Summary
Användning av tredimensionella organiska kulturer för att visualisera morfologi och funktionella markörer för spott körtlar kan ge nya insikter i mekanismerna för vävnads skada efter strålning. Beskrivs här är ett protokoll till avsnitt, kultur, irradiate, fläcken, och bild 50 – 90 μm tjocka Saliv körtel sektioner före och efter exponering för joniserande strålning.
Abstract
Hyposalivering och mun torrhet skapa kroniska orala komplikationer som minskar livskvaliteten i huvud-och hals cancer patienter som behandlas med strål behandling. Experimentella metoder för att förstå mekanismer för spott körtel dysfunktion och restaurering har fokuserat på in vivo-modeller, som är handikappade av en oförmåga att systematiskt skärm terapeutiska kandidater och effektivitets vinster i transfektion förmåga att manipulera specifika gener. Syftet med detta protokoll för Saliv körtel organotypisk kultur är att utvärdera maximal tid för kulturens livs kraft och karakterisera cell förändringar efter ex vivo-strålbehandling. Vi utnyttjade Immunofluorescerande färgning och konfokalmikroskopi för att avgöra när specifika cell populationer och markörer är närvarande under en 30-dagars kultur period. Dessutom utvärderas cell markörer som tidigare rapporter ATS i in vivo-strålningsmätningar i kulturer som är bestrålade ex vivo. Att gå framåt, denna metod är en attraktiv plattform för snabb ex vivo bedömning av murina och mänskliga Saliv körtel vävnad svar på terapeutiska medel som förbättrar spott funktion.
Introduction
Ordentlig spott körtel funktion är nödvändig för oral hälsa och ändras efter huvud-och hals cancer behandling med strål terapi1. I 2017, nästan 50 000 nya fall av huvud-och hals cancer rapporterades i USA2. På grund av den vävnads skada och ofta oåterkalleliga effekter av strål behandling på omgivande normala vävnader såsom saliv körtlar, patienter är ofta kvar med allvarliga biverkningar och minskad livskvalitet2,3, med 4. Vanliga komplikationer orsakade av strålnings skador manifesteras i symtom som mun torrhet (den subjektiva känslan av mun torrhet), karies, nedsatt förmåga att tugga och svälja, tal svårigheter, och nedsatt orala mikrobiomer2, 3 för att , 4. dessa symtom kan kollektivt leda till undernäring och försämrad överlevnad hos drabbade individer5. Medan Saliv körtel dysfunktion i denna population har väldokumenterade, de bakomliggande mekanismerna för skador på acinar celler har ifrågasatts, och det finns lite integration mellan olika djur modeller6,7.
De nuvarande metoderna för att studera Saliv körtel funktion och Strålningsinducerade skador inkluderar användning av in vivo-modeller, förevigas cellinjer, tvådimensionella (2D) primära cell kulturer, och tredimensionella (3-D) salisphere kulturer8, 9,10,11,12. Traditionellt, cell kulturer modeller från förevigat cellinjer och 2-D kulturer involverar enskiktade celler odlade på plana ytor och är värdefulla för snabba, enkla och kostnads effektiva experiment. Emellertid, konstgjorda cell odlings förhållanden kan förändra differentierings status och fysiologiska svar av celler som utsätts för olika förhållanden, och resultaten ofta Miss lyckas med att översätta till hela organismen modeller14,15. Dessutom kräver odödligade cell kulturer modulering av p53-aktivitet, vilket är kritiskt för Saliv körtel reaktionen på DNA-skador16,17.
3-D salisphere kulturer berikas för stamceller och stamcells celler vid tidiga tidpunkter i kulturen och har varit användbara för att förstå radiosensitiviteten hos denna delmängd av Saliv körtel cellerna9,18. En kritisk begränsning av alla dessa kultur modeller är att de är ineffektiva i att visualisera 3D-strukturen av Saliv körtel, inklusive extracellulär matrix (ECM) och cell-cell interaktioner över olika skikt, som är avgörande för modulerande saliv utsöndringen15. Behovet av en metod som omfattar beteendet hos vävnaden som helhet, men kan också manipuleras under laboratorie förhållanden för att studera effekterna av behandlingen är nödvändigt för att ytterligare upptäcka de bakomliggande mekanismerna för strålningsinducerad Saliv körtel Dysfunktion.
Levande vävnad snittning och kultur har dokumenterats tidigare19,20 och används ofta för att studera hjärn vävnad interaktioner21. I tidigare studier, parotis (par) Saliv körtel vävnad från möss var Snittade vid cirka 50 μm och odlade för upp till 48 h, och analys av lönsamhet, celldöd, och funktion utfördes därefter19. Su et al. (2016) expanderade på denna metod genom odling av humana submandibular körtlar (SMGs) snittas vid 35 μm eller 50 μm i 14 dagar20. Den föreslagna metoden är en avancemang i att den innehåller både parotis och submandibular spott körtlar snittas på 50 μm och 90 μm och utvärdering av kulturerna för 30 dagar. Förmågan att skära en rad vävnad tjocklek är viktigt för att utvärdera cell-cell och cell-ECM interaktioner som är relevanta för cellulära processer inklusive apikal-basolateral polaritet och innervation för utsöndring. Dessutom var spott körtel skivor bestrålas medan i kulturen för att fastställa genomförbarheten av denna kultur modell för att studera strålnings-inducerad Saliv körtel skada.
Syftet med detta protokoll för Saliv körtel organotypisk kultur är att utvärdera maximal tid för kulturens livs kraft och karakterisera cell förändringar efter ex vivo-strålbehandling. För att fastställa den maximala tid avsnitt som är livskraftig efter dissektion, trypan blå färgning, levande cell färgning, och immunohistokemisk färgning för celldöd utfördes. Konfokalmikroskopi och Immunofluorescerande färgning utnyttjades för att utvärdera specifika cell populationer, morfologiska strukturer och spridnings nivåer. Vävnads sektion kulturer utsattes också för joniserande strålning för att bestämma effekterna av strålning på olika markörer i denna 3-D-modell. Induktion av celldöd, cytoskelettrelaterade störningar, förlust av differentierings markörer och kompensatorisk spridning i bestrålade ex vivo-kulturer jämfördes med tidigare studier av in vivo-modeller. Denna metod ger ett sätt att undersöka cell cellernas interaktioner efter strålnings skador och ger en experimentell modell för att effektivt utvärdera effekten av terapeutiska ingrepp (gen manipulationer eller farmakologiska agens ) som kan vara mindre lämpade för in vivo-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av vibratome
- Spraya löstagbara delar av vibratomen inklusive Buffertbricka, blad fäste, AGA ros block mögel, och laboratorie film med 70% etanol, sedan UV-sterilisera i minst 30 min.
- Placera och säkra ett extra ark med laboratorie film över buffertbrickan för att förhindra att is faller in.
- Fyll iskammaren med krossad is, ta bort laboratorie filmen från buffertbrickan och fyll buffertbrickan med 100 mL iskall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), kompletterad med 1% penicillin-streptomycin-ampicillin (PSA).
- Placera ett rakblad i rost fritt stål i blad hållaren. Använd skruvmejseln för att dra åt/lossa och ändra vinkeln på bladet.
2. beredning av vävnads prov i AGA ros-block och snittning med hjälp av vibratomen
- Autoklavera alla nödvändiga dissektion och snittning verktyg inklusive pincett, sax och penslar.
- Förbered 3% låg smält punkt AGA ros i steril 1x PBS och mikrovågsugn tills AGA ros löses upp i lösning. Se till att lösningen inte koka över och snurra flaskan regelbundet för att blanda.
Obs: förhindra låg smältning AGA ros från stelna genom att hålla den i ett varmt vatten bad. Den låg smälta AGA ros är flytande vid 37 ° c och sätter vid 25 ° c. Dock bör vatten badet vara under 40 ° c för att hälla AGA ros runt vävnaden vid fysiologisk temperatur. - Isolera saliv körtlar och placera dissekeras vävnad i 2 mL Ice-Cold 1x PBS kompletteras med 1% PSA i en steril, 30 mm kultur mat rätt.
- Använda autoklaverade pincett, ta bort saliv körtlar från 1x PBS + 1% PSA-lösning och position på botten av en inbäddning mögel. Fyll mögel med flytande 3% låg smält punkt AGA ros för att täcka vävnaden.
- Med hjälp av pincett, justera vävnaden till mitten av blocket och placera spott körtel i lämplig plan. De bästa tvärsnitt för submandibular och parotis körtlar är i det vertikala planet.
- Placera AGA ros block på isen för 10 min att härda.
- Försiktigt köra ett rakblad runt den yttre kanten av AGA ros att lossa och låt blocket glida ut på UV-steriliserad laboratorium film från steg 1,1.
- Använd ett rakblad för att skära ut en AGA ros låda som innehåller spott körtel. Se till att sektions planet är rakt och parallellt med blockets motsatta sida (den yta som ska limmas ned). Eftersom AGA ros inte infiltrerar vävnaden, inte trimma bort för mycket AGA ros runt vävnaden så att vävnaden kommer att stödjas väl.
- Använd superlim för att fästa blocket på skär ytan.
- Sektion vid 50 μm eller 90 μm tjocklek av vibratome med en hastighet av 0,075 mm/s och frekvens på 100 Hz.
Anmärkning: inställning av vibratomen vid högsta frekvens och lägsta klinghastighet ger de mest optimala skivorna. - Samla sektioner i en 24-brunn vävnad kultur mat rätt som innehåller ~ 1 mL iskalla PBS per väl med hjälp av en autoklaverad, naturlig hår pensel, placera borsten i 70% etanol mellan slice samlingar för att bibehålla sterilitet.
3. odling av sektioner
- Autoklavera en mikro-spatel och pincett.
- Gör lager vibratome kultur media med eller utan Foster nötkreatur serum (FBS): DMEM/F12 Media kompletteras med 1% PSA, 5 μg/mL transferrin, 1,1 μM Hydro kortison, 0,1 μM retinoinsyra, 5 μg/mL insulin, 80 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor, 5 mM L-glutamin, 50 μg/mL gentamicinsulfat och 10 μL/mL spårämne blandning. Lägg till en lämplig mängd FBS att göra 0%, 2,5%, 5,0%, eller 10% lösningar.
- Innan snittning, tillsätt 300 μL av förvärmda media och placera en 12 mm diameter, 0,4 μm porstorlek membran infoga i varje brunn av en 24-well vävnads kultur plattan. Medierna bör nå membranet botten för att skapa en vätske-luft gränssnitt för kultur.
- Försiktigt lägga spott avsnitten ovanpå membranet infoga med hjälp av mikro spatel och kultur vid 37 ° c i befuktade 5% CO2 och 95% luft atmosfär inkubator.
- Tillsätt ca 300 μL primär odlings medium i brunnen och några droppar in i membranen (ca 40 μL) varannan dag eller efter behov. Korrekt odling visade att cellerna kan överleva och underhållas i upp till 30 dagar ex vivo.
4. bestrålning av spott körtel sektioner
- Behandla avsnitt med en enda dos av strålning (5 Gy) med hjälp av cobalt-60 (eller motsvarande) irradiator.
- Transport sektioner till irradiator anläggning med en täckt frigolit behållare för att undvika temperaturvariationer. Dessutom måste man vara försiktig under transporten tillbaka till laboratorieinkubator för att säkerställa att medierna inte stänk på odlings locket och inducerar kontaminering.
- Placera 24-brunnen plattan som innehåller spott körtel sektioner 80 cm från strål källan, i mitten av en 32 "x 32" strålnings fält. Strålnings dos beräkningar och motsvarande tid i irradiator kommer att variera beroende på instrument och cobalt-60 förfall.
- Fortsätt att övervaka och odla dessa avsnitt enligt beskrivningen i avsnitt 3.
5. bärkraft färgning
- Aspirera gamla medier och tvätta skivor två gånger med steril, pre-värmde 1x PBS.
- Fläcken delar med trypan blått färg ämne.
- Använd en mikro-spatel för att flytta segmentet från kulturen till en glas rutsch bana.
- Tillsätt 0,4% trypan blå lösning till vibratome skiva med tillräckligt volym för att täcka vävnaden (10-20 μL).
- Inkubera skivor i rums temperatur (RT) i trypan blå i 1 – 2 min för att färg ämnet ska tränga in i vävnaden. Icke livskraftiga celler kommer att färgas blått, och livskraftiga celler kommer att vara obefläckade.
- Stain sektioner med calcein, AM levande celler färg ämne.
- Tillsätt tillräckligt med fläck för att täcka delen i en brunn av en 24 brunn-platta (200-300 μL).
- Inkubera skivor vid RT i 15 minuter för att möjliggöra färg inträngning.
- Ta försiktigt bort sektionen från brunnen och placera på en glas rutsch bana. Montera skivor med 1 droppe monterings material.
- Bild sektioner på ett fluorescerande Mikroskop vid excitation/emissions våg längder på 488 nm och 515 nm.
6. anti kroppar Färgnings vibratome sektioner
Anmärkning: följande ger ett generellt anti kropps Färgnings protokoll specifikt för KI-67; Detta protokoll kan dock användas med alla anti kroppar. Alla tvättar utförs på RT om inget annat anges.
- I multi-well vävnad kultur skålen, aspirera bort media och tvätta minst 2x med steril 1x PBS.
- Fixera sektioner med 4% paraformaldehyd (PFA) över natten vid 4 ° c.
- Aspirera av 4% PFA och tvätta 3x med PBT [1x PBS, 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100].
Obs: sektioner kan förvaras i 1x PBS vid 4 ° c och färgas vid ett senare tillfälle. Maximal lagrings tid som testades i detta manuskript var 3 veckor. Längre lagrings tid kommer att behöva optimeras av den enskilde användaren om det önskas. - Permeabilize avsnitt med 0,3% Triton X-100 i 1x PBS för 30 min.
Obs: detta steg kan modifieras och optimeras för specifik anti kropps färgning och permeabilisering. - Pipet av permeabiliseringen lösning.
- Tvätta skivor 3x för 5 min med 1x PBS, 1% BSA, och 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Blockera skivorna med blockerande medel med 1% normalt get serum i 1 h.
- Tvätta skivorna 3x i 5 min med PBT.
- Inkubera skivorna över natten vid 4 ° c med 500 μL anti-Ki67 kaninmonoklonal anti kropp utspädd i 1% BSA i 1x PBS.
Anmärkning: för phalloidin färgning, hoppa över steg 6,9 och fortsätt använda protokollet för den specifika phalloidin används. För DNA-motfärgning, gå till steg 6,15. - Aspirera anti-Ki67 kanin monoklonal anti kropp.
- Tvätta skivorna 6x i 5 min i 1x PBS.
- Inkubera skivorna i 500 μl fluorescensmarkerade konjugerad sekundär anti kropp kompatibel med anti-Ki67 anti kroppen utspädd i 1% BSA i 1x PBS vid RT för 1,5 h täckt av ljus.
Observera: baserat på sekundär anti kropp som används kan inkubations tiden med den sekundära anti kroppen optimeras ytterligare av den enskilde användaren. Dessutom är den sekundära anti kroppen ljus känslig. Alla efterföljande tvättar måste utföras i mörker. - Aspirera sekundära anti kroppar.
- Tvätta skivor för 3x för 5 min med 1x PBS.
- Tvätta skivor i 5 minuter i avjoniserat vatten.
- Counterstain skivor med DAPI (1μg/mL) för 20 min vid RT.
- Tvätta skivor (en gång) i 5 minuter i avjoniserat vatten.
- Montera skivor med en droppe (~ 40 μL) monterings material. För att undvika överskott bubblor, placera täckglasen långsamt på monterings mediet på bilden, med början med en 45 ° vinkel.
- För att förhindra krossning av tjocka sektioner med täckglasen, montera varje skiva med en spacer. En Spacer kan skapas genom att placera en fälg av vakuum fett i en kvadrat runt vävnads sektionen.
- Vid läggning av täckglasen kan kanterna på täckglasen förseglas med vakuum fett. Tryck ned täckglasets kanter med tummen för att fästa den på bilden. Alternativt kan du täta täckglasen på Mikroskop glaset med hjälp av klart nagellack.
7. Imaging vibratome sektioner
- Bild de färgade dia bilder inom 5 dagar efter färgning.
- Få optiska delar av de färgade vibratome skivor med hjälp av en konfokal Mikroskop. Med ett konfokal Mikroskop, få en z-stack på en definierad steg storlek eller ta enskilda bilder beroende på användarens experimentella design. Bilder kan undersökas på valfri dator skärm efter konfokalsamlingen.
Anmärkning: på grund av tjock leken på vibratome skivor, rekommenderas att en konfokal Mikroskop eller en omfattning med z-stack kapacitet används för att visualisera Detaljer inom proverna. För bilderna som användes i detta manuskript användes ett 63x oljemål; Detta kan dock skräddarsys och modifieras ytterligare av den enskilde användaren och den specifika omfattning som används. Rekommenderad Pixel upplösning för varje objektiv och zoomfaktor med den antagna nyquistsamplingen på 2,5 pixlar i X och Y för den minsta optiskt matchas strukturen användes. Men vissa kommentatorer föreslår 2,3 pixlar, medan andra föreslår 2,8 pixlar. Se hand boken för biologisk konfokalmikroskopi22 för mer information om hur du gör dessa beräkningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primära 2-D kulturer odlas i Foster nötkreatur serum (FBS) kompletteras Media medan primära 3-D salisphere kultur är typiskt odlade i serum-fria villkor10,11. I tillägg de två föregående studierna som använder vibratome kulturer från spott körtlar odlade deras delar upp i 0% eller 10% FBS kompletterade massmedia19,20. Mus submandibular skivor var snittas med en tjocklek av 50 μm med hjälp av en vibratome och optimala odlings förhållanden bestämdes med hjälp av en serie av FBS koncentrationer (0%, 2,5%, 5,0%, och 10%). För bestämning av överlevnads egenskaper togs bilder med ljust fält i Mikroskop på kultur dagar 1, 4, 7, 14 och 30 efter snittningen (figur 1). Dessutom var körtel sektioner färgas med 0,4% trypan blått färg ämne och avbildas med en ljus-fält Mikroskop vid 40x vid de angivna tidpunkter (figur 2A). Icke-livskraftiga celler färgas blå och livskraftiga celler förblev tydliga.
På samma sätt, för att bestämma överlevnaden egenskaper tjockare skivor snittas på 90 μm, ljus-fält Mikroskop bilder med och utan trypan blå färgning togs på dag 30 i kulturer kompletteras med 2,5% FBS (figur 2b). På grund av slice tjocklek, 90 μm sektioner färgas med trypan blå färg var avbildade hela sedan halverats för att utvärdera mitten av segmentet (figur 2b). Som en bekräftelse, en levande cell färg ämne utnyttjades för att utvärdera cell överlevnad i olika FBS odlings förhållanden villkor (figur 2C). I ljus-fält bilder, höga halter av genomskinliga, överlevande celler i vävnader snittas på både 50 μm och 90 μm observerades. Intressant, avsnitten blev mörkare och övergripande vävnad området kondenserar över tiden i kulturen, men en betydande del av avsnittet verkar överleva 30-dagars kultur period (figur 1, figur 2). Denna kondensation var tydligast i de 0% och 10% FBS odlings förhållanden. Trypan blå positiva celler observerades på omkretsen av alla avsnitt oavsett odlings förhållanden, och det fanns en ökning av trypan blått positivt cell område i 0% FBS odlings förhållanden jämfört med de högre FBS odlings förhållanden villkor (figur 2A , 2b).
Med hjälp av levande cell fläcken, de sektioner odlade i 0% visade den lägsta mängden färgning, och tillsats av FBS till kulturen Media förbättrat mängden levande celler. Sammantaget sektioner odlade i 0% FBS visade synlig vävnad kondensation, förhöjda trypan blå missfärgade områden, och de lägsta nivåerna av levande cell färgning. Tillägget av 2,5% FBS till kulturerna förbättrade mängden genomskinlig vävnad, minskade trypan blått positivt område, och ökade nivåerna av levande cell färgning. Ytterligare ökningar av koncentrationen av FBS förefaller inte förbättra vävnadens överlevnadsförmåga. Därför var 2,5% FBS i vibratome-mediet den optimala FBS-koncentrationen och användes som odlings villkor för alla efterföljande experiment.
För att fastställa genomförbarheten av submandibular ex vivo vävnad skivor efter dissektion, proliferativa och apoptotiska markörer utvärderades vid dag 1, 3, 7, 14 och 30 i kulturen. Den proliferativa aktiviteten bedömdes av Ki67 immunofärgning i en delmängd av odlings skivorna (figur 3a). Ki67 positiva celler observerades vid alla tidpunkter utvärderade och fortsatte att vara närvarande vid dag 30 i kulturen, med minimala skillnader mellan tidpunkter. Likaså utvärderades graden av apoptos genom klyvt Caspas-3 immunofärgning i en separat delmängd av avsnitt (figur 3b). En låg nivå av klyvs caspase-3 positiva celler observerades vid alla tidpunkter upp till dag 14 i kulturen, medan dag 30 förhållanden verkade ha en liten ökning av antalet klyvs caspase-3 positiva celler i vissa områden. Utvärdering av vävnads kanterna avslöjade inte högre halter av klyvt caspase-3, som inte rekapitulera trypan blå färgning (figur 2). Sammantaget tyder dessa resultat på att LED trådar för spridning och lönsamhet förblev närvarande i vibratomen kulturer under 30-dagars utvärderings perioden.
Tjocka avsnitt vibratome kulturer tillåter möjligheten att utvärdera interaktioner mellan cellulära bestånds delar i en viss vävnad på ett djup som innehåller mer än en epitelceller tjocklek i vardera riktningen. Dessutom är det viktigt att kunna odla både stora spott körtlar, eftersom de skiljer sig i sammansättningen av saliv proteiner produceras, histologisk arkitektur, radiosensitivitet, och andra viktiga funktioner. För att fastställa olika cellulära populationer i submandibular körtel kulturer, submandibular sektioner färgas med E-cadherin (E-CAD) för att upptäcka epitelceller, slät muskelaktin (SMA) för att upptäcka myoepitelceller, och aktin filament (phalloidin) att upptäcka cytoskeletala strukturer under de 30 dagarna i kulturen (figur 4a).
E-cadherin färgning observerades på membranen i en majoritet av cellerna och upptäcktes under hela 30-dagars kultur perioden. SMA +-celler upptäcktes under hela kultur perioden, med liknande nivåer vid varje tidpunkt. Cytoskeletala organisation av aktin glöd trådar verkade också bibehållas vid varje tidpunkt punkt utvärderas. Däremot fanns det cellulära markörer som inte var konsekvent upprätthålls under hela utvärderings perioden och dessa inkluderade CD31 (kärl teckning), TUBB3 (neuroner), och Aquaporin-5 (AQP-5, acinar markör) (figur 4b). Vaskulära strukturer genom konfokalstackarna observerades tydligt vid dag 1 och 3 efter kultur; dessa strukturer verkade dock fragmenterade på dag 7. Likaså var neuronala processer intakt under den första dagen av kulturen, verkade minskat på dag 3, och senare förlorade på dag 7 i kulturen. Aqp5 + celler observerades vid dag 1, 3, 7 och 14 i kulturen; om än, på dag 14, den totala infärgnings nivån verkade minska, med en mer detaljerad likhet i de återstående positiva cellerna. Dessa data tyder på att submandibular kulturer innehåller mångfalden av vävnad bestånds delar med underhåll av de vaskulära och neuronala cell typer för kortare kultur perioder, och epitelial och myoepithelial cell typer för längre kultur perioder.
Medan vibratome-sejerade kulturer har tidigare rapporter ATS för parotis spott körtel, kulturerna upprätthölls för 48 h, vilket begränsar den tidsram under vilken de kunde studeras. För att avgöra om parotis körtlar kan upprätthållas för längre, murina parotis körtlar var snittas och odlade för 1, 3, 7, eller 14 dagar. Färre sektioner erhölls från öronspottkörteln på grund av dess mindre storlek i möss; Därför gjordes inte en 30-dagars kultur period. Skivor utvärderades för proliferation av Immunofluorescerande färgning med anti kroppar mot Ki67. I likhet med submandibular kulturer, Ki67 positiva celler observerades vid alla tidpunkter, vilket tyder på att cellerna upprätthåller en grad av spridning i kulturen (figur 5a).
Dessutom, upprätthållandet av funktionella acinar markörer (α-amylas och Aqp5), en epitelial markör (E-CAD), och vaskulär (CD31) och neuronala (TUBB3) cell populationer utvärderades. Amylas är en av de mest förekommande proteiner som produceras av differentierade parotis epitelceller och ofta förlorade under 2-D odling av primära parotis celler. I de vibratome kulturer, amylas observerades i acinar celler och uteslutas från de duktal cellerna under hela 14-dagars kultur period (Figur 5b). I likhet med submandibular kulturer, Aqp5 + celler var närvarande i parotis kulturer vid varje tidpunkt, med den dag 14 kulturer uppvisar minskade nivåer jämfört med tidigare tidpunkter (figur 5c). E-cadherin nivåer upprätthölls också på membranen i en majoritet av cellerna under 14-dagars kultur period (figur 5D). Neuronala strukturer verkade bibehållas under 7 dagar kultur perioden och bedömdes inte vid senare tidpunkter (figur 5E). Däremot verkade kärl strukturer intakt under den första dagen i kulturen, och endast mindre strukturer var närvarande på dag 3 och 7 i kulturen (figur 5F). Dessa data tyder på att parotis kulturer bibehålla sin proliferativa förmåga och mest funktionella kapacitet för 7-14 dagar i kulturen och potentiellt uppvisar en mer intakt vävnads struktur för en längre tidsram.
Den funktionella nyttan av vibratome kulturen modellen behandlades genom att behandla parotis eller submandibular kulturer med en enda dos av strålning (figur 6, figur 7, figur 8). Tidigare arbete i bestrålade mus modeller har fokuserat på öronspottkörteln och visat induktion av apoptos som toppar vid 24 h, induktion av kompensatorisk proliferation börjar vid dag 5, störningar av aktin glöd trådar från dag 5, och förlust av differentierings markörer (t. ex. amylas) efter dag 1423,24,26. Bestrålning av parotis vibratome kulturer ledde till ökningar i apoptos dag 1, ökningar i proliferation vid dag 7, störningar av aktin filament vid dag 7, och minskningar av amylas dag 7 (figur 6). Bestrålning av submandibular vibratome kulturer ledde till ökningar i apoptos vid dag 1 och 3, ökningar i proliferation på dagen 7, och störningar av aktin filament på dag 7 (figur 7). E-cadherin nivåer verkade relativt intakt i både parotis och submandibular kulturer, som liknade in vivo observationer26. De funktionella acinar cell markörer AQP-5 i submandibular körtel sektioner och amylas i parotis körtel avsnitt minskade på dag 14, jämfört med motsvarande obehandlade tidpunkter (figur 8). Dessa data tyder på att strålnings-inducerad vävnads förändringar som observerades in vivo observerades också i bestrålade vibratome kulturer.
I figur 1: Ljust-sätta in Mikroskop avbildar av 50 μm submandibular avsnitt. Submandibular körtlar från kvinnliga FVB möss (4-8 veckor gamla) var dissekerade, snittas till 50 μm tjocklek, och odlade på organotypisk cell kultur insatser för 1, 4, 7, 14, och 30 dagar efter dissektion på 0%, 2,5%, 5,0%, och 10% Foster bovint serum (FBS) i media för att bestämma kultur egenskaper och optimera odlings förhållandena. Skal streck = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bärkraft färgning av submandibular avsnitt. (A) ljus-fält Mikroskop bilder av 50 μm submandibular dissekerade från 4-till 8-veckors gamla kvinnliga fbv möss och färgas med trypan blå (0,4%) vid 1, 3, 7, 14 och 30 dagar i kultur med media som innehåller 2,5% Foster bovint serum (FBS). (B) ljus-fält Mikroskop bilder av 90 μm submandibular sektioner (vänster panel), färgas med trypan blå (mellersta panelen), halveras och färgas med trypan blå (höger panel), sedan odlade till 30 dagar efter dissektion i media som innehåller 2,5% FBS. C) fluorescerande bilder av 50 μm submandibulär sektioner odlade i olika FBS-koncentrationer (0%, 2,5%, 5%, 10%) färgas med calcein AM att indikera levande celler (grön) på kultur dag 7. Skal streck = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Utvärdering av proliferativa och apoptotiska markörer i submandibular organotypiska vävnads skivor. Submandibular körtlar från kvinnliga FVB möss (4-8 veckor gamla) dissekerades, skivade till 50 μm tjocklek, och odlade i media kompletteras med 2,5% FBS på organotypisk cell kultur skär för 1, 3, 7, 14, och 30 dagar efter dissektion. Vid de angivna tidpunkter, var skivor fixeras och färgas för proliferativa (Ki67) och apoptotiska (kluvna caspase-3) markörer. (A) Immunofluorescerande färgning av Ki67-positiva celler (grön) och kärnan (blå). B) Immunofluorescerande färgning av klyvs caspase-3-postive-celler (röd) och kärnan (blå) från två punkter i en skiva. Den översta rad panelen visar klyvs caspase-3-positiva celler på kanten av ett segment, och den nedersta raden panelen visar klyvs caspase-3-positiva celler från mitten av ett segment. Representativa konfokala bilder valdes ut från flera z-stackar per tids punkt. Skal streck = 30 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Förekomst av cellulära strukturer under submandibular organotypiska vävnads skivor . Submandibular körtlar från kvinnliga FVB möss (4-8 veckor gamla) dissekerades, skivade till 50 μm tjocklek, och odlade i media kompletteras med 2,5% FBS på organotypisk cell kultur skär för 1, 3, 7, 14, eller 30 dagar efter dissektion. Vid de angivna tidpunkter, var skivor fixeras och färgas för sina motsvarande markörer med kärnan (blå). (A) submandibular avsnitt utvärderades vid dag 1, 7, 14, och 30 post-dissektion för nivåerna av E-cadherin, Smooth MUSKELAKTIN (SMA), och F-aktin (phalloidin). (B) submandibular avsnitt utvärderades vid dag 1, 3, och 7 för nivåer av CD31 (kärl teckning) och TUBB3 (nerv celler). Aquaporin-5 (Aqp5) utvärderades vid dag 1, 3, 7 och 14. Representativa konfokala bilder valdes ut från flera z-stackar per tids punkt. Skal streck = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Utvärdering av proliferativa och funktionella markörer i par organotypiska vävnads segment. Parotid körtlar från kvinnliga FVB möss (4-8 veckor gamla) var dissekcted, skivade till 50 μm tjocklek, och odlade i media kompletteras med 2,5% FBS på organotypisk cell kultur skär för 1, 3, 7, eller 14 dagar efter dissektion. Vid de angivna tidpunkter, var skivor fixeras och färgas för sina motsvarande markörer med kärnan (blå). (A) Immunofluorescerande färgning av Ki67-positiva celler (grön). (B) Immunofluorescerande färgning av amylas-positiva celler (röd). C) Immunofluorescerande färgning av aquaporin-5 (Aqp5)-positiva celler (gröna). (D) Immunofluorescerande färgning av E-cadherin (röda) positiva celler. (E) Immunofluorescerande färgning av nerv celler som INDIKERAS av TUBB3 (Magneta) positiva celler. (F) Immunofluorescerande färgning av blod kärlen som INDIKERAS av CD31 (röda) positiva celler. Representativa konfokala bilder valdes ut från flera z-stackar per tids punkt. Skal streck = 30 μm; d = duktala celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: cellulära förändringar efter bestrålning av parotis organotypisk vävnad skivor. Parotid körtlar från kvinnliga FVB möss (4-8 veckor gamla) dissekerades, skivade till 50 μm tjocklek, och odlade i kompletterat med 2,5% FBS på organotypisk cell kultur skär. På dag 1 efter dissektion, en delmängd av skivor utsattes för 5 Gy strålning och upprätthålls för 2, 4, eller 8 dagar efter dissektion (motsvarar dag 1, 3, och 7 efter strålning). Immunofluorescent färgning av obehandlade och bestrålade parotis avsnitt för att bestämma nivåer av (a) Ki67 (grön)-positiva celler, (b) klyvs kaspas 3 (röd)-positiva celler, (c) phalloidin (cyan)-positiva celler, (D) amylas (röda)-positiva celler och (e) e-cadherin (röda) positiva celler. All nukleär färgning utnyttjad DAPI (blå). Representativa konfokala bilder valdes ut från flera z-stack per tidpunkt. Skal streck = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: cellulära förändringar efter bestrålning av submandibular organotypiska vävnads skivor. Submandibular körtlar från kvinnliga FVB möss (4-8 veckor gamla) dissekerades, skivade till 50 μm tjocklek, och odlade i media kompletteras med 2,5% FBS på organotypisk cell kultur insatser. På dag 1 efter dissektion, en delmängd av skivor bestrålades med 5Gy och upprätthålls för 2, 4, eller 8 dagar efter dissektion (motsvarar dag 1, 3, och 7 efter strålning). Immunofluorescent färgning av obehandlade och bestrålade submandibular avsnitt för att bestämma nivåer av (a) Ki67 (grön)-positiva celler, (b) klyvs kaspas 3 (röd)-positiva celler, (c) phalloidin (cyan)-positiva celler, (D) akvaporinet 5 (Aqp5) (grön)-positiva celler, och (e) e-cadherin (röda) positiva celler. All nukleär färgning utnyttjad DAPI (blå). Representativa konfokala bilder valdes ut från flera z-stack per tidpunkt. Skal streck = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: funktionella acinar markörer i bestrålad parotis och submandibular organotypisk vävnad skivor. Submandibular och parotis körtlar från kvinnliga fvb möss (4-8 veckor gamla) dissekerades, skivade till 50 μm tjocklek, och odlade i media kompletteras med 2,5% FBS på organotypisk cell kultur skär. På dag 1 efter dissektion, en delmängd av skivor bestrålades med 5Gy och upprätthålls i 14 dagar efter bestrålning. Immunofluorescent färgning av obehandlade (UT) och bestrålade (IR) avsnitt användes för att bestämma nivåer av (a) aquaporin-5 (Aqp5) (grön)-positiva celler och (b) amylas (röd)-positiva) celler. All nukleär färgning utnyttjad DAPI (blå). Representativa konfokala bilder valdes ut från flera z-stack per tidpunkt. Skal streck = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saliv körtel forskning har utnyttjat ett antal kultur modeller, inklusive förevigas 2-d kulturer, primära 2-d kulturer, 3-d salisphere kulturer, och 3-d orgel kulturer från embryonala blad sticklingar att fastställa frågor om underliggande biologi och fysiologi. Dessa kultur modeller har gett insiktsfulla information över en mängd olika forsknings frågor och kommer att fortsätta att vara viktiga verktyg i spott forskning. Begränsningarna i dessa kultur modeller inkluderar modulering av p53-aktivitet under odödlighet, övergående livs kraft för primär kulturer, förlust av differentiering och sekretoriska proteiner i kulturen, och oförmåga att utvärdera cell-cell, cell-ECM och polaritet interaktioner i vuxna vävnader. Den första 3-D organotypisk slice kultur (vibratome Snittade kulturer) metod för spott körtlar publicerades i 200818; denna teknik har dock i stort sett underutnyttjats inom detta område trots frekvent användning inom andra områden. Arbetet odlade parotis avsnitt för 48 h, som begränsar förmågan att studera dessa avsnitt för kroniska effekter efter strål behandling eller utnyttja transfektion eller transduktion protokoll för fenotyper efter manipulering av specifika gener. Den metod som beskrivs här har optimerats för att möjliggöra längre tid i kulturen, ge högupplösta bilder genom konfokalmikroskopi, ge en metod för att studera intra-och intercellulär dynamik på en 3-D avsnitt, och utvärdera strålnings-inducerad förändringar under en kultur period på minst 14 dagar.
Medan varje steg krävs för genomförandet av tekniken, vissa steg är avgörande för framgångs rik snittning och kultur underhåll. Dessa inkluderar kapning av spott körtel skivor, underhålla sektorerna i kulturen, och färgning och avbildning skivorna med konfokalmikroskopi. Det presenterade protokollet ställer vissa utmaningar som kräver tålamod och övning för att få optimala skivor för analys. Följande förslag kommer att hjälpa till att genomföra detta protokoll framgångs rikt. Det är absolut nödvändigt att helt isolera spott körtel från omgivande bindväv efter dissektion. Resterande bindväv orsakar vibratome bladet att dra körteln ut från Aga ros blocket och kräver vävnad som skall återbäddas i AGA ros. Detta kan vara en stor begränsning eftersom flera återinbäddning kan öka risken för kontaminering och minska lönsamheten för skivorna. Detta är särskilt viktigt för odling parotis körtlar, eftersom parotis körtlar är mer Lobulär i struktur och därför mer benägna att ha främmande vävnad.
Tillsats av 1% penicillin-streptomycin-amfotericin B (PSA) till alla vätskor inklusive buffertbrickan, slice Collection skålen, och vibratome Media minimerar kontaminering av sektorerna efter dissektion. Variation av AGA ros koncentration användes för att optimera framgångs rik kapning. På grund av tätheten av spott körtlarna, 1,9% AGA ros var för mjuk, och körtlarna var lätt avställas från blocket. Vibratome snittning inom andra områden har använt 5,0% agarose; men detta orsakade ojämna nedskärningar och skivor var suboptimala. Efter att ha testat flera AGA ros procent villkor, 3% AGA ros var den mest optimala för att stödja vikt och fasthet i vävnaden. I synnerhet, den AGA ros koncentrationen utnyttjas i Warner et al. och Su et al. var också 3%19,20.
Dessutom kan vinkeln, frekvensen av vibrationer, och frammarsch hastighet av bladet ändras baserat på den vävnad som ska sedeleras. För submandibular och parotis spott körtlar, en 15 ° vinkel, hastighet av 0,075 mm/s, och frekvensen 100 Hz var lämpliga för snittning. På grund av mjukheten i spott körtlarna, de optimala skär förhållanden krävde bladet att avancera långsamt genom vävnaden vid en hög vibration. För immunofluorescensfärgning är permeabiliseringen, inkubations tiden och tvätt stegen nödvändiga för optimala fläckar. Om positiv färgning endast förekommer i de yttre lagren av vävnads segmentet, kan en strängare permeabilisering med proteinas K behövas, medan ojämn färgning eller hög bakgrunds färgning kan kräva en mindre sträng färgning med 0,2% Triton X-100. Inkubations tiderna optimerades för hög signal och låg bakgrund, vilket kan behöva skräddarsys efter specifika primära anti kroppar. Längre tvätt steg är avgörande för att minska den höga bakgrunden och kan skräddarsys efter de specifika anti kroppar som används.
En stor tillämpning av denna metod är utökad kinetisk analys efter strålnings exponeringen av spott körtlar. Tidigare arbete har etablerat både akuta och kroniska fas förändringar i bestrålade spott körtlar6,24,25,26, och vibratome kultur system kan vara ett kraftfullt verktyg för att dissekera den kritiska molekyl ära händelser vid specifika tidpunkter efter behandling. Till exempel, strålnings-inducerad cellulära förändringar i spott körtel som har rapporter ATS i litteraturen, inklusive minskningar i amylas, apoptos av acinar celler, kompensatorisk proliferation av acinar celler, förlust av polaritet och störningar i cytoskeletala strukturen. I synnerhet, vibratome kulturer bestrålade ex vivo uppvisar liknande förändringar i dessa markörer.
Dessutom pivoterar den akuta fas reaktionen i spott körtlar runt p53-aktivitet; Det är dock oklart vilken roll p53 spelar i senare tidpunkter på grund av den ~ 5-dagars livs kraften hos primär kulturer. Detta system skulle tillåta ex vivo, kontrollerad störning av p53-aktiviteten vid senare tidpunkter och avslöja en roll i kroniska skador eller regenerativa reaktioner. Dessutom inleds den kompensatoriska spridnings reaktionen 5 dagar efter strål behandling, och det är svårt att avgränsa de molekyl ära regulatorerna av detta svar i transienta primär kulturer. Den mest använda tillämpningen av denna metod kommer sannolikt att omfatta cell-cell, cell-ECM, och polaritet interaktioner i vuxna vävnader. Effektfulla studier har utförts i 3-D orgel kulturer från embryonala körtlar för att avslöja den intrikata interaktion mellan utveckla spott körtlar och neuronala eller vaskulära nätverk27,28,29, 30,31.
Den metod som beskrivs här tyder på att ytterligare optimering behövs för neuronala eller vaskulära arbete i submandibular kulturer och möjligen parotis kulturer. Strålnings skador stör också Junktional regulatorer, inducerar kollagen deposition, förändrar F-Actin organisation, och modulerar sekretoriska granulat26,30,32. Spott körtel förnyelse studier är handikappade av avsaknaden av en vuxen modell för att utvärdera dessa interaktioner. Denna organotypiska kultur metod kan ge ett system för att tillämpa avancerade molekyl ära tekniker och ytterligare studera regleringen av dessa medlare i en 3-D sammanhang och effektivt upptäcka nya terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av pilot finansiering som tillhandahålls av University of Arizona Office of Research and Discovery och National Institute of Health (r01 DE023534) till Kirsten Limesand. Den cancer biologi Training Grant, T32CA009213, förutsatt stipendium stöd för Wen Yu Wong. Författarna vill tacka M. Rice för hans värdefulla tekniska bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
