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Engineering

एक्सक्पेंशन-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी को कुशलता से फ्लुओरेंस सिग्नलों को भेदभाव करने के लिए

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

स्पेक्ट्रल इमेजिंग एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट संकेतों की पहचान और जुदाई के लिए एक विश्वसनीय समाधान बन गया है और आसानी से पृष्ठभूमि या autofluorscence से ब्याज के संकेतों को अलग कर सकते हैं। उत्तेजना-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग आवश्यक छवि अधिग्रहण समय को कम करके इस तकनीक पर सुधार करती है, जबकि साथ ही सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि करती है।

Abstract

कई तकनीकों की पहचान करने या घटना का अध्ययन करने के लिए या कार्यों को स्पष्ट करने के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने पर भरोसा करते हैं। इन फ्लोरोसेंट संकेतों का पृथक्करण हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग के आगमन तक बोझिल साबित हुआ, जिसमें फ्लोरोसेंट स्रोतों को एक दूसरे से अलग किया जा सकता है और साथ ही पृष्ठभूमि संकेतों और ऑटोफ्लोरेसीसेंस (अपने वर्णक्रमीय का ज्ञान दिया गया है) हस्ताक्षर)। हालांकि, पारंपरिक, उत्सर्जन स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग धीमी अधिग्रहण समय और कम संकेत-से-शोर अनुपात दोनों उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश की आवश्यक फ़िल्टरिंग के कारण से ग्रस्त है। यह पहले से दिखाया गया है कि उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग आवश्यक अधिग्रहण समय कम कर देता है, जबकि एक साथ प्राप्त डेटा के संकेत से शोर अनुपात में वृद्धि. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे इकट्ठा करने के लिए, जांचना, और एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट स्रोतों से संकेतों की जुदाई के लिए एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करें. जबकि कोशिकाओं और ऊतकों के सूक्ष्म इमेजिंग के लिए अत्यधिक लागू है, इस तकनीक भी फ्लोरोसेंट का उपयोग प्रयोग के किसी भी प्रकार के लिए उपयोगी हो सकता है जिसमें यह उत्तेजना तरंगदैर्ध्य भिन्न करने के लिए संभव है, सहित, लेकिन तक सीमित नहीं: रासायनिक इमेजिंग, पर्यावरण अनुप्रयोगों, नेत्र देखभाल, खाद्य विज्ञान, फोरेंसिक विज्ञान, चिकित्सा विज्ञान, और खनिज विज्ञान.

Introduction

स्पेक्ट्रल इमेजिंग विभिन्न तरीकों से की जा सकती है और इसे अनेक शब्दों1,2,3,4द्वारा निर्दिष्ट किया जाता है . सामान्य तत्त्क्षणीय इमेजिंग कम से कम दो स्थानिक आयामों और एक वर्णक्रमीय आयाम में प्राप्त डेटा को निर्दिष्ट करता है। बहुस्पेक्ट्रल और हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग अक्सर तरंगदैर्ध्य बैंडों की संख्या से अलग होती है या क्या वर्णक्रमीय बैंड समीपवर्ती1होते हैं। इस आवेदन के लिए, hyperspectral डेटा उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक bandpass फिल्टर की आधी अधिकतम (FWHM) पर आधे से कम नहीं आधे से अधिक पूर्ण चौड़ाई केंद्र तरंगदैर्ध्य के अंतराल द्वारा प्राप्त निरंतर तरंगदैर्ध्य बैंड के साथ प्राप्त वर्णक्रमीय डेटा के रूप में परिभाषित किया गया है (यानी, 5 एनएम 14-20 एनएम बैंडविड्थ के साथ bandpass फिल्टर के लिए केंद्र तरंगदैर्ध्य रिक्ति) डेटा बैंड के निरंतर प्रकृति डेटासेट के एक oversampling के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करना है कि NyQuist मापदंड संतुष्ट हैं जब वर्णक्रमीय डोमेन नमूना.

हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग को नासा द्वारा 1970 और 1980 के दशक में पहले लैंडसैट उपग्रह5,6के साथ संयोजन के रूप में विकसित किया गया था . कई आसन्न वर्णक्रमीय बैंड से डेटा एकत्र प्रत्येक पिक्सेल की एक चमक स्पेक्ट्रम की पीढ़ी की अनुमति दी. अलग-अलग घटकों की चमक स्पेक्ट्रम की पहचान और परिभाषित करने से न केवल उनकी विशेषता स्पेक्ट्रम द्वारा सतह सामग्री का पता लगाना संभव हो गया है, बल्कि यह हस्तक्षेप संकेतों को हटाने के लिए भी अनुमति देता है, जैसे कि सिग्नल में बदलाव के कारण वायुमंडलीय स्थितियों. उनकी विशेषता स्पेक्ट्रम का उपयोग कर सामग्री का पता लगाने की अवधारणा 1996 में जैविक प्रणालियों के लिए लागू किया गया था जब श्रेक एट अल. पांच अलग fluorophores और उनके ज्ञात spectra के संयोजन का इस्तेमाल किया एक प्रक्रिया में लेबल गुणसूत्रों भेद करने के लिए कहा वर्णक्रमीय कर्योटाइपिंग7| इस तकनीक पर विस्तार से किया गया था 2000 Tsurui एट अल द्वारा ऊतक के नमूने के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, सात फ्लोरोसेंट रंगों और विलक्षण मूल्य अपघटन का उपयोग करने के लिए संदर्भ में स्पेक्ट्रम के रैखिक संयोजन में प्रत्येक पिक्सेल के वर्णक्रमीय जुदाई को प्राप्त करने के लिए पुस्तकालय8| उनके रिमोट सेंसिंग समकक्षों के समान, प्रत्येक ज्ञात फ्लोरोफोर के योगदान की गणना हाइपरस्पेक्ट्रल छवि से की जा सकती है, प्रत्येक फ्लोरोफोर के स्पेक्ट्रम की एक प्राथमिकता जानकारी दी जाती है।

हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग कृषिकेक्षेत्रों में भी किया गया है 9 , खगोल विज्ञान10, बायोमेडिसिन11, रासायनिक इमेजिंग12, पर्यावरण अनुप्रयोग13, नेत्र देखभाल14, खाद्य विज्ञान15, फॉरेंसिक साइंस16,17, मेडिकल साइंस18, खनिजविज्ञान 19, और निगरानी20. वर्तमान फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप hyperspectral इमेजिंग सिस्टम की एक प्रमुख सीमा यह है कि मानक hyperspectral इमेजिंग प्रौद्योगिकी द्वारा संकीर्ण बैंड में फ्लोरोसेंट संकेतों को अलग 1) पहले नमूना उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए उत्तेजना प्रकाश छानने, तो 2) आगे छानने उत्सर्जित प्रकाश संकीर्ण बैंड है कि बाद में गणितीय21अलग किया जा सकता है में फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को अलग करने के लिए। उत्तेजना रोशनी और उत्सर्जित फ्लोरोसेंट दोनों को फ़िल्टर करने से उपलब्ध सिग्नल की मात्रा कम हो जाती है, जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम करती है और लंबा अधिग्रहण समय आवश्यक है। कम संकेत और लंबा अधिग्रहण बार एक नैदानिक उपकरण के रूप में hyperspectral इमेजिंग की प्रयोज्यता सीमा.

एक इमेजिंग मोडलिटी विकसित की गई है जो हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग करती है लेकिन उपलब्ध सिग्नल को बढ़ा देती है, जिससे आवश्यक अधिग्रहण समय21,22को कम किया जा सकता है। इस नई मोडलिटी, जिसे उत्तेजना-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग कहा जाता है, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को अलग करके और उत्सर्जित प्रकाश की एक विस्तृत श्रृंखला का संग्रह करके वर्णक्रमीय छवि डेटा प्राप्त करती है। यह पहले से दर्शाया गया है कि इस तकनीक से उत्सर्जन स्कैनिंग तकनीकों21,22की तुलना में संकेत-से-शोर अनुपात में परिमाण वृद्धि के आदेश प्राप्त होते हैं। सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि काफी हद तक उत्सर्जन प्रकाश के विस्तृत बैंडपास ($600 एनएम) के कारण हुई है, जबकि विशिष्टता फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के बजाय केवल उत्तेजना प्रकाश को छानने के द्वारा प्रदान की जाती है। यह सभी उत्सर्जित प्रकाश की अनुमति देता है (हर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए) डिटेक्टर21तक पहुँचने के लिए. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक exogenous लेबल से autofluorence भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, वृद्धि की डिटेक्टेबल सिग्नल के कारण अधिग्रहण समय को कम करने की क्षमता photobleaching के खतरे को कम कर देता है और साथ ही एक अधिग्रहण दर है कि वर्णक्रमीय वीडियो इमेजिंग के लिए स्वीकार्य है पर वर्णक्रमीय स्कैन की अनुमति देता है.

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उत्तेजना-स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोपी के लिए एक डेटा अधिग्रहण गाइड के रूप में सेवा करने के लिए है. इसके अतिरिक्त, वर्णन शामिल किए गए हैं जो प्रकाश पथ और हार्डवेयर को समझने में मदद करते हैं. यह भी वर्णित एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोप के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के कार्यान्वयन है. अंत में, विवरण कैसे एक NIST-ट्रेसकरनेयोग्य मानक करने के लिए प्रणाली जांचना, सटीक परिणाम के लिए सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए प्रदान की जाती हैं, और अलग-अलग घटकों से योगदान में पता चला संकेत unmix.

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Protocol

1. डिवाइस सेट-अप

  1. प्रकाश स्रोत: उच्च शक्ति उत्पादन और उच्च समांतरण के साथ एक व्यापक बैंड वर्णक्रमीय प्रकाश स्रोत का चयन करें (एक 300 डब्ल्यू Xe चाप दीपक इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया था).
  2. शटर (वैकल्पिक): समय चूक इमेजिंग के लिए photobleaching को कम करने के लिए ऑप्टिकल पथ के लिए एक शटर जोड़ें.
  3. Tunable फिल्टर प्रणाली: एक यांत्रिक ट्यूनिंग विधानसभा और पतली फिल्म टूनाबल फिल्टर (TFTF) वांछित तरंगदैर्ध्य समायोज्य उत्तेजना रेंज (जैसे, 360-485 एनएम) को सक्षम करने के लिए सेट शामिल हैं।
  4. माइक्रोस्कोप: एक motorized dichroic फिल्टर बुर्ज और नियंत्रक सहित एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    1. फ्लोरोसेंट फिल्टर घन: एक लंबे समय से पास फ्लोरोसेंट फिल्टर घन इकट्ठा। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, उत्सर्जन प्रकाश (उदाहरण के लिए, 495 nm95) से उत्तेजना के इष्टतम पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए एक ही तरंगदैर्ध्य पर एक dichroic दर्पण और लंबी पास उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें।
    2. उद्देश्य: प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया तरंगदैर्ध्य रेंज पर एक समान ध्यान केंद्रित सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त apochromatic उद्देश्य का उपयोग करें (एक 60x पानी उद्देश्य इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था).
    3. स्वचालित चरण (वैकल्पिक): छवि सिलाई के माध्यम से दृश्य और/या बहुत बड़ी फ़ील्ड के त्वरित नमूने के लिए एक स्वचालित चरण का उपयोग करें. उद्देश्य और कैमरे के साथ मंच कैलिब्रेट.
  5. कैमरा: प्रयोग के स्थानिक संकल्प, संवेदनशीलता, और शोर आवश्यकताओं को प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त कैमरे का चयन करें (इस प्रणाली एक उच्च संवेदनशीलता sCMOS कैमरा का उपयोग किया).

2. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर

  1. प्रत्येक हार्डवेयर घटक, जैसे माइक्रो-प्रबंधक के स्वतंत्र नियंत्रण की अनुमति देता है एक सॉफ़्टवेयर पैकेज का चयन करें।
    1. कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल बनाना: कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल उपकरणों और निर्देश है कि माइक्रो प्रबंधक सिस्टम के हार्डवेयर को संचालित करने के लिए लोड होगा की एक सहेजी गई सेट है। कोई कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल बनाने के लिए, उपकरण और हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन विज़ार्डक्लिक करें.
      1. चरण 1 में, जारी रखने के लिए नया कॉन्फ़िगरेशन बनाएँ पर क्लिक करें. ध्यान दें कि यदि उपयोगकर्ता पहले से उपलब्ध है, तो मौजूदा कॉन्फ़िगरेशन को संशोधित या एक्सप्लोर करना चुन सकता है.
      2. चरण 2 में, माइक्रो-प्रबंधक, जैसे माइक्रोस्कोप, लैंप, चरण, शटर, और कैमरा के माध्यम से नियंत्रित करने के लिए डिवाइस खोजने के लिए उपलब्ध डिवाइस सूची ब्राउज़ करें। हाइलाइट किए जाने पर, जोड़ें क्लिक करें... स्थापित उपकरणों की सूची में डिवाइस जोड़ने के लिए बटन। यह एक नई विंडो खोलेगा.
        1. लेबल बॉक्स में डिवाइस का लेबल निर्दिष्ट करें. (उदा., sCMOS कैमरा)
        2. मानके अंतर्गत, प्रत्येक डिवाइस के लिए उपयुक्त COM पोर्ट का चयन करें। यह डिवाइस गुणों की एक सूची विंडो के निचले भाग में प्रकट करने के लिए कारण होगा।
        3. डिवाइस गुण उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर छोड़ दें। ध्यान दें कि प्रत्येक डिवाइस गुण के लिए कस्टम मान वांछित के रूप में दर्ज किया जा सकता है।
        4. जब प्रत्येक डिवाइस जोड़ा जाता है, तो अगले चरण पर जारी रखने के लिए अगला बटन क्लिक करें. ध्यान दें कि यदि कोई डिवाइस छोड़ दिया जाता है या परिवर्तित करने की आवश्यकता है, तो कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल चरण 2.1.1.1 में वर्णित के रूप में बाद में संशोधित किया जा सकता है।
      3. चरण 3 में, डिफ़ॉल्ट कैमरा, शटर और फ़ोकस चरण का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें. ऑटो-शटर वांछित है, तो फ़ोकस चरण ड्रॉप-डाउन सूची के नीचे चेक बॉक्स पर क्लिक करें। यदि $-चरण की फोकस दिशा ज्ञात है, तो स्टेज फ़ोकस दिशाओं (उन्नत)के अंतर्गत ड्रॉप-डाउन सूची से उसका चयन करें। अन्यथा, डिफ़ॉल्ट को अज्ञातके रूप में छोड़ दें.
      4. चरण 4 में, विलंब [ms] के अंतर्गत बॉक्स को डबल-क्लिक करें, दीपक, चरण, और शटर के लिए स्वचालित उपकरणों के साथ जुड़े विलंब सेट करने के लिए शीर्षक, और यांत्रिक ट्यूनिंग असेंबली के लिए आदेशों के लिए 250 ms विलंब के लिए खाते में फिल्टर के बीच यांत्रिक स्विचन समय.
      5. चरण 5 में, स्थिति डिवाइस के लिए लेबल असाइन करें. उत्तेजना स्कैनिंग माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए विन्यास प्रत्येक फ्लोरोसेंट फिल्टर घन की पहचान करने के लिए फिल्टर ब्लॉक में लेबल का उपयोग करता है (उदाहरण के लिए, राज्य 0 लेबल उज्ज्वलसे मेल खाती है, खाली फिल्टर घन उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के दौरान इस्तेमाल किया; जबकि राज्य 3 लेबल 495 एनएम और कस्टम 495 एनएम dichroic फिल्टर घन 495 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश अलग करने के लिए इस्तेमाल किया से मेल खाती है। प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए स्विचन आदेश ों स्टोर करने के लिए यांत्रिक ट्यूनिंग असेंबली में भी उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, राज्य 0 यांत्रिक ट्यूनिंग असेंबली के लिए 340 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य ट्यूनिंग आदेश से मेल खाता है)।
      6. चरण 6 में, कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल के लिए कोई स्थान और फ़ाइल नाम चुनने के लिए कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल बॉक्स के आगे ब्राउज़ करें बटन क्लिक करें. कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल सहेजने के लिए समाप्त क्लिक करें.
    2. स्टार्टअप समूह और प्रीसेट: Micro-Manager हार्डवेयर का सबसेट सक्रिय करने या परिवर्तित करने के लिए प्रत्येक कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल में विभिन्न समूहों को संग्रहीत कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक "सिस्टम स्टार्टअप" समूह और प्रीसेट संयोजन डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स जैसे बाइनिंग आकार और कैमरे के लिए readout दरों संग्रहीत करेगा।
      1. समूह उप-खंड में मुख्य विंडो में + क्लिक करके एक समूह (उदा., सिस्टम)बनाएँ.
      2. समूह में किसी भी उपयोग की जाँच करें? समूह के अंदर बक्से जिन्हें सेट करने के लिए डिफ़ॉल्ट मान की आवश्यकता होगी (उदा., संबद्ध डिफ़ॉल्ट कैमरे में binning).
      3. पूर्व निर्धारित उपखंड में मुख्य विंडो में + पर क्लिक करके एक नया पूर्व निर्धारित (उदा., "स्टार्टअप") बनाएँ।
      4. चरण 2 में चेक किया गया प्रत्येक बॉक्स यहाँ एक प्रीसेट विकल्प के रूप में दिखाई देगा. चेक किए गए प्रत्येक बॉक्स के लिए लोड करने के लिए कोई डिफ़ॉल्ट मान चुनें.
    3. उत्तेजित तरंगदैर्ध्य के लिए समूह और presets: माइक्रो प्रबंधक यह अपने स्वयं के तरंगदैर्ध्य स्विचन आदेश के साथ अपने स्वयं के चैनल के रूप में प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य व्यवहार करता है; इसलिए, प्रत्येक अपने स्वयं के पूर्व निर्धारित के रूप में सहेजा जाना चाहिए।
      1. वांछित उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का एक सेट शामिल करने के लिए एक नया समूह बनाएँ (उदा., "495 एनएम dichroic")
      2. समूह में उपयोग करें चेक करें? लेबल VF-5 डिवाइस के संगत नाम बॉक्स.
      3. प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (उदाहरण के लिए, "340 एनएम") के लिए नामित एक नया पूर्व निर्धारित बनाएँ।
      4. प्रत्येक प्रीसेट को उपयुक्त प्रॉपर्टी नाम और प्रीसेट मान असाइन करें (उदा., प्रॉपर्टी का नाम: "लेबल"; प्रीसेट मान: "340 nm").
    4. बहु आयामी अधिग्रहण उपकरण: क्लिक करेंमल्टी-डी एके.एक एकल बटन के क्लिक के साथ प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर नमूने की एक छवि पर कब्जा करने के लिए उपयोग करने के लिए एक अनुकूलन उपकरण खोलने के लिए माइक्रो-प्रबंधक विंडो के ऊपर बाईं ओर. अधिग्रहण का निर्माण करने के लिए कई अनुकूलन विकल्प हैं बिल्कुल वांछित के रूप में.
      1. Timepoints (इस उदाहरण में उपयोग नहीं किया गया): कोई समय चूक घटक के साथ अध्ययन के लिए, बॉक्स अनियंत्रित छोड़ दें। यदि समय चूक अध्ययन वांछित हैं, तो इस बॉक्स को चेक करें। यदि चेक किया गया है, तो शेष प्राप्ति सेटिंग्स को संख्या बॉक्स में निष्पादित करने के लिए समय की संख्या दर्ज करें. अंतराल बॉक्स में अवधि दर्ज करके क्रमिक अधिग्रहण के बीच समय सेट करें और उचित इकाई (मिलीसेकंड, सेकंड, या मिनट; आमतौर पर सेकंड) चुनें.
      2. एकाधिक पदों (XY; इस उदाहरण में इस्तेमाल नहीं किया): एक XY स्थिति के अध्ययन के लिए, बॉक्स अनियंत्रित छोड़ दें। यदि एकाधिक XY स्थितियां वांछित हैं, तो बॉक्स को चेक करें और एक अलग विंडो खोलने के लिए संपादन स्थिति सूची बटन क्लिक करें. प्रत्येक इच्छित स्थान पर मंच ले जाएँ और सॉफ्टवेयर में उस स्थिति को बचाने के लिए मार्क बटन क्लिक करें। सभी वांछित XY पदों के रूप में चिह्नित कर रहे हैं जब तक दोहराएँ। जारी रखने के लिए इस विंडो को बंद करें.
      3. इस उदाहरण में उपयोग नहीं किए गए --स्टैक्स (स्लाइड; इस उदाहरण में उपयोग नहीं किया गया): एकल स्थिति के अध्ययन के लिए, बॉक्स को अनचेक छोड़ दें. यदि एकाधिक $ स्थितिवांछित हैं, तो बॉक्स को चेक करें. चरण को इच्छित शुरुआत स्थिति पर ले जाएँ और $-स्टार्ट बॉक्स के आगे सेट करें बटन क्लिक करें. चरण को इच्छित समाप्त होने वाली स्थिति पर ले जाएँ और $-end बॉक्स के आगे सेट करें बटन क्लिक करें. $-चरण बॉक्स में इच्छित चरण आकार (माइक्रोन में) दर्ज करें.
      4. चैनल: सुनिश्चित करें कि चैनल बॉक्स की जाँच की है. यहाँ, चैनलों व्यक्तिगत उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए दिए गए नाम हैं. उपलब्ध "चैनल" चरण 2.1.2 और 2.1.3 में वर्णित "समूह" के अनुरूप हैं।
        1. समूह: उपलब्ध उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (उदा., 495 एनएम dichroic) का चयन करने के लिए एक समूह का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन सूची पर क्लिक करें।
        2. प्रत्येक चैनल के लिए अधिग्रहण के बीच शटर खुला रखने के लिए शटर खोलें बॉक्स पर क्लिक करें. ध्यान दें कि शटर अभी भी क्रमिक वर्णक्रमीय स्कैन के बीच बंद हो जाएगा अगर इस बॉक्स की जाँच की है, यह मानते हुए autoshutter विकल्प भी मुख्य विंडो में चुना जाता है.
      5. प्राप्ति सूची में चैनल जोड़ने के लिए नया बटन क्लिक करें. ध्यान दें कि निकालें बटन का उपयोग अब वांछित किसी भी चैनल को निकालने के लिए किया जा सकता है और किसी भी चयनित चैनल को पुन: व्यवस्थित करने के लिए ऊपर और नीचे का उपयोग किया जा सकता है.
        1. सुनिश्चित करें कि उपयोग? चेकबॉक्स वर्णक्रमीय स्कैन में प्रत्येक वांछित तरंगदैर्ध्य के लिए चुना गया है।
        2. विन्यास: विन्यास के तहत ड्रॉप-डाउन सूची पर क्लिक करें और वांछित वर्णक्रमीय रेंज (उदा., 340 एनएम) में पहली तरंगदैर्ध्य का चयन करें।
        3. एक्सपोजर: एक्सपोजर के तहत बॉक्स डबल क्लिक करें और चयनित तरंगदैर्ध्य के लिए वांछित जोखिम समय इनपुट (उदाहरण के लिए, "100" 100 एमएस के लिए). उचित प्रदर्शन समय चुनने के लिए सुझावों के लिए अनुभाग 5 ("डेटा प्राप्ति") देखें.
        4. $-ऑफ़सेट (एक वर्णक्रमीय स्कैन में लागू नहीं): इस बॉक्स को रिक्त छोड़ दें (0 पर) वर्णक्रमीय स्कैन करते समय.
        5. $-स्टैक: सुनिश्चित करें कि इस बॉक्स वर्णक्रमीय श्रेणी में प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए जाँच की है अगर एक $-स्टैक प्रदर्शन.
        6. Fr. छोड़ें (एक वर्णक्रमीय स्कैन में लागू नहीं): इस बॉक्स को रिक्त छोड़ दें (0 पर) एक वर्णक्रमीय स्कैन करते समय. ध्यान दें कि यह चुनिंदा घटना है कि एक या कुछ उत्तेजना तरंगदैर्ध्य काफी दूसरों की तुलना में अधिक शक्तिशाली हैं या यदि व्यक्तिगत उत्तेजना तरंगदैर्ध्य विशेष रूप से phototoxic साबित हो में फ्रेम को छोड़ करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
        7. रंग: एक वर्णक्रमीय स्कैन करते समय इस बॉक्स को रिक्त छोड़ दें। ध्यान दें कि रंग डेटा दृश्य प्रयोजनों के लिए अलग-अलग तरंगदैर्ध्य बैंड के लिए चुना जा सकता है, लेकिन रंग बाद में वर्णक्रमीय unmixing के लिए अनुपयुक्त है.
        8. दिए गए वर्णक्रमीय स्कैनिंग रेंज के भीतर प्रत्येक वांछित उत्तेजना तरंगदैर्ध्य जोड़ा जाता है जब तक इन चरणों को दोहराएँ.
      6. प्राप्ति क्रम: यह चुनने के लिए ड्रॉप-डाउन सूची पर क्लिक करें कि उपरोक्त विकल्प (2.1.4.1-2.1.4.5) निष्पादित किए जाएँगे. इस तरह के एक यहाँ दिखाया के रूप में वर्णक्रमीय स्कैन के लिए, अधिग्रहण आदेश बस चैनलहै। ध्यान दें कि अतिरिक्त विकल्प अतिरिक्त बक्से के रूप में दिखाई देते हैं मल्टी-डिमेंशनल अधिग्रहण उपकरण [timepoints, एकाधिक पदों (XY), और [-स्टैक (slices)] के भीतर जाँच की जाती है और या तो स्थिति या समय के चुनाव की अनुमति पहले, या तो टुकड़ा या चैनल.
      7. Autofocus (इस उदाहरण में उपयोग नहीं किया): यदि एकाधिक पदों (XY) का चयन किया जाता है, autofocusing के कई अलग अलग शैलियों उपलब्ध हैं. विकल्प बटन पर क्लिक करें और बंद करें बटन के बगल में ड्रॉप-डाउन सूची से एक autofocus विधि का चयन करें.
      8. सारांश: timepoints की संख्या का एक सारांश के लिए इस विंडो की समीक्षा करें, XY पदों, जेड स्लाइस, चैनल, छवियों की कुल संख्या, कुल स्मृति, स्कैन अवधि, और अधिग्रहण के आदेश सूचीबद्ध जानकारी अपेक्षित अधिग्रहण सेटिंग्स से मेल खाता है सुनिश्चित करने के लिए.
      9. छवियाँ सहेजें: सुनिश्चित करें कि इस बॉक्स को मल्टी-आयाम अधिग्रहण उपकरण के उपयोग के माध्यम से एकत्रित डेटा को सहेजने के लिए चेक किया गया है.
        1. क्लिक करें ... निर्देशिका रूट के बगल में बटन एक निर्देशिका रूट जिसमें फ़ाइलों को सहेजा जाएगा का चयन करने के लिए। प्रयोग के प्रासंगिक विवरण का वर्णन करता है कि एक फैशन में निर्देशिका रूट नाम (उदाहरण के लिए, GCaMP Airway चिकना मांसपेशी कोशिकाओं).
        2. वर्तमान छवि प्राप्ति का वर्णन करने वाले नाम उपसर्ग के बगल में स्थित बॉक्स में कोई नाम दर्ज करें (उदा. FOV1]100ms]60X]495nmDichroicFilter). यह एक नाम उपसर्ग है कि देखने और जोखिम समय की क्षेत्र की पहचान करता है, साथ ही इस तरह के वस्तु और dichroic फिल्टर के रूप में अन्य प्रासंगिक जानकारी का इस्तेमाल किया बनाने के लिए सलाह दी जाती है. ध्यान दें कि इन सेटिंग्स का उपयोग करके लिया गया पहला चित्र स्टैक नाम उपसर्ग के बाद "$1" के साथ सहेजा जाएगा. एक ही निर्देशिका रूट और नाम उपसर्ग के साथ लिया गया कोई भी अनुवर्ती स्टैक "$n" के साथ सहेजा जाएगा, जिसमें "n" निर्देशिका में इस नाम के साथ स्टैक लिया गया है समय की संख्या है।
        3. प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर उत्पन्न छवि को सहेजा गया है यह सुनिश्चित करने के लिए छवि फ़ाइलों को अलग करें क्लिक करें।
      10. इस रूप में सहेजें: आसान भविष्य के उपयोग के लिए इन अधिग्रहण सेटिंग्स को बचाने के लिए मल्टी-डिमेंशनल अधिग्रहण उपकरण के शीर्ष दाईं ओर के पास इस रूप में सहेजें बटन पर क्लिक करें। ध्यान दें कि निर्देशिका रूट और नाम उपसर्गों, के रूप में अच्छी तरह से सहेजा जाएगा.
      11. अधिग्रहण: अंत में, प्राप्त करें क्लिक करें! बटन ऊपर चुना अधिग्रहण सेटिंग्स के अनुसार छवियों को प्राप्त करने शुरू करने के लिए।

3. स्पेक्ट्रल प्रतिक्रिया सुधार (वैकल्पिक):

  1. स्पेक्ट्रल आउटपुट सुधार सिस्टम की वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया को एक ज्ञात मानक, जैसे NIST-ट्रेसेबल लैंप या अन्य NIST-ट्रेसेबल मानक या उपकरण के लिए जांचना करने के लिए किया जा सकता है। यह कदम विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर परिणाम अन्य वर्णक्रमीय इमेजिंग उपकरणों के साथ तुलना कर रहे हैं, स्पेक्ट्रोमीटर, या विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच. इस प्रक्रिया की विस्तार सेरिपोर्टकी गई है 21,23.
    1. एक NIST-ट्रेसेबल प्रकाश स्रोत (जैसे LS-1-CAL-INT, महासागर प्रकाशिकी) या अन्य NIST-ट्रेसेबल मानक के लिए calibrated एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें के रूप में नमूना चरण में मापा रोशनी की स्पेक्ट्रोरेडियोमीट्रिक शक्ति प्राप्त करने के लिए. प्रकाश स्रोत सेटिंग, dichroic दर्पण, और उद्देश्य के प्रत्येक संयोजन के लिए एक अलग सुधार प्रदर्शन करते हैं। सही माइक्रोस्कोप उद्देश्य से चौड़े कोण रोशनी को मापने के लिए स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित एक एकीकृत क्षेत्र का प्रयोग करें।
    2. प्रकाशित तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोरेडियोमीट्रिक डेटा को एकीकृत करने के लिए, trapezoidal नियम के रूप में एक एकीकरण विधि, का उपयोग करें। केंद्र तरंगदैर्ध्य के आसपास केंद्रित एकीकरण के लिए एक 40 एनएम बैंडविड्थ आधे अधिकतम (FWHM) पर 14-20 एनएम पूर्ण चौड़ाई के बीच की एक नाममात्र बैंडविड्थ है कि सबसे फिल्टर के लिए पर्याप्त है. एकीकृत मान प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य बैंड पर वर्णक्रमीय रोशनी की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है.
    3. वर्णक्रमीय रोशनी तीव्रता प्रोफ़ाइल के दृश्य की अनुमति देने के लिए उत्तेजना केंद्र तरंगदैर्ध्य के एक समारोह के रूप में प्रत्येक तरंगदैर्ध्य बैंड की एकीकृत तीव्रता प्लॉट.
    4. सबसे कम एकीकृत तीव्रता के साथ तरंगदैर्ध्य बैंड का निर्धारण.
    5. तरंगदैर्ध्य-निर्भर सुधार कारक उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक तरंगदैर्ध्य बैंड की एकीकृत तीव्रता द्वारा सबसे कम एकीकृत तीव्रता को विभाजित करके वर्णक्रमीय रोशनी तीव्रता प्रोफ़ाइल को सामान्य करें।

4. नमूना तैयारी

  1. एक "रिक्त" नमूना तैयार करें (उदा., सेल चैम्बर में एक ग्लास कवरस्लिप रखें और बफर के 1 एमएल जोड़ें)। इस बफ़र को पहले24बताया जा चुका है.
  2. किसी भी नमूना autofluorence निर्धारित करने के लिए एक unlabeled नमूना तैयार (उदा.,एक गिलास coverslip जगह unlabeled airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 25,26 सेल कक्ष में और बफर के 1 एमएल जोड़ें).
  3. प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल के लिए एक अलग, एकल-लेबल वाला नमूना निम्नानुसार तैयार करें:
    1. एक 100 एनएम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए बफर करने के लिए पतला mitochondrial लेबल जोड़ें. एयरवे चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से युक्त कवरस्लिप में यह बफर जोड़ें। 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट। कवरस्लिप को कक्ष में ले जाएँ और 1 एमएल बफ़र जोड़ें. ध्यान दें कि mitochondrial लेबल के इष्टतम एकाग्रता निर्माता जैसे कारकों द्वारा अलग अलग होंगे, जुड़े रंग, और वांछित विशिष्टता.
    2. एक कवरस्लिप जिसमें एयरवे चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को ले जाएँ, जीकेएमपी जांच27 के साथ सेल चैम्बर में ट्रांसफेक किया गया है और बफर के 1 एमएल जोड़ें।
  4. वांछित फ्लोरोसेंट लेबल का एक मिश्रण युक्त एक या एक से अधिक प्रयोगात्मक नमूने तैयार करें.
    1. बफर के 1 एमएल जोड़ें (100 एनएम mitochondrial लेबल की एकाग्रता) एक coverslip युक्त airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं GCaMP जांच के साथ transfected और 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट. कवरस्लिप को कक्ष में ले जाएँ और 1 एमएल बफ़र जोड़ें.

5. डेटा अधिग्रहण:

  1. उचित dichroic बीमस्प्लिटर (उदा., 495 एनएम dichroic फिल्टर घन), उद्देश्य (उदा., 60x पानी उद्देश्य), और कैमरा (sCMOS कैमरा) का चयन कर रहे हैं कि जाँच करें।
  2. मंच पर नमूना लोड करें।
  3. एक्सपोजर [ms] के बगल में बॉक्स को डबल-क्लिक करें और 100 ms. नोट पर जोखिम समय सेट करने के लिए "100" लिखें कि नमूने की फ्लोरोसेंट तीव्रता के आधार पर जोखिम समय को बढ़ाने या कम करने की आवश्यकता हो सकती है.
  4. प्रारंभिक नमूना देखने के लिए माइक्रो-प्रबंधक मुख्य विंडो के ड्रॉप-डाउन मेनू से 475 एनएम का चयन करें। ध्यान दें कि 475 एनएम नमूना देखने या निर्धारित करने के लिए इष्टतम तरंगदैर्ध्य नहीं हो सकता है कि oversaturation छवि ढेर भर में हो जाएगा.
  5. नमूना देखने के लिए लाइव पर क्लिक करें.
    1. सार्थक दृश्य श्रेणियों में न्यूनतम और अधिकतम मान लाने के लिए विंडो के निचले भाग पर हिस्टोग्राम के आगे स्वचालित तीव्रता देखने वाले श्रेणी बटन ऑटो पर क्लिक करें.
  6. नमूने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप के ध्यान knobs का प्रयोग करें. यह अक्सर ध्यान केंद्रित करने में सहायता करने के लिए नमूना के किनारे खोजने के लिए उपयोगी है. नमूना ध्यान केंद्रित किया जाएगा जब छवि में बढ़त सुविधाओं तेज दिखाई देते हैं. ध्यान दें कि यह फ्लोरोसेंट छवि को देखने में सहायता करने के लिए ध्यान केंद्रित करने के दौरान ऑटो बटन कई बार क्लिक करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अतिरिक्त, कुछ उपयोगकर्ताओं को यह आसान नमूना पर ध्यान केंद्रित करने के लिए मिल सकता है अगर माइक्रोस्कोप संचरण मोड में है.
    1. यदि संचरण मोड में ध्यान केंद्रित, सुरक्षा के लिए, पहले सुनिश्चित करें कि वर्णक्रमीय प्रकाश स्रोत संचरण इमेजिंग के लिए प्रकाश पथ का समायोजन करने से पहले eyepieces के लिए प्रकाश संचारण नहीं है. यह भी ध्यान दें कि संचरण और फ्लोरोसेंट छवियों के फोकस के बीच छोटे विचलन हो सकता है. जब स्वीकार्य ध्यान प्राप्त किया गया है, वर्णक्रमीय फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए प्रकाश पथ पुनः कॉन्फ़िगर.
  7. क्लिक करें मल्टी-डी एकेक्यू. बहु-आयाम प्राप्ति उपकरण खोलने के लिए विंडो के ऊपर बाईं ओर बटन (वर्णित और अनुभाग 2 में कॉन्फ़िगर किया गया)
  8. वर्णक्रमीय अधिग्रहण के लिए एक उपयुक्त वर्णक्रमीय रेंज चुनें (उदाहरण के लिए, 360-485 एनएम 495 एनएम dichroic फिल्टर के लिए) लोड पर क्लिक करके ... पहले बचाया (चरण 2.1.4.10 में). उपयुक्त वर्णक्रमीय पर्वतमाला के बारे में जानकारी के लिए चर्चा देखें.
  9. पृष्ठभूमि/रिक्त छवि प्राप्त करें जिसमें पृष्ठभूमि और शोर घटाव के लिए उपयोग करने के लिए कोई फ्लोरोसेंट डेटा नहीं है. यह एक रिक्त नमूना (चरण 4.1) का उपयोग कर या एक प्रयोगात्मक नमूने के एक रिक्त क्षेत्र पर नेविगेट करके किया जा सकता है. के रूप में कदम 5.6 में वर्णित है, यह सबसे आसानी से नमूना के किनारे तो यह स्थिति इतनी है कि बढ़त को देखने के क्षेत्र के भीतर केंद्रित है खोजने के द्वारा हासिल की है.
    1. एक बार अधिग्रहण सेटिंग्स की पुष्टि कर रहे हैं और एक पृष्ठभूमि क्षेत्र दिखाई दे रहा है, एक वर्णक्रमीय छवि ढेर पृष्ठभूमि और शोर युक्त प्राप्त करने के लिए बाद में घटाव के लिए उपयोग करने के लिए प्राप्त करें बटन क्लिक करें. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नमूनों में नमूने के किनारे से अधिक तीव्र फ्लोरोसेंट होने की संभावना है। यह नमूना के बारे में स्थानांतरित करने के लिए सलाह दी जा सकती है "सबसे तेज" क्षेत्रों को खोजने के लिए और कई परीक्षण छवि ढेर प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त अधिग्रहण समय निर्धारित करते हैं और overexposure से बचने के.
  10. नमूना है कि तीव्र फ्लोरोसेंट के लिए प्रतीत होता है के एक क्षेत्र पर एक छवि ढेर ले लो यह सुनिश्चित करने के लिए कि तरंगदैर्ध्य का कोई संयोजन और कि जोखिम बार overexposure में परिणाम.
  11. ImageJ का उपयोग करने के लिए पुष्टि करें कि कोई तरंगदैर्ध्य overexposed पिक्सेल होते हैं.
    1. ImageJ में, क्लिक करें फ़ाइल gt; आयात gt; छवि अनुक्रम और चरण 5.10 में लिया वर्णक्रमीय छवियों युक्त फ़ोल्डर में नेविगेट. यह एक नई विंडो खोलेगा. छवियों की संख्या के आगे बॉक्स पर क्लिक करें और वर्णक्रमीय स्कैन में शामिल तरंगदैर्ध्य की संख्या दर्ज करें (उदा., 26). छवि शुरू छोड़ दो और "1" के रूप में वृद्धि. जारी रखने के लिए ठीक बटन क्लिक करें.
    2. ImageJ के उपाय समारोह का उपयोग करने के लिए कीबोर्ड पर एम दबाएँ. सुनिश्चित करें कि अधिकतम के तहत सूचीबद्ध संख्या कैमरे की ऊपरी पहचान सीमा (उदा., 65,535) नहीं है. वर्णक्रमीय स्कैन में प्रत्येक छवि के लिए दोहराएँ. ध्यान दें कि कैमरे का पता लगाने की सीमा कैमरे पर ही निर्भर करता है. ऊपरी सीमा MicroManager की मुख्य विंडो में हिस्टोग्राम के ऊपरी दाएँ भाग पर प्रदर्शित किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, ऊपरी सीमा ImageJ में एक छवि खोलने और छवि के लिए नेविगेट करके निर्धारित किया जा सकता है gt; समायोजित करें और चमक / परिणामी पॉप-अप विंडो में सेट करें बटन क्लिक करें, अधिकतम प्रदर्शित मानके बगल वाले रिक्त स्थान में एक अत्यधिक बड़ा मान (उदा., 999,999) दर्ज करें, और जारी रखने के लिए ठीक क्लिक करें. नए हिस्टोग्राम में प्रदर्शित अधिकतम मान कैमरे की ऊपरी पहचान सीमा होनी चाहिए.
    3. यदि किसी भी छवियों कैमरे के ऊपरी पता लगाने की सीमा निहित (जैसे, 65,535), वर्णक्रमीय स्कैन के जोखिम समय समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि वर्णक्रमीय रेंज भर में अधिकतम संकेत कैमरे के गतिशील रेंज से अधिक नहीं है.
  12. किसी भी autofluorence निर्धारित करने के लिए unlabeled नमूनों से वर्णक्रमीय छवि डेटा प्राप्त करें। प्रयोग के शेष के रूप में एक समान तरंगदैर्ध्य रेंज और कैमरा सेटिंग्स का उपयोग कर unlabeled नमूनों के लिए स्कैन प्राप्त (उदाहरण के लिए, 360-485 एनएम 100 एमएस प्रति तरंगदैर्ध्य पर).
  13. वर्णक्रमीय पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए वर्णक्रमीय नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए एकल लेबल नमूनों से वर्णक्रमीय छवि डेटा प्राप्त करें। एक समान तरंगदैर्ध्य रेंज, जोखिम समय, और कैमरा सेटिंग्स का उपयोग कर प्रत्येक लेबल के लिए स्कैन प्रदर्शन. ध्यान दें कि एक लंबे समय तक अधिग्रहण समय कुछ नमूनों के लिए न्यूनतम शोर योगदान के साथ सटीक लेबल स्पेक्ट्रम का पता लगाने की अनुमति के लिए आवश्यक हो सकता है.
  14. एक प्रयोगात्मक नमूना पर माप प्रदर्शन (उदाहरण के लिए, मानव airway GCaMP जांच और mitochondrial लेबल के साथ चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं).
    1. माइक्रोस्कोप पर प्रयोगात्मक नमूने वाली स्लाइड या कवरस्लिप रखें।
    2. ऊतकों के उचित लेबल कोशिकाओं के साथ देखने के एक क्षेत्र का चयन करें।
    3. ऊपर वर्णित के रूप में वांछित अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग कर वर्णक्रमीय छवि डेटा प्राप्त करें.

6. छवि विश्लेषण

  1. एक फ्लैट वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया करने के लिए छवियों को सही.
    1. अनुभाग 5.9 में प्राप्त पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम को घटाएँ और अनुभाग 3.1.5 में निर्धारित सुधार गुणांक से गुणा करें। यह एक साधारण MATLAB स्क्रिप्ट या ImageJ दिनचर्या के साथ किया जा सकता है. एक घटाव / सुधार MATLAB कोड (इस उदाहरण में इस्तेमाल किया) दक्षिण अलबामा Bioimaging संसाधन वेबसाइट पर उपलब्ध है.
      1. MATLAB में घटाव/सुधार कोड लोड करें।
      2. संपादक टैब में, चलाएँक्लिक करें. यह एक नई विंडो खोल देगा जिसमें एक BSQ Correction बटन होगा. निर्देशिका, पृष्ठभूमि फ़ाइल, सुधार कारक फ़ाइल, और गलत tiff फ़ोल्डर के लिए विकल्प युक्त एक और विंडो खोलने के लिए BSQ Correction बटन क्लिक करें।
        1. ब्राउज़ करें का उपयोग करें... कार्य निर्देशिका के बगल में बटन फ़ाइल पथ जहां बाद में खिड़कियां खुल जाएगा चुनने के लिए. सहेजे गए पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम वाले फ़ोल्डर पर नेविगेट करें (.dat स्वरूप में).
        2. ब्राउज़ करें का उपयोग करें... पृष्ठभूमि फ़ाइल (.dat) के बगल में बटन चरण 6.1.1.2.1 में चुना निर्देशिका खोलने के लिए और वांछित पृष्ठभूमि फ़ाइल (.dat प्रारूप में) का चयन करने के लिए। जारी रखने के लिए खोलें बटन क्लिक करें.
        3. सुधार कारक चुनने के लिए सुधार कारक (.dat) के पास ब्राउज़ करें... बटन का उपयोग करें. पैरेंट MATLAB कोड के स्थान के लिए सुधार कारक डिफ़ॉल्ट के लिए निर्देशिका। यदि आवश्यक हो, तो सुधार कारक फ़ाइल (.dat स्वरूप में) वाले सबफ़ोल्डर पर नेविगेट करें. उचित सुधार कारक फ़ाइल हाइलाइट करें और जारी रखने के लिए खोलें बटन क्लिक करें.
        4. चरण 6.1.1.2.1 में चुना निर्देशिका खोलने के लिए और पृष्ठभूमि घटाव और छवि सुधार के लिए फ़ोल्डर का चयन करने के लिए ठीक किया Tiff फ़ोल्डर के बगल में ब्राउज़ करें... बटन का उपयोग करें (यह आमतौर पर Pos0 फ़ोल्डर है कि तुरंत कच्चे शामिल है वर्णक्रमीय छवियों). जारी रखने के लिए खोलें बटन क्लिक करें.
        5. स्पेक्ट्रल सुधार बटन के लिए क्लिक करें क्लिक करें. प्रसंस्करण पूरा होने के बाद, एक विंडो संदेश के साथ खुल जाएगा "BsQ Correction Complete". जारी रखने के लिए ठीक बटन क्लिक करें. सुधार छवियों को मूल अपरिष्कृत वर्णक्रमीय छवि फ़ोल्डर और एक अतिरिक्त "$Corrected" (उदा., Pos0]Corrected) के साथ नामित एक नया फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जाता है।
  2. वर्णक्रमीय पुस्तकालय उत्पन्न करें। कई सॉफ्टवेयर संकुल ImageJ सहित छवियों से वर्णक्रमीय डेटा निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, निर्धारित जो तरंगदैर्ध्य बैंड सबसे तीव्र मूल्य है और उस अधिकतम मूल्य से प्रत्येक तरंगदैर्ध्य बैंड पर माप विभाजित द्वारा सबसे बड़ी तीव्रता की तरंगदैर्ध्य बैंड के लिए प्रत्येक endmember सामान्यीकरण. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऑटोफ्लोरेसेंट नमूनों के भीतर उत्पन्न एकल लेबल नियंत्रणों को अतिरिक्त संशोधनों की आवश्यकता होगी28,29,30,31,32. चरण 6.2.4 देखें और विवरण के लिए चर्चा करें.
    1. ImageJ में, क्लिक करें फ़ाइल gt; आयात gt; छवि अनुक्रम| यह एक नई विंडो खोलेगा. सही वर्णक्रमीय छवियों वाले फ़ोल्डर पर नेविगेट करें. नई विंडो खोलने के लिए फ़ोल्डर में किसी भी छवि फ़ाइल को डबल-क्लिक करें. छवियों की संख्या के आगे बॉक्स पर क्लिक करें और वर्णक्रमीय स्कैन में शामिल तरंगदैर्ध्य की संख्या दर्ज करें (उदा., 26). छवि शुरू छोड़ दो और "1" के रूप में वृद्धि. जारी रखने के लिए ठीक बटन क्लिक करें.
    2. ImageJ मुख्य विंडो में, बहुभुज चयन चिह्न क्लिक करें, फिर प्रतिस्पद डेटा वाले क्षेत्र के आस-पास बहुभुज बनाने के लिए छवि पर क्लिक करके माउस सूचक का उपयोग करें. ध्यान दें कि प्रारंभिक तरंगदैर्ध्य में कोई फ्लोरोसेंट डेटा के लिए कम हो सकता है. ब्याज की फ्लोरोसेंट डेटा वाले क्षेत्रों को बेहतर ढंग से विज़ुअलाइज़ करने के लिए किसी अन्य तरंगदैर्ध्य छवि और/या का उपयोग चमक/कंट्रास्ट उपकरण (छविऔर समायोजित करें )पर नेविगेट करें।
    3. बहुभुज तैयार के साथ, छवि पर क्लिक करके $-अक्ष प्रोफ़ाइल उत्पन्न करें ] gt; स्टैक ]gt; प्लॉट जेड-अक्ष प्रोफ़ाइल। यह एक नई विंडो खोलेगा. .csv फ़ाइल के रूप में वर्णक्रमीय डेटा सहेजने के लिए सहेजें क्लिक करें.
    4. शुद्ध लेबल autofluorscence संदूषण से रहित के साथ एक उचित वर्णक्रमीय पुस्तकालय सुनिश्चित करने के लिए एक घटाव प्रदर्शन. किसी एकल-लेबल और फ्लोरोसेंट के मिश्रण से शुद्ध स्पेक्ट्रम को अलग करने के लिए निम्न समीकरण29 का उपयोग करें:
      Equation 1(1)
      कहाँ: एसशुद्ध लेबल के शुद्ध स्पेक्ट्रम है, एसमिश्रित autofluorscence के साथ दूषित नमूना के मापा स्पेक्ट्रम है, S autoFLa मापा autofluorscence स्पेक्ट्रम है, "एक" एक अदिश है ऑटोफ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम का गुणक (0 और 1 के बीच; उदा., 0.4), और "ऑफ़सेट" एक ऑफसेट (आमतौर पर 0) है। एक के पास शून्य मूल्य autofluorscence के स्पष्ट योगदान के लिए हासिल की है जब तक "एक" शब्द भिन्न. अतिरिक्त जानकारी कई प्रकाशनों28,29,30,31,32में पाई जा सकती है .
  3. वर्णक्रमीय छवि डेटा को अमिश्रण करें. unmixing कदम प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल, जहां बहुतायत संबंधित लेबल से छवि में रिश्तेदार फ्लोरोसेंट संकेत की राशि है के लिए एक बहुतायत छवि उत्पन्न करेगा. कई unmixing एल्गोरिदम ImageJ33,34,35के साथ उपयोग के लिए उपलब्ध हैं . इसके अतिरिक्त, एक वर्णक्रमीय unmixing MATLAB कोड (इस उदाहरण में इस्तेमाल किया) दक्षिण अलबामा Bioimaging संसाधन वेबसाइट के विश्वविद्यालय पर उपलब्ध है. वर्णक्रमीय मिश्रण का एक अधिक व्यापक अवलोकन उपलब्ध है36.
    1. MATLAB में वर्णक्रमीय unmixing कोड लोड करें।
    2. प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुरूप करने के लिए वेवलेंथ.मैट और Library.mat फ़ाइलों को संपादित करें (उदा., "वेवलेंथ" के रूप में 360-485 पांच की वेतन वृद्धि में).
      नोट: उन तरंगदैर्ध्य के लिए इसी मान में लोड किया जाना चाहिए "पुस्तकालय" प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल के लिए (और autofluorscence). Endmember]Name को लेबल्स को "लाइब्रेरी" के स्तंभ मानों के समान क्रम में सूचीबद्ध करना चाहिए. ध्यान दें कि Library.mat फ़ाइल में "लाइब्रेरी" और "Endmember]Name" चर होना चाहिए.
    3. संपादक टैब में, चलाएँक्लिक करें. यह उपयोगकर्ता एक निर्देशिका का चयन करने की अनुमति एक नई विंडो खुल जाएगा. वर्णक्रमीय छवियों को मिश्रित किया जा करने के लिए युक्त फ़ोल्डर पर नेविगेट करें। एक बार चयनित, यह एक नई विंडो खुल जाएगा.
    4. परिणामी रिक्त स्थानमें, छवि नाम दर्ज करें (उदाहरण के लिए, GCaMP और Mito FOV1 के साथ HASMC), तरंगदैर्ध्य बैंड की संख्या (उदाहरण के लिए, 26), timepoints की संख्या (उदाहरण के लिए, 1) और क्या एक FRET माप वांछित है (उदाहरण के लिए, n) उनके संबंधित रिक्त स्थान में. FRET के लिए "n" चयनित है, तो दोनों अंतिम सदस्य रिक्त स्थान खाली छोड़ दें। जारी रखने के लिए ठीक दबाएँ, जो एक नई विंडो खोलेगा.
    5. वेवलेंथ.मैट फ़ाइल वाले फ़ोल्डर के लिए Naviagate. एक बार चयनित होने पर, जारी रखने के लिए खोलें क्लिक करें, जो एक नई विंडो खोलेगा.
    6. Library.mat फ़ाइल वाले फ़ोल्डर पर नेविगेट करें. एक बार चयनित, जारी रखने के लिए खोलें क्लिक करें, जो वर्णक्रमीय छवियों वाली निर्देशिका के अंदर एक नया "अमिश्रित" फ़ोल्डर में अमिश्रित छवियों को बचाएगा।
  4. गुणवत्ता के लिए अमिश्रित वर्णक्रमीय छवियों का निरीक्षण करें।
    1. प्रत्येक unmixed छवि नेत्रहीन शुद्ध घटकों के वितरण का निरीक्षण करने के लिए खोलें।
      1. अमिश्रित छवियों के उन लोगों के लिए त्रुटि छवि के परिमाण की तुलना करें (चरण 5.11 के समान, यह ImageJ के उपाय समारोह के माध्यम से किया जा सकता है). यदि त्रुटि छवि का परिमाण अमिश्रित बहुतायत छवियों के परिमाण में समान है, तो यह संभावना है कि वर्णक्रमीय छवि डेटा में संकेत हैं जो वर्णक्रमीय पुस्तकालय और रैखिक वर्णक्रमीय अनमिक्स प्रक्रिया द्वारा सही रूप से हिसाब नहीं कर रहे हैं।
      2. त्रुटि छवि की तुलना अमिश्रित छवियों से करें ताकि यह पता चल सके कि अज्ञात अवशिष्ट संरचनाएँ हैं या नहीं.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल से कई महत्वपूर्ण कदम डेटा है कि दोनों सटीक और इमेजिंग और वर्णक्रमीय कलाकृतियों से रहित है के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं. इन चरणों को छोड़ने के परिणामस्वरूप वह डेटा हो सकता है जो महत्वपूर्ण दिखाई देता है लेकिन उसे सत्यापित नहीं किया जा सकता है या किसी अन्य वर्णक्रमीय इमेजिंग सिस्टम के साथ पुनरुत्पादित नहीं किया जा सकता है, जिससे उक्त डेटा के साथ किए गए किसी भी निष्कर्ष को प्रभावी रूप से निरस्त कर दिया जा सकता है. इन महत्वपूर्ण चरणों में मुख्य उचित वर्णक्रमीय उत्पादन सुधार (धारा 3) है। सुधार कारक टूनाबल उत्तेजना प्रणाली के वर्णक्रमीय आउटपुट में तरंगदैर्घ्य-निर्भर विविधताओं के लिए क्षतिपूर्ति करता है। यह उच्च शक्ति उत्तेजना के साथ तरंगदैर्ध्य स्केलिंग इस तरह है कि ऑप्टिकल रोशनी शक्ति एक कम शक्ति उत्तेजना के साथ तरंगदैर्ध्य के लिए तुलनीय है, एक फ्लैट वर्णक्रमीय उत्तेजना प्रोफ़ाइल को प्राप्त करने के द्वारा पूरा किया है. एक अनुचित सुधार कारक का एक उदाहरण है कि बहुत कम मान शामिल है (उदाहरण के लिए, और lt;0.001) एक या अधिक तरंगदैर्ध्य पर, यह दर्शाता है कि तीव्रता मान उन तरंगदैर्ध्य पर मापा बहुत एक फ्लैट वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए क्षीण किया जाना चाहिए.

NIST-ट्रेसकरनेयोग्य मानक के लिए सिस्टम का अंशांकन यह सुनिश्चित करता है कि उत्तेजना-स्कैनिंग वर्णक्रमीय इमेजिंग सिस्टम के साथ एकत्रित डेटा भी NIST-ट्रेसकरनेयोग्य मानकों के लिए अंशांकित अन्य प्रणालियों के बराबर है। इसलिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि कोई भी सुधार कारक एकत्र किए गए डेटा को उचित रूप से समायोजित करे। सुधार कारक की शुद्धता को फ्लोरोसेंट मानक के उपयोग के साथ सत्यापित किया जा सकता है, जैसे NIST-ट्रेसेबल फ्लोरोरेसिन. चित्र 1 एक उपयुक्त और अनुपयुक्त सुधार कारक को दिखाता है, जिसे ग्राफ़िकल और छवि डेटा के माध्यम से विज़ुअलाइज़ किया गया है. इस स्थिति में, 340 दउ पर वर्णक्रमीय निर्गत वर्णक्रमीय श्रेणी के शेष की तुलना में लगभग न के बराबर था, जिसके परिणामस्वरूप लगभग प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए लगभग शून्य ([lt;001) मान होता है। छवि स्टैक करने के लिए लागू, यह सबसे पिक्सेल के लिए छवि स्टैक के अधिकांश के माध्यम से लगभग शून्य मान में परिणाम है।

के रूप में अनुभाग 5 में कहा गया है, उत्तेजना रेंज, चयनित फ्लोरोफोर, और अधिग्रहण सेटिंग्स संभावित है कि एक या कई उत्तेजना तरंगदैर्ध्य छवि बैंड oversaturated पिक्सल होते बना सकते हैं. चित्र 2 एक उदाहरण दिखाता है जिसमें जोखिम समय उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के कई के लिए बहुत लंबा सेट किया गया था, बाद में छवियों oversaturated पिक्सल को शामिल करने के लिए कारण. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि, जैसा कि आंकड़ा दिखाता है, दोनों व्यक्तिगत छवियों और झूठे रंग की छवियों नेत्रहीन स्वीकार्य तीव्रता पर्वतमाला के भीतर होने के लिए प्रकट हो सकता है.

घटाव के लिए एक पृष्ठभूमि क्षेत्र के उपयुक्त चयन भी सिस्टम के बीच डेटा तुलना के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह कैमरा शोर या आवारा प्रकाश के तत्वों को हटा NIST-traceable वर्णक्रमीय सुधार से पहले (चित्र3) . यह छवि के भीतर वर्णक्रमीय सुविधाओं कल्पना करने के क्रम में वर्णक्रमीय छवि ढेर के एक आरजीबी झूठे रंग की छवि उत्पन्न करने के लिए बाद में छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण चरणों के लिए अक्सर उपयोगी है. चित्र 4 तीन चयनित तरंगदैर्ध्य बैंड (370 एनएम - नीले, 420 एनएम - हरे, 470 एनएम ] लाल विलय द्वारा उत्पन्न एक आरजीबी झूठे रंग की छवि से पता चलता है।

स्पेक्ट्रल unmixing प्रत्येक व्यक्ति फ्लोरोसेंट स्रोत के वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल के ज्ञान की आवश्यकता है. उत्तेजना-स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग के मामले में, यह प्रत्येक फ्लोरोफोर (और autofluorscence) के लिए वर्णक्रमीय छवि ढेर प्राप्त करके किया जाता है. चित्र 5 एक वर्णक्रमीय लायब्रेरी जनरेट करने के लिए एकल-लेबल नियंत्रणों से क्षेत्रों को चुनने के लिए एक उदाहरण के रूप में शामिल किया गया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रत्येक माप अपने चरम तरंगदैर्ध्य के लिए सामान्यीकृत किया गया है.

जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, वर्णक्रमीय unmixing प्रक्रिया प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल से संबंधित योगदान में एक वर्णक्रमीय छवि ढेर के जुदाई की अनुमति देता है. चित्र ााला 6 एक उदाहरण अमिश्रित वर्णक्रमीय छवि सेट दिखाता है, जिसमें निम्नलिखित संकेतों में से प्रत्येक के लिए अलग-अलग छवियों के साथ: एयरवे चिकनी मांसपेशी सेल ऑटोफ्लोरेसेंस, एक जीकेएमपी जांच, और एक माइटोकोंड्रियाल लेबल। वर्णक्रमीय unmixing के साथ जुड़े त्रुटि भी दिखाया गया है और unmixed संकेतों के उन लोगों के लिए त्रुटि की तीव्रता के स्तर की तुलना करने के लिए जांच की जा सकती है. इस त्रुटि की गणना औरव्याख्या पर पहले 37 चर्चा की जा चुकी है। जैसा कि चित्र 6में दर्शाया गया है, कोशिकाओं के नाभिकीय और परीनाभिक क्षेत्रों से संबंधित उच्च त्रुटि है, जो यह दर्शाती है कि उन क्षेत्रों के मापे गए स्पेक्ट्रम को स्पेक्ट्रम द्वारा स्पेक्ट्रम द्वारा वर्णक्रमीय पुस्तकालय में अच्छी तरह से नहीं दर्शाया गया है। त्रुटि का एक संभावित स्रोत हो सकता है कि GCaMP और mitochondrial लेबल के लिए एकल लेबल नियंत्रण airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का उपयोग कर तैयार किए गए थे, जो एक उच्च देशी autofluorscence है. इसलिए, GCaMP और mitochondrial लेबल शुद्ध endmember स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है. इसके अलावा, autofluorscence संकेत एक तरीका है कि ठीक से के लिए जिम्मेदार नहीं था में दो अन्य लेबल के लिए पुस्तकालय spectra प्रभावित कर सकते हैं, एक कम सटीक फिटिंग में जिसके परिणामस्वरूप अगर लेबल थोड़ा के साथ एक सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त किया गया था की तुलना में कोई स्वपुष्पन। इसके अतिरिक्त, उदाहरण तब शामिल किए जाते हैं जब किसी वर्णक्रमीय लाइब्रेरी के बहुत कम या बहुत अधिक घटक उपलब्ध होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप वर्णक्रमीय छवि डेटा का अंडरफिटिंग और अधिक उपयुक्त होता है (चित्र6, चित्र 7, चित्र 8, चित्र 9, और तालिका 1) ) .

के रूप में अनुभाग में उल्लेख किया 6.2 और विशेष रूप से कदम 6.2.4, "शुद्ध" स्पेक्ट्रम लेबल कोशिकाओं है कि भी autofluorcent हैं से एकत्र की संभावना शुद्ध घटक के लिए वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल दूषित होगा. इस प्रकार, ध्यान उनके autofluorescent मेजबान से ब्याज के लेबल के शुद्ध स्पेक्ट्रम को अलग करने के लिए लिया जाना चाहिए. चित्र 10 में वर्णित विधि द्वारा परिकलित शुद्ध स्पेक्ट्रम के साथ स्वतः प्रवाहीयता (मिश्रित) बनाम शुद्ध स्पेक्ट्रम के साथ मिश्रित "शुद्ध" स्पेक्ट्रम के साथ मिश्रण का अंतर दर्शाता है। अंतर मुख्य रूप से ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल को मिलाने में होता है। उचित संकेत जुदाई के बिना (उदाहरण के लिए, GCaMP स्पेक्ट्रम से autofluorscence संदूषण के घटाव), autofluorscence और GCaMP पुस्तकालय घटकप्रत्येक पिक्सेल में एक ही वर्णक्रमीय डेटा के लिए प्रतिस्पर्धा, विशेषता छेद या काले धब्बे में जिसके परिणामस्वरूप ऑटोफ्लोरेंस ी छवि में.

Figure 1
चित्र 1 : अनुचित और उचित सुधार कारकों के उदाहरण अनुप्रयोगों के लिए एक फ्लैट वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया करने के लिए छवियों को सही करने के लिए इस्तेमाल किया. (ए) प्लॉट किए गए अनुचित और उचित सुधार कारक। (B) (A) में अनुपयुक्त सुधार कारक के उपयोग के साथ उत्पन्न एक RGB छवि. (C) एक उचित सुधार कारक के उपयोग के अलावा, (B) के रूप में देखने के समान फ़ील्ड के साथ जनरेट की गई RGB छवि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : उदाहरण है कि उचित अधिग्रहण सेटिंग्स के महत्व को समझाने. (ए, बी) RGB छवियों एक उपयुक्त अधिग्रहण समय (ए, 100 एमएस) बनाम एक संतृप्त अधिग्रहण समय (बी, 500 एमएस) के साथ देखने का एक ही क्षेत्र द्वारा उत्पन्न. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरजीबी छवियों समान दिखाई देते हैं जब झूठे रंग का. (ग) ब्याज का वह क्षेत्र (A) और (B) के सर्वाधिक तीव्र क्षेत्रों से तीव्रता मानों का सर्वेक्षण करने के लिए चुना गया है. (घ) 100 एमएस एक्सपोजर टाइम इमेज (ए, ब्लैक लाइन) और 500 एमएस एक्सपोजर टाइम (बी, रेड लाइन) से प्रति तरंगदैर्ध्य के लिए प्लॉटकी तीव्रता मान। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पिक्सेल तीव्रता के लिए 500 एमएस जोखिम समय डिटेक्टर के गतिशील रेंज की सीमा तक पहुँच गए हैं (65,535 AU) 370 एनएम पर और 525 एनएम तक कम नहीं है, वर्णक्रमीय कलाकृति में जिसके परिणामस्वरूप. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : पृष्ठभूमि घटाव के लिए ब्याज की एक क्षेत्र का चयन. (ए) एक कच्चा, तरंगदैर्ध्य-संक्षिप्त तीव्रता छवि। (B) छवि के क्षेत्र जो पिक्सेल-औसत पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम को लाल रंग में दिखाए गए पृष्ठभूमि घटाव के लिए निर्धारित करने के लिए चुने गए हैं. (C) पृष्ठभूमि-सबक्ठित, सही, और संक्षेप तीव्रता छवि. (डी) सही छवि (सी) के एक आरजीबी रंग. RGB झूठे रंग की छवि उत्पन्न करने की प्रक्रिया चित्र 4में दिखाई गई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एक आरजीबी झूठे रंग की छवि पैदा करने की प्रक्रिया. (ए-सी) तीन तरंगदैर्ध्य बैंड वर्णक्रमीय अधिग्रहण रेंज भर में समान रूप से स्थान झूठी रंग के लिए चुना गया (नीले रंग 370 एनएम, हरे ] 420 एनएम, लाल ] 470 एनएम). (घ) छवि घन में सभी तरंगदैर्ध्य बैंडों से पिक्सेल तीव्रता जोड़कर अभिशर्धित अभिव्यक्त तीव्रता प्रतिबिंब। (ई-जी) पैनल में छवियों (ए-सी) उनके संबंधित झूठी रंग देखो अप टेबल के साथ लागू किया. (ज) परिणामी विलयित प्रतिबिंब (ई-जी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : वर्णक्रमीय पुस्तकालय उत्पादन के लिए एकल लेबल नियंत्रण का क्षेत्र चयन. (ए)आरजीबी एयरवे चिकनी मांसपेशियों की नकली रंग की छवि (एएसएम) सेल autofluorscence. (ख) लाल रंग में दिखाया गया है, के क्षेत्रों (ए) वर्णक्रमीय पुस्तकालय के autofluorscence घटक के लिए चुना. (सी) आरजीबी झूठे रंग का एएसएम कोशिकाओं mitochondrial लेबल के साथ लेबल. (घ) वर्णक्रमीय पुस्तकालय के मिटोकोन्डील लेबल घटक के लिए चुने गए (सी) के लाल क्षेत्रों में दिखाया गया है। नाभिक के निकट स्थानीय एएसएम कोशिकाओं के स्व-प्रवाह के कारण, माइटोकोंड्रिल लेबल स्पेक्ट्रम की पहचान करने के लिए नाभिक से दूर छोटे क्षेत्रों का चयन किया गया। (ई) आरजीबी झूठे रंग का एएसएम कोशिकाओं GCAMP जांच के साथ transfected. (च) वर्णक्रमीय पुस्तकालय के जीसीएएमपी घटक के लिए चयनित (ई) के क्षेत्र लाल रंग में दिखाए जाते हैं। (डी) के समान, नाभिक से दूर क्षेत्रों का चयन किया गया. (छ) ए-एफ से प्राप्त स्पेक्ट्रमी पुस्तकालय, सबसे मजबूत संकेत के साथ तरंगदैर्ध्य में एकता के मूल्य के लिए सामान्यीकृत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 6
चित्र 6 : अमिश्रित छवि डेटा का उदाहरण जिसमें प्रत्येक लाइब्रेरी घटक से अमिश्रित सापेक्ष संकेत योगदान की कल्पना की जा सकती है. (ए-डी) GCAMP, mitochondrial लेबल, autofluorscence, और त्रुटि शब्द की अमिश्रित बहुतायत. (ई-जी) पैनल में छवियों (ए-सी) उनके संबंधित झूठी रंग देखो अप टेबल के साथ लागू किया. (ज) समग्र, विलय, झूठे रंग की छवि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 7
चित्र 7 : एक ठीक से परिभाषित वर्णक्रमीय पुस्तकालय से, मतलब तीव्रता और कुल फ्लोरोसेंट के प्रतिशत सहित मिश्रित रिश्तेदार संकेत योगदान,. (ए-डी) ऑटोफ्लोरेसींस, जीकेएमपी, माइटोकोंड्रियाल लेबल, और त्रुटि शब्द के लिए अमिश्रित बहुतायत। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि त्रुटि शब्द मापा कुल फ्लोरोसेंट संकेत के कम से कम 10% शामिल हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 8
चित्र 8 : अमिश्रित सापेक्ष संकेत योगदान, मतलब तीव्रता और कुल फ्लोरोसेंट के प्रतिशत सहित, एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय से एक घटक नमूने में शामिल होने के लिए जाना जाता याद आ रही है (यानी, एक underdefined वर्णक्रमीय पुस्तकालय). (ए-सी) ऑटोफ्लोरेसेंस, माइटोकोंड्रिल लेबल, और त्रुटि शब्द की अमिश्रित बहुतायत। ध्यान दें कि वर्णक्रमीय पुस्तकालय से जीसीएएमपी की चूक ने चित्र 7की तुलना में पुस्तकालय घटकों से परिकलित सापेक्ष संकेत योगदान के साथ-साथ त्रुटि शब्द में वृद्धि की है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9 : अमिश्रित सापेक्ष संकेत योगदान, मतलब तीव्रता और कुल फ्लोरोसेंट के प्रतिशत सहित, एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय से एक अतिरिक्त घटक नमूने में लापता होने के लिए जाना जाता है युक्त से (यानी, एक overdefined वर्णक्रमीय पुस्तकालय). (ए-ई) ऑटोफ्लोरेसेंस, जीकेएमपी, माइटोकोंड्रियाल लेबल, न्यूक्लियर लेबल, और त्रुटि शब्द की अमिश्रित बहुतायत। ध्यान दीजिए कि स्पेक्ट्रमी पुस्तकालय में नाभिकीय लेबल के योग से चित्र 7की तुलना में स्व-प्रवाह से परिकलित सापेक्ष संकेत योगदान में कमी आई है। इसके अलावा, त्रुटि शब्द ठीक से परिभाषित वर्णक्रमीय पुस्तकालय द्वारा निर्दिष्ट प्रतिशत त्रुटि के नीचे कमी आई है. इसका कारण यह है कि एक overdefined पुस्तकालय लगभग हमेशा एक ठीक से परिभाषित पुस्तकालय से प्रयोगात्मक डेटा के लिए एक बेहतर फिट की अनुमति होगी, भले ही नमूने से अनुपस्थित होने के लिए जाना जाता घटकों के लिए बहुतायत संकेत (वास्तव में) overdefining की कलाकृतियों वर्णक्रमीय पुस्तकालय. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10 : उचित autofluorscence संदूषण संकेत घटाव से पहले और बाद में एक पुस्तकालय का उपयोग करते समय unmixed छवियों की तुलना. (क) मूल "शुद्ध" स्पेक्ट्रम एकल लेबल नियंत्रण से प्राप्त अत्यधिक autofluorescent airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में स्केल घटाव चरण 6.2.4 में विस्तृत से पहले. (बी-डी) unmixed autofluorscence, GCaMP, और परमाणु लेबल छवियों का उपयोग कर उत्पन्न (ए) पुस्तकालय के रूप में. (ई) स्केल घटा घटाव के बाद अत्यधिक स्वप्रवाही airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में एकल लेबल नियंत्रण से व्युत्पन्न सही शुद्ध स्पेक्ट्रम. (एफ-एच) unmixed autofluorscence, GCaMP, और परमाणु लेबल छवियों का उपयोग कर उत्पन्न (ई) पुस्तकालय के रूप में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

मतलब तीव्रता (AU)
उचित फिटिंग अंडरफिटिंग ओवरफिटिंग
ऑटोफ्लोरेसेंस 187 299 164
जी.सी.एम. 139 - 140
माइटोकोंड्रियाल लेबल 246 318 248
परमाणु लेबल - - 26
RMS त्रुटि 53 126 43
मानक विचलन (AU)
उचित फिटिंग अंडरफिटिंग ओवरफिटिंग
ऑटोफ्लोरेसेंस 362 442 315
जी.सी.एम. 168 168
माइटोकोंड्रियाल लेबल 344 388 345
परमाणु लेबल - - 93
RMS त्रुटि 62 126 44
अधिकतम तीव्रता (AU)
उचित फिटिंग अंडरफिटिंग ओवरफिटिंग
ऑटोफ्लोरेसेंस 6738 7409 6738
जी.सी.एम. 1336 - 1336
माइटोकोंड्रियाल लेबल 5098 5194 5098
परमाणु लेबल - - 1257
RMS त्रुटि 1050 1286 910
कुल फ्लोरेसेंस का %
उचित फिटिंग अंडरफिटिंग ओवरफिटिंग
ऑटोफ्लोरेसेंस 30% 40% 26%
जी.सी.एम. 22% 43% 23%
माइटोकोंड्रियाल लेबल 39% - 40%
परमाणु लेबल - - 4%
RMS त्रुटि 8% 17% 7%

तालिका 1: एक तालिका औसत, मानक विचलन, और अधिकतम अमिश्रित बहुतायत तीव्रता मूल्यों एक उचित वर्णक्रमीय पुस्तकालय से और underdefined या overdefined वर्णक्रमीय पुस्तकालयों से, साथ ही प्रति कुल फ्लोरोसेंट के प्रतिशत प्रति अमिश्रित बहुतायत छवि प्रति की तुलना unmixed बहुतायत छवि (प्रत्येक छवि के लिए न्यूनतम unmixed बहुतायत तीव्रता हमेशा शून्य था). चित्र 7, चित्र 8और चित्र 9से लिए गए आंकड़े .

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Discussion

एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग सेट अप का इष्टतम उपयोग प्रकाश पथ के निर्माण के साथ शुरू होता है. विशेष रूप से, प्रकाश स्रोत की पसंद, फिल्टर (टूनाबल और dichroic), फिल्टर स्विचन विधि, और कैमरा उपलब्ध वर्णक्रमीय रेंज, संभव स्कैन गति, डिटेक्टर संवेदनशीलता, और स्थानिक नमूना निर्धारित करते हैं। बुध चाप लैंप कई उत्तेजना तरंगदैर्ध्य चोटियों प्रदान करते हैं, लेकिन एक फ्लैट वर्णक्रमीय उत्पादन प्रदान नहीं करते हैं और एक NIST-ट्रेसेबल प्रतिक्रिया38करने के लिए वापस वर्णक्रमीय छवि डेटा को सही करने के लिए उत्पादन चोटियों पर महत्वपूर्ण संकेत कमी की आवश्यकता होगी। एक्से आर्क लैंप और सफेद प्रकाश सुपरनिरंतर लेजर जैसे वैकल्पिक प्रकाश स्रोत, एक अधिक समान वर्णक्रमीय आउटपुट प्रदान कर सकते हैं जो उत्तेजना के लिए बेहतर अनुकूल है-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्वल इमेजिंग38,39,40. प्रकाश स्रोत, टूनाबल फिल्टर, और डाइक्रोइक फिल्टर्स का विकल्प उपलब्ध वर्णक्रमीय श्रेणी निर्धारित करता है। इस रेंज प्रयोगात्मक नमूना के वांछित वर्णक्रमीय जानकारी के लिए सावधानी से विचार के साथ चुना जाना चाहिए.

इसके अतिरिक्त, विचार Tunable फिल्टर के लिए इस्तेमाल किया स्विचन तंत्र को दिया जाना चाहिए, साथ ही क्वांटम दक्षता, पिक्सेल आकार, और उपलब्ध फ्रेम दरों के रूप में विभिन्न कैमरा कारकों, के रूप में इन कारकों संभावित नमूना दरों को प्रभावित करेगा41 ,42,43. हालांकि, अन्य सभी कारकों लगातार किया जा रहा है, उत्तेजना स्कैनिंग दृष्टिकोण का उपयोग वृद्धि की संवेदनशीलता और तेजी से इमेजिंग के लिए क्षमता प्रदान करना चाहिए, सबसे उत्सर्जन स्कैनिंग वर्णक्रमीय इमेजिंग दृष्टिकोण21की तुलना में.

जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग यहाँ अधिग्रहीत डेटा की निरंतर और वर्णक्रमीय अतिव्यापन प्रकृति को संदर्भित करता है। इस प्रकार, सिस्टम की क्षमताओं को उत्तेजना केंद्र तरंगदैर्ध्य की रिक्ति का उपयोग करके फ़िल्टर के FWHM की आधी दूरी से कम डेटा एकत्र करने में सक्षम होना चाहिए। जैसा कि पहले बताया गया है, पतली फिल्म टूनाबल फिल्टर की एक सावधानी से चुना सरणी केंद्र तरंगदैर्ध्य के साथ डेटा अधिग्रहण की अनुमति देता है 5 एनएम के अलावा स्थान, एक दूरी के बीच FWHM के साथ फिल्टर दिया उत्तेजना स्पेक्ट्रम oversample करने के लिए पर्याप्त 14-20 एनएम. इस तरह के एक रिक्ति की संभावना unmixing प्रक्रिया की सटीकता बढ़ जाती है के साथ वर्णक्रमीय डेटा संग्रह में थोड़ा अतिरेक देता है. स्पेक्ट्रल श्रेणियों और सटीक मिश्रण के लिए तरंगदैर्ध्य चैनलोंकी आवश्यक न्यूनतम संख्या दोनों पर विचार पहले 44 ,45,46पर चर्चा की गई है . इस अंत में, इन फिल्टर की बैंडविड्थ को देखते हुए, उत्तेजना रेंज एक तरंगदैर्ध्य है कि कुछ हद तक कम है पर समाप्त करने के लिए चुना जाना चाहिए (5-10 एनएम कम) dichroic बीमस्प्लिटर की कट-ऑफ तरंगदैर्ध्य से. यह सुनिश्चित करेगा कि उत्तेजना रोशनी की पूरी बैंडविड्थ dichroic बीमस्प्लिटर की कटऑफ तरंगदैर्ध्य के नीचे है (उदाहरण के लिए, 495 dichroic फिल्टर के लिए 360-485 एनएम) उत्तेजना उत्सर्जन पार बात से बचने के लिए.

सॉफ्टवेयर स्वतंत्र रूप से उच्च गति वर्णक्रमीय इमेजिंग स्कैन प्राप्त करने के लिए हार्डवेयर के प्रत्येक घटक को नियंत्रित करने की आवश्यकता है. सॉफ्टवेयर शटर संचालित करने में सक्षम होना चाहिए, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का चयन करें, और प्रयोगात्मक शर्तों को पूरा करने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च गति पर छवियों को प्राप्त (सटीक नमूना दर आवश्यकताओं प्रयोग भिन्न होंगे, लेकिन एक उदाहरण के लक्ष्य के लिए चार प्राप्त हो सकता है प्रति मिनट पूर्ण वर्णक्रमीय छवि ढेर). अधिक जटिल प्रयोगों के कई dichroic दर्पण, उद्देश्यों, या XY$ स्थानों का उपयोग कर सकते हैं। डेटा अधिग्रहण47,48के लिए कई सॉफ्टवेयर पैकेज उपलब्ध हैं . माइक्रो-प्रबंधक माइक्रोस्कोप स्वचालन के लिए एक मुक्त खुला स्रोत सॉफ्टवेयर है कि अनुकूलन विकल्प की एक किस्म प्रदान करता है. इसके अलावा, माइक्रो-प्रबंधक में मुख्य उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में उपलब्ध नहीं अतिरिक्त अनुकूलन के लिए एक स्क्रिप्टिंग पैनल शामिल है। उदाहरण के लिए, यह एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए टूनाबल फिल्टर स्विचर के 250 एमएस देरी को कम करने के लिए संभव है 10 एमएस सभी उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर तरंगदैर्ध्य को छोड़कर जिसमें फिल्टर पहिया एक नया टूनाबल फ़िल्टर करने के लिए rotates, प्रभावी इमेजिंग को कम करने अधिकांश तरंगदैर्ध्य के लिए तरंगदैर्ध्य प्रति 240 एमएस द्वारा समय। इस अनुकूलन के तहत 4 s में 30 तरंगदैर्ध्य के अधिग्रहण की अनुमति दी है. अंत में, माइक्रो-प्रबंधक को माइक्रोस्कोप डिवाइस नियंत्रण को और अनुकूलित करने के लिए MATLAB जैसे अन्य वातावरणों के साथ संचालित किया जा सकता है।

नमूना देखने और बाद में डेटा अधिग्रहण के लिए उचित वर्णक्रमीय उत्तेजना रेंज, अधिग्रहण समय, और प्रारंभिक तरंगदैर्ध्य का निर्धारण बहुत महत्वपूर्ण है. हालाँकि, सिस्टम के अलग-अलग घटकों की गलत कार्रवाई आगे समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। ऑप्टिकल पथ के प्रत्येक घटक प्राप्त छवि डेटा के लिए योगदान देता है. इसलिए, यह वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया और प्रकाश पथ के भीतर ऑप्टिकल घटकों के ऑप्टिकल संचरण सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर अगर समग्र प्रणाली प्रतिक्रिया का अनुकूलन करने की कोशिश कर रहा. प्रकाश स्रोतों में प्राय : परिवर्तनीय तीव्रता की सेटिंग्स होती हैं और बल्ब40के जीवनकाल में शक्ति में कमी हो सकती है . एक नमूना मंद प्रकट होता है, तो कारण प्रकाश स्रोत से आउटपुट कम किया जा सकता है। माइक्रो-प्रबंधक में autoshutter समारोह, हमारे अनुभव में, समय के 100% काम नहीं करता है. संकेत की कमी एक बंद शटर संकेत हो सकता है. लघु-प्रबंधक की कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल में सहेजी गई प्रारंभिक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य चित्र 1में दर्शाए गए 340 दउ उदाहरण जैसे छोटे या कोई वर्णक्रमीय आउटपुट वाले तरंगदैर्घ्य में डिफ़ॉल्ट हो सकती है।

इसके अतिरिक्त, यह गलती से एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य है कि लंबे समय से पास dichroic बीमस्प्लिटर के कटऑफ तरंगदैर्ध्य से ऊपर है चुनने के लिए असामान्य नहीं है, अतिरिक्त पार बात में जिसके परिणामस्वरूप और / संभावित रूप से कैमरा सेंसर को नुकसान. इसी प्रकार, संचरण इमेजिंग के लिए प्रकाश पथ को समायोजित करने के परिणामस्वरूप कैमरे को सिग्नल की हानि हो सकती है, जो सूक्ष्मदर्शी के विन्यास पर निर्भर करता है। इसके अलावा, चित्र 2में दर्शाए अनुसार प्रारंभिक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और नमूना देखने के लिए जोखिम समय का विकल्प उपयुक्त दिखाई दे सकता है लेकिन वास्तव में इसके परिणामस्वरूप अन्य उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर अतिसंतृप्त पिक्सेल हो सकते हैं। इस तथ्य को स्पष्ट नहीं किया जाएगा जब तक पिक्सेल संतृप्ति प्रत्येक छवि के लिए जाँच की है, तो यह अक्सर नमूना है कि सबसे तीव्र फ्लोरोसेंट शामिल प्रतीत होता है के एक क्षेत्र पर एक परीक्षण छवि ढेर प्रदर्शन करने के लिए विवेकपूर्ण है.

यह भी ध्यान देने योग्य है कि चर तीव्रता पृष्ठभूमि क्षेत्रों के लिए चुना छवियों में मौजूद हो सकता है लायक है. यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि इन क्षेत्रों में वास्तव में प्रासंगिक छवि डेटा न हो, क्योंकि बाद के डेटा सुधार चरण इस संकेत को नमूने में अन्य क्षेत्रों में प्राप्त छवि डेटा से घटाएँगे. यह कभी कभी संचरण सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए आवश्यक है और / या काफी जोखिम समय बढ़ाने के लिए जाँच करें कि क्षेत्र नमूना पृष्ठभूमि को मापने के लिए चयनित वास्तव में कोई नमूना शामिल है. इसी तरह, unmixed छवियों autofluorscence छवि में काले धब्बे या छेद के साथ मौजूद हो सकता है. यह एकल लेबल कोशिकाओं से "शुद्ध" वर्णक्रमीय संकेतों के autofluorscence "संदूषण" की वजह से एक अनुचित पुस्तकालय के कारण हो सकता है. इसका कारण यह है कि किसी भी "शुद्ध" वर्णक्रमीय संकेत autofluorscence युक्त एक नमूना से एकत्र हमेशा autofluorscence स्पेक्ट्रम के कुछ ही शामिल होगा, भले ही मात्रा का पता लगाने में. देखभाल के लिए एक उचित वर्णक्रमीय पुस्तकालय सुनिश्चित करने के लिए एकल लेबल नियंत्रण से autofluorence संकेतों को घटाना चाहिए, के रूप में Mansfield एट अल द्वारा कई अवसरों पर वर्णित28,29,30, 31,32

हालांकि इस अनुच्छेद में प्रदर्शन नहीं किया, उत्तेजना स्कैनिंग वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रणाली भी कई XY स्थानों पर समय चूक इमेजिंग और इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (या छवि सिलाई के कारण देखने का एक बड़ा क्षेत्र) एकाधिक फोकल विमानों में. यदि इन विकल्पों को एक ही प्रयोग के लिए वांछित हैं, सावधान सोचा अधिग्रहण आदेश और photobleaching के संभावित प्रभाव के महत्व को दिया जाना चाहिए. यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि यदि लिया गया वास्तविक समय अनुमानित समय से अधिक हो जाता है (उदा., एक छवि स्टैक अनुमानित 10 s के बजाय प्राप्त करने के लिए 11 s लेता है), माइक्रो-प्रबंधक timepoints और/या पदों की चयनित संख्या प्राप्त करने के लिए जारी रहेगा। इस गलत गणना एकाधिक timepoints के साथ यौगिक और गणना लौकिक नमूना बदल सकते हैं, संभावित डेटा से किए गए किसी भी निष्कर्ष विषम.

यह उदाहरण एक 145 एनएम उत्तेजना स्कैनिंग रेंज के भीतर फ्लोरोसेंट के तीन स्रोतों को अलग करने की क्षमता को दर्शाता है. इस प्रणाली का उपयोग कर पिछले प्रयोगों को एक ही सीमा के भीतर फ्लोरोसेंट के पांच स्रोतों को अलग करने में सक्षम किया गया है. इस छवि अधिग्रहण के लिए आवश्यक समय कम से कम 1 मिनट है, जो काफी सबसे उत्सर्जन स्कैनिंग वर्णक्रमीय इमेजिंग सिस्टम की तुलना में तेजी है. प्रकाश पथ में सुधार, इस तरह के उच्च गति उत्तेजना तरंगदैर्ध्य ट्यूनिंग के रूप में, आगे इस इमेजिंग प्रौद्योगिकी गति है कि वीडियो दर वर्णक्रमीय इमेजिंग के लिए पर्याप्त हैं अग्रिम कर सकते हैं.

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Disclosures

Drs. Leavesley और रिच एक स्टार्ट-अप कंपनी में वित्तीय हित का खुलासा, SpectraCyte LLC, वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रौद्योगिकी के व्यावसायीकरण के लिए स्थापित किया गया.

Acknowledgments

लेखकों को एनएसएफ 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, और मिशेल कैंसर अनुसंधान से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

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References

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Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

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