Summary
Durch die Verwendung dreidimensionaler organotypischer Kulturen zur Visualisierung der Morphologie und funktionellen Marker von Speicheldrüsen können neue Einblicke in die Mechanismen von Gewebeschäden nach Strahlung gegeben werden. Hier wird ein Protokoll zu den Abschnitten, Kultur, Bestrahlung, Fleck und Bild 50 – 90 μm dicken Speicheldrüsenabschnitten vor und nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung beschrieben.
Abstract
Hyposalivation und Xerostomia erzeugen chronische orale Komplikationen, die die Lebensqualität bei Kopf-und Nackenkrebspatienten, die mit Strahlentherapie behandelt werden, verringern. Experimentelle Ansätze zum Verständnis von Mechanismen der Speicheldrüsenfunktionsstörungen und Restaurationen haben sich auf in vivo-Modellen konzentriert, die durch die Unfähigkeit, therapeutische Kandidaten und Effizienz in der Transfektion systematisch zu untersuchen behindert werden, behindert werden. Fähigkeit, bestimmte Gene zu manipulieren. Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Wir haben die immunfluoreszierende Färbung und die konfokale Mikroskopie eingesetzt, um festzustellen, wann bestimmte Zellpopulationen und Marker während einer 30-tägigen Kulturperiode vorhanden sind. Darüber hinaus werden in vivo Strahlungsmodelle in Kulturen ausgewertet, die ex vivo bestrahlt werden. Diese Methode, die sich vorwärts bewegt, ist eine attraktive Plattform für die schnelle Ex-vivo-Bewertung von Murin-und menschlichen Speichelgewebe Reaktionen auf therapeutische Wirkstoffe, die Speichelfunktion verbessern.
Introduction
Die richtige Speicheldrüsenfunktion ist für die Mundgesundheit von entscheidender Bedeutung und wird nach der Kopf-und Nackenkrebsbehandlung mit der Strahlentherapie1 verändert. 2017 wurden in den USA 2 knapp 50.000 neue Fälle von Kopf-und Nackenkrebsgemeldet. Aufgrund der gewebeschädigenden und häufig irreversiblen Auswirkungen der Strahlentherapie auf umgebende normale Gewebe wie Speicheldrüsen sind die Patienten oft mit schweren Nebenwirkungen und verminderter Lebensqualität2,3, 4. Platz Häufige Komplikationen, die durch Strahlenschäden verursacht werden, manifestieren sich in Symptomen wie Xerostomie (das subjektive Gefühl des trockenen Mundes), Zahnkaries, Beeinträchtigung der Fähigkeit zu kauen und zu schlucken,Sprachbeeinträchtigungen und kompromittierten Mundmikrobiomes 2, 3 , 4. Diese Symptome können kollektiv zu Unterernährung und Beeinträchtigung des Überlebens bei betroffenen Personen führen 5. Während die Speicheldrüsenfunktionsstörungen in dieser Population gut dokumentiert sind, wurden die zugrundeliegenden Mechanismen der Schädigung von Akinarzellen bestritten, und es gibt kaum Integration zwischen den verschiedenen Tiermodellen6,7.
Die aktuellen Methoden zur Untersuchung der Speicheldrüsenfunktion und der strahlenbedingten Schädigung umfassen die Verwendung von In-vivo-Modellen, verewigten Zelllinien, zweidimensionalen (2-D) Primärzellkulturen und dreidimensionalen (3-D) Salisphere-Kulturen8, 9,10,11,12. Traditionell sind Zellkulturmodelle aus verewigten Zelllinien und 2-D-Kulturen einschichtige Zellen, die auf flachen Oberflächen kultiviert werden und für schnelles, einfaches und kostengünstiges Experimentieren wertvoll sind. Künstliche Zellkultur-Bedingungen können jedoch den Differenzierungsstatus und die physiologischen Reaktionen von Zellen verändern, die verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind, und die Ergebnisse können oft nicht auf ganze Organorganismus-Modelle14,15übersetzen. Darüber hinaus benötigen verewigte Zellkulturen eine Modulation der p53-Aktivität, was für die Reaktion der Speicheldrüse auf DNA-Schäden16,17entscheidendist.
3-D Salisphere Kulturen sind für Stamm-und Vorläuferzellen in der frühen Zeit Punkte in der Kultur angereichert und waren nützlich, um die Radiosensibilität dieser Untergruppe von Speicheldrüsenzellen9,18zuverstehen. Eine kritische Einschränkung all dieser Kulturmodelle ist, dass sie bei der Visualisierung der 3-D-Struktur der Speicheldrüse, einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM) und Zellzellinteraktionen über verschiedene Schichten, die bei der Modulation von Speichelvarianten entscheidend sind, wirkungslos sind. Sekretion15. Die Notwendigkeit einer Methode, die das Verhalten des Gewebes als Ganzes umfasst, aber auch unter Laborbedingungen manipuliert werden kann, um die Auswirkungen der Behandlung zu untersuchen, ist notwendig, um die zugrunde liegenden Mechanismen der strahleninduzierten Speicheldrüse weiter zu entdecken. fehlfunktion.
Die Lebendgeweb-Sektionierung und-kultur wurde bereits19,20 dokumentiertund wird häufig zur Untersuchung von Gehirngewebeinteraktionen21verwendet. In früheren Studien wurde Parotid (PAR) Speicheldrüsengewebe von Mäusen auf etwa 50 μm abgetrennt und für bis zu 48 Stunden kultiviert, und die Analyse der Lebensfähigkeit, des Zelltodes und der Funktion wurde danach19durchgeführt. Su et al. (2016) erweiterte diese Methodik durch die Kultivierung der menschlichen submandibulären Drüsen (SMGs), die für 14 Tage auf 35 μm oder50 μm verteilt sind. 20 Tage lang wurden sie mit 35 μm oder 50 μm abgetrennt. Die vorgeschlagene Methode ist insofern ein Fortschritt, als sie sowohl parotide als auch submandibuläre Speicheldrüsen umfasst, die mit 50 μm und 90 μm abgetrennt sind und die Kulturen 30 Tage lang auswerten. Die Fähigkeit, einen Bereich der Gewebedicke zu schneiden, ist wichtig bei der Bewertung von Zellzell-und Zell-ECM-Interaktionen, die für zelluläre Prozesse relevant sind, einschließlich apical-Basolateralpolarität und Innervation für die Sekretion. Darüber hinaus wurden die Speicheldrüsenscheiben bestrahlt, während sie in der Kultur die Machbarkeit dieses Kulturmodells zur Untersuchung von strahlenbedingten Speicheldrüsenschäden feststellen konnten.
Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Um die maximalen Zeitabschnitte zu bestimmen, die nach der Trennung lebensfähig sind, wurden trypan-Blau-Färbung, lebende Zellfärbung und immunhistochemische Färbung für den Zelltod durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie und die immunfluoreszierende Färbung wurden eingesetzt, um bestimmte Zellpopulationen, morphologische Strukturen und Proliferationsniveaus zu bewerten. Auch die Gewebeschnittkulturen waren ionisierender Strahlung ausgesetzt, um die Auswirkungen der Strahlung auf verschiedene Marker in diesem 3-D-Modell zu bestimmen. Die Induktion des Zelltodes, die Zytoskelettstörung, der Verlust von Differenzierungsmarkern und die Kompensationsvermehrung in bestrahlten Ex-vivo-Kulturen wurden mit früheren Studien von in vivo-Modellen verglichen. Diese Methodik bietet ein Mittel, um die Rolle von Zellzellinteraktionen nach Strahlenschäden zu untersuchen und stellt ein experimentelles Modell zur Verfügung, um die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen (Genmanipulationen oder pharmakologische Wirkstoffe) effizient zu bewerten. ), die für in vivo Modellen weniger geeignet sein können.
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Protocol
1. Zubereitung von Vibrationen
- Sprühbare, abnehmbare Bauteile des Vibratoms inklusive Puffertablett, Messerbefestigung, Acharo-Blockform und Laborfolie mit 70% Ethanol, dann UV-Sterilize für mindestens 30 min.
- Legen und sichern Sie ein zusätzliches Blatt Laborfolie über das Puffertablett, um zu verhindern, dass Eis hereinfällt.
- Füllen Sie die Eiskammer mit zerkleinertem Eis, entfernen Sie die Laborfolie aus dem Puffertablett und füllen Sie das Puffertablett mit 100 ml eiskalter 1x Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), ergänzt um 1% Penicillin-Streptomycin-Ampicillin (PSA).
- Legen Sie eine Edelstahl-Rasierklinge in den Messerhalter. Mit dem Schraubenzieher können Sie den Winkel der Klinge anziehen und verändern.
2. Zubereitung der Gewebeprobe im Agrose-Block und Abtrennung mit dem Vibratom
- Autoklave alle notwendigen Trenn-und Trennwerkzeuge, einschließlich Zangen, Scheren und Pinsel.
- Bereiten Sie 3% niedrige Schmelzpunkt auf, die in sterilen 1x PBS und Mikrowelle entwickelt wurden, bis sich der Acharose in Lösung auflöst. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht überkocht und wirbeln Sie die Flasche regelmäßig mischen.
Achtung: Verhindern Sie, dass sich der schmelzarme Awanz verfestigt, indem Sie ihn in einem warmen Wasserbad halten. Der schmelzarme Achrot ist bei 37 ° C flüssig und setzt bei 25 ° C. Das Wasserbad sollte jedoch unter 40 ° C liegen, um den Acharoten bei physiologischer Temperatur um das Gewebe zu gießen. - Isolieren Speicheldrüsen und platzieren Sie das zersekelte Gewebe in 2 mL eiskalte 1x PBS, ergänzt mit 1% PSA in einem sterilen, 30 mm Kulturgericht.
- Mit Hilfe von Autoklaven-Zangen, entfernen Sie Speicheldrüsen von 1x PBS + 1% PSA-Lösung und Position am Boden einer Einbettung Form. Füllen Sie die Form mit Flüssigkeit 3% niedriger Schmelzpunkt, um das Gewebe zu bedecken.
- Stellen Sie das Gewebe mit Hilfe der Zangen in die Mitte des Blocks ein und positionieren Sie die Speicheldrüse in der entsprechenden Ebene. Die besten Querschnitte für die submandibulären und parotiden Drüsen befinden sich in der vertikalen Ebene.
- Platz agarose Block auf Eis für 10 Minuten zu härten.
- Führen Sie vorsichtig eine Rasierklinge um den äußeren Rand des Agrotes, um sich zu lockern und den Block aus Schritt 1.1 auf den UV-sterilisierten Laborfilm ausrutschen zu lassen.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, um eine Acharo-Kiste mit der Speicheldrüse auszuschneiden. Achten Sie darauf, dass die Ebene des Abschnitts gerade und parallel zur gegenüberliegenden Seite des Blocks ist (die Oberfläche, die abgeklebt wird). Da die Acharose das Gewebe nicht infiltrieren, schneiden Sie nicht zu viel Agirete um das Gewebe ab, so dass das Gewebe gut unterstützt wird.
- Verwenden Sie Superkleber, um den Block an der Schnittfläche zu befestigen.
- Ausschnitt bei 50 μm oder 90 μm Dicke durch Vibratome bei einer Geschwindigkeit von 0,75 mm und einer Frequenz von 100 Hz.
Hinweis: Das Setzen des Vibratoms auf die höchste Frequenz und die niedrigste Messergeschwindigkeit liefert die optimalsten Scheiben. - Sammeln Sie Abschnitte in einem 24-Brunnen-Gewebekultur-Gericht mit ~ 1 mL eiskalten PBS pro gut mit einer autoklavierten, natürlichen Haarpinsel, indem Sie die Bürste in 70% Ethanol zwischen Scheiben Sammlungen, um Sterilität zu erhalten.
3. Kulturabschnitte
- Autoklave eine Mikro-Spachtel und Zangen.
- Machen Sie Stock-Vibratome Kulturmedien mit oder ohne fetales Rinderserum (FBS): DMEM/F12 Medien ergänzt mit 1% PSA, 5 μg/mL Transferrin, 1,1 μM Hydrocortison, 0,1 μM Retinosäure, 5 μg/mL Insulin, 80 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor, 5 mM L-Glutamin, 50 μg/mL Gentamicin-Sulfat und 10 μL/mL Spurenelemente-Gemisch. Fügen Sie eine angemessene Menge an FBS hinzu, um 0%, 2,5%, 5,0% oder 10% Lösungen zu machen.
- Vor der Abspaltung 300 μL vorgewärmtes Medium hinzufügen und in jeden Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte einen 12 mm Durchmesser mit einer Porengröße einlegen. Die Medien sollten den Membranboden erreichen, um eine Flüssigluft-Schnittstelle für die Kultur zu schaffen.
- Die Speichelabschnitte mit dem Mikrospachtel und der Kultur bei 37 ° C in befeuchteten 5% CO 2 und 95% Luftatmosphäre Inkubator auf die Membraneinlage legen.
- Etwa 300 μL Primärkulturmedien in den Brunnen und ein paar Tropfen in die Membraneinsätze (ca. 40 μL) jeden zweiten Tag oder bei Bedarf. Die richtige Kultivierung zeigte, dass die Zellen überleben und bis zu 30 Tage ab vivo gewartet werden können.
4. Bestrahlung von Speicheldrüsenabschnitten
- Behandeln Sie die Abschnitte mit einer einzigen Strahlendosis (5 Gy) mit dem Kobalt-60 (oder gleichwertigen) Bestrahler.
- Transport von Abschnitten zur Bestrahleranlage mit einem überdachten Styroporbehälter zur Vermeidung von Temperaturschwankungen. Darüber hinaus muss beim Transport zurück in den Inkubator des Labors darauf geachtet werden, dass die Medien nicht auf den Kulturdeckel zupraschen und zu einer Verunreinigung führen.
- Platzieren Sie die 24-Well-Platte mit Speicheldrüsenabschnitten 80 cm von der Strahlungsquelle entfernt, in der Mitte eines 32 "x 32"-Strahlungsfeldes. Die Berechnungen der Strahlendosis und die entsprechende Zeit im Bestrahler variieren je nach Instrument und Kobalt-60-Zerfall.
- Die Überwachung und Kultivierung dieser Abschnitte, wie sie in Abschnitt 3 beschrieben sind, wird weiter überwacht und kultiviert.
5. Haltbarkeit
- Aspirieren Sie alte Medien und waschen Sie Scheiben zweimal mit sterilen, vorgewärmten 1x PBS.
- Stapelabschnitte mit trypanblauem Farbstoff.
- Verwenden Sie einen Mikrospachtel, um die Scheibe von der Kultur auf eine Glasscheibe zu verschieben.
- Fügen Sie der Vibratomscheibe 0,4% Trypusblaue Lösung mit genügend Volumen hinzu, um das Gewebe zu bedecken (10 – 20 μL).
- Inkubieren Sie Scheiben bei Raumtemperatur (RT) im Trypan-Blau für 1 – 2 min für den Farbstoff, um in das Gewebe einzudringen. Nicht lebensfähige Zellen werden blau gefärbt und lebensfähige Zellen werden nicht befleckt.
- Stapelabschnitte mit Calcein, AM-Live-Zell-Farbstoff.
- Fügen Sie genügend Fleckenvolumen hinzu, um den Abschnitt in einem Brunnen einer 24-Wellplatte (200 – 300 μL) abzudecken.
- Inkubate Scheiben bei RT für 15 Minuten, um Farbstoffdurchdringen zu ermöglichen.
- Den Abschnitt vorsichtig vom Brunnen entfernen und auf eine Glasscheibe legen. Mount Scheiben mit 1 Tropfen Montageband.
- Bildausschnitte auf einem Leuchtstoffmikroskop mit Erredung/Emissionswellenlängen von 488 nm und 515 nm.
6. Antikörper-Färbung Vibratome Abschnitte
Hinweis: Im Folgenden finden Sie ein allgemeines Antikörper-Färbung, das speziell für Ki-67 spezifisch ist; Dieses Protokoll kann jedoch mit jedem Antikörper verwendet werden. Alle Waschungen werden bei RT durchgeführt, sofern nicht anders vermerkt.
- In der Multi-well-Gewebekulturschale die Medien absaugen und mindestens 2x mit sterilen 1x PBS waschen.
- Fixierte Abschnitte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C.
- 4% PFA absaugen und 3x mit PBT waschen [1x PBS, 1% Rinder-Serum Albumin (BSA), 0,1% Triton X-100].
Hinweis: Abschnitte können bei 4 ° C in 1x PBS gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt verfärbt werden. Die maximale Lagerzeit, die in diesem Manuskript getestet wurde, betrug 3 Wochen. Eine längere Speicherzeit muss der einzelne Nutzer optimieren, wenn dies gewünscht wird. - Durchlässige Abschnitte mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS für 30 min.
Hinweis: Dieser Schritt kann modifiziert und optimiert werden, um eine spezifische Antikörper-Färbung und Durchlässigkeit zu ermöglichen. - Die Durchlässigkeit.
- Wasch 3x für 5 min mit 1x PBS, 1% BSA und 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Blockieren Sie die Scheiben mit Blockiermittel mit 1% normalem Ziegenserum für 1 h.
- Die Scheiben 3x für 5 min mit PBT waschen.
- Die Scheiben über Nacht bei 4 ° C mit 500 μL anti-Ki67 Kaninchen monoklonalen Antikörper verdünnt in 1% BSA in 1x PBS.
NOTE: Für die Phalloidin-Färbung, überspringen Schritt 6.9 und fahren Sie mit dem Protokoll für die spezifische Phalloidin verwendet. Für DNA-Gegenfleck, überspringen Sie zu Schritt 6.15. - Aspirate anti-Ki67 Kaninchen monoklonalen Antikörper.
- Die Scheiben 6x für 5 min in 1x PBS waschen.
- Inkubieren Sie die Scheiben in 500 μL fluoresziertem konjugierten sekundären Antikörper, die mit dem Anti-Ki67-Antikörper kompatibel sind, der in 1% BSA in 1x PBS bei RT für 1,5 h aus Licht bedeckt ist.
Hinweis: Auf Basis des verwendeten sekundären Antikörpers kann die Inkubationszeit mit dem sekundären Antikörper durch den einzelnen Nutzer weiter optimiert werden. Außerdem ist der sekundäre Antikörper lichtempfindlich. Alle nachfolgenden Waschungen müssen im Dunkeln durchgeführt werden. - Aspirate sekundäre Antikörper.
- Waschscheiben für 3 x für 5 min mit 1x PBS.
- Die Scheiben 5 min in deionisiertem Wasser waschen.
- Gegenfleckscheiben mit DAPI (1μg/mL) für 20 min bei RT.
- Scheiben (einmal) für 5 min in deionisiertem Wasser waschen.
- Teigscheiben mit einem Tropfen (~ 40 μL) von Montagebrädern. Um überschüssige Blasen zu vermeiden, legen Sie den Koppel langsam auf das Montagemutter auf der Rutsche, beginnend mit einem 45 °-Winkel.
- Um zu verhindern, dass die dicken Abschnitte mit dem Kofenlip zerkleinert werden, montieren Sie jede Scheibe mit einem Abstandshalter. Ein Abstandshalter kann erzeugt werden, indem man einen Rand aus Vakuumfett in ein Quadrat um den Gewebeabschnitt legt.
- Beim Verlegen des Kerklips können die Kanten des Kerkel mit Vakuumfett versiegelt werden. Drücken Sie mit dem Daumen auf die Kanten des Kegenlippens, um ihn fest auf die Rutsche zu kleben. Alternativ können Sie die Keillippe mit klarem Nagellack auf die Mikroskope schieben.
7. Bildgebung von Vibratome
- Bild der gebeizten Folien innerhalb von 5 Tagen nach der Färbung.
- Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Sie optische Abschnitte der gebeizten Vibratome. Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Sie einen z-Stack in definierter Schrittgröße oder nehmen Sie je nach experimentellem Design des Nutzers einzelne Bilder. Bilder können nach einer konfokalen Sammlung auf jedem Computerbildschirm untersucht werden.
Hinweis: Aufgrund der Dicke der Vibratome wird empfohlen, Details innerhalb der Proben mit einem konfokalen Mikroskop oder einem Bereich mit z-Stack-Fähigkeit zu visualisieren. Für die Bilder, die in diesem Manuskript verwendet werden, wurde ein 63x-Ölobjekt verwendet; Dies kann jedoch vom einzelnen Nutzer und dem jeweiligen Umfang angepasst und weiter modifiziert werden. Empfohlene Pixelauflösung für jeden Objektiv-und Zoomfaktor mit der vermuteten Nyquist-Probenahme von 2,5 Pixeln in X und Y für die kleinste optisch auflösbare Struktur wurde verwendet. Einige Kommentatoren schlagen jedoch 2,3 Pixel vor, andere vermuten 2,8 Pixel. Weitere Informationen zu diesen Berechnungen finden Sie im Handbuch der Biologischen Konfokalen Mikroskopie22 .
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Representative Results
Primär werden 2-D-Kulturen in fetalem Rinderserum (FBS) angebaut, die Medien ergänzen,währenddie primäre 3-D-Salisphere-Kultur typischerweise unter serumfreien Bedingungen10,11kultiviert wird. Darüber hinaus haben die beiden vorhergehenden Studien, die Vibratomkulturen aus Speicheldrüsen verwendeten, ihre Abschnitte in 0% oder 10% FBS kultiviert,dieMedien19,20ergänzt. Die Submandibularscheiben der Maus wurden mit einem Vibratom mit einer Dicke von 50 μm getrennt und mit einer Reihe von FBS-Konzentrationen (0%, 2,5%, 5,0% und 10%) optimale Kulturbedingungen ermittelt. Um Überlebensmerkmale zu bestimmen, wurden an den Kulturtagen 1, 4, 7, 14 und 30 nach der Abtrennung hellfeld-Mikroskop-Bilder aufgenommen (Abbildung 1). Zusätzlich wurden Drüsenabschnitte mit 0,4% trypenblauem Farbstoff befleckt und mit einem Lichtfeldmikroskop bei 40x an den angegebenen Zeitpunkten abgebildet (Abbildung 2A). Nicht lebensfähige Zellen waren blau gefärbt und lebensfähige Zellen blieben klar.
Um die Überlebensmerkmale von dickeren Scheiben zu bestimmen, die mit 90 μm abgetrennt sind, wurden am 30. Tag in Kulturen, die mit 2,5% FBS (Abbildung 2B) ergänzt wurden, hellfeld-Mikroskop-Bilder mit und ohne Trypan-blaue Färbungaufgenommen. Aufgrund der Scheibendicke wurden 90 μm-Abschnitte, die mit trypanblauem Farbstoff befleckt waren, vollständig abgebildet und dann halbiert, um die Mitte der Scheibe zu bewerten (Abbildung 2B). Als Bestätigung wurde ein Live-Zell-Farbstoff verwendet, um das Überleben der Zellen unter verschiedenen FBS-Kultivierungsbedingungen zu bewerten (Abbildung 2C). In leuchtenden Feldbildern wurden hohe Mengen an durchscheinenden, überlebenden Zellen im Gewebe beobachtet, die sowohl auf 50 μm als auch auf 90 μm verteilt sind. Interessanterweise verdichten sich die Abschnitte im Laufe der Zeit in der Kultur, doch ein bedeutender Teil der Sektion scheint die 30-Tage-Kulturperiode zu überstehen (Abbildung 1, Abbildung 2). Diese Kondensation zeigte sich am deutlichsten in den Bedingungen für die FBS-Kultivierung von 0% und 10%. Trypan blue positive cells wurden am Rand aller Abschnitte beobachtet, unabhängig von kultivierenden Bedingungen, und es gab einen Anstieg des trypan blauen positiven Zellbereichs in 0% FBS-Kulturbedingungen im Vergleich zu den höheren FBS-kultivierenden Bedingungen (Abbildung 2A , 2B).
Mit Hilfe des Live-Zellflecks zeigten die in 0% kultivierten Abschnitte die niedrigste Menge an Färbung, und die Zugabe von FBS in die Kulturmedien verbesserte die Menge der lebenden Zellen. Zusammengenommen zeigten Abschnitte, die in 0% kultiviert wurden, sichtbare Gewebekondensation, erhöhte trypanblau gefärbte Bereiche und die niedrigsten Ebenen der Lebendzellflärbung. Durch die Zugabe von 2,5% FBS zu den Kulturen wurde die Menge des durchsichtigen Gewebes verbessert, der trypale blaue Positivbereich verringert und die Fettleiste der lebenden Zellen erhöht. Zusätzliche Anstiege der FBS-Konzentration schienen die Überlebensfähigkeit des Gewebes nicht zu verbessern; 2,5% FBS in den Vibratommedien war daher die optimale FBS-Konzentration und wurde als Kulturbedingung für alle nachfolgenden Experimente genutzt.
Um die Lebensfähigkeit der submandibulären Ex-vivo-Gewebeseige nach der Trennung zu bestimmen, wurden an den Tagen 1, 3, 7, 14 und 30 in der Kultur proliferative und apoptotische Marker ausgewertet. Die proliferative Aktivität wurde durch die Ki67-Immunfärbung in einer Teilgruppe von Kulturscheiben (Abbildung 3A) bewertet. Ki67-Positivzellen wurden zu allen bewerteten Zeitpunkten beobachtet und waren weiterhin am 30. Tag in der Kultur präsent, mit minimalen Unterschieden zwischen den Zeitpunkten. In ähnlicher Weise wurde der Grad der Apoptosedurchdie aufgeschaltete Caspase-3-Immunfärbung in einem separaten Teil von Abschnitten bewertet (Abbildung 3B). Ein niedriges Niveau an aufgeschalteten caspase-3-positiven Zellen wurde zu allen Zeitpunkten bis zum 14. Tag in der Kultur beobachtet, während die Bedingungen für Tag 30 in einigen Bereichen einen kleinen Anstieg der Anzahl der aufgespalten gefundenen Caspase-3-positiven Zellen zu haben schienen. Die Auswertung der Gewebekanten ergab keine höheren Konzentrationen von geteiltem Kaspase-3, der die trypische blaue Färbung nicht rekapituliert (Abbildung2). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass in den 30-tägigen Bewertungszeiten in den Schwingungskulturen die Faktoren für die Verbreitung und Lebensfähigkeit vorhanden blieben.
Dicke Abschnitte Vibratome bieten die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen zellulären Bestandteilen eines bestimmten Gewebes in einer Tiefe zu bewerten, die mehr als eine Epithelzelldicke in jede Richtung umfasst. Darüber hinaus ist es wichtig, in der Lage zu sein, die beiden großen Speicheldrüsen zu kultivieren, da sie sich in der Zusammensetzung der produzierten Speichelproteine, der histologischen Architektur, der Radiosensibilität und anderer kritischer Merkmale unterscheiden. Um verschiedene Zellpopulationen in submandibulären Drüsenkulturen zu bestimmen, wurden submandibuläre Abschnitte mit E-cadherin (E-cad) befleckt, um Epithelzellen zu erkennen, glatte Muskelaktin (SMA), um Myyoepithelzellen zu erkennen, und Aktin-Filamente (Phalloidin), um Erkennen Sie Zytoskelettstrukturen während der 30 Tage in der Kultur (Abbildung 4A).
Die E-Cadherin-Färbung wurde an den Membranen der meisten Zellen beobachtet und während der 30-tägigen Kulturperiode nachgewiesen. SMA +-Zellen wurden während der gesamten Kulturperiode erkannt, wobei zu jedem Zeitpunkt ähnliche Werte gelten. Auch die zytoskelettale Organisation der Aktin-Filamente schien zu jedem bewerteten Zeitpunkt beibehalten zu werden. Im Gegensatz dazu gab es zelluläre Marker, die während des gesamten Bewertungszeitraums nicht konsequent gewartet wurden, darunter CD31 (Vaskulatur), TUBB3 (Neuronen) und Aquaporin-5 (Aqp-5, acinar Marker) (Abbildung 4B). Gefäßstrukturen durch die konfokalen Stapel wurden an den Tagen 1 und 3 nach der Kultur deutlich beobachtet; Diese Strukturen erschienen jedoch am 7. Tag zersplittert. In ähnlicher Weise waren neuronale Prozesse am ersten Tag der Kultur intakt, schienen am 3. Tag geschwächt zu sein und wurden in der Folge an Tag 7 in der Kultur verloren. Aqp5+-Zellen wurden an den Tagen 1, 3, 7 und 14 in der Kultur beobachtet; Wenn auch an Tag 14, schien die allgemeine Färbung zu verringern, mit einer granularen Ähnlichkeit in den verbleibenden positiven Zellen. Diese Daten deuten darauf hin, dass submandibuläre Kulturen die Vielfalt der Gewebebestandteile mit der Pflege der Gefäß-und neuronalen Zelltypen für kürzere Kulturperioden und epitheliale und myoepitheliale Zelltypen für längere Kulturperioden enthalten.
Während die vibratom-abgetrennten Kulturen zuvor für die Parotid-Sellvariendrüse gemeldet wurden, wurden die Kulturen für 48 Stunden beibehalten, was den Zeitrahmen einschränkte, in dem sie untersucht werden konnten. Um festzustellen, ob Parotiddrüsen länger erhalten werden können, wurden Murin-Parotiddrüsen für 1, 3, 7 oder 14 Tage abgetrennt und kultiviert. Aus der Parotiddrüse wurden aufgrund ihrer geringeren Größe bei Mäusen weniger Abschnitte gewonnen; Eine 30-tägige Kulturperiode wurde daher nicht versucht. Die Scheiben wurden durch die immunluoreszierende Färbung mit Antikörper gegen Ki67 zur Proliferation ausgewertet. Ähnlich wie bei den submandibulären Kulturen wurden Ki67-Positivzellen zu allen Zeitpunkten beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Zellen einen gewissen Grad an Vermehrung in der Kultur aufrechterhalten (Abbildung 5A).
Außerdem wurden die Wartung von funktionellen Akinarmarkern (α-Amylase und Aqp5), einer Epithelmarkierung (E-cad) sowie Gefäßmarker (CD31) und neuronalen (TUBB3) Zellpopulationen bewertet. Amylase ist eines der am häufigsten vorkommenden Proteine, die durch differenzierte Parotidepithelzellen produziert werden und häufig bei der 2-D-Kultivierung der primären Parotidzellen verloren gehen. In den Vibratomkulturen wurde in den Akinarzellen Amylase beobachtet und während der 14-tägigen Kulturperiode (Abbildung 5B) von den Duktalzellen ausgeschlossen (Abbildung 5B). Ähnlich wie die submandibulären Kulturen waren Aqp5+-Zellen in den Parotidkulturen zu jedem Zeitpunkt vorhanden, wobei der Tag, an dem 14 Kulturen im Vergleich zu früheren Zeitpunkten einen reduzierten Wert aufweisen (Abbildung 5C). Auch auf den Membranen der meisten Zellen wurden während der 14-tägigen Kulturperiode E-cadherin-Spiegelgehalten (Abbildung 5D). Die neuronalen Strukturen schienen während der 7-tägigen Kulturperiode erhalten zu bleiben und wurden zu späteren Zeitpunkten nicht bewertet (Abbildung 5E). Im Gegensatz dazu erschienen Gefäßstrukturen am ersten Tag in der Kultur intakt, und nur kleinere Strukturen waren an den Tagen 3 und 7 in der Kultur vorhanden (Abbildung 5F). Diese Daten deuten darauf hin, dass Parotidkulturen ihre proliferativen Fähigkeiten und funktionellsten Fähigkeiten für 7-14 Tage in der Kultur beibehalten und potenziell eine intaktere Gewebestruktur für einen längeren Zeitraum aufweisen.
Der funktionale Nutzen des Vibratomkulturmodells wurde durch die Behandlung von Parotid-oder submandibulären Kulturen mit einer einzigen Strahlendosis (Abbildung6, Abbildung 7, Abbildung8) angegangen. Die bisherige Arbeit in bestrahlten Mausmodellen hat sich auf die Parotiddrüse konzentriert und die Induktion von Apoptose, die bei 24 h, die Induktion der Kompensationsverbreitung ab Tag 5, die Störung der Aktin-Filamente ab Tag 5, und den Verlust von Differenzierungsmarkierungen (z.B. Amylase) am Tag 1423,24,26. Die Bestrahlung von Parotid-Vibratomkulturen führte zu einer Zunahme der Apoptose am ersten Tag, zu einer Zunahme der Proliferation am 7. Tag, zu einer Störung der Aktin-Filamente am 7. Tag und zu einer Verringerung der Amylase am 7. Tag (Abbildung6). Die Bestrahlung submandibulärer Vibratomkulturen führte zu einer Zunahme der Apoptose an den Tagen 1 und 3, zu einer Zunahme der Proliferation an Tag 7 und zu Störungen der Aktin-Filamente am 7. Tag (Abbildung7). E-cadherin-Niveaus erschienen sowohl in Parotid-als auch in submandibulären Kulturen relativ intakt, was in vivo-Beobachtungen 26 ähnlich war. Die funktionellen Akinarzellen-Marker Aqp-5 in submandibulären Drüsenabschnitten und Amylase in Parotiddrüsenabschnitten sind an Tag 14 im Vergleich zu entsprechenden unbehandelten Zeitpunkten zurückgegangen (Abbildung8). Diese Daten deuten darauf hin, dass strahleninduzierte Gewebeveränderungen, die in vivo beobachtet wurden, auch in bestrahlten Vibratomkulturen beobachtet wurden.
Bild 1: Bright-Feld-Mikroskop-Bilder von 50 μm Submandibulär Abschnitte. Submandibuläre Drüsen von weiblichen FVB-Mäusen (4-8 Wochen alt) wurden zerlegt, Auf 50 μm Dicke abgetrennt und auf organotypischen Zellkultureinsätzen für 1, 4, 7, 14 und 30 Tage nach der Trennung mit 0%, 2,5%, 5,0% und 10% fetalem Rinderserum (FBS) in den Medien kultiviert Kulturelle Besonderheiten bestimmen und Kulturbedingungen optimieren. Maßstabsge = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Durchlässigkeitsfärbung von Submandibulär Abschnitte. (A) Bright-Feld-Mikroskop-Bilder von 50 μm submandibulär von 4-bis 8 Wochen alten FBV-Mäusen zerlegt und mit Trypan-Blau (0,4%) befleckt An 1, 3, 7, 14 und 30 Tagen in der Kultur mit Medien, die 2,5% fetales Rinderserum (FBS) enthalten. (B) Bright-Feld-Mikroskop-Bilder von 90 μm submandibulären Abschnitten (linke Platte), mit trypusblau (Mittelplatte) gebeizt, halbiert und mit trypanblau (rechtes Panel) befleckt, dann bis zu 30 Tage Nachteiteilung in Medien mit 2,5% FBS kultiviert. C) Fluoreszenzbilder von 50 μm submandibulären Abschnitten, die in verschiedenen FBS-Konzentrationen kultiviert sind (0%, 2,5%, 5%, 10%) gefärbt mit Calcein AM, um lebende Zellen (grün) am Tag 7 der Kultur anzuzeigen. Maßstabsge = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3: Bewertung von proliferativen und apoptotischen Markern in Submandibulär Organotypische Gewebeseischscheiben. Submandibuläre Drüsen von weiblichen FVB-Mäusen (4-8 Wochen alt) wurden zerlegt, auf 50 μm Dicke geschnitten und in Medien kultiviert, ergänzt mit 2,5% FBS auf organotypische Zellkultur-Einsätze für 1, 3, 7, 14 und 30 Tage nach der Trennung. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Scheiben für proliferative (Ki67) und apoptotische (geträumte caspase-3) Markierungen fixiert und verfärbt. (A) Immunfluoreszierende Färbung von Ki67-positiven Zellen (grün) und Kern (blau). (B) Immunfluoreszierende Färbung von gespaltenen Caspase-3-postive-Zellen (rot) und dem Kern (blau) aus zwei Blickwinkeln einer Scheibe. Die obere Reihe zeigt aufgespaltene Caspase-3-positive Zellen am Rand einer Scheibe, und die untere Reihe zeigt geklebt caspase-3-positive Zellen aus der Mitte einer Scheibe. Repräsentative konfokale Bilder wurden aus mehreren z-Stapeln pro Zeitpunkt ausgewählt. Skalierbalken = 30 μm.
Bild 4: Präsenz von Zellstrukturen In Submandibulär Organotypische Gewebeseischscheiben . Submandibuläre Drüsen von weiblichen FVB-Mäusen (4-8 Wochen alt) wurden zerlegt, auf 50 μm Dicke geschnitten und in Medien kultiviert, ergänzt mit 2,5% FBS auf organotypische Zellkultur-Einsätze für 1, 3, 7, 14 oder 30 Tage nach der Trennung. An den angegebenen Zeitpunkten wurden die Scheiben für die entsprechenden Markierungen mit dem Kern (blau) fixiert und verfärbt. (A) Submandibuläre Abschnitte wurden an den Tagen 1, 7, 14 und 30 Nachteiler für die Niveaus von E-cadherin, glattem Muskelaktin (SMA) und F-actin (Phalloidin) ausgewertet. (B) Submandibuläre Abschnitte wurden an den Tagen 1, 3 und 7 für die Werte von CD31 (Vaskulatur) und TUBB3 (Neuronen) ausgewertet. Aquaporin-5 (Aqp5) wurde an den Tagen 1, 3, 7 und 14 ausgewertet. Repräsentative konfokale Bilder wurden aus mehreren z-Stapeln pro Zeitpunkt ausgewählt. Maßstabsge = 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 5: Auswertung von proliferativen und funktionellen Markern in PAR-organotypischen Gewebeseischen. Parotiddrüsen von weiblichen FVB-Mäusen (4-8 Wochen alt) wurden zerlegt, auf 50 μm Dicke geschnitten und in Medien kultiviert, ergänzt mit 2,5% FBS auf organotypische Zellkultureinsätze für 1, 3, 7 oder 14 Tage nach der Trennung. An den angegebenen Zeitpunkten wurden die Scheiben für die entsprechenden Markierungen mit dem Kern (blau) fixiert und verfärbt. (A) Immunfluoreszierende Färbung von Ki67-positiven Zellen (grün). B) Immunfluoreszierende Färbung von Amylase-positiven Zellen (rot). (C) Immunfluoreszierende Färbung von Aquaporin-5 (Aqp5)-positive Zellen (grün). D) Immunfluoreszierende Färbung von E-cadherin (roten) positiven Zellen. (E) Immunfluoreszierende Färbung von Neuronen, die von TUBB3 (Magneta) positiven Zellen angezeigt wird. F) Immunfluoreszierende Färbung der Vaskulatur, die durch CD31 (rote) positive Zellen angezeigt wird. Repräsentative konfokale Bilder wurden aus mehreren z-Stapeln pro Zeitpunkt ausgewählt. Maßstabsge = 30 μm; D = Duktalzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Zellveränderungen nach Bestrahlung von parotiden organotypischen Gewebeseischen. Parotiddrüsen von weiblichen FVB-Mäusen (4-8 Wochen alt) wurden zerlegt, auf 50 μm Dicke geschnitten und mit 2,5% FBS auf organotypischen Zellkultureinsätzen kultiviert. Am ersten Tag wurde eine Untergruppe von Scheiben 5 Gy-Strahlung ausgesetzt und für 2, 4 oder 8 Tage Nachteilung beibehalten (entspricht den Tagen 1, 3 und 7 Nachstrahlung). Immunfluoreszierende Färbung von unbehandelten und bestrahlten Parotidabschnitten zur Bestimmung der Werte von (A) Ki67 (grün)-positiven Zellen, (B) geteilten Caspase 3 (rote)-positive Zellen, (C) Phalloidin (Cyan)-positive Zellen, (D) Amylase (rot)-positive Zellen, und (E) E-cadherin (rote) positive Zellen. Alle Kernfärbung verwendet DAPI (blau). Repräsentative konfokale Bilder wurden aus mehreren z-Stack pro Zeitpunkt ausgewählt. Maßstabsge = 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Zelluläre Veränderungen nach Bestrahlung submandibulärer organotypischer Gewebeseige . Submandibuläre Drüsen von weiblichen FVB-Mäusen (4-8 Wochen alt) wurden zerlegt, auf 50 μm Dicke geschnitten und in Medien kultiviert, ergänzt mit 2,5% FBS auf organotypischen Zellkultureinlagen. Am ersten Tag wurde eine Untergruppe von Scheiben mit 5Gy bestrahlt und für 2, 4 oder 8 Tage Nachteilung beibehalten (entspricht den Tagen 1, 3 und 7 Nachstrahlung). Immunfluoreszierende Färbung von unbehandelten und bestrahlten submandibulären Abschnitten zur Bestimmung der Niveaus von (A) Ki67 (grüne)-positive Zellen, (B) getastete Caspase 3 (rot)-positive Zellen, (C) Phalloidin (Cyan)-positive Zellen, (D) Aquaporin 5 (Aqp5) (grün)-positive Zellen, und (E) E-cadherin (rot) positive Zellen. Alle Kernfärbung verwendet DAPI (blau). Repräsentative konfokale Bilder wurden aus mehreren z-Stack pro Zeitpunkt ausgewählt. Maßstabsge = 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Funktionelle Akinarmarker in bestrahlten Parotid-und submandibulären organotypischen Gewebeseischscheiben. Submandibuläre und parotide Drüsen von weiblichen FVB-Mäusen (4-8 Wochen alt) wurden zerlegt, auf 50 μm Dicke geschnitten und in Medien kultiviert, ergänzt mit 2,5% FBS auf organotypische Zellkultureinsätze. Am ersten Tag wurde eine Untergruppe von Scheiben mit 5Gy bestrahlt und 14 Tage lang nach der Bestrahlung aufrechterhalten. Die immunluoreszierende Färbung von unbehandelten (UT) und bestrahlten (IR) Abschnitten wurde verwendet, um die Konzentrationen von (A) Aquaporin-5 (Aqp5) (grün)-positive und (B) Amylase (rot)-positive) Zellen zu bestimmen. Alle Kernfärbung verwendet DAPI (blau). Repräsentative konfokale Bilder wurden aus mehreren z-Stack pro Zeitpunkt ausgewählt. Maßstabsge = 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Speicheldrüsenforschung hat eine Reihe von Kulturmodellen genutzt, darunter verewigte 2-D-Kulturen, primäre 2-D-Kulturen, 3-D-Salisphere-Kulturen und 3-D-Organkulturen von embryonalen Explanten, um Fragen zur zugrunde liegenden Biologie und Physiologie zu klären. Diese Kulturmodelle haben in einer Vielzahl von Forschungsfragen aufschlussreiche Informationen geliefert und werden auch in Zukunft wichtige Werkzeuge in der Speichelforschung sein. Zu den Grenzen dieser Kulturmodelle gehören die Modulation der p53-Aktivität während der Verewigung, die vorübergehende Lebensfähigkeit der Primärkulturen, der Verlust von Differenzierung und heimlichen Proteinen in der Kultur sowie die Unfähigkeit, Zellzellen, Zell-ECM und Polarität zu bewerten. Wechselwirkungen im Erwachsenengewebe. Die erste organotypische Scheibenkultur (vibratome sektionierte Kulturen) für Speicheldrüsen wurde2008 18 veröffentlicht; Diese Technik ist in diesem Bereich jedoch trotz häufigen Einsatzes in anderen Bereichen weitgehend wenig genutzt worden. Die Arbeit kultivierte Parotidabschnitte für 48 Stunden, die die Fähigkeit, diese Abschnitte für chronische Effekte nach Strahlenbehandlung zu studieren oder die Verwendung von Transflektions-oder Transduktionsprotokollen für Phenotypen nach Manipulation bestimmter Gene beschränkt. Die hier beschriebene Methode wurde optimiert, um längere Zeit in der Kultur zu ermöglichen, hochauflösende Bilder durch konfokale Mikroskopie zu erzeugen, eine Methode zur Untersuchung der intra-und interzellulären Dynamik auf einem 3-D-Abschnitt zu liefern und strahlenbedingte Veränderungen während Eine Kulturperiode von mindestens 14 Tagen.
Während jeder Schritt für die Umsetzung der Technik erforderlich ist, sind einige Schritte entscheidend für eine erfolgreiche Sektionierung und Pflege der Kultur. Dazu gehören das Schneiden der Speicheldrüsenscheiben, die Erhaltung der Scheiben in der Kultur sowie die Färbung und Abbildung der Scheiben mit konfokaler Mikroskopie. Das vorgestellte Protokoll stellt einige Herausforderungen dar, die Geduld und Übung erfordern, um optimale Analysescheiben zu erhalten. Die folgenden Vorschläge werden bei der erfolgreichen Durchführung dieses Protokolls helfen. Es ist zwingend erforderlich, die Speicheldrüse nach der Trennung vollständig vom umgebenden Bindegewebe zu isolieren. Das Restgewebe führt dazu, dass die Vibratomklinge die Drüse aus dem Agarcha-Block herauszieht und das Gewebe wieder in den Acharose eingebettet werden muss. Dies kann eine große Einschränkung sein, da eine mehrfache Neueinbettung die Kontaminierungschancen erhöhen und die Lebensfähigkeit der Scheiben verringern kann. Dies ist besonders wichtig für die Kultivierung von Parotiddrüsen, da die Parotiddrüsen stärker in der Struktur lobulär sind und daher eher Fremdgewebe haben.
Die Zugabe von 1% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (PSA) zu allen Flüssigkeiten einschließlich der Pufferschale, der Scheibensammlung und der Vibratome Medien minimiert die Verunreinigung der Scheiben nach der Trennung. Die Variation der Achrokonzentration wurde zur Optimierung des erfolgreichen Schneidens eingesetzt. Aufgrund der Dichte der Speicheldrüsen waren 1,9% der Acharchinen zu weich, und die Drüsen wurden leicht aus dem Block entfernt. Vibratome Sektionierung in anderen Feldern haben 5,0% der Agarose verwendet; Dies führte jedoch zu zackigen Schnitten und Scheiben waren suboptimal. Nach mehreren Agange-Sehandelzuständen waren 3% der optimale, um das Gewicht und die Festigkeit des Gewebes zu unterstützen. Besonders gut war die in Warner et al. und Su et al. verwendete Agary-Konzentration ebenfalls bei 3%19,20.
Zusätzlich können der Winkel, die Schwingungsfrequenz und die fortschreitende Geschwindigkeit der Klinge auf der Grundlage des zu zerstretenden Gewebes verändert werden. Für submandibuläre und parotide Speicheldrüsen waren ein 15 °-Winkel, eine Geschwindigkeit von 0,75 mm/s und eine Frequenz von 100 Hz geeignet. Durch die Weichheit der Speicheldrüsen erforderten die optimalen Schnittbedingungen, dass die Klinge bei hoher Vibration langsam durch das Gewebe vorwärts rückte. Für die Immunfluoreszenzfärbung sind die Durchlässigkeit, die Dauer der Inkubationen und Waschschritte für optimale Flecken unerlässlich. Taucht eine positive Färbung nur in den äußeren Schichten der Gewebescheibe auf, kann eine strengere Durchlässigkeit mit Proteinase K erforderlich sein, während ungleichmäßige Färbung oder hohe Hintergrundfärbung eine weniger strenge Färbung mit 0,2% Triton X-100 erfordern kann. Die Inkubationszeiten wurden für hohe Signale und niedrigen Hintergrund optimiert, die eventuell auf bestimmte primäre Antikörper zugeschnitten werden müssen. Längere Waschschritte sind wichtig, um den hohen Hintergrund zu reduzieren, und dies kann auf die spezifischen Antikörper zugeschnitten werden.
Eine wichtige Anwendung dieser Methode ist eine erweiterte kinetische Analyse nach der Strahlenbelastung von Speicheldrüsen. Vorarbeit hat sowohl akute als auch chronische Phasenveränderungen in bestrahlten Speicheldrüsen6,24,25, 26 festgestellt,und das Vibratome Kultursystem kann ein mächtiges Werkzeug sein, um die kritische Molekulare Ereignisse zu bestimmten Zeitpunkten nach der Behandlung. Zum Beispiel, strahleninduzierte zelluläre Veränderungen in der Speicheldrüse, die in der Literatur berichtet wurden, einschließlich der Reduktion der Amylase, Apoptose von Akinarzellen, Kompensationsvermehrung von Akinarzellen, Verlust der Polarität und Störungen in Zytoskelett-Struktur. Besonders, Vibratomkulturen, die ex vivo bestrahlt sind, weisen ähnliche Veränderungen in diesen Markern auf.
Darüber hinaus schwenkt die akute Phasenreaktion in Speicheldrüsen um p53-Aktivität; Allerdings ist unklar, welche Rolle p53 in späteren Zeitpunkten aufgrund der ~ 5-Tage-Lebensfähigkeit der Primärkulturen spielt. Dieses System würde ex vivo, kontrollierte Störung der p53-Aktivität zu späteren Zeitpunkten und Aufdeckung einer Rolle bei chronischen Schäden oder regenerativen Reaktionen ermöglichen. Darüber hinaus wird die Reaktion der Kompensationsverbreitung 5 Tage nach der Strahlenbehandlung eingeleitet, und es ist schwierig, die molekularen Regulatoren dieser Reaktion in vorübergehenden Primärkulturen zu definieren. Die am weitesten verbreitete Anwendung dieser Methodik wird wahrscheinlich Zellzellen, Zell-ECM und Polaritätsinteraktionen in erwachsenen Geweben umfassen. In 3-D-Organkulturen aus embryonalen Drüsen wurden wirkungsvolle Studien durchgeführt, um die komplizierte Wechselwirkung zwischen der Entwicklung von Speicheldrüsen und dem neuronalen oder vaskulären Netzwerk27,28, 29 zuentdecken. 30,31.
Die hier beschriebene Methode weist darauf hin, dass für neuronale oder Gefäßarbeiten in den submandibulären Kulturen und möglicherweise Parotidkulturen weitere Optimierungen erforderlich sind. Strahlenschäden stören auch die junktionellen Regulatoren, induzieren Kollagenablagerungen, verändert die F-actin-Organisation und moduliert Secrettifikorulat 26,30,32. Die Salivarien-Drüsenregenerationsstudien werden durch das Fehlen eines erwachsenen Modells zur Beurteilung dieser Wechselwirkungen behindert. Diese organotypische Kulturmethode kann ein System zur Anwendung fortschrittlicher molekularer Techniken bieten und die Regulierung dieser Mediatoren in einem 3-D-Kontext weiter untersuchen und neue Therapien effizient entdecken.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unter anderem durch die Pilotförderung unterstützt, die das Office of Research and Discovery and National Institutes of Health (R01 DE023534) an Kirsten Limesand zur Verfügung stellte. Der Cancer Biology Training Grant, T32CA009213, hat Wen Yu Wong unterstützt. Die Autoren danken M. Rice für seinen wertvollen technischen Beitrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
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