Summary
Использование трехмерных органотипных культур для визуализации морфологии и функциональных маркеров слюнных желез может обеспечить новый взгляд на механизмы повреждения тканей после облучения. Описанный здесь протокол к разделу, культуре, излучать, пятно, и изображение 50-90 мкм толщиной слюнных желез разделы до и после воздействия ионизирующего излучения.
Abstract
Гипосаливация и ксеростомия создают хронические устные осложнения, которые снижают качество жизни больных раком головы и шеи, которые лечатся лучевой терапией. Экспериментальные подходы к пониманию механизмов дисфункции слюнных желез и восстановления были сосредоточены на в моделях естественных условиях, которые являются инвалидами из-за неспособности систематически экран терапевтических кандидатов и эффективность в трансфекции способность манипулировать конкретными генами. Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание и кофокальные микроскопии, чтобы определить, когда конкретные популяции клеток и маркеры присутствуют в течение 30-дневного периода культуры. Кроме того, сотовые маркеры ранее зарегистрированных в в естественных условиях излучения модели оцениваются в культурах, которые облученных ex естественных условиях. Двигаясь вперед, этот метод является привлекательной платформой для быстрого ex в естественных условиях оценки мышиных и человека слюнных желез ткани ответы на терапевтические агенты, которые улучшают функцию слюнных.
Introduction
Правильная функция слюнных желез имеет важное значение для здоровья полости рта и изменяется после лечения рака головы и шеи с лучевой терапией1. В 2017, около 50 000 новых случаев рака головы и шеи были зарегистрированы в Соединенных Штатах2. Из-за повреждающих ткани и часто необратимых последствий лучевой терапии на окружающих нормальных тканях, таких как слюнные железы, пациенты часто остаются с тяжелыми побочными эффектами и уменьшением качества жизни2,3, 4. в Общие осложнения, вызванные радиационным повреждением проявляется в таких симптомах, как Ксеростомия (субъективное чувство сухости во рту), кариеса зубов, нарушение способности жевать и глотать, нарушения речи и скомпрометированных устных микробиомов2, 3-х , 4. Эти симптомы коллективно может привести к недоеданию и нарушение выживания в пострадавших лиц5. В то время как дисфункция слюнных желез в этой популяции была хорошо документирована, основные механизмы повреждения клеток ацинар были оспорены, и мало интеграции между различными моделями животных6,7.
Текущие методы изучения функции слюнной железы и радиационно-индуцированных повреждений включают использование в моделях естественных условиях, увековечены клеточных линий, двумерных (2-D) первичных клеточных культур, а также трехмерные (3-D) культуры салисферы8, 9,10,11,12. Традиционно, модели клеточной культуры от увековечены клеточных линий и 2-D культур привлекать однослоистых клеток культивировали на плоских поверхностях и ценны для быстрой, простой и экономически эффективных экспериментов. Однако, искусственные условия культуры клетки могут изменить состояние дифференцировки и физиологические реакции клеток, котор подвергли действию к различным условиям, и результаты часто не могут перевести к всем моделям организма14,15. Кроме того, увековечены клеточных культур требует модуляции р. р. деятельности, которая имеет решающее значение для реакции слюнных желез на повреждение ДНК16,17.
3-D культуры салисфера обогащаются для стволовых клеток и клетки-предшественников в раннем времени точки в культуре и были полезны для понимания радиозентивности этого подмножества слюнных желез клеток9,18. Критическое ограничение всех этих моделей культуры они неэффективны в визуализации 3-D структуры слюнной железы, в том числе внеклеточной матрицы (ЕОС) и клеточных взаимодействий в течение различных слоев, которые имеют решающее значение в модуляции слюнных секреции15. Необходимость метода, который включает в себя поведение ткани в целом, но может также манипулировать в лабораторных условиях для изучения последствий лечения необходимо для дальнейшего обнаружить основные механизмы радиационно-индуцированной слюнной железы Дисфункции.
Живая ткань секционирования и культуры был документально ранее19,20 и часто используется для изучения мозга ткани взаимодействия21. В предыдущих исследованиях, околоушной (пар) слюнных желез ткани от мышей был секционного примерно на 50 мкм и культивировали до 48 ч, и анализ жизнеспособности, гибель клеток, и функция была выполнена после19. SU et al. (2016) расширена по этой методологии путем культивирования человеческих Подчелюстные железы (SMGs) секционные на 35 мкм или 50 мкм в течение 14 дней20. Предлагаемый метод является продвижение в том, что она включает в себя как околоушной и подчелюстной слюнных желез секционные на 50 мкм и 90 мкм и оценка культур в течение 30 дней. Способность вырезать диапазон толщины ткани имеет важное значение при оценке клеточных и клеточных взаимодействий, которые актуальны для клеточных процессов, включая апокально-базолатеральной полярности и иннервации для секреции. Кроме того, ломтики слюнной железы были облучены в то время как в культуре, чтобы определить целесообразность этой модели культуры для изучения радиационно-индуцированных повреждений слюнных желез.
Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Чтобы определить максимальное время разделы, которые являются жизнеспособными после рассечения, ТриАН синего окрашивания, живые окрашивание клеток, и иммуногистолехимического окрашивания для клеточной смерти были выполнены. Кофокальная микроскопия и иммунолюминесцентная окрашивание использовались для оценки популяции конкретных клеток, морфологических структур и уровней распространения. Ткани раздел культур также подвергаются ионизирующего излучения для определения последствий излучения на различных маркеров в этой 3-D модели. Индукция клеточной смерти, разрушение цитоскелета, потеря маркеров дифференциации, и компенсационного распространения в облученных ex естественных условиях культуры были по сравнению с предыдущими исследованиями в моделях естественных условиях. Эта методология предоставляет средства для изучения роли клеточных взаимодействий после радиационного поражения и обеспечивает экспериментальную модель для эффективной оценки эффективности терапевтических вмешательств (манипуляции генами или фармакологические агенты ), которые могут быть менее подходящими для в естественных условиях моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление вибратома
- Спрей съемные компоненты вибратом включая буфер лоток, лезвие крепления, агарозы блок плесень, и лабораторный фильм с 70% этанола, то УФ-стерилизации, по крайней мере 30 мин.
- Поместите и закрепите дополнительный лист лабораторной пленки над буферным лотком, чтобы предотвратить падение льда.
- Заполните ледяную камеру колотым льдом, снимите лабораторный фильм из буферного лотка и заполните буфер с 100 мл ледяного раствора 1x фосфата-буферного раствора (PBS), дополненное 1% пенициллин-стрептомицин-ампициллин (PSA).
- Поместите лезвие бритвы из нержавеющей стали в держатель лезвия. Используйте отвертку, чтобы затянуть/ослабить и изменить угол лезвия.
2. Подготовка образца ткани в блоке агарозы и секционирование с использованием вибратомы
- Автоклав все необходимые рассечение и секционирования инструменты, включая щипцы, ножницы и кисти.
- Подготовка 3% низкая точка плавления агарозы в стерильных 1x PBS и микроволновой печи, пока агарозы растворяется в растворе. Убедитесь, что раствор не кипятить и вихревой бутылку периодически смешивать.
Примечание: предотвратите низкоплавное агарозы от затвердевать путем держать его в ванне теплой воды. Низкоплавное агарозы жидкости при температуре 37 ° c и устанавливает при температуре 25 °C. Однако, водяной бане должен быть ниже 40 ° c для того, чтобы вылить агарозы вокруг ткани при физиологической температуре. - Изолировать слюнных желез и поместить расчлененные ткани на 2 мл ледяной 1x PBS дополнены 1% PSA в стерильных, 30 мм блюдо культуры.
- Использование автоклапинных щипцов, удаление слюнных желез от 1x PBS + 1% PSA решение и положение в нижней части вложения плесени. Заполните плесень с жидкостью 3% низкая точка плавления агарозы для покрытия ткани.
- Используя щипцы, отрегулируйте ткань к середине блока и положение слюнной железы в соответствующем плоскости. Лучшие поперечники для подчелюстной и околоушной железы находятся в вертикальной плоскости.
- Место агарозы блока на льду в течение 10 минут, чтобы затвердевать.
- Аккуратно Запустите лезвие бритвы вокруг внешнего края агарозы, чтобы ослабить и пусть блок слайд на УФ-стерилизовать лабораторный фильм из шага 1,1.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать в коробке агарозы, содержащей слюнные железы. Убедитесь, что плоскость раздела прямая и параллельная противоположной стороне блока (поверхность, которая будет приклеена). Так как агарозы не проникают в ткань, не обрезайте слишком много агарозы вокруг ткани, поэтому ткань будет хорошо поддерживаться.
- Используйте суперклей для прикрепления блока к режущей поверхности.
- Секция на 50 мкм или 90 мкм толщина от вибратомы со скоростью 0,075 мм/с и частотой 100 Гц.
Примечание: Настройка вибратомы на самой высокой частоте и низкая скорость лезвия обеспечивает наиболее оптимальные ломтики. - Соберите разделы в 24-хорошо ткань культуры блюдо, содержащее ~ 1 мл ледяной PBS на хорошо использованием автоматической, натуральные волосы кисти, поместив кисть в 70% этанола между срез коллекций для поддержания бесплодия.
3. секции культивирования
- Автоклав микро-шпатель и щипцы.
- Сделать фондовом вибратомы культуры СМИ с или без плода бычий сыворотки (ФПС): ДМЭМ/F12 СМИ дополнены 1% PSA, 5 мкг/мл трансферрин, 1,1 мкм гидрокортизон, 0,1 мкм ретиноевой кислоты, 5 мкг/мл инсулина, 80 нг/мл эпидермального фактора роста, 5 мм L-глютамина, 50 мкг/мл гентатаин сульфат, и 10 мкл/мл смесь трассировки элементов. Добавьте соответствующее количество ФПС, чтобы сделать 0%, 2,5%, 5,0%, или 10% решений.
- До секционирования, добавить 300 мкл предварительно нагреваемых средств массовой информации и поместить 12 мм диаметром, 0,4 мкм поры размера мембраны вставки в каждый колодец 24-хорошо ткань культуры пластины. Средства массовой информации должны достичь дна мембраны для создания интерфейса жидкостного воздуха для культуры.
- Аккуратно положите слюнные разделы поверх вставки мембраны с помощью микро-шпателя и культуры при температуре 37 ° c в увлажненный 5% CO2 и 95% атмосферы воздуха инкубатора.
- Добавьте приблизительно 300 мкл первичных сред культуры в колодец и несколько капель в мембранные вставки (приблизительно 40 мкл) через день или по мере необходимости. Надлежащее культивирование показало, что клетки способны выживать и поддерживаться до 30 дней ex естественных условиях.
4. облучение участков слюнных желез
- Лечить разделы с одной дозой излучения (5 гр) с использованием кобальта-60 (или эквивалент) irрадиатор.
- Транспорт разделы для irрадиатор объекта с помощью крытого контейнера пенополистирола, чтобы избежать колебаний температуры. Кроме того, необходимо позаботиться во время транспортировки обратно в лабораторию инкубатор для обеспечения того, чтобы средства массовой информации не брызгать на культуру крышкой и вызвать загрязнение.
- Поместите 24-хорошо пластины, содержащие участки слюнной железы 80 cm от источника излучения, в центре 32 "х 32" поле излучения. Расчеты дозы излучения и соответствующее время в радиаторе будут варьироваться в зависимости от прибора и распада кобальта-60.
- Продолжайте мониторинг и культивирование этих разделов, как описано в разделе 3.
5. пятнать жизнеспособности
- Аспирин старых средств массовой информации и мыть ломтики дважды стерильные, предварительно нагретой 1x PBS.
- Окрашивание участков с синей краской трипона.
- Используйте микро-шпатель для перемещения ломтик от культуры к стеклянной слайде.
- Добавить 0,4% трипаное синее решение на срез вибратомы с достаточным объемом для покрытия ткани (10 – 20 мкл).
- Инкубировать ломтики при комнатной температуре (RT) в синий трипаном для 1-2 мин для красителя проникать в ткань. Нежизнеспособные клетки будут окрашены в синий цвет, а жизнеспособные клетки будут незапятнанными.
- Пятно разделы с calcein, AM живой-клеточной краски.
- Добавить достаточное количество пятен, чтобы покрыть секции в одном хорошо 24 хорошо пластины (200-300 мкл).
- Инкубировать ломтики на RT в течение 15 мин, чтобы позволить красителя проникновения.
- Аккуратно удалите секцию из колодца и поместите на стеклянную горку. Гора ломтики с 1 капля монтажа средств массовой информации.
- Разделы изображения на флуоресцентном микроскопе при возбуждении/излучении длин волн 488 нм и 515 нм.
6. антитело окрашивание участков вибратома
Примечание: ниже приводится общий окраски антител протокол специфическое для Ki-67; Однако, этот протокол может быть использован с любым антителом. Все мойки проводятся в РТ, если не указано иное.
- В мульти-хорошо ткани культуры блюдо, аспирин от средств массовой информации и мыть по крайней мере 2x стерильных 1x PBS.
- Исправьте разделы с помощью 4% параформальдегида (ФА) на ночь при температуре 4 °C.
- Аспирин от 4% и мыть 3x с PBT [1x PBS, 1% бычьего сыворотки альбумина (БСА), 0,1% тритон X-100].
Примечание: разделы могут храниться в 1x PBS при температуре 4 °C и окрашиваются в более позднее время. Максимальное время хранения, испытано в этой рукописи, составляло 3 недели. Более длительное время хранения необходимо будет оптимизировать отдельным пользователем, если это желательно. - Проникая разделы с использованием 0,3% Тритон X-100 в 1x PBS в течение 30 мин.
Примечание: этот шаг можно доработать и оптимизировать для специфически пятнать и проникания антитела. - Pipet от раствора перностизации.
- Вымойте ломтики 3x в течение 5 минут с 1x PBS, 1% БСА, и 0,1% тритон X-100 (PBT).
- Блок ломтики с блокирующим агентом с 1% нормальный козьего сыворотки для 1 ч.
- Вымойте ломтики 3x в течение 5 минут с PBT.
- Инкубировать ломтики ночь на 4 ° c с 500 мкл анти-Ki67 кролика моноклональных антител разбавленных в 1% БСА в 1x PBS.
Примечание: для Фаллоидин окрашивание, пропустить шаг 6,9 и продолжить использовать протокол для конкретного phаллоидин используется. На ДНК-контрапятно, перейдите к шагу 6,15. - Аспирин анти-Ki67 кролика моноклональных антител.
- Вымойте ломтики 6X в течение 5 минут в 1x PBS.
- Инкубировать ломтики в 500 МКН из флуоресцентно спряженных вторичных антител совместимы с антителом Anti-Ki67 разбавленным в 1% БСА в 1x PBS на RT для 1,5 h покрыты от света.
Примечание: основано на вторичной антитело используемой, время инкубации с вторичным антителом можно более добавочным оптимизировать индивидуальным потребителем. Кроме того, вторичное антитело является светочувствительным. Все последующие мойки должны выполняться в темноте. - Аспирин вторичных антител.
- Вымойте ломтики для 3x в течение 5 минут с 1x PBS.
- Вымойте ломтики на 5 минут в обожионизированной воде.
- Контрпятно ломтики с DAPI (1мкг/мл) в течение 20 минут на RT.
- Вымойте ломтики (один раз) на 5 минут в обожионизированной воде.
- Гора ломтики с одной каплей (~ 40 мкл) монтажа средств массовой информации. Чтобы избежать лишних пузырей, медленно поместите покрывало на монтажные носители на слайде, начиная с угла 45 °.
- Чтобы предотвратить дробление толстых участков с помощью комбинезона, установите каждый кусочек с помощью прокладки. Прокладка может быть создана путем размещения обода вакуумной смазки в квадрат вокруг ткани раздела.
- При укладке кроя, края покрышек можно запечатать вакуумной смазкой. Нажмите на края комбинезона с большим пальцем, чтобы твердо придерживаться его на слайде. Кроме того, печать покрывало на Микроскоп слайд, используя четкие Лак для ногтей.
7. секции вибратоза изображений
- Изображение окрашенных слайдов в течение 5 дней окрашивания.
- Получить оптические разделы окрашенных фрагментов вибратомы с помощью конфокального микроскопа. С помощью конфокального микроскопа, получить z-стек на определенный шаг размер или принять отдельные изображения в зависимости от пользовательского экспериментального дизайна. Изображения могут быть рассмотрены на любом экране компьютера после конфокальной коллекции.
Примечание: из-за толщины ломтиков вибратомы рекомендуется использовать кофокальный Микроскоп или область с возможностью стека z для визуализации деталей в образцах. Для изображений, используемых в этой рукописи, была использована 63-х нефтяная цель; Однако, это может быть приспособлена и дополнительно модифицирована индивидуальным пользователем и конкретной сферой применения. Рекомендованное разрешение пикселей для каждого объективного и зум-фактора с предполагаемыми сэмплирования Найквиста 2,5 пикселей в X и Y для мельчайших оптически разрешимых структур. Тем не менее, некоторые комментаторы предлагают 2,3 пикселей, в то время как другие предполагают 2,8 пикселей. Пожалуйста, обратитесь к справочнике биологической Кофокальной микроскопии22 для получения дополнительной информации о том, как сделать эти расчеты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первичные 2-D культуры выращиваются в фетальной сыворотке говядины (ФПС) дополнены средствами массовой информации в то время как первичная 3-D культура салисферы, как правило, культивируются в сыворотке без условий10,11. Кроме того, два предыдущих исследования, использующие вибратомы культур из слюнных желез культивируемых их разделы в 0% или 10% ФПС дополнены СМИ19,20. Подчелюстные кусочки мыши были секционные при толщине 50 мкм с использованием вибратомы и оптимальные условия культуры определились с помощью серии концентраций ФПС (0%, 2,5%, 5,0% и 10%). Чтобы определить характеристики выживания, изображения микроскопа яркого поля были взяты в дни культуры 1, 4, 7, 14 и 30 после секционирования (рис. 1). Кроме того, участки железа были запятнанны 0,4% триканской синей краской и запечатлена с помощью ярко-полевого микроскопа в 40x на указанных временных точках (рис. 2A). Нежизнеспособные клетки были запятнанными синими, а жизнеспособные клетки оставались ясными.
Аналогичным образом, чтобы определить выживаемость толще ломтики секционные на 90 мкм, яркий-полевой Микроскоп изображения с и без Трифена синего окрашивания были приняты в день 30 в культурах дополнены 2,5% ФБС (рис. 2B). Из-за толщины ломтик, 90 мкм разделы окрашенных трибан синий краситель были отображаемого целом затем разрезать пополам для того, чтобы оценить центр ломтик (рис. 2B). Как подтверждение, краситель живой клетки использовался для оценки выживаемости клеток в различных условиях культивирования ФПС (Диаграмма 2C). В ярко-полевых изображениях наблюдались высокие уровни полупрозрачных, сохранившиеся ячейки в тканях, отделанные как на 50 мкм, так и на 90 мкм. Интересно, что разделы стали темнее и общая ткань области конденсируется с течением времени в культуре, но значительная часть раздела, как представляется, пережить 30-дневный период культуры (рис. 1, рис. 2). Эта конденсация наиболее очевидна в условиях 0% и 10% культивирования ФПС. Синие положительные ячейки трипона наблюдались по периметру всех участков независимо от условий культивирования, и наблюдалось увеличение в 0%-й зоне культуры трипона в 10% в сравнении с более высокими условиями культивирования ФПС (рис. 2A , 2b).
Использование живого пятна ячейки, разделы культивируемых в 0% показали наименьшее количество окрашивания, а также добавление ФПС к культуре СМИ улучшилось количество живых клеток. Взятые вместе, разделы культивируемых в 0% ФПС показали, видимых тканей конденсации, повышенный трипане синий окрашенных областях, и низкий уровень живой ячейки окрашивания. Добавление 2,5% ФПС в культурах улучшилось количество полупрозрачных тканей, снизилась трипане синий положительный области, и увеличил уровень живой ячейки окрашивания. Дополнительное увеличение концентрации ФПС, как представляется, не улучшает выживаемость тканей; Таким образом, 2,5% ФПС в вибратоме СМИ были оптимальной концентрацией ФПС и использовались как условие культуры для всех последующих экспериментов.
Чтобы определить жизнеспособность поднижнечелюстной ex естественных тканей ломтиками после рассечения, пролиферативные и Апоптотические маркеры были оценены в дни 1, 3, 7, 14 и 30 в культуре. Пролиферативная активность оценивалась на Ki67 иммуноокрашивания в подмножестве кусочков культуры (Рисунок 3A). Ki67 положительные клетки наблюдались на всех точках времени оценены и продолжаемый для того чтобы присутствовать на 30-ое день в культуре, с минимальными разницами между пунктами времени. Аналогичным образом, степень апоптоза была оценена путем расщепляя caspase-3 иммуноокрашивания в отдельном подмножестве разделов (рисунок 3B). Низкий уровень расщепляемый caspase-3 положительных клеток наблюдалось во все временные точки до 14-дневного дня в культуре, в то время как день 30 условия, как представляется, имеют небольшое увеличение числа расщепляемого caspase-3 положительных клеток в некоторых областях. Оценка краев ткани не выявили более высокие уровни расщепляют caspase-3, который не повторять трипана синего окрашивания (рис. 2). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что сигналы для распространения и жизнеспособности оставались в вибратоме культур в течение 30-дневного периода оценки.
Толстые секции вибратомы культур позволяют возможность оценить взаимодействия между клеточных составляющих определенной ткани на глубине, которая включает в себя более чем одной толщины эпителиальной клетки в каждом направлении. Кроме того, важно, чтобы иметь возможность культуры как крупных слюнных желез, так как они различаются по составу слюнных белков, гистологическую архитектуру, радиосенсибилизация, и другие критические особенности. Для определения различных клеточных популяций в субчелюстной культуре железы, подчелюстные секции были запятнанны E-кадхерин (E-CAD) для обнаружения эпителиальных клеток, гладких мышц актин (СМА) для выявления миоэпителиальных клеток, и актин нитей (фаллайдин), чтобы обнаруживать цитоскелеттовые структуры в течение 30 дней в культуре (рис. 4A).
E-кадхерин окрашивание наблюдалось на мембране большинства клеток и обнаружено в течение 30-дневного периода культуры. Клетки СМА + были обнаружены на протяжении всего периода культуры, с аналогичными уровнями в каждый момент времени. Цитокелтовой Организации актин нитей также, как представляется, поддерживается в каждый момент оценки. В отличие от этого, были Сотовые маркеры, которые не были последовательно поддерживается в течение всего периода оценки и они включали CD31 (сосудов), TUBB3 (нейроны), и Аквапорин-5 (AQP-5, ацинар маркер) (рис. 4B). Сосудистые структуры через конфокальные стеки были четко отмечены в дни 1 и 3 посткультуры; Однако, эти структуры появились фрагментарный в день 7. Аналогичным образом, нейрональных процессов были нетронутыми в течение первого дня культуры, появились уменьшилась в день 3, и впоследствии были потеряны в день 7 в культуре. Aqp5 + клетки наблюдались в дни 1, 3, 7, и 14 в культуре; Хотя, на 14 день, общий уровень окрашивания, как представляется, быть сокращены, с более зернистого сходства в оставшихся положительных клеток. Эти данные предполагают, что подчелюстные культуры содержат разнообразие составляющих ткани с обслуживанием сосудистых и нейрональных типов клеток для более коротких периодов культуры, и типов эпителиальных и миоэпителиальных клеток для более длительных периодов культуры.
В то время как культуры вибратомы-секционные были ранее сообщалось для околоушной слюнной железы, культуры были сохранены для 48 h, ограничивая временные рамки, в течение которых они могут быть изучены. Для того, чтобы определить, являются ли околоушной железы могут поддерживаться дольше, мышиных околоушные железы были секционные и культивировали для 1, 3, 7, или 14 дней. Меньшее количество разделов были получены из околоушной железы из-за его меньшего размера в мышах; Таким образом, 30-дневный период культуры не было предпринято. Ломтики были оценены для распространения путем иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против Ki67. Как и в поднижнечелюстной культурах, Ki67 положительных клеток наблюдались во все временные точки, указывая, что клетки поддерживают степень распространения в культуре (рис.5A).
Кроме того, была проведена оценка содержания функциональных ацинарных маркеров (Aqp5), эпителиального маркера (E-CAD) и сосудистой (CD31) и нейрональных (TUBB3) клеток. Амилаза является одним из наиболее распространенных белков, производимых дифференцированной околоушной эпителиальных клеток и часто теряется в течение 2-D культивирования первичных околоушной клетки. В вибратоме культур, амилазы наблюдалось в ацинар клеток и исключены из клеток протоков в течение 14-дневного периода культуры (рис. 5B). Как и в подчелюстной культур, Aqp5 + клетки присутствовали в околоушной культуры в каждой точке времени, с днем 14 культур выставке снижение уровней по сравнению с предыдущими точками времени (Рисунок 5C). Уровни E-кадхерин также поддерживались на мембране большинства клеток в течение 14-дневного периода культуры (рис. 5D). Нейрональные структуры, как представляется, поддерживались в течение 7-дневного периода культуры и не оценивались на более поздних временных точках (Диаграмма 5E). В отличие от них, в течение первого дня в культуре, сосудистые структуры появились нетронутыми, и только меньшие структуры присутствовали в дни 3 и 7 в культуре (Рисунок 5F). Эти данные свидетельствуют о том, что околоушной культуры сохранить свои пролиферативные возможности и наиболее функциональных возможностей для 7-14 дней в культуре и потенциально проявляют более нетронутыми структуры ткани в течение более длительного периода времени.
Функциональная полезность модели вибратомы культуры была решена при лечении околоушной или подчелюстной культур с одной дозой радиации (рис. 6, рис. 7, рис. 8). Предыдущая работа в облученных моделях мышей была сосредоточена на околоушной железы и продемонстрировал индукции апоптоза, что пики на 24 ч, индукции компенсационного распространения, начиная с 5-го дня, нарушение актин нитей, начиная с 5-го дня, и потеря маркеры дифференциации (например, амилаза) в день 1423,24,26. Облучение околоушной вибратомы культур привело к увеличению апоптоза в день 1, увеличение распространения в день 7, разрушение актин нитей в день 7, и снижение амилазы в день 7 (рис. 6). Облучение поднижнечелюстной вибратомной культуры привело к увеличению апоптоза в дни 1 и 3, увеличению пролиферации в день 7 и нарушению актин нитей в день 7 (рис. 7). E-кадхерин уровни появились относительно нетронутыми как в околоушной и подчелюстной культур, который был похож на в естественных условиях наблюдений26. Функциональные ацинарные маркеры клеток AQP-5 в подчелюстной железы разделы и амилазы в околоушной железы разделы снизилась на 14 день, по сравнению с соответствующими необработанных точек времени (Рисунок 8). Эти данные свидетельствуют о том, что вызванные радиацией изменения тканей, которые наблюдались в естественных условиях, наблюдались также в облученных культурах вибрационных.
Рисунок 1: Яркий-полевой Микроскоп изображения 50 мкм подчелюстной разделов. Подчелюстной железы от женщин FVB мышей (4-8 недель) были расчлененные, секционные до 50 мкм толщины, и культивировали на органотипных клеток культуры вставки для 1, 4, 7, 14, и 30 дней после вскрытия на 0%, 2,5%, 5,0%, и 10% плода бычьей сыворотки (ФПС) в средствах массовой информации, чтобы определять культурные особенности и оптимизировать культурные условия. Шкала баров = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2: жизнеспособность окрашивания подчелюстной разделов. (A) яркий-полевой микроскоп изображения 50 мкм поднижнечелюстной расчлененный от 4-к 8-недельного женского FBV мышей и окрашивается трикановая синяя (0,4%) на 1, 3, 7, 14 и 30 дней в культуре со средствами массовой информации, содержащими 2,5% фетальной бычьей сыворотки (ФПС). (B) яркий-полевой микроскоп изображения 90 мкм подчелюстной секции (левая панель), окрашенных в трипанный синий (средняя панель), разрезать пополам и окрашивали синий трипань (правая панель), затем культивировали до 30 дней после вскрытия в средствах массовой информации, содержащих 2,5% ФПС. C) флуоресцентные изображения 50 мкм подчелюстной секции, культивируемые в различных КОНЦЕНТРАЦИЯХ ФПС (0%, 2,5%, 5%, 10%) окрашенных calcein AM указать живые клетки (зеленый) на день культуры 7. Шкала баров = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3: Оценка пролиферативных и апоптотических маркеров в подчелюстной ломтиками органотипические ткани. Подчелюстной железы от женщин FVB мышей (4-8 недель) были расчлененные, нарезанный до 50 мкм толщины, и культивировали в средствах массовой информации дополнены 2,5% ФБС на органотипных клеток культуры вставки для 1, 3, 7, 14, и 30 дней после вскрытия. В указанные моменты времени, ломтики были фиксированными и окрашенных для пролиферативных (Ki67) и апоптотических (расщепляющих caspase-3) маркеров. А) иммунофлуоресцентное окрашивание Ki67-положительных клеток (зеленых) и ядра (синий). (B) иммунофлуоресцентное окрашивание расщепляющего caspase-3-постиствительных клеток (красных) и ядра (синий) с двух точек зрения на срез. Панель верхнего ряда отображает расщепанное caspase-3-положительные ячейки на краю ломтика, а нижняя строка строки отображает расщепанное caspase-3-положительные ячейки из середины фрагмента. Репрезентативные конфокальные изображения выбирались из нескольких z-стеков в момент времени. Шкала баров = 30 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4: Наличие клеточных структур в ходе подчелюстной ломтиками органотипические ткани . Подчелюстной железы от женщин FVB мышей (4-8 недель) были расчлененные, нарезанный до 50 мкм толщины, и культивировали в средствах массовой информации дополнены 2,5% ФБС на органотипных клеток культуры вставки для 1, 3, 7, 14, или 30 дней после вскрытия. В указанные моменты времени, ломтики были фиксированными и окрашенных для их соответствующих маркеров с ядром (синий). (A) поднижнечелюстной секции были оценены в дни 1, 7, 14, и 30 после вскрытия для уровней E-кадхерин, гладких мышц актин (СМА), и F-актина (фалалидин). (B) субмандибулярного сечения были оценены в дни 1, 3 и 7 для уровней CD31 (сосудов) и TUBB3 (нейронов). Аквапорин-5 (Aqp5) оценивали в дни 1, 3, 7 и 14. Репрезентативные конфокальные изображения выбирались из нескольких z-стеков в момент времени. Шкала баров = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 5: Оценка пролиферативных и функциональных маркеров в дольнотипипические ломтики ткани пар. Околоушной железы от женщин FVB мышей (4-8 недель) были расчлененные, нарезанный до 50 мкм толщины, и культивировали в средствах массовой информации дополнены 2,5% ФБС на органотипных клеток культуры вставки для 1, 3, 7, или 14 дней после вскрытия. В указанные моменты времени, ломтики были фиксированными и окрашенных для их соответствующих маркеров с ядром (синий). (A) иммунофлуоресцентного окрашивания Ki67-положительных клеток (зеленый). (B) иммунофлуоресцентное окрашивание амилазы-положительных клеток (красных). C) иммунофлуоресцентное окрашивание Аквапорин-5 (Aqp5)-положительных клеток (зеленых). (D) иммунолюминесцентное окрашивание E-кадхерин (красных) положительных клеток. (E) иммунофлуоресцентного окрашивания нейронов, указанных TUBB3 (магнитона) положительных клеток. (F) иммунофлуоресцентное окрашивание сосудов, указанных CD31 (красными) положительными клетками. Репрезентативные конфокальные изображения выбирались из нескольких z-стеков в момент времени. Шкала баров = 30 мкм; d = протоковой клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 6: клеточные изменения после облучения околоушной органотипические ломтики ткани. Околоушной железы от женщин FVB мышей (4-8 недель) были расчлененные, нарезанный до 50 мкм толщины, и культивировали в дополнено 2,5% ФПС на органотипные культуры клеток вставки. В день 1 после вскрытия, подмножество ломтиков подвергается воздействию 5 гр излучения и поддерживается в течение 2, 4 или 8 дней после вскрытия (соответствует дням 1, 3 и 7 после излучения). Иммунофлуоресцентное окрашивание необработанных и облученных околоушных участков для определения уровней (A) Ki67 (зеленых)-положительных клеток, (B) расщепляемого caspase 3 (красных)-положительных клеток, (C) Фаллоидин (голубой)-позитивные клетки, (D) амилазы (красные)-положительные клетки, и (e) e-кадхерин (красные) положительные клетки. Все ядерное окрашивание использовали DAPI (синий). Репрезентативные конфокальные изображения выбирались из нескольких z-стека в момент времени. Шкала баров = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 7: клеточные изменения после облучения подчелюстной органотипного ломтиками ткани. Подчелюстной железы от женщин FVB мышей (4-8 недель) были расчлененные, нарезанный до 50 мкм толщины, и культивировали в средствах массовой информации дополнены 2,5% ФБС на органотипные культуры клеток вставки. На 1-й день после вскрытия, подмножество ломтиков было облучено с 5Gy и поддерживается в течение 2, 4, или 8 дней после вскрытия (соответствует дням 1, 3 и 7 после излучения). Иммунофлуоресцентное окрашивание необработанных и облученных подчелюстных участков для определения уровней (A) Ki67 (зеленых)-положительных клеток, (B) расщепляемого caspase 3 (красных)-положительных клеток, (с) Фаллоидин (голубой)-положительных клеток, (D) Аквапорин 5 (Aqp5) (зеленый)-положительные клетки, и (e) e-кадхерин (красные) положительные клетки. Все ядерное окрашивание использовали DAPI (синий). Репрезентативные конфокальные изображения выбирались из нескольких z-стека в момент времени. Шкала баров = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 8: функциональные цинарены маркеры в облученных околоушной и поднижнечелюстной органотипно ломтиками ткани. Подчелюстной и околоушной железы от женщин FVB мышей (4-8 недель) были расчлененные, нарезанный до 50 мкм толщины, и культивировали в средствах массовой информации дополнено 2,5% ФПС на органотипные клетки культуры вставки. На 1-й день после вскрытия, подмножество ломтиков было облучено с 5Gy и поддерживается в течение 14 дней после облучения. Для определения уровней (а) амилазы-5 (Aqp5) (зеленых)-положительных клеток и (B) амилаза (красных)-положительных клеток используется иммунолюминесцентное ОКРАШИВАНИЕ необработанных (UT) и ОБЛУЧЕННЫХ участков (ИК). Все ядерное окрашивание использовали DAPI (синий). Репрезентативные конфокальные изображения выбирались из нескольких z-стека в момент времени. Шкала баров = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования слюнных желез использовал ряд моделей культуры, в том числе увековечены 2-D культур, первичных 2-D культур, 3-D культуры салисферы, и 3-D органные культуры из эмбриональных эксфолиантов для выяснения вопросов на основе биологии и физиологии. Эти модели культуры дали глубокую информацию по широкому спектру вопросов исследования и будут продолжать быть важными инструментами в исследованиях слюнных. Ограничения этих моделей культуры включают в себя модуляцию активности р 53 при увековечивание, преходящее жизнеспособность первичных культур, потерю дифференцировки и секреторных белков в культуре, а также неспособность оценивать клеточные ячейки, клеточную и полярность взаимодействий в взрослых тканях. Первый 3-D органотипных срез культуры (вибратомы секционные культур) метод для слюнных желез был опубликован в 200818; Однако, этот метод был в значительной степени недоиспользован в этой области, несмотря на частое использование в других областях. Работа культивированного околоушной секции для 48 h, что ограничивает способность изучать эти разделы для хронических эффектов после лучевой терапии или использовать перелив или транспроизводство протоколов для фенотипов после манипуляции конкретных генов. Описанный здесь метод был оптимизирован для обеспечения более длительного времени в культуре, получения изображений с высоким разрешением посредством конфокальной микроскопии, предоставления метода изучения внутриклеточной и межклеточных динамики на 3-D секции и оценки вызванных радиацией изменений во время период культуры не менее 14 дней.
Хотя для реализации методики требуется каждый шаг, некоторые шаги имеют решающее значение для успешного проведения секционирования и поддержания культуры. К ним относятся резки слюнных желез ломтиками, сохраняя ломтики в культуре, и окрашивание и изображений ломтики с конфокальной микроскопии. Представленный протокол создает некоторые проблемы, требующие терпения и практики для получения оптимальных фрагментов для анализа. Следующие предложения помогут успешно выполнять этот протокол. Крайне важно, чтобы полностью изолировать слюнной железы от окружающих соединительной ткани после рассечения. Остаточная соединительная ткань вызывает вибратому лезвие для перетаскивания железы из блока агарозы и требует, чтобы ткань была повторно встроена в агарозы. Это может быть основным ограничением, так как многократные ревложения могут увеличить вероятность заражения и уменьшить жизнеспособность ломтиков. Это особенно важно для культивирования околоушной железы, так как околоушной железы более дольковой в структуре и, следовательно, более вероятно, имеют посторонние ткани.
Добавление 1% пенициллина-стрептомицина-амфотерицина B (PSA) ко всем жидкостям, включая буферный лоток, блюдо для сбора кусочков, и средства вибратомы минимизируют загрязнение после вскрытия. Для оптимизации успешной резки использовалась вариация концентрации агарозы. Из-за плотности слюнных желез, 1,9% агарозы было слишком мягким, и железы были легко выбили из блока. В других полях секционирования вибратоматома использовали 5,0% агарозы; Однако, это вызвало неровные порезы и ломтики были субоптимальных. После тестирования нескольких процентных состояний агарозы, 3% агарозы были наиболее оптимальными для поддержания веса и твердости ткани. Примечательно, что концентрация агарозы использовалась в Warner et al. и SU et al. также 3%19,20.
Кроме того, угол, частота вибрации, и повышение скорости лезвия может быть изменен на основе ткани, чтобы быть секционные. Для подчелюстной и околоушной слюнных желез, угол 15 °, скорость 0,075 мм/с, и частота 100 Гц были подходящими для секционирования. Из-за мягкости слюнных желез, оптимальные условия резки требовали, чтобы лезвие медленно продвигаясь через ткань при высокой вибрации. Для иммунофлуоресцентного окрашивания, проникания, продолжительность инкубаций, и мыть шаги необходимы для оптимального пятна. Если положительные окрашивание появляется только в наружных слоях ткани ломтик, более строгие проникания с протеинозы K может потребоваться, в то время как неравномерное окрашивание или высокой окраски фона может потребовать менее строгие окрашивание с 0,2% Тритон X-100. Инкубационный раз были оптимизированы для высокого сигнала и низкого фона, которые, возможно, должны быть адаптированы к конкретным первичных антител. Более длинние шаги мытья необходимы в уменьшении высокого фона и это может быть приспособленные к специфическим антителам используемым.
Одним из основных применения этой методологии является расширенный кинетический анализ после радиационного облучения слюнных желез. Предварительная работа установила как острые, так и хронические изменения фазы в облученных слюнных железах6,24,25,26, и система вибратомы культуры может быть мощным инструментом, чтобы вскрыть критический молекулярные события в определенные временные точки после лечения. Например, радиационно-индуцированных клеточных изменений в слюнных желез, которые были зарегистрированы в литературе, в том числе снижение амилазы, апоптоз ацинарных клеток, компенсационных пролиферации ацинарных клеток, потеря полярности и нарушения в структуры цитоскелета. Примечательно, что вибратомы культур облученных ex естественных условиях демонстрируют аналогичные изменения в этих маркеров.
Кроме того, острый фазовый ответ в слюнных желез поворачивается вокруг активности р 53; Однако, неясно, какую роль р 53 играет в более поздних временных точках из-за ~ 5-дневной жизнеспособности первичных культур. Эта система позволит ex естественных условиях, контролируемые нарушения деятельности р 53 на более поздних точках времени и выявить роль в хронических повреждений или регенеративных реакций. Кроме того, меры по компенсационному распространению начаты через 5 дней после лучевой терапии, и трудно очертить молекулярные регуляторы этой реакции в переходных первичных культурах. Наиболее широко используемое применение этой методологии, скорее всего, будет включать клеточные ячейки, клетки-помеем и полярность взаимодействий в взрослых тканях. Впечатляющие исследования были проведены в 3-D органные культуры из эмбриональных желез, чтобы раскрыть сложное взаимодействие между развивающимися слюнных желез и нейрональных или сосудистой сети27,28,29, 30,31.
Описанный здесь метод указывает на необходимость дальнейшей оптимизации для нейрональных или сосудистых работ в подчелюстной культуре и, возможно, околоушной культуры. Радиационное повреждение также нарушает регуляторные органы, индуцирует отложения коллагена, изменяет организацию F-Actin и модулирует секреторные гранулы26,30,32. Исследования регенерации слюнных желез являются ограниченными из-за отсутствия взрослой модели для оценки этих взаимодействий. Этот метод органотипных культуры может обеспечить систему для применения передовых молекулярных методов и дальнейшего изучения регулирования этих посредников в 3-D контексте и эффективно открывать новые методы лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана в части пилотным финансированием, предоставляемый университетом Аризоны Управление исследований и открытий и национальных институтов здравоохранения (R01 DE023534) Кирстен Limesand. Обучение биологии рака Грант, T32CA009213, при условии стипендиальной поддержки Вэнь Юй Вонг. Авторы хотели бы поблагодарить м. Райс за его ценный технический вклад.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
