光谱成像已成为在同一份样本中识别和分离多种荧光信号的可靠方法，能够有效区分目标信号与背景或自发荧光。激发扫描高光谱成像在此基础上进一步优化，可在降低图像采集所需时间的同时，显著提高信噪比。
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摘要
摘要
多种技术依赖于荧光信号的检测，以识别或研究现象，或阐明功能。在高光谱成像技术出现之前，分离这些荧光信号一直是一项繁琐的工作；而高光谱成像技术能够将不同荧光源彼此分离，并将其与背景信号及自发荧光区分开来（前提是已知其光谱特征）。然而，传统的发射光扫描高光谱成像由于需要对激发光和发射光均进行滤波，导致采集时间较长且信噪比较低。已有研究证明，激发光扫描高光谱成像可在减少必要采集时间的同时，显著提高所获取数据的信噪比。本实验方案利用市售设备，详细描述了如何构建、校准并使用激发光扫描高光谱成像显微系统，以实现对单个样品中多个荧光源信号的分离。该技术虽特别适用于细胞与组织的显微成像，但也可能广泛应用于任何可调节激发波长的荧光实验中，包括但不限于：化学成像、环境科学、眼科护理、食品科学、法医学、医学科学以及矿物学等领域。
引言
光谱成像可通过多种方式进行，并有多个相关术语1，2，3，4。通常，光谱成像指在至少两个空间维度和一个光谱维度上获取的数据。多光谱成像与高光谱成像通常根据波长波段的数量或光谱波段是否连续来区分1。在本应用中，高光谱数据定义为通过连续波长波段获取的光谱数据，其相邻波段中心波长的间隔不超过所用激发滤光片半高全宽（FWHM）的一半（即对于带宽为14–20 nm的滤光片，中心波长间隔不大于5 nm）。数据波段的连续性实现了数据集的过采样，从而确保在对光谱域进行采样时满足奈奎斯特准则。
高光谱成像技术由美国国家航空航天局（NASA）在20世纪70年代和80年代结合第一颗陆地卫星（Landsat）的发展而研发5,6收集多个连续光谱波段的数据，可生成每个像素的辐射光谱。通过识别和定义各组分的特征辐射光谱，不仅能够根据其特有的光谱特征检测表面物质，还能消除干扰信号，例如由大气条件引起的信号变化。利用物质特征光谱进行检测的概念于1996年被应用于生物系统，Schröck 等人采用....
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方案
1. 设备设置
- 光源：选择具有高功率输出和高准直性的宽带光谱光源（本研究使用了300 W的Xe弧光灯）。
- 快门（可选）：在光路中添加快门，以减少时间序列成像中的光漂白现象。
- 可调滤光系统：集成机械调谐组件和薄膜可调滤光片（TFTF），以实现所需的可调激发波长范围（例如360–485 nm）。
- 显微镜：使用倒置荧光显微镜，配备电动多色镜转盘及控制器。
- 荧光滤光块：组装一个长通荧光滤光块。为获得最佳效果，选择相同波长的二向色镜和长通发射滤光片，以实现激发光与发射光的最佳分离（例如495 nm）。
- 物镜：使用合适的复消色差物镜，以确保在整个实验所用波长范围内焦点均匀（本研究使用了60倍水镜）。
- 自动载物台（可选）：使用自动载物台，以快速采集多个视野或通过图像拼接获取极大视野。使用物镜和相机对载物台进行校准。
- 相机：选择合适的相机，以满足实验对空间分辨率、灵敏度和噪声的要求（本系统使用了高灵敏度sCMOS相机）。
2. 采集软件
- 选择一种能够独立控制每个硬件组件的软件包，例如 Micro-Manager。
- 创建配置文件：配置文件是一组已保存的仪器和指令，Micro-Manager 将加载该文件以控制系统的硬件。要创建配置文件，....
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结果
本方案中的若干关键步骤对于获取准确且无成像与光谱伪影的数据至关重要。若省略这些步骤，可能导致数据看似显著，但无法通过其他光谱成像系统验证或重复，从而实质性地使基于这些数据得出的任何结论无效。其中最重要的步骤是正确的光谱输出校正（第3节）。校正因子用于补偿可调谐激发系统光谱输出随波长变化的差异。该过程通过调整高激发功率的波长，使其光学照明功率与低激发功率波长下的照明功率相当，从而实现平坦的光谱激发轮廓。不恰当校正因子的一个示例是在一个或多个波长处具有极低的数值（例如，<0.001），这表明在这些波长下测得的强度值必须被大幅衰减才能获得平坦的光谱响应。
将系统校准至可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准，可确保使用激发扫描光谱成像系统所采集的数据与其他同样校准至NIST可溯源标准的系统具有可比性。因此，必须确保任何校正因子均能适当地调整所采集的数据。校正因子的准确性可通过使用荧光标准物质（例如可溯源至NIST的荧光素）进行验证。
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讨论
激发扫描高光谱成像系统的最佳使用始于光路的构建。具体而言，光源、滤光片（可调谐和二向色性滤光片）、滤光片切换方式以及相机的选择，决定了可用的光谱范围、可能的扫描速度、探测器灵敏度和空间采样能力。汞弧灯提供多个激发波长峰，但其光谱输出不平坦，因此在输出峰处需要显著降低信号强度，以将光谱图像数据校正至可追溯至美国国家标准与技术研究院（NIST）的响应值38。其他替代光源，如氙弧灯和白光超连续谱激光器，可能提供更均匀的光谱输出，更适合用于激发扫描高光谱成像38,39,40。光源、可调谐滤光片和二向色性滤光片的选择共同决定了可用的光谱范围。该范围应根据实验样品所需的光谱信息进行慎重选择。
此外，在选择可调谐滤光片的切换机制时，还应考虑各种相机参数，例如量子效率、像素尺寸和可用的帧率，因为这些因素会影响潜在的采样速率41
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披露
Leavesley 博士和 Rich 博士披露其对一家初创公司 SpectraCyte LLC 持有财务利益，该公司成立的目的是将光谱成像技术商业化。
致谢
作者感谢以下机构的支持：NSF 1725937、NIH P01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417、NIH R01HL137030、AHA 18PRE34060163 以及 Abraham Mitchell 癌症研究基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气道平滑肌细胞 | 国家疾病研究互换组织（NDRI） | 从美国神经疾病与中风研究所（NDRI）获取的人肺组织中分离得到 | 高度自发荧光的钙敏感细胞 |
| 自动快门 | Thorlabs 公司 | SHB1 | 可远程控制的快门以最小化光漂白 |
| 自动载物台 | Prior Scientific | H177P1T4 | 用于自动采集多视野或拼接图像的远程可控载物台 |
| 自动载物台控制器（XY） | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | 用于连接自动载物台与计算机及操纵杆 |
| 缓冲液 | 自制 | 自制 | 145 mM NaCl，4 mM KCl，20 mM HEPES，10 mM D-葡萄糖，1 mM MgCl2，以及 1 mM CaCl2，pH 7.3 |
| 细胞培养室 | 赛默飞世尔科技 | Attofluor 细胞培养皿，A7816 | 由外科级不锈钢和橡胶O型圈组成的盖玻片支架，用于密封培养基并防止样本和/或物镜污染 |
| 激发滤光片 | Semrock 公司 | TBP01-378/16 | 中心波长范围（340–378 nm），带宽（最小 16 nm，标称 FWHM 20 nm），折射率（1.88） |
| Semrock 公司 | TBP01-402/16 | 中心波长范围（360–400 nm），带宽（最小16 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.8） | |
| Semrock 公司 | TBP01-449/15 | 中心波长范围（400–448.8 nm），带宽（最小15 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.8） | |
| Semrock 公司 | TBP01-501/15 | 中心波长范围（448.8–501.5 nm），带宽（最小15 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.84） | |
| Semrock 公司 | TBP01-561/14 | 中心波长范围（501.5–561 nm），带宽（最小 14 nm，标称 FWHM 20 nm），折射率（1.83） | |
| 荧光滤光片组 二向色镜分光器 | Semrock 公司 | FF495-Di03 | 在495 nm处分离激发光和发射光（>350–488 nm 范围内反射率高达 98% >502-950 nm 范围内透射率为 93%，滤光片有效折射率（1.78） |
| 荧光滤光片组 长通滤光片 | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | 允许波长大于496 nm的光通过（ >503.2–1100 nm 范围内的平均透射率为 93%，折射率为 1.86 |
| GCaMP探针 | Addgene | G-CaMP3；质粒编号 #22692 | 基于单波长GCaMP2的基因编码钙离子指示剂 |
| 积分球 | 海洋光学 | FOIS-1 | 用于宽角度照明的精确测量 |
| 倒置荧光显微镜 | 尼康仪器公司 | TE2000 | 倒置显微镜可直接激发样品，无需穿透培养基和/或组织的多层结构。 |
| Mitotracker Green FM | 赛默飞世尔科技 | M7514 | 标记线粒体 |
| 可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的校准光源 | 海洋光学 | LS-1-CAL-INT | 具有已知光谱、用作标准的光源 |
| 可溯源至美国国家标准与技术研究院的荧光素 | 赛默飞世尔科技 | F36915 | 用于验证系统的适当光谱响应 |
| NucBlue | 赛默飞世尔科技 | R37605 | 标记细胞核 |
| 目标（10X） | 尼康仪器公司 | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | 适用于大视野观察 |
| 目标（20倍） | 尼康仪器公司 | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | 最常用于组织样本 |
| 目标（60倍物镜） | 尼康仪器公司 | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | 最常用于细胞样本 |
| sCMOS相机 | Photometrics | Prime 95B（版本 A8-062802018） | 用于获取高灵敏度数字图像 |
| 光谱仪 | 海洋光学 | QE65000 | 用于测量激发扫描光谱系统的光谱输出 |
| 可调滤光片转换器 | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | 用于自动激发滤光片调谐/切换的电动装置 |
| 氙弧灯 | Sunoptic Technologies | Titan 300HP 光源 | 光谱输出相对均匀的光源 |
参考文献
- Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
- Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements an....
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