждения использует метки в блоке фильтра для идентификации каждого куба флуоресценции фильтра (например, состояние 0 соответствует метке Bright, пустой куб фильтра, используемый при визуализации яркого поля; в то время как состояние 3 соответствует этикетке 495 нм и обычай 495 нм дихроический фильтр куб, используемый для разделения возбуждения и выбросов света на 495 нм). Этикетки также используются в механической сборке настройки для хранения команд переключения для каждой длины волн возбуждения (например, состояние 0 соответствует команде настройки длины возбуждения 340 нм для механической сборки тюнинга).
      6. На шестом шаге нажмите кнопку «Просмотр» рядом с файлом Configuration, чтобы выбрать место сохранения и имя файла для файла конфигурации. Нажмите на финиш, чтобы сохранить файл конфигурации.
    2. Группы стартапов и пресеты: Micro-Manager может хранить различные группы в каждом файле конфигурации для активации или изменения подмножества оборудования. Например, группа "системный запуск" и предустановленная комбинация будут хранить настройки по умолчанию, такие как размер связывания и скорость считывания для камеры.
      1. Создайте группу (например, System),нажав на основное окно в подразделе Группы.
      2. Проверить любое использование в группе? коробки внутри группы, которые потребуют установки значения по умолчанию (например, связывание в связанной камере по умолчанию).
      3. Создайте новую пресет-установку (например, "Startup"), нажав на основное окно в подразделе Preset.
      4. Каждая коробка, проверенная в шаге 2, будет отображаться как предустановленная опция здесь. Выберите значение по умолчанию для загрузки для каждого проверенного окна.
    3. Группа и пресеты для волн возбуждения: Micro-Manager рассматривает каждую длину волн возбуждения как свой собственный канал с его собственной командой переключения длины волны; поэтому каждый из них должен быть сохранен как свой собственный предустановленный.
      1. Создайте новую группу, содержащую набор желаемых длин волн возбуждения (например, дихроик 495 нм)
      2. Проверьте использование в группе? коробка под названием Label, соответствующая устройству VF-5.
      3. Создайте новый предустановленный набор, названный для каждой длины волн возбуждения (например, "340 нм").
      4. Присвоить каждому предустановленное имя свойства и предустановленное значение (например, имя свойства: "Label"; предустановленное значение: "340 нм").
    4. Многомерный инструмент приобретения: нажмитеMulti-D Acq.в верхнем левом верхнем левом окне Micro-Manager, чтобы открыть настраиваемый инструмент для захвата изображения образца на каждой длине волн возбуждения одним нажатием кнопки. Есть несколько вариантов настройки, чтобы построить приобретение точно по желанию.
      1. Тайм-пойнты (не используемые в данном примере): для исследований, не имеющих компонента замедленного времени, оставьте коробку без контроля. Если пожелается замедленное исследование, проверьте эту коробку. Если проверено, введите количество раз, чтобы выполнить остальные настройки приобретения в поле Номера. Установите время между последовательными приобретениями, введя продолжительность в поле Interval и выберите подходящий блок (миллисекунды, секунды или минуты; обычно секунды).
      2. Несколько позиций (XY; не используется в этом примере): для исследования одного положения XY, оставьте коробку без проверки. Если несколько позиций XY являются желательными, проверьте поле и нажмите кнопку списка позиции Edit, чтобы открыть отдельное окно. Переместите сцену в нужное место и нажмите кнопку «Знак», чтобы сохранить эту позицию в программном обеспечении. Повторяйте до тех пор, пока не будут отмечены все желаемые позиции XY. Закройте это окно, чтобы продолжить.
      3. Стеки (слайды; не используются в данном примере): для изучения одного положения, оставьте коробку без контроля. Если несколько позиций являются желательными, проверьте поле. Переместите сцену в нужное начало и нажмите кнопку Set рядом с окном «старт». Переместите сцену в желаемое положение окончание и нажмите кнопку Set рядом с коробкой с конечным результатом. Введите желаемый размер шага (в микронах) в поле для шага.
      4. Каналы: убедитесь, что коробка каналов проверена. Здесь каналы — это имена, присвоенные отдельным длинам волн возбуждения. Имеющиеся "Каналы" соответствуют "Группам", описанным в шагах 2.1.2 и 2.1.3.
        1. Группа: нажмите на выпадающий список, чтобы выбрать группу, из которой можно выбрать доступные длины волн возбуждения (например, дихроик 495 нм).
        2. Нажмите на поле Keep Shutter Open, чтобы держать затвор открытым между приобретениями для каждого канала. Обратите внимание, что затвор будет по-прежнему закрыт между последовательными спектральными сканированиями, если это поле проверено, предполагая, что опция автозатвора также выбрана в главном окне.
      5. Нажмите кнопку «Новая», чтобы добавить каналы в список приобретений. Обратите внимание, что кнопка Удалить можно использовать для удаления любых каналов, которые больше не нужны, и что Up and Down может быть использован для повторного заказа любого выбранного канала.
        1. Убедитесь, что флажок Use? выбран для каждой нужной длины волны в спектральном сканировании.
        2. Конфигурация: щелкните список выпадающих вниз под конфигурацией и выберите первую длину волны в нужном спектральном диапазоне (например, 340 нм).
        3. Экспозиция: дважды щелкните поле под экспозицией и введивите желаемое время экспозиции для выбранной длины волны (например, "100" на 100 мс). См. раздел 5 ("Приобретение данных") для предложений по выбору подходящего времени экспозиции.
        4. Смещение (не применимо при спектральном сканировании): оставьте эту коробку пустой (при 0) при выполнении спектрального сканирования.
        5. - стек: убедитесь, что эта коробка проверяется на каждую длину волны в спектральном диапазоне при выполнении стека.
        6. Пропустить fr. (не применимо в спектральном сканировании): оставьте эту коробку пустой (на 0) при выполнении спектрального сканирования. Обратите внимание, что это может быть полезно выборочно пропустить кадры в случае, если один или несколько волн возбуждения длины значительно более мощным, чем другие, или если отдельные длины волн возбуждения оказаться особенно фототоксичные.
        7. Цвет: оставьте эту коробку пустой при выполнении спектрального сканирования. Обратите внимание, что цвета могут быть выбраны для отдельных полос длинволн для визуализации данных, но цвет не подходит для последующего спектрального несмешивания.
        8. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет добавлена каждая желаемая длина волн возбуждения в пределах заданного спектрального диапазона сканирования.
      6. Заказ на приобретение: нажмите на выпадающий список, чтобы выбрать, в каком порядке будут выполнены вышеуказанные варианты (2.1.1.1-2.1.4.5). Для спектральных сканирований, таких как показано здесь, порядок приобретения просто канал. Обратите внимание, что дополнительные опции появляются по мере того, как дополнительные коробки проверяются в инструменте Multi-Dimensional Acquisition (Timepoints, Multiple Positions (XY) и «стеки» (срезы)» и позволяют выбирать позицию или время, за которым следуют либо срезы, либо Канал.
      7. Автофокус (не используется в этом примере): Если выбрано несколько позиций (XY), доступно несколько различных стилей автофокусировки. Нажмите кнопку Параметры и выберите метод автофокусировки из списка выпадающих рядом с кнопкой "закрыть".
      8. Резюме: просмотрите это окно для сводки количества тайм-пойнтов, позиций XY, срезов, каналов, общего количества изображений, общей памяти, продолжительности сканирования и порядка приобретения, чтобы обеспечить ожидаемые параметры получения информации.
      9. Сохранить изображения: убедитесь, что это поле проверяется для сохранения данных, собранных с помощью многомерного инструмента приобретения.
        1. Нажмите на ... кнопка рядом с корнем каталога, чтобы выбрать корень каталога, в котором будут сохранены файлы. Назовите корень каталога таким образом, который описывает соответствующие детали эксперимента (например, GCaMP Airway Smooth Muscle Cells).
        2. Введите имя в поле рядом с приставкой Name, описывающим текущее приобретение изображения (например, FOV1-100ms-60X-495nmDichroicFilter). Целесообразно создать приставку имени, которая определяет поле зрения и время экспозиции, а также другую соответствующую информацию, такую как объект и используемый дихротический фильтр. Обратите внимание, что первый стек изображений, сделанный с помощью этих настроек, будет сохранен с помощью "No1" после приставки имени. Любой последующий стек, взятый с тем же корнем каталога и приставкой имени, будет сохранен с помощью "N", в котором "n" - это количество раз, когда стек был взят с этим именем в каталоге.
        3. Нажмите Отдельные файлы изображений, чтобы гарантировать сохранение изображения, генерируемого на каждой длине волн возбуждения.
      10. Сохранить как: нажмите кнопку Сохранить как... Обратите внимание, что корень каталога и префиксы имен также будут сохранены.
      11. Приобретите: наконец, нажмите На Acquire! кнопка, чтобы начать приобретать изображения в соответствии с настройками приобретения, выбранными выше.

3. Коррекция спектрального ответа (необязательно):

  1. Спектральная коррекция вывода может быть выполнена для калибровки спектральной реакции системы на известный стандарт, такой как лампа NIST-traceable или другой стандарт или инструмент NIST-traceable. Этот шаг особенно важен, если результаты сравниваются с другими спектральными приборами, спектрометрами или между различными лабораториями. Этот процесс был подробно сообщен ранее21,23.
    1. Используйте спектрометр, откалиброванный к источнику NIST-traceable light source (например, LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) или другому стандарту NIST-traceable для приобретения спектрорадиометрической мощности освещения, измеряемого на этапе выборки. Выполните отдельную коррекцию для каждой комбинации параметров источника света, дихроического зеркала и объективности. Используйте интегрирующую сферу в сочетании с спектрометром для точного измерения широкоугольного освещения от цели микроскопа.
    2. Используйте метод интеграции, такой как трапециевидное правило, для интеграции спектрорадиометрических данных по освещенным длинам волн. Пропускная способность 40 нм для интеграции, сосредоточенной вокруг центральной длины волны, достаточна для большинства фильтров, которые имеют номинальную пропускную способность между 14-20 нм полной шириной на половину максимума (FWHM). Интегрированное значение представляет интенсивность спектрального освещения на каждой полосе длины волн возбуждения.
    3. Участок интегрированной интенсивности каждой полосы длины волны в качестве функции возбуждания центр длины волны, чтобы визуализация спектрального профиля интенсивности освещения.
    4. Определите полосу длины волны с наименьшей интегрированной интенсивностью.
    5. Нормализовать профиль интенсивности спектрального освещения, разделив наименьшую интегрированную интенсивность интегрированной интенсивностью каждой полосы длины волны для генерации фактора коррекции, зависящей от длины волны.

4. Подготовка образцов

  1. Подготовьте «пустой» образец (например, поместите стеклянный покрывало в камеру ячейки и добавьте 1 мл буфера). Этот буфер был описан ранее24.
  2. Подготовьте немаркированный образец для определения любого образца автофлюоресценции (например, поместите стеклянный покрывало, содержащее немаркированные клетки мышц25,26 в камере клеток и добавьте 1 мл буфера).
  3. Подготовьте отдельный образец с одной маркировкой для каждой флуоресцентной метки, используемой в эксперименте, следующим образом:
    1. Добавьте разбавленную митохондриальную этикетку в буфер для достижения концентрации 100 НМ. Добавьте этот буфер к крышке, содержащей гладкие мышечные клетки дыхательных путей. Инкубировать в течение 20 мин при 20-25 градусах Цельсия. Переместите coverslip в камеру ячейки и добавьте 1 мл буфера. Обратите внимание, что оптимальная концентрация митохондриальной этикетки будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как производитель, связанный цвет и желаемая специфичность.
    2. Переместите крышку, содержащую гладкие мышечные клетки дыхательных путей, трансфицируемые зондом GCaMP27, в камеру клетки и добавьте 1 мл буфера.
  4. Подготовьте один или несколько экспериментальных образцов, содержащих смесь желаемых флуоресцентных этикеток.
    1. Добавьте 1 мл буфера (100 нм концентрации митохондриальной этикетки) к крышке, содержащей гладкие мышечные клетки дыхательных путей, трансфицированные зондом GCaMP, и инкубировать в течение 20 мин при 20-25 градусах Цельсия. Переместите coverslip в камеру ячейки и добавьте 1 мл буфера.

5. Получение данных:

  1. Убедитесь, что выбран ынатворный луч (например, куб дихроического фильтра 495 нм), объективный (например, 60-кратная цель воды) и камера (камера sCMOS).
  2. Загрузите образец на сцену.
  3. Дважды щелкните поле рядом с экспозицией и введите "100", чтобы установить время экспозиции на уровне 100 мс. Обратите внимание, что время экспозиции, возможно, потребуется увеличить или уменьшить в зависимости от интенсивности флуоресценции образца.
  4. Выберите 475 нм из выпадающего меню главного окна Micro-Manager для первоначального просмотра образца. Обратите внимание, что 475 нм может быть не оптимальной длиной волны для просмотра образца или определения того, будет ли перенасыщение происходит ьизм на протяжении всего стека изображений.
  5. Нажмите Live, чтобы просмотреть образец.
    1. Нажмите кнопку автоматического обзора интенсивности Авто рядом с гистограммой в нижней части окна, чтобы принести минимальные и максимальные значения в значимые визуальные диапазоны.
  6. Используйте фокусные ручки микроскопа, чтобы сосредоточиться на образце. Это часто полезно, чтобы найти край образца, чтобы помочь в фокусировке. Образец будет сфокусирован, когда элементы края изображения будут казаться острыми. Обратите внимание, что это может быть необходимо нажать кнопку Auto несколько раз во время фокусировки, чтобы помочь в просмотре флуоресценции изображения. Кроме того, некоторым пользователям может быть легче сосредоточиться на образце, если микроскоп находится в режиме передачи.
    1. Если фокусировка в режиме передачи, для безопасности, сначала убедитесь, что спектральный источник света не передает свет на окуи, прежде чем регулировать световой путь для передачи изображений. Также обратите внимание, что могут быть небольшие отклонения между фокусом передачи и флуоресценции изображений. Когда достигнута приемлемая направленность, перенастроить световой путь для спектральной флуоресценции.
  7. Нажмите на Multi-D Acq. кнопка в верхнем левом верхнем цвете окна для открытия инструмента многомерного приобретения (описанного и настроенного в разделе 2).
  8. Выберите подходящий спектральный диапазон для спектрального приобретения (например, 360-485 нм для дихроического фильтра 495 нм), нажав кнопку Load... в правом верхнем углу окна инструмента Multi-Dimensional Acquisition и ориентируясь на настройки возбуждения сохранены ранее (в шаге 2.1.4.10). Смотрите обсуждение информации о соответствующих спектральных диапазонах.
  9. Приобретите фоновое/пустое изображение, которое не содержит данных флуоресценции для использования для фонового и шумового вычитания. Это может быть выполнено с помощью пустого образца (шаг 4.1) или путем навигации по пустой области экспериментального образца. Как описано в шаге 5.6, это наиболее легко достигается путем нахождения края образца, а затем позиционирования его так, что край по центру в поле зрения.
    1. После подтверждения параметров приобретения и видимой фоновой области нажмите кнопку Acquire!, чтобы приобрести спектральный стек изображения, содержащий фон и шум для последующего использования для вычитания. Следует отметить, что образцы, вероятно, имеют более интенсивную флуоресценцию вдали от края образца. Возможно, целесообразно переместить образец, чтобы найти "самые яркие" регионы и выполнить несколько тестовых стеков изображений, чтобы определить подходящее время приобретения и избежать передержки.
  10. Возьмите один стек изображения на области образца, который, как представляется, имеют интенсивную флуоресценцию, чтобы гарантировать, что никакое сочетание длин волн и что время экспозиции приводит к чрезмерной экспозиции.
  11. Используйте ImageJ, чтобы подтвердить, что длины волн не содержат переэкспонированных пикселей.
    1. В ImageJ, нажмите файл (ru) импортное изображение и перейдите к папке, содержащей спектральные изображения, сделанные в шаге 5.10. Это откроет новое окно. Нажмите на поле рядом с числом изображений и введите количество длин волн, включенных в спектральный скан (например, 26). Оставьте Исходное изображение и приращение как "1". Нажмите кнопку OK, чтобы продолжить.
    2. Нажмите M на клавиатуре, чтобы использовать функцию измерения ImageJ. Убедитесь, что номер, указанный под Максом, не является верхним пределом обнаружения камеры (например, 65 535). Повторите для каждого изображения в спектральном сканировании. Обратите внимание, что предел обнаружения камеры зависит от самой камеры. Верхний предел отображается в верхней правой части гистограммы в главном окне MicroManager. Кроме того, верхний предел может быть определена путем открытия изображения в ImageJ и навигации по изображению Нажмите кнопку Set в полученном всплывающем окне, введите чрезмерно большое значение (например, 999,999) в пустой рядом с максимальным отображаемым значением,и нажмите OK, чтобы продолжить. Максимальное значение, отображаемые в новой гистограмме, должно быть верхним пределом обнаружения камеры.
    3. Если какие-либо изображения содержали верхний предел обнаружения камеры (например, 65 535), отрегулируйте время экспозиции спектрального сканирования, чтобы обеспечить, чтобы максимальный сигнал во всем спектральном диапазоне не превышал динамический диапазон камеры.
  12. Приобретение спектральных данных изображений из немаркированных образцов для определения любой аутофлуоресценции. Приобретите сканирование немаркированных образцов, используя одинаковый диапазон длин волн и настройки камеры в качестве оставшейся части эксперимента (например, 360-485 нм при 100 мс на длину волны).
  13. Приобретение спектральных изображений из одномаркированных образцов для использования в качестве спектрального элемента управления для создания спектральной библиотеки. Выполните сканирование для каждой метки, используя одинаковый диапазон длин волн, время экспозиции и настройки камеры. Обратите внимание, что для некоторых образцов может потребоваться более длительное время приобретения, чтобы обеспечить точное обнаружение спектра меток с минимальным вкладом шума.
  14. Выполняйте измерения на экспериментальном образце (например, гладкие мышечные клетки дыхательных путей человека с зондом GCaMP и митохондриальной этикеткой).
    1. Поместите слайд или крышку, содержащую экспериментальный образец, на микроскоп.
    2. Выберите поле зрения с соответствующим образом помечены клетки тканей.
    3. Приобретите данные спектрального изображения, используя желаемые настройки приобретения, как описано выше.

6. Анализ изображений

  1. Правильные изображения с плоской спектральной реакцией.
    1. Вычесть фоновый спектр, полученный в разделе 5.9, и умножить на коэффициент коррекции, определенный в разделе 3.1.5. Это можно сделать с помощью простого скрипта MATLAB или процедуры ImageJ. Код subtraction/коррекции MATLAB (используется в этом примере) доступен на веб-сайте Университета южной Алабамы Bioimaging Resources.
      1. Загрузите код вычитания/коррекции в MATLAB.
      2. Во вкладке EDITOR нажмите Run. Это откроет новое окно, содержащее кнопку коррекции Bsq. Нажмите кнопку Коррекция Bsq, чтобы открыть другое окно, содержащее выбор для рабочего каталога, фонового файла, файла фактора коррекции и неисправленной папки tiff.
        1. Используйте просмотр... кнопка рядом с рабочим каталогом, чтобы выбрать путь файла, где будут открыты последующие окна. Перейдите к папке, содержащей сохраненный фоновый спектр (в формате .dat).
        2. Используйте просмотр... кнопка рядом с фоновым файлом (.dat), чтобы открыть каталог, выбранный в шаге 6.1.1.2.1 и выбрать нужный фоновый файл (в формате .dat). Нажмите кнопку "Открытая", чтобы продолжить.
        3. Используйте кнопку «Обзор» рядом с фактором коррекции (.dat), чтобы выбрать коэффициент коррекции. Каталог для фактора коррекции по умолчанию влияет на расположение родительского кода MATLAB. При необходимости перейдите к субфолдеру, содержащему файл фактора коррекции (в формате .dat). Выделите правильный файл фактора коррекции и нажмите кнопку Open для продолжения.
        4. Используйте кнопку Browse... рядом с Неисправленым Tiff Folder, чтобы открыть каталог, выбранный в шаге 6.1.1.2.1 и выбрать папку для фонового вычитания и коррекции изображения (обычно это папка Pos0, которая сразу же содержит сырье спектральных изображений). Нажмите кнопку "Открытая", чтобы продолжить.
        5. Нажмите кнопку «Нажмите на спектральную коррекцию». После завершения обработки откроется окно с сообщением "Bsq Коррекция завершена". Нажмите кнопку OK, чтобы продолжить. Изображения коррекции хранятся в новой папке с именем с исходной папкой исходного спектрального изображения и дополнительной «Исправленной» (например, Pos0-Corrected).
  2. Создайте спектральную библиотеку. Несколько пакетов программного обеспечения могут быть использованы для извлечения спектральных данных из изображений, включая ImageJ. Для достижения наилучших результатов, нормализовать каждый endmember к диапазону длины волны наибольшей интенсивности, определяя, какая полоса длины волны имеет наиболее интенсивное значение и деления измерения на каждой полосе длины волны, что максимальное значение. Следует также отметить, что одномаркировка управления, генерируемого в автофлуоресцентных образцах, потребует дополнительных модификаций28,29,30,31,32. Смотрите шаг 6.2.4 и обсуждение для деталей.
    1. В ImageJ, нажмите файл (gt; Импорт) Это откроет новое окно. Перейдите к папке, содержащей исправленные спектральные изображения. Дважды щелкните любой файл изображения в папке, чтобы открыть новое окно. Нажмите на поле рядом с числом изображений и введите количество длин волн, включенных в спектральный скан (например, 26). Оставьте Исходное изображение и приращение как "1". Нажмите кнопку OK, чтобы продолжить.
    2. В главном окне ImageJ щелкните значок выбора полигона, а затем используйте указатель мыши, нажав на изображение, чтобы создать полигон вокруг области, содержащей данные флуоресценции. Обратите внимание, что в начальной длине волны практически не может быть данных о флуоресценции. Перейдите к другому изображению длины волны и / или использовать яркость / контрастный инструмент (Изображение йgt; Отрегулируйте йgt; Яркость / Контрастный йgt; Авто), чтобы лучше визуализировать регионов, содержащих данные флуоресценции, представляющие интерес.
    3. С полигоном обращается, генерировать профиль оси, нажав на изображение Это откроет новое окно. Нажмите Сохранить, чтобы сохранить спектральные данные в виде файла .csv.
    4. Выполните вычитание для обеспечения надлежащей спектральной библиотеки с чистыми этикетками, лишенными загрязнения автофлюоресценции. Используйте следующее уравнение29, чтобы изолировать чистый спектр от смеси одной метки и флуоресценции:
      Equation 1(1)
      Где: S чистый является чистый спектр этикетки, Sсмешанный является измеренный спектр образца загрязненных автофлюоресценции, S autoFL является измеренный спектр автофлюоресценции, "а" является масштабирование множитель спектра автофлюоресценции (между 0 и 1; например, 0,4), и "смещение" является смещением (обычно 0). Варите термин "а" до достижения почти нулевого значения за очевидный вклад автофлюоресценции. Дополнительную информацию можно найти в нескольких публикациях28,29,30,31,32.
  3. Не смешивайте данные спектрального изображения. Несмешивающий шаг будет генерировать изображение изобилия для каждого флуоресцентного ярлыка, где изобилие количество относительного сигнала флуоресценции на изображении от соответствующей этикетки. Несколько алгоритмов unmixing доступны для использования с ImageJ33,34,35. Кроме того, спектральный несмешивающий код MATLAB (используется в этом примере) доступен на веб-сайте Университета южной Алабамы Bioimaging Resources. Более полный обзор спектрального unmixing доступен36.
    1. Загрузите спектральный код unmixing в MATLAB.
    2. Редактизировать файлы Wavelength.mat и Library.mat в соответствии с экспериментальными условиями (например, "Длина волны" как 360-485 с шагом в пять).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие значения для этих длин волн должны быть загружены в "Библиотека" для каждой флуоресцентной метки (и автофлюоресценции). Имя endmember должно перечислять метки в том же порядке, что и значения столбца "Библиотека". Обратите внимание, что файл Library.mat должен содержать как переменные "Библиотека" и "Endmember-Name".
    3. Во вкладке EDITOR нажмите Run. Это откроет новое окно, позволяющее пользователю выбрать каталог. Перейдите к папке, содержащей спектральные изображения, чтобы быть unmixed. После выбора, это откроет новое окно.
    4. В полученных пробелах введите имя изображения (например, HASMC с GCaMP и Mito FOV1), количество полос длин волн (например, 26), количество таймтов (например, 1) и желательно ли измерение FRET (например, n) в соответствующих заготовках. Если "n" выбран для FRET, оставьте оба пробела End-Member пустыми. Нажмите OK, чтобы продолжить, который откроет новое окно.
    5. Naviagate в папку, содержащую файл Wavelength.mat. После выбора нажмите Open, чтобы продолжить, что откроет новое окно.
    6. Перейдите к папке, содержащей файл Library.mat. После выбора нажмите Open, чтобы продолжить, что сохранит несмешанные изображения в новой папке "Unmixed" внутри каталога, содержащей спектральные изображения.
  4. Осмотрите несмешанные спектральные изображения на качество.
    1. Откройте каждое несмешанное изображение, чтобы визуально проверить распределение чистых компонентов.
      1. Сравните величину изображения ошибки с изображением несмешанных изображений (по аналогии с шагом 5.11, это может быть сделано с помощью функции измерения ImageJ). Если величина изображения ошибки по величине схожа с изображениями несмешанного изобилия, то вполне вероятно, что в данных спектрального изображения есть сигналы, которые точно не учитываются спектральной библиотекой и линейным спектральным процессом несмешивания.
      2. Сравните изображение ошибки с несмешанными изображениями, чтобы увидеть, есть ли неопознанные остаточные структуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Несколько важных шагов из этого протокола необходимы для обеспечения сбора данных, которые являются точными и лишенными изображений и спектральных артефактов. Пропуск этих шагов может привести к тому, что данные будут значительными, но не могут быть проверены или воспроизведены с помощью любой другой системы спектральной визуализации, тем самым фактически сведя на нет любые выводы, сделанные с помощью указанных данных. Главным из этих важных шагов является надлежащая спектральная коррекция вывода (раздел 3). Коэффициент коррекции компенсирует отклонения длины волны в спектральном выходе системы настраиваемой возбуждения. Это достигается путем масштабирования длин волн с высокой силой возбуждения таким образом, что оптическая сила освещения сравнима с длинами волн с низким возбуждением мощности, достигая плоского спектрального профиля возбуждения. Примером неадекватного фактора коррекции является фактор, содержащий очень низкие значения (например, lt;0.001) на одной или нескольких длинах волн, что указывает на то, что значения интенсивности, измеренные на этих длинах волн, должны быть значительно ослаблены для достижения плоской спектральной реакции.

Калибровка системы в стандарт NIST-traceable гарантирует, что данные, собранные с помощью системы спектральной визуализации возбуждения, сопоставимы с другими системами, также откалиброванными по стандартам NIST-traceable. Поэтому крайне важно обеспечить, чтобы любой фактор коррекции корректировал собранные данные надлежащим образом. Точность коррекционного фактора может быть проверена с использованием стандарта флуоресценции, такого как NIST-отслеживаемый флуоресцеин. Рисунок 1 иллюстрирует соответствующий и неподходящий фактор коррекции, визуализированный с помощью графических и графических данных. В этом случае спектральный выход на уровне 340 нм практически отсутствовал по сравнению с остальной спектральной дальностью, что привело к значению почти нулевого (0,001) для практически каждой длины волны. Применяется к стеку изображения, это приводит к почти нулевым значениям через большую часть стека изображений для большинства пикселей.

Как указано в разделе 5, диапазон возбуждения, выбранные флюорофоры и настройки приобретения могут создать потенциал, что одна или несколько волнообразных диапазонов волн содержат перенасыщенные пиксели. Рисунок 2 иллюстрирует пример, в котором время экспозиции было установлено слишком долго для нескольких волн возбуждения, в результате чего последующие изображения содержат перенасыщенные пиксели. Это важно отметить, потому что, как показано на рисунке, как отдельные изображения и ложные изображения могут визуально казаться в пределах допустимых диапазонов интенсивности.

Для сравнения данных между системами также важен подходящий выбор фонового региона для вычитания данных, поскольку он удаляет элементы шума камеры или рассеянного света до NIST-отслеживаемой спектральной коррекции(рисунок 3). Часто полезно для последующей обработки изображений и шагов анализа данных для создания RGB ложного цвета изображения спектрального стека изображения для того, чтобы визуализировать спектральные объекты в изображении. На рисунке 4 показано изображение ложного цвета RGB, генерируемое путем слияния трех выбранных полос длинволн (370 нм, синий, 420 нм , зеленый, 470 нм и красный).

Спектральное несмешивание требует знания спектрального профиля каждого отдельного источника флуоресценции. В случае гиперспектральной визуализации, сканирующей возбуждение, это делается путем приобретения спектральных стеков изображений для каждого флюорофора (и автофлюоресценции). Рисунок 5 включен в качестве примера для выбора регионов из элементов управления одним имаркальным управлением для создания спектральной библиотеки. Следует отметить, что каждое измерение нормализовалось до пиковой длины волны.

При правильном выполнении процесс спектрального несмешивания позволяет разделить спектральный стек изображения на соответствующие вклады с каждой флуоресценции. На рисунке 6 показан пример несмешанного спектрального набора изображений с отдельными изображениями для каждого из следующих сигналов: аутофлуоресценция гладких мышечных клеток дыхательных путей, зонд GCaMP и митохондриальная этикетка. Ошибка, связанная со спектральным несмешиванием, также показана и может быть рассмотрена для сравнения уровней интенсивности ошибки с уровнями несмешанных сигналов. Расчет и интерпретация этой ошибки обсуждались ранее37. Как показано на рисунке 6, существует высокая ошибка, связанная с ядерными и перинуклеарными регионами клеток, что указывает на то, что измеренные спектры этих регионов не учитываются спектрами в спектральной библиотеке. Одним из потенциальных источников ошибки может быть то, что одно-метка управления для GCaMP и митохондриальной этикетке были подготовлены с использованием дыхательных путей гладкие мышечные клетки, которые имеют высокий родной автофлюоресценции. Таким образом, GCaMP и митохондриальная этикетка не могут представлять собой чистый спектр endmember. Кроме того, сигнал автофлюоресценции может влиять на библиотечные спектры для двух других меток таким образом, что не было должным образом учтено, в результате чего менее точная установка, чем если бы этикетки были приобретены с помощью клеточной линии с практически нет автофлюоресценции. Кроме того, приведены примеры, когда слишком мало или слишком много компонентов спектральной библиотеки доступны, в результате чего недооборудование и переоборудование спектральных изображений данных, соответственно(Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, и таблица 1).

Как отмечается в разделе 6.2 и конкретно шаге 6.2.4, "чистые" спектры, собранные из маркированных клеток, которые также являются автофлуоресцентными, скорее всего, загрязнят спектральный профиль для чистого компонента. Таким образом, следует проявлять осторожность, чтобы отделить чистые спектры этикеток, представляющих интерес, от их автофлюоресцентных хостов. На рисунке 10 показана разница в несмешивании с «чистыми» спектрами, загрязненными автофлюоресценцией (смешанной) по сравнению с чистыми спектрами, рассчитанными методом, описанным в шаге 6.2.4. Разница возникает в основном в несмешивание сигнала автофлюоресценции. Без надлежащего разделения сигнала (например, вычитание аутофлуоресценции загрязнения из спектра GCaMP), автофлуоресценции и GCaMP библиотечные компоненты конкурируют за те же спектральные данные в каждом пикселе, в результате чего характерные отверстия или темные пятна в автофлуоресценции изображения.

Figure 1
Рисунок 1 : Пример применения неуместных и соответствующих факторов коррекции, используемых для коррекции изображений в плоский спектральный ответ. (A) Заложенные неуместные и соответствующие факторы коррекции. (B) Изображение RGB, генерируемое с использованием неуместного фактора коррекции в (A). (C) Изображение RGB, генерируемое с тем же полем зрения, что и (B), за исключением соответствующего фактора коррекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Примеры, иллюстрирующие важность соответствующих параметров приобретения. (A, B) RGB изображения, генерируемые соответствующим временем приобретения (A, 100 мс) против того же поля зрения с насыщенным временем приобретения (B, 500 мс). Следует отметить, что изображения RGB появляются идентичными при ложном цвете. (C) Регион интереса выбран для обследования значений интенсивности из наиболее интенсивных регионов (A) и (B). (D) Значения интенсивности на плотные значения на длину волны от изображения времени экспозиции 100 мс (A, черная линия) и 500 мс время экспозиции (B, красная линия). Следует отметить, что интенсивность пикселей за время экспозиции 500 мс достигла предела динамического диапазона детектора (65 535 а.е.) на уровне 370 нм и не уменьшается до 525 нм, что приводит к спектральному артефакту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Выбор региона, представляющих интерес для фонового вычитания. (A) Сырой, длина волны подытожил интенсивность изображения. (B) Регионы выбранного изображения для определения среднего фонового спектра для фонового вычитания, показанного красным цветом. (C) Фон-вычитается, исправлено и суммируется интенсивность изображения. (D) RGB окраска исправленного изображения (C). Процесс генерации изображения ложного цвета RGB показан на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Процесс создания Изображения ложного цвета RGB. (A-C) Три полосы длины волны, расположенные равномерно по всему спектральному диапазону приобретения, были выбраны для ложной окраски (синий - 370 нм, зеленый - 420 нм, красный - 470 нм). (D) Подытожил интенсивность изображения, генерируемого путем добавления интенсивности пикселей от всех полос длины волны в кубе изображения. (E-G) Изображения в панелях (A-C) с их соответствующими ложными цветами поиска таблицы применяются. (H) В результате слилось изображение (E-G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Выбор одного метки управления для генерации спектральной библиотеки. (A)RGB ложного цвета изображения дыхательных путей гладкой мышцы (ASM) клеточной аутофлуоресценции. (B) Показаны красным цветом, области (A) выбраны для компонента автофлюоресценции спектральной библиотеки. (C) RGB ложных цветных ASM клеток, помеченных митохондриальной этикеткой. (D) Показаны красным цветом, области (C) выбраны для компонента метки митохондиральной спектральной библиотеки. Из-за автофлуоресценции клеток ASM, локализованных вблизи ядра, небольшие области были выбраны далеко от ядер для определения спектра митохондриальных меток. (E) RGB ложных цветных ASM клеток, трансфицироваться с зондом GCaMP. (F) Регионы (E), выбранные для компонента GCaMP спектральной библиотеки, отображаются красным цветом. Подобно (D), были выбраны регионы вдали от ядер. (G) Спектральная библиотека, полученная от A-F, нормализуется до значения единства на длине волны с самым сильным сигналом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Figure 6
Рисунок 6 : Пример несмешанных данных изображений, в которых можно визуализировать несмешанные относительные сигнальные вклады от каждого компонента библиотеки. (A-D) Несмешанное обилие GCaMP, митохондриальной этикетки, автофлюоресценции и термина ошибки. (E-G) Изображения в панелях (A-C) с их соответствующими ложными цветами поиска таблицы применяются. (H) Композитный, слитый, ложного цвета изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Figure 7
Рисунок 7 : Несмешанные относительные сигнальные вклады, включая среднее интенсивность и процент от общей флуоресценции, из правильно определенной спектральной библиотеки. (A-D) Несмешанное изобилие для автофлюоресценции, GCaMP, митохондриальной этикетки и термина ошибки. Следует отметить, что термин погрешности составляет менее 10% от общего количества измеренного сигнала флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Figure 8
Рисунок 8 : Несмешанные относительные сигнальные вклады, включая среднее интенсивность и процент от общей флуоресценции, из спектральной библиотеки отсутствует компонент, который, как известно, включен в выборку (т.е. неопределенный спектральный диапазон). (A-C) Несмешанное обилие автофлуоресценции, митохондриальной этикетки и термина ошибки. Обратите внимание, что упущение GCaMP из спектральной библиотеки увеличило расчетный относительный вклад сигнала от компонентов библиотеки, а также термин ошибки, по сравнению с рисунком 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9 : Несмешанные относительные сигнальные вклады, включая среднее интенсивность и процент от общей флуоресценции, из спектральной библиотеки, содержащей дополнительный компонент, который, как известно, отсутствует в образце (т.е. переопределенная спектральная библиотека). (A-E) Несмешанное обилие автофлуоресценции, GCaMP, митохондриальной этикетки, ядерной этикетки и термина ошибки. Обратите внимание, что добавление ядерной метки в спектральную библиотеку снизило расчетный относительный сигнал от автофлюоресценции, по сравнению с рисунком 7. Кроме того, термин ошибки уменьшается ниже процентной погрешности, указанной правильно определенной спектральной библиотекой. Это потому, что переопределенная библиотека почти всегда позволит лучше соответствовать экспериментальным данным, чем правильно определенная библиотека, даже если сигналы изобилия для компонентов, которые, как известно, отсутствуют в образце, являются (на самом деле) артефактами переопределения спектральной библиотеки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10 : Сравнение несмешанных изображений при использовании библиотеки до и после надлежащего автоматического загрязнения сигнала вычитания. (A) Оригинальный "чистый" спектр, полученных от одной этикетки управления в высокой автоматической флуоресцентных дыхательных путей гладких мышечных клеток до масштабирования вычитания подробно в шаге 6.2.4. (B-D) Несмешанные автофлуоресценции, GCaMP и изображения ядерных метки, генерируемые с использованием (A) в качестве библиотеки. (E) Исправленные чистые спектры, полученные из одного метки управления в высокой аутофлуоресцентных дыхательных путей гладких мышечных клеток после масштабирования вычитания. (F-H) Несмешанные автофлуоресценции, GCaMP и изображения ядерных метки, генерируемые с использованием (E) в качестве библиотеки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Средняя интенсивность (AU)
Правильная установка Недоподходящая установка Переоборудование
Автофлюоресценция 187 299 164
GCaMP 139 - 140
Митохондриальная этикетка 246 318 248
Ядерная этикетка - - 26
Ошибка RMS 53 126 43
Стандартное отклонение (AU)
Правильная установка Недоподходящая установка Переоборудование
Автофлюоресценция 362 442 315
GCaMP 168 168
Митохондриальная этикетка 344 388 345
Ядерная этикетка - - 93
Ошибка RMS 62 126 44
Максимальная интенсивность (AU)
Правильная установка Недоподходящая установка Переоборудование
Автофлюоресценция 6738 7409 6738
GCaMP 1336 - 1336
Митохондриальная этикетка 5098 5194 5098
Ядерная этикетка - - 1257
Ошибка RMS 1050 1286 910
% от общей флуоресценции
Правильная установка Недоподходящая установка Переоборудование
Автофлюоресценция 30% 40% 26%
GCaMP 22% 43% 23%
Митохондриальная этикетка 39% - 40%
Ядерная этикетка - - 4%
Ошибка RMS 8% 17% 7%

Таблица 1: Таблица, сравнивая средние, стандартные отклонения и максимальные значения интенсивности изобилия несмешанного изобилия на несмешанное изображение изобилия из правильной спектральной библиотеки и из неопределенных или переопределенных спектральных библиотек, а также процент от общего количества флуоресценции на несмешанное изобилие изображения (минимальная интенсивность несмешанного изобилия для каждого изображения всегда была равна нулю). Данные взяты из рисунка 7, Рисунок 8, и рисунок 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Оптимальное использование гиперспектральной визуализации, сканирующего возбуждение, начинается со построения световой траектории. В частности, выбор источника света, фильтров (невозможных и дихронических), метода переключения фильтров и камеры определяют доступный спектральный диапазон, возможную скорость сканирования, чувствительность детектора и пространственную выборку. Меркурий дуги лампы предлагают много волнося волны пики, но не обеспечивают плоский спектральный выход и потребует значительного сокращения сигнала на выходе пиков для коррекции спектральных данных изображения обратно в NIST-traceable ответ38. Альтернативные источники света, такие как лампы Дуги Xe и лазеры с белым светом supercontinuum, могут обеспечить более равномерный спектральный выход, который лучше подходит для возбуждения сканирования гиперспектральной визуализации38,39,40. Выбор источника света, настраиваемых фильтров и дихроческих фильтров определяет доступный спектральный диапазон. Этот диапазон следует выбирать с тщательным рассмотрением желаемой спектральной информации экспериментального образца.

Кроме того, следует рассмотреть механизм переключения, используемый для настраиваемых фильтров, а также различные факторы камеры, такие как квантовая эффективность, размер пикселей и доступные частоты кадров, поскольку эти факторы повлияют на потенциальные показатели выборки41 ,42,43. Тем не менее, все другие факторы, являющиеся постоянными, использование возбуждания сканирования подход должен обеспечить повышенную чувствительность и способность к более быстрой визуализации, по сравнению с большинством выбросов сканирования спектральной визуализации подходов21.

Как отмечается во введении, гиперспектральная визуализация здесь относится к смежному и спектрально перекрывающегося характеру приобретенных данных. Таким образом, возможности системы должны быть в состоянии собирать данные с помощью интервалов между длинами волн в центре возбуждения менее половины расстояния от FWHM фильтров. Как сообщалось ранее, тщательно подобранный массив тонкопленочных tunable фильтров позволяет присугции данных с центральными длинами волн, расположенными на расстоянии 5 нм друг от друга, расстояние, достаточное для того, чтобы преодолеть спектр возбуждения, учитывая фильтры с FWHM между 14-20 нм. Такое расстояние дает небольшое избыточность в сборе спектральных данных с вероятным повышением точности процесса несмешивания. Рассмотрение как спектральных диапазонов, так и необходимого минимального количества каналов длины волны для точного несмешивания обсуждалось ранее44,45,46. С этой целью, учитывая пропускную способность этих фильтров, диапазон возбуждения должен быть выбран, чтобы закончиться на длине волны, которая несколько ниже (5-10 нм ниже), чем отсечение длины волны дихроической балки. Это позволит обеспечить, чтобы вся пропускная способность возбуждения освещения ниже отсечения длины волны дихроической лучевой (например, 360-485 нм для 495 дихроический фильтр), чтобы избежать возбуждения выбросов перекрестного разговора.

Для получения высокоскоростного спектрального сканирования необходимо программное обеспечение для самостоятельного управления каждым компонентом оборудования. Программное обеспечение должно быть в состоянии работать затвор, выбрать возбуждая длинволн, и приобрести изображения на достаточно высоких скоростях для удовлетворения экспериментальных условий (точные требования к выборке скорость будет варьироваться эксперимент, но пример цель может быть приобрести четыре полные спектральные стеки изображения в минуту). Более сложные эксперименты могут использовать несколько дихроических зеркал, целей или xY' местоположений. Есть ряд пакетов программного обеспечения, доступных для получения данных47,48. Micro-Manager — это бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для автоматизации микроскопа, которое предлагает различные варианты настройки. Кроме того, Micro-Manager включает в себя панель сценариев для дополнительной настройки, недоступной в основном пользовательском интерфейсе. Например, можно использовать пользовательский скрипт, чтобы уменьшить задержку 250 мс tunable переключатель фильтра до 10 мс на всех длинах волн возбуждения, за исключением переходов длины волны, в которых колесо фильтра вращается к новому фильтру, уменьшая эффективное изображение время на 240 мс на длину волны для большинства длин волн. Эта настройка позволила приобрести до 30 длин волн в возрасте до 4 с. Наконец, Micro-Manager может работать вместе с другими средами, такими как MATLAB, для дальнейшей настройки управления микроскопом устройства.

Определение правильного спектрального диапазона возбуждения, времени приобретения и начальной длины волны для просмотра выборки и последующего получения данных очень важно. Однако неправильная работа отдельных компонентов системы может потребовать дальнейших устранения неполадок. Каждый компонент оптического пути вносит свой вклад в полученные данные изображения. Поэтому важно проверить спектральный ответ и оптическую передачу оптических компонентов в пределах пути света, особенно при попытке оптимизировать общий ответ системы. Источники света часто имеют переменные параметры интенсивности и могут иметь уменьшение мощности в течение всего срока службы лампы40. Если образец кажется тусклым, причиной может быть уменьшен выход из источника света. Функция автоматического затвора в Micro-Manager, по нашему опыту, не работает 100% времени. Отсутствие сигнала может указывать на закрытый затвор. Начальная длина волн возбуждения, сохраненная в файле конфигурации Micro-Manager, может по умолчанию соблюдать длину волны с небольшим спектральным выходом или вообще без него, например пример 340 нм, показанный на рисунке 1.

Кроме того, это не редкость по ошибке выбрать волновой длины возбуждения, что выше отсечения длины волны долгопроходимы дихроического луча, в результате чего дополнительные перекрестные разговоры и / или возбуждение свет шунтируется непосредственно на камеру, которая может потенциально повредить датчик камеры. Аналогичным образом, регулировка траектории света для передачи изображения может привести к потере сигнала к камере, в зависимости от конфигурации микроскопа. Кроме того, как указано на рисунке 2, выбор первоначальной длины волн возбуждения и времени экспозиции для просмотра образца может показаться целесообразным, но на самом деле привести к перенасыщению пикселей на других длинах волн возбуждения. Этот факт не будет очевидным, если насыщенность пикселей проверяется для каждого изображения, поэтому часто разумно выполнять стек изображения теста на области образца, которая, как представляется, содержит наиболее интенсивную флуоресценцию.

Стоит также отметить, что переменная интенсивность может присутствовать на изображениях, выбранных для фоновых регионов. Следует позаботиться о том, чтобы эти регионы фактически не содержали соответствующих данных изображений, поскольку последующие шаги по коррекции данных затем вычитают этот сигнал из данных изображений, полученных в других регионах выборки. Иногда необходимо использовать настройки передачи и/или резко увеличить время экспозиции, чтобы проверить, действительно ли выбранный регион для измерения фона выборки действительно не содержит выборки. Аналогичным образом, несмешанные изображения могут представлять с темными пятнами или отверстиями в изображении автофлюоресценции. Это может быть связано с неправильной библиотекой, вызванной аутофлуоресценцией "загрязнения" "чистых" спектральных сигналов от одномаркированных клеток. Это потому, что любой "чистый" спектральный сигнал, собранный из образца, содержащего автофлуоресценцию, неизменно будет содержать некоторые из самоспектров автофлюоресценции, даже если в следовых количествах. Следует позаботиться о том, чтобы вычесть сигналы автофлюоресценции из одномаркированных элементов управления, чтобы обеспечить правильную спектральную библиотеку, как описано несколько раз Мэнсфилд и др.28,29,30, 31,32

Хотя это и не продемонстрировано в этой статье, возбуждение сканирования спектральной системы визуализации также может быть использован для замедленного изображения и изображения в нескольких местах XY (или большое поле зрения из-за сшивания изображения) в нескольких фокусных плоскостей. Если эти варианты необходимы для одного эксперимента, следует тщательно подумать о важности заказа на приобретение и потенциальных последствий фотоотбелевания. Стоит также отметить, что если фактическое время превышает предполагаемое время (например, стек изображения приобретает 11 с, а не примерно 10 с), Micro-Manager будет продолжать приобретать выбранное количество тайм-пойнтов и/или позиций. Этот просчет может усугубляться несколькими временными точками и изменять рассчитанную временную выборку, потенциально искажая любые выводы, сделанные из данных.

Этот пример демонстрирует способность разделять три источника флуоресценции в диапазоне 145 нм сканирующего возбуждения. Предыдущие эксперименты с использованием этой системы были в состоянии отделить до пяти источников флуоресценции в том же диапазоне. Время, необходимое для приобретения этого изображения составляет менее 1 мин, что значительно быстрее, чем большинство систем спектральной визуализации, сканирующей выбросы. Улучшения в траектории света, такие как более высокая скорость возбуждения волнений настройки, может способствовать дальнейшему продвижению этой технологии визуализации до скорости, которые являются достаточными для видео-скорости спектральной визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Доктора Ливзли и Рич раскрывают финансовую заинтересованность в стартап-компании SpectraCyte LLC, основанной для коммерциализации технологии спектральной визуализации.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE3406016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

Tags

Инженерия выпуск 150 гиперспектральная спектроскопия возбуждение флуоресценция микроскопия автофлюоресценция визуализация настраиваемый фильтр тонкая пленка
Возбуждение-сканирование гиперспектральной микроскопии изображений для эффективной дискриминации сигналов флуоресценции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deal, J., Britain, A., Rich, T.,… More

Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter