Summary
שימוש תלת מימדי בתרבויות אורגאותוגית להמחיש מורפולוגיה וסמנים פונקציונלי של בלוטות הרוק עשוי לספק תובנות הרומן לתוך מנגנונים של נזק רקמות לאחר הקרינה. מתוארים כאן הוא פרוטוקול לסעיף, תרבות, הקרנת, כתם, תמונה 50 – 90 יקרומטר עבה בלוטת הרוק סעיפים לפני ובעקבות חשיפה לקרינה מייננת.
Abstract
היפרליבציה ו xerostomia ליצור סיבוכים אוראלי כרונית הפחתת איכות החיים בראש ובחולי סרטן הצוואר אשר מטופלים עם הקרנות. הגישות הנסיוניות להבנת מנגנונים של תפקוד בלוטת הרוק ושיקום התמקדו במודלים vivo, אשר מוגבלים על ידי חוסר יכולת למסך בשיטתיות מועמדים טיפוליים ויעילות בניתוח יכולת לתמרן גנים ספציפיים. המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע מתי אוכלוסיית תאים וסמנים ספציפיים נמצאים בתקופת תרבות של 30 יום. בנוסף, סמנים סלולריים דיווחו בעבר ב vivo מודלים קרינה מוערכים בתרבויות כי הם לשעבר לקרינה vivo. מעבר קדימה, שיטה זו היא פלטפורמה אטרקטיבית עבור הערכה מהירה לשעבר vivo של murine והאדם בלוטת הרוק התגובות התגובה לסוכנים הטיפוליים לשפר את תפקוד הרוק.
Introduction
תפקוד תקין בלוטת הרוק חיוני לבריאות הפה והוא שונה לאחר הטיפול בראש ובצוואר הסרטן עם הקרנות1. ב 2017, כמעט 50,000 מקרים חדשים של סרטן הראש והצוואר דווחו בארצות הברית2. בשל השפעות מזיקות לעתים קרובות בלתי הפיך של טיפול בקרינה על רקמות הסביבה הרגילה כגון בלוטות הרוק, חולים הם לעתים קרובות עזבו עם תופעות לוואי חמורות ואיכות מופחתת של חיים2,3, ד. סיבוכים נפוצים נגרמת על ידי נזק הקרינה מתבטא בתסמינים כגון xerostomia (התחושה הסובייקטיבית של הפה היבש), עששת, היכולת הלקוי ללעוס ולבלוע, דיבור ליקויים, ו מיקרובימי אוראלי פרוצים2, מיכל שלוש , 4. הסימפטומים הללו באופן קולקטיבי יכול להוביל תזונה ולקויה הישרדות אנשים מושפעים5. בעוד תפקוד בלוטת הרוק באוכלוסייה זו היתה מתועדת היטב, המנגנונים הבסיסיים של נזק לתאים acinar היו שנויות במחלוקת, ויש שילוב קטן בין דגמי בעלי חיים שונים6,7.
השיטות הנוכחיות של לימוד תפקוד בלוטת הרוק ונזק המושרה הקרינה כוללים את השימוש במודלים vivo, שורות תאים מונצח, דו מימדי (2-D) מתרבויות התא הראשי, ו תלת מימדי (3-D) התרבות הערבה8, . תשע,עשר,11,12 באופן מסורתי, מודלים של תרבות התא מקווי תאים מונצח ותרבויות דו-ממדיות כרוכות בתאים בעלי שכבות יחיד המתורבת על משטחים שטוחים והם יקרי ערך עבור ניסויים מהירים, קלים וחסכוניים. עם זאת, התנאים של תרבות התא המלאכותי יכולים לשנות את סטטוס הבידול ואת התגובות הפיסיולוגיים של תאים חשופים לתנאים שונים, והתוצאות לעתים קרובות אינן מצליחות לתרגם את כל האורגניזם מודלים14,15. בנוסף, תרביות תאים מונצח דורשים אפנון של פעילות p53, אשר קריטי עבור תגובת בלוטת הרוק נזק DNA16,17.
תרביות תלת-מימד מועשר בתאי גזע ומחולל בזמן מוקדם בתרבות ושימושיים להבנת הרגישות הרדיושל קבוצת משנה זו של תאי בלוטת הרוק9,18. מגבלה קריטית של כל המודלים האלה של התרבות היא שהם לא יעילים בהמחיש את המבנה התלת-ממדי של בלוטת הרוק, כולל מטריצה החילוץ (ECM) ואינטראקציה תא תא על פני שכבות שונות, אשר חיוניים הרוק מודלטינג הפרשה15. הצורך בשיטה המקיף את ההתנהגות של הרקמה כמכלול, אבל יכול להיות גם מניפולציות תחת תנאי מעבדה כדי ללמוד את ההשפעות של הטיפול הוא הכרחי כדי לגלות עוד את המנגנונים הבסיסיים של בלוטת הרוק המושרה קרינה תפקוד.
שימוש ברקמה חיה ותרבות כבר תועד בעבר19,20 והוא משמש לעתים קרובות לחקר אינטראקציות רקמות המוח21. במחקרים קודמים, פרוטיד (PAR) רקמת בלוטת הרוק מפני עכברים היה מנות ב כ 50 יקרומטר ו תרבותי עבור עד 48 h, ניתוח של הכדאיות, מוות תאים, ותפקוד בוצע לאחר מכן19. . סו ואח ' (2016) הורחב במתודולוגיה זו על ידי בלוטות הלסת האנושית של culturing (smgs) בשעה 35 יקרומטר או 50 יקרומטר עבור 14 ימים20. השיטה המוצעת היא התקדמות בכך שהוא כולל בלוטות הרוק השני והלסת התחתונה מנות ב 50 יקרומטר ו 90 יקרומטר והערכה של התרבויות עבור 30 ימים. היכולת לחתוך מגוון רחב של רקמות חשוב בהערכת תאים סלולריים ואינטראקציות תאים-ECM הרלוונטיות לתהליכים סלולריים, כולל קוטביות-באסולתית ושימור הפרשה. יתר על כן, פרוסות בלוטת הרוק הוקרן לקרינה בעוד בתרבות כדי לקבוע את הכדאיות של מודל זה תרבות כדי ללמוד המושרה קרינה נזק בלוטת הרוק.
המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע את מקטעי הזמן המרביים הקיימים לאחר הניתוח, הכדורית כחול, מכתים תאים חיים וכתמים אימונוהיסטוכימיה עבור מוות תאים בוצעו. מיקרוסקופיה קונפוקלית וכתמים מוחיסוניות מנוצלים להערכת אוכלוסיות תאים מסוימות, מבנים מורפולוגיים ורמות התפשטות. תרביות מקטע רקמות נחשפו גם לקרינה מייננת כדי לקבוע את ההשפעות של קרינה על סמנים שונים במודל זה 3-D. אינדוקציה של מוות התא, הפרעה ציטושלד, הפסד של סמנים בידול, והתפשטות הפצה בתרבויות הvivo לשעבר הקרינה היו לעומת מחקרים קודמים של במודלים vivo. מתודולוגיה זו מספקת אמצעים לחקור את התפקיד של אינטראקציות תא תא בעקבות נזקי קרינה ומספק מודל ניסיוני כדי להעריך ביעילות את היעילות של התערבויות טיפוליות (מניפולציות גנים או סוכני תרופתי ) שעשוי להיות מתאים פחות למודלים vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הרטט
- ספריי להסרה רכיבים של הרטט כולל מגש המאגר, מצורף להב, כייר בלוק agarose, וסרט מעבדה עם 70% אתנול, ולאחר מכן UV-לחטא לפחות 30 דקות.
- מקום ולאבטח גיליון נוסף של סרט מעבדה על מגש המאגר כדי למנוע את הקרח מליפול.
- למלא את תא קרח עם קרח כתוש, להסיר את הסרט מעבדה ממגש המאגר, ולמלא את מגש המאגר עם 100 mL של הקרח קר 1x פוספט מלוחים באגירה (PBS) פתרון בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפיצילין (PSA).
- מניחים להב גילוח נירוסטה למחזיק להב. השתמש במברג כדי להדק/לשחרר ולשנות את זווית הלהב.
2. הכנת דגימת רקמה בבלוק והפחתה באמצעות הרטט
- הקלפה את כל הכלים הנחוצים לניתוח והכללה כולל מלקחיים, מספריים ומכחולים.
- הכינו 3% התכה נמוכה הגובה ההיתוך ב-PBS 1-x ומיקרוגל עד agarose מתמוסס לתוך הפתרון. ודא כי הפתרון אינו מרתיחה ומערבולת את הבקבוק מדי פעם כדי לערבב.
הערה: מניעת המסת ההיתוך הנמוכה מההתגבכת על ידי שמירה על מקלחת מים חמה. הצמח הנמוך הוא נוזל ב-37 ° c ומגדיר ב -25 ° c. עם זאת, אמבט המים צריך להיות מתחת 40 ° c כדי לשפוך את הצמח סביב הרקמה בטמפרטורה פיזיולוגית. - בודד בלוטות הרוק ובמקום לגזור את הרקמה לתוך 2 מ"ל קרח קר 1x PBS בתוספת עם 1% PSA ב סטרילי, 30 מ"מ צלחת התרבות.
- באמצעות מלקחיים בלוק להסיר בלוטות הרוק מ 1x PBS + 1% הפתרון PSA ומיקום בתחתית של עובש הטבעה. ממלאים את העובש עם נוזל 3% התכה נמוכה agarose לכסות את הרקמה.
- באמצעות מלקחיים, להתאים את הרקמה לאמצע הבלוק ולמקם את בלוטת הרוק במישור המתאים. חתכי הצלב הטובים ביותר עבור בלוטות הלסת התחתונה והתת הפרודיות נמצאים במישור האנכי.
- מקום בלוק צמח על הקרח 10 דקות כדי הארדן.
- בזהירות להפעיל להב תער סביב הקצה החיצוני של agarose כדי לשחרר ולתת לחסום להחליק על הסרט מעבדה UV-מעוקר משלב 1.1.
- השתמש להב גילוח כדי לגזור תיבת agarose המכילה את בלוטת הרוק. ודא שמישור המקטע הוא ישר ומקביל לצד הנגדי של הבלוק (המשטח שיודבק למטה). מאז agarose לא לחדור את הרקמה, לא לקצץ יותר מדי אגקם סביב הרקמה כך הרקמה תהיה נתמכת היטב.
- השתמש בדבק על מנת לחבר את הבלוק למשטח החיתוך.
- סעיף ב-50 יקרומטר או 90 יקרומטר עובי על-ידי הרטט במהירות של 0.075 מ"מ/s ותדירות של 100 Hz.
הערה: הגדרת הרטט בתדר הגבוה ביותר ומהירות הלהב הנמוכה ביותר מספקת את הפרוסות האופטימליות ביותר. - לאסוף סעיפים 24-היטב התרבות רקמה המכילה ~ 1 mL קרח קר PBS לכל טוב באמצעות autoclaved מכחול שיער טבעי, הצבת מברשת ב 70% אתנול בין אוספי פרוסה כדי לשמור על עקרות.
3. סעיפים בתפירה
- . אוטוקלב מיקרו-מרית ומלקחיים
- להפוך את המניה רטט מדיה תרבות עם או בלי סרום שור עוברי (FBS): DMEM/F12 מדיה בתוספת 1% PSA, 5 μg/mL מועבר, 1.1 μM הידרוקורטיזון, 0.1 μM חומצה retinoic, 5 מילימטר μg/אינסולין, 80 ng/mL גורם צמיחה באפידרמיס, 5 מ"מ-גלוטמין, 50 μg gentamicin סולפט, ו 10 μL/mL תערובת האלמנט. הוסף כמות מתאימה של FBS כדי לבצע 0%, 2.5%, 5.0% או 10% פתרונות.
- לפני הודעה, להוסיף 300 μl של מדיה מראש מחומם ומקום בקוטר 12 מ"מ, 0.4 יקרומטר ממברנה בגודל הנקבוביות להכניס לתוך כל טוב של לוח 24-היטב הרקמה התרבותית. התקשורת צריכה להגיע לתחתית הקרום כדי ליצור ממשק באוויר הנוזלי עבור התרבות.
- בעדינות להניח את קטעי הרוק על גבי להוסיף ממברנה באמצעות מרית ותרבות ב 37 ° c ב מחולל לחות 5% CO2 ו 95% אטמוספירה אוויר חממה.
- הוסף כ 300 μL מדיית התרבות הראשית לתוך הבאר וכמה טיפות לתוך הממברנה מוסיף (כ 40 μL) כל יום אחר או לפי הצורך. Culturing נכונה הראה כי התאים מסוגלים לשרוד ולהישמר עד 30 ימים לשעבר vivo.
4. הקרנה של חתכי בלוטת הרוק
- טיפול סעיפים עם מנה אחת של קרינה (5 Gy) באמצעות קובלט-60 (או שווה ערך) irradiator.
- מחלקים תחבורה למתקן הסקה באמצעות מכולה קלקר מכוסה כדי למנוע תנודות בטמפרטורה. בנוסף, הטיפול צריך להילקח במהלך ההובלה בחזרה לחממה מעבדה כדי להבטיח כי התקשורת לא להתיז על מכסה התרבות ולגרום לזיהום.
- מניחים את הצלחת 24-באר המכיל בלוטת הרוק סעיפים 80 ס מ ממקור הקרינה, במרכז של 32 "x 32" שדה קרינה. הקרינה חישובי המינון ואת הזמן המתאים ב-עוצמה ישתנו על ידי כלי מכשיר קובלט-60 ריקבון.
- המשך לעקוב אחר מקטעים אלה כמתואר בסעיף 3.
5. הכדאיות מכתים
- מנושף את המדיה הישנה ומכבסת פרוסות פעמיים באמצעות הערוץ הטרום-מחמם של 1x.
- כתמים מפרקים עם צבע כחול טריכאני.
- השתמשו במיקרו-מרית כדי להזיז את הפרוסה מהתרבות למגלצת זכוכית.
- הוסף 0.4% טרי, פתרון כחול לפרוסת הרטט עם נפח מספיק כדי לכסות את הרקמה (10 – 20 μL).
- מודטת פרוסות בטמפרטורת החדר (RT) בטריקון הכחול עבור 1 – 2 דקות כדי שצבען יחדור לרקמה. תאים לא קיימא יהיה כחול מוכתם, ותאים קיימא יהיה בלתי מוכתם.
- צביעת סעיפים עם calcein, לחיות בצבע התאים.
- הוסף נפח מספיק של הכתם כדי לכסות את המקטע בבאר אחת של 24 היטב-צלחת (200-300 μL).
- מודקון פרוסות ב-RT עבור 15 דקות כדי לאפשר חדירה לצבע.
- הסר בזהירות את המקטע מבאר ומניחים על מגלשת זכוכית. פרוסות מעלות עם טיפה אחת של מדיה הכוללת הרכבה.
- מקטעי תמונה על מיקרוסקופ פלורסנט ב עירור/פליטת אורכי גל של 488 ננומטר ו 515 nm.
6. נוגדן צביעת סעיפים הרטט
הערה: להלן מספק פרוטוקול נוגדן כללי מכתים ספציפי עבור קי-67; עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש עם כל נוגדן. כל שוטף מתנהלים ב-RT אלא אם צוין אחרת.
- בצלחת התרבות רב-היטב של הרקמה, מביסה את המדיה ולשטוף לפחות 2 x עם סטרילי 1x PBS.
- לתקן מקטעים באמצעות 4% פאראמפורמלדהיד (כיתה) ב -4 ° c.
- מנושף את 4% כדור הראש ולשטוף 3x עם PBT [1x PBS, 1% בסרום שור אלבומין (BSA), 0.1% טריטון X-100].
הערה: ניתן לאחסן מקטעים ב-1x PBS ב-4 ° c ומוכתם במועד מאוחר יותר. זמן האחסון המקסימלי שנבדק בכתב היד הזה היה 3 שבועות. זמן אחסון ארוך יותר יהיה צורך למטב על-ידי המשתמש הבודד אם הדבר רצוי. - מקטעים מתוך החדירות באמצעות 0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS במשך 30 דקות.
הערה: שלב זה יכול להיות שונה וממוטב עבור מכתים נוגדנים ספציפיים וחדירות. - ללטף את פתרון החדירות.
- לשטוף את פרוסות 3x עבור 5 דקות עם 1 x PBS, 1% BSA, ו 0.1% טריטון X-100 (PBT).
- לחסום את הפרוסות עם הסוכן חסימת 1% סרום עז רגיל עבור 1 h.
- לשטוף את הפרוסות 3 x עבור 5 דקות עם PBT.
- מודלת את הפרוסות לילה ב -4 ° צ' עם 500 μL anti-Ki67 הארנב נוגדן מונוטוני ב 1% BSA ב-1x PBS.
הערה: עבור phalloidin כתמים, לדלג על צעד 6.9 ולהמשיך באמצעות פרוטוקול עבור phalloidin הספציפי המשמש. , בשביל כתמי דנ א. דלג לשלב 6.15 - מKi67 את הארנבת. בנוגדן חד-שבטיים
- שטוף את הפרוסות 6x עבור 5 דקות ב-1x PBS.
- מודלת את הפרוסות ב-500 μL של הנוגדנים משני מצובטים משולשים תואם עם הנוגדן anti-Ki67 מדולל 1% BSA ב-1x PBS ב RT עבור 1.5 h מכוסה מהאור.
הערה: מבוסס על הנוגדן המשני בשימוש, זמן דגירה עם הנוגדן המשני יכול להיות ממוטב נוסף על ידי המשתמש הבודד. בנוסף, הנוגדן המשני הוא רגיש לאור. כל השיטיפות הבאות חייבות להתבצע בחשכה. - . מנושף נוגדן משני
- לשטוף פרוסות עבור 3 x עבור 5 דקות עם 1x PBS.
- רוחצים פרוסות עבור 5 דקות במים מפוהים.
- פרוסות כתמי נגד עם DAPI (1μg/mL) עבור 20 דקות ב-RT.
- שטוף פרוסות (פעם אחת) עבור 5 דקות במים מפוהים.
- פרוסות מעלות עם טיפה אחת (~ 40 μL) של התקנת מדיה. כדי להימנע מעודף בועות, הציבו לאט את הכיסויים על המדיה העולה בשקופית, החל בזווית 45 °.
- כדי למנוע ריסוק חלקים עבים עם שמיכות, הר כל פרוסה עם מרווח. מרווח יכול להיווצר על ידי הצבת שפה של שומן ואקום במשבצת סביב מקטע הרקמה.
- כאשר הנחת שמיכות, הקצוות של שמיכות יכול להיות אטום עם שומן ואקום. לחץ על קצות שמיכות עם האגודל כדי לדבוק אותו בחוזקה על השקופית. לחילופין, לאטום את הכיסויים על שקופית המיקרוסקופ באמצעות לק ברור מסמר.
7. הדמיה מקטעים רטט
- תמונה השקופיות ויטראז בתוך 5 ימים של כתמים.
- השיגו חלקים אופטיים של הפרוסות המוכתמת ויטראז ' בעזרת מיקרוסקופ קונקטאלי. בעזרת מיקרוסקופ קוננסאני, השג מחסנית z בגודל שלב מוגדר או צלם תמונות בודדות בהתאם לעיצוב הניסיוני של המשתמש. תמונות ניתן לבחון על כל מסך מחשב לאחר איסוף מיקוד.
הערה: בשל עובי פרוסות הרטט, מומלץ להשתמש במיקרוסקופ מיקוד או בטווח עם יכולת מחסנית z להמחיש פרטים בתוך הדגימות. עבור התמונות המשמשות בכתב יד זה, שימש מטרת הנפט 63 x; עם זאת, ניתן להתאים את זה ולשנות את השימוש על ידי המשתמש הבודד והטווח הספציפי המשמש. רזולוציית פיקסלים מומלצת לכל גורם מטרה וזום עם דגימת נייקוויסט של 2.5 פיקסלים ב-X ו-Y עבור המבנה הקטן ביותר בצורה אופטית שנעשה בו שימוש. עם זאת, כמה פרשנים מציעים 2.3 פיקסלים, בעוד אחרים מציעים 2.8 פיקסלים. לפרטים נוספים על האופן שבו ניתן לבצע חישובים אלה, אנא התייחס למדריך המיקרוסקופיה הביולוגית22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התרבויות הראשיות דו-ממדיות מגודלים בסרום של שור עוברי (FBS) שיושלם מדיה בזמן שהתרבות הראשית תלת-ממדית של סליספירה מתרבות בדרך כלל בתנאים ללא נסיוב10,11. בנוסף, שני המחקרים הקודמים ניצול תרבויות הרטט מבלוטות מתוך בלוטות הרוק שלהם סעיפים 0% או 10% fbs שנוספו מדיה19,20. פרוסות הלסת התחתונה של העכבר היו מנות בעובי של 50 יקרומטר באמצעות הרטט ותנאי התרבות האופטימליים נקבעו באמצעות סדרה של ריכוזי fbs (0%, 2.5%, 5.0%, ו 10%). כדי לקבוע מאפייני הישרדות, בשדה בהיר תמונות מיקרוסקופ נלקחו בימי התרבות 1, 4, 7, 14, ו 30 לאחר הצבת (איור 1). בנוסף, מקטעי בלוטת היו מוכתמים עם 0.4% טריטין צבע כחול והתמונה עם מיקרוסקופ שדה בהיר ב 40x בנקודות הזמן המצוין (איור 2A). תאים לא קיימא היו כחול מוכתם ותאים קיימא נשאר ברורים.
באופן דומה, כדי לקבוע את מאפייני ההישרדות של פרוסות עבות יותר מנות ב 90 μm, מיקרוסקופ בשטח בהיר תמונות עם וללא טריכתים כחולים נלקחו ביום 30 בתרבויות שנוספו עם 2.5% FBS (איור 2B). בשל עובי הפרוסה, 90 יקרומטר סעיפים מוכתמים בטרידיום צבע כחול היו מוכתמות במלואו ולאחר מכן חתכו לשניים כדי להעריך את מרכז הפרוסה (איור 2b). כאישור, צבע תא חי היה מנוצל כדי להעריך את ההישרדות של התאים בתנאים שונים של FBS culturing (איור 2C). בתמונות בשדה בהיר, רמות גבוהות של תאים שקופים, ששרדו ברקמות מנות בשני 50 יקרומטר ו 90 יקרומטר נצפו. מעניין, קטעים הפכו כהה יותר ואזור רקמות כללי מתעבה לאורך זמן בתרבות, אך חלק ניכר מהמקטע נראה לשרוד את תקופת התרבות של 30 יום (איור 1, איור 2). עיבוי זה היה בולט ביותר בתנאים של 0% ו-10% FBS culturing. טריפי תאים חיוביים כחולים נצפו על ההיקף של כל הסעיפים ללא קשר לתנאים culturing, והיה גידול באזור התאים הכחולים בצבע כחול חיובי 0% FBS תנאי התרבות כאשר לעומת התנאים הגבוהים FBS culturing (איור 2A , 2b).
באמצעות כתם התאים החיים, הסעיפים התרבותיים ב -0% הראו את הכמות הנמוכה ביותר של הכתמים, ותוספת של FBS למדיית התרבות שיפרה את כמות התאים החיים. יחד עם זאת, סעיפים המתורמים ב -0% FBS הראו עיבוי רקמות גלויות, טריפומים כחולים ויטראז ', והרמות הנמוכות ביותר של כתמים של תאים חיים. התוספת של 2.5% FBS לתרבויות שיפרה את כמות הרקמה השקופה, הצטמצמה את הטריכא הכחול האזור החיובי, והגדיל את רמות הצביעת תאים חיים. עליות נוספות בריכוז FBS לא נראה לשפר את יכולת ההישרדות של הרקמה; לכן, 2.5% FBS ב התקשורת הרטט היה הריכוז האופטימלי FBS ומנוצל כתנאי התרבות עבור כל הניסויים הבאים.
כדי לקבוע את הכדאיות של vivo לשעבר הלסת התחתונה פרוסות רקמה לאחר הניתוח, ההתרבות והאפוטוטיק סמנים הוערכו בימים 1, 3, 7, 14, ו 30 בתרבות. הפעילות ההתרבות הוערך על ידי Ki67 מכתים בקבוצת משנה של פרוסות תרבות (איור 3A). Ki67 תאים חיוביים נצפו בכל הזמן נקודות העריכו והמשיך להיות נוכחים ביום 30 בתרבות, עם הבדלים מינימליים בין נקודות זמן. באופן דומה, את מידת אפופטוזיס הוערך על ידי ביקצה caspase-3 חיסוני בקבוצה נפרדת של סעיפים (איור 3B). רמה נמוכה של ביקתה caspase-3 תאים חיוביים נצפתה בכל הזמן נקודות עד יום 14 בתרבות, בעוד יום 30 התנאים נראה שיש עלייה קטנה במספר ביקתה caspase-3 תאים חיוביים באזורים מסוימים. הערכה של קצוות הרקמה לא חשף רמות גבוהות יותר של caspase-3, אשר אינו מסכם את הטריכבד כחול (איור 2). באופן כללי, תוצאות אלה מרמזות על כך שסימנים להתפשטות ולכדאיות נשארו נוכחים בתרביות הרטט במהלך תקופת ההערכה של 30 יום.
מקטע עבה התאמת התרבויות לאפשר את ההזדמנות להעריך את האינטראקציות בין מרכיבים סלולריים של רקמה מסוימת בעומק הכולל יותר מעובי תא אחד האפיתל בכל כיוון. בנוסף, חשוב להיות מסוגל לתרבות הן בלוטות הרוק הגדולות, כפי שהם נבדלים בהרכב של חלבונים הרוק המיוצר, אדריכלות היסטולוגית, רגישות לרדיו, ותכונות קריטיות אחרות. כדי לקבוע אוכלוסיות סלולריות שונות בתרביות בלוטת הלסת התחתונה, מקטעי הלסת התחתונה היו מוכתמים ב-e-קדהרין (E-cad) כדי לזהות תאים אפיתל, השריר החלק אקטין (SMA) כדי לזהות תאים מיואפיתל, ו אקטין הסיבים (phalloidin) כדי ל לזהות מבנים ציטושלד במהלך 30 הימים בתרבות (איור 4A).
כתמים של E-קדהרין נצפה על הקרומים של רוב התאים וזיהה במהלך תקופת התרבות של 30 יום. SMA + תאים זוהו במהלך תקופת התרבות, עם רמות דומות בכל פעם בנקודה. ארגון השלד של אקטין גם נראה להישמר בכל נקודה בזמן מוערך. לעומת זאת, היו סמנים סלולריים שלא שמרו בעקביות במהלך תקופת ההערכה כולה, ואלה כללו CD31 (ואסילטורה), TUBB3 (נוירונים), ו אקופורטל-5 (Aqp-5, סמן שכבתית) (איור 4B). מבנים וסקולריים באמצעות ערימות הקונמוקד נצפו בבירור בימים 1 ו -3 לאחר התרבות; עם זאת, מבנים אלה נראו מפוצלים ביום 7. באופן דומה, התהליכים העצביים היו שלמים במהלך היום הראשון של התרבות, הופיעו פחתה ביום 3, ולאחר מכן אבדו במשך היום 7 בתרבות. Aqp5 + תאים נצפו בימים 1, 3, 7, ו -14 בתרבות; אם כי, ביום 14, רמת הצביעת הכוללת היתה מופחתת, עם דמיון יותר מצועצע בתאים חיוביים שנותרו. נתונים אלה מראים כי תרבויות הלסת התחתונה מכילות את הגיוון של המרכיבים רקמות עם אחזקה של סוגי התאים של כלי הדם והעצבי לתקופות התרבות קצר יותר, ו אפיתל ומיואפיתל סוגי תאים לתקופות תרבות ארוכה יותר.
בעוד שתרבויות הרטט כבר דווחו בעבר בלוטת הרוק הפרוטיד, התרבויות נשמרו 48 h, הגבלת פרק הזמן שבמהלכו ניתן ללמוד. כדי לקבוע אם בלוטות פרוטיד ניתן לשמור למשך זמן רב יותר, בלוטות הפרוטיד מורטין היו מנות ומתורבתים עבור 1, 3, 7, או 14 ימים. מקטעים פחות התקבלו מבלוטת הפרוטיד בשל גודלו הקטן יותר בעכברים; לפיכך, לא נוסה תקופת תרבות של 30 יום. הפרוסות הוערכו להפצה באמצעות נוגדנים נגד Ki67. בדומה לתרביות הלסת התחתונה, התאים Ki67 חיוביים נצפו בכל נקודות הזמן, ומציינים כי התאים שומרים על מידת התפשטות התרבות (איור 5A).
בנוסף, את התחזוקה של סמנים שכבתית פונקציונלי (α-עמילאז ו Aqp5), סמן אפיתל (E-cad), ו כלי דם (CD31) ו עצבי (TUBB3) אוכלוסיות תאים הוערכו. עמיקלז הוא אחד החלבונים הנפוצים ביותר המיוצר על ידי הבדיל התאים האפיתל מובחנים לעתים קרובות אבדו במהלך השני-D culturing של תאים ראשוניים הראשוני. בתרבויות הרטט, אמילז נצפתה בתאים המובינטים ומחוץ לתאי הדוטל לאורך תקופת התרבות של 14 הימים (איור 5B). בדומה לתרבויות הלסת התחתונה, Aqp5 + תאים היו קיימים בתרבויות הפרוטיד בכל נקודה, עם היום 14 תרבויות מציג רמות מופחתת לעומת נקודות זמן קודמות (איור 5C). רמות E-קדהרין שמרו גם על הקרומים של רוב התאים בתקופת התרבות של 14 הימים (איור 5D). המבנים העצביים נראו שמרו במהלך תקופת התרבות 7 ימים ולא העריכו מאוחר יותר נקודות זמן (איור 5E). לעומת זאת, מבנים כלי הדם הופיעו בשלמותו במהלך היום הראשון בתרבות, ומבנים קטנים בלבד היו נוכחים בימים 3 ו -7 בתרבות (איור 5F). נתונים אלה מראים כי תרבויות הפרוטיד לשמור על יכולות ההתרבות שלהם ואת היכולות הפונקציונליות ביותר עבור 7-14 ימים בתרבות, פוטנציאל התערוכה מבנה רקמות שלמות יותר עבור מסגרת זמן ארוך יותר.
כלי השירות הפונקציונלי של מודל התרבות הרטט התייחס באמצעות הטיפול בתרביות או הלסת התחתונה עם מנה אחת של קרינה (איור 6, איור 7, איור 8). העבודה הקודמת מודלים העכבר לקרינה התמקדה בלוטת הפרוטיד והפגינו אינדוקציה של אפופטוזיס כי פסגות ב 24 שעות, אינדוקציה של התפשטות הפצה החל ביום 5, הפרעה של שיאים אקטין החל ביום 5, ואובדן של סמני בידול (לדוגמה, עמילאז) ביום 1423,24,26. הקרנה של תרבויות הרטט מזהה הוביל לעלייה באפופטוזיס ביום 1, מגביר את התפשטות ביום 7, הפרעה של הסיבים האקטין ביום 7, והנחות עמילאז ביום 7 (איור 6). הקרנה של תרבויות הלסת התחתונה ה, הובילו להגברת האפופטוזיס בימים 1 ו -3, מגדילה את התפשטות ההתפשטות ביום 7, והפרעה בחוטי אקטין ביום 7 (איור 7). רמות E-קדהרין הופיעו ללא פגע יחסית הן בתרבויות הפרומסיביות והן בתרביות הלסת התחתונה, שהיו דומות בתצפיות הvivo26. התאים הפונקציונליים שכבתית תא Aqp-5 בתוך מקטעים בלוטת הלסת התחתונה ו עמילאז בסעיפים בלוטת פרוטיד ירד ביום 14, לעומת נקודות הזמן המקביל מטופל (איור 8). נתונים אלה מראים כי שינויים ברקמות המושרה על ידי קרינה שנצפו בvivo נצפו גם בתרבויות הקרנה הקרינה.
איור 1: מיקרוסקופ שדה בהיר תמונות של 50 יקרומטר תת-לסת סעיפים. בלוטות הלסת התחתונה של עכברים fvb הנשי (4-8 שבועות בן) היו גזור, מנות ל 50 יקרומטר עובי, ומתורבת על מוסיף תרבות תא אורגאוטימית עבור 1, 4, 7, 14, ו 30 ימים לאחר ניתוח ב 0%, 2.5%, 5.0%, ו 10% סרום של שור עוברי (fvb) במדיה לקבוע מאפייני תרבות ולמטב את תנאי התרבות. קנה מידה של סרגלים = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כתמים של הכדאיות של תת-לסת סעיפים. (א) תמונות מיקרוסקופ שדה בהיר של 50 יקרומטר הלסת התחתונה גזור מ 4 עד 8 שבוע עכברים fbv הנשי ויטראז ' כחול (0.4%) ב 1, 3, 7, 14, ו 30 ימים בתרבות עם מדיה המכילה 2.5% סרום העובר העוברי (FBS). (ב) תמונות מיקרוסקופ שדה בהיר של 90 יקרומטר מקטעים הלסת התחתונה (הפאנל השמאלי), ויטראז ' כחול (פאנל באמצע), לחתוך למחצה מוכתם בצבע כחול (בלוח הימני), לאחר מכן תרבותי 30 ימים לאחר הניתוח במדיה המכילה 2.5% fbs. (ג) תמונות פלורסנט של 50 יקרומטר סעיפים הלסת תרבותית בריכוזים fbs שונים (0%, 2.5%, 5%, 10%) מוכתם עם calcein AM לציין תאים חיים (ירוק) ביום התרבות 7. קנה מידה של סרגלים = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכה של סמנים מתרבים ואפוטוטיים ב תת-לסת . פרוסות רקמות אורגנואיות בלוטות הלסת התחתונה של עכברים fvb הנשי (4-8 שבועות בן) היו גזור, חתוך ל 50 יקרומטר עובי, ותרבותי בתקשורת בתוספת עם 2.5% fvb על מוסיף תרבות תא אורגאותית עבור 1, 3, 7, 14, ו 30 ימים לאחר הניתוח. על נקודות הזמן המצוין, פרוסות היו קבוע ומוכתם להתרבות (Ki67) ו האפוטוטיק (ביקקה caspase-3) סמנים. (א) אימונוofor, כתמים של Ki67, תאים חיוביים (ירוק) והגרעין (כחול). (ב) אימונואופלוקסאותים של כתמים של כדוריות הדם-3-תאים מתקמים (אדום) והגרעין (כחול) משתי נקודות מבט של פרוסה. בלוח השורה העליונה מציג כדוריות caspase-3-תאים חיוביים בקצה של פרוסה, ובלוח השורה התחתונה מציג כדוריות caspase-3-תאים חיוביים מאמצע פרוסה. תמונות מהייצוג הייצוגי נבחרו ממספר רב של מחסניות לכל נקודת זמן. קנה מידה של פסים = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נוכחות מבנים סלולאריים בשנת תת-לסת פרוסות רקמה אורגאולית . בלוטות הלסת התחתונה של עכברים fvb הנשי (4-8 שבועות בן) היו גזור, חתוך ל 50 יקרומטר עובי, ותרבותי בתקשורת בתוספת עם 2.5% fvb על מוסיף תרבות תא אורגאותית עבור 1, 3, 7, 14, או 30 ימים לאחר הניתוח. בנקודות הזמן המצוין, הפרוסות היו קבועות ומוכתמות עבור הסמנים המקבילים עם הגרעין (כחול). (א) מקטעי הלסת התחתונה הוערכו בימים 1, 7, 14, ו -30 לאחר ניתוח עבור רמות E-קדהרין, השריר החלק אקטין (SMA), ו-F-אקטין (phalloidin). (ב) מקטעי הלסת התחתונה הוערכו בימים 1, 3, ו 7 עבור רמות של CD31 (ואסיקובלטורה) ו TUBB3 (נוירונים). אקופורטל 5 (Aqp5) הוערך בימים 1, 3, 7 ו -14. תמונות מהייצוג הייצוגי נבחרו ממספר רב של מחסניות לכל נקודת זמן. קנה מידה של סרגלים = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הערכה של סמנים מתרבים ופונקציונלי ב-PAR פרוסות רקמה. בלוטות פרוטיד מעכברים fvb הנשי (4-8 שבועות בן) היו גזור, חתוך ל 50 יקרומטר עובי, ו תרבותי בתקשורת בתוספת עם 2.5% fvb על מוסיף תרבות תא אורגאותית עבור 1, 3, 7, או 14 ימים לאחר הניתוח. בנקודות הזמן המצוין, הפרוסות היו קבועות ומוכתמות עבור הסמנים המקבילים עם הגרעין (כחול). (א) אימונוofor, כתמים של Ki67, תאים חיוביים (ירוק). (ב) מודלי כתמים של עמילאז-תאים חיוביים (אדום). (ג) מכתים כתמים של אקואפוב-5 (Aqp5)-תאים חיוביים (ירוק). (ד) אימונוofor, כתמים של התאים החיוביים של E-קדהרין (אדום). (ה) אימונוofor, כתמים של נוירונים המצוין על ידי TUBB3 (magneta) תאים חיוביים. (ו) אימונוofor, כתמים של הוזוקובלטורה המצוין על ידי CD31 (אדום) תאים חיוביים. תמונות מהייצוג הייצוגי נבחרו ממספר רב של מחסניות לכל נקודת זמן. סולם סרגלים = 30 μm; ד = תאי דוטל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שינויים סלולריים בעקבות הקרנה של פרוסות רקמה אורגאולית. בלוטות פרוטיד מן הנקבה fvb עכברים (4-8 שבועות בן) היו גזור, חתוכים ל 50 יקרומטר עובי, ומתורבת בתוספת עם 2.5% fvb על מוסיף תרבות תא אורגאותית. ביום 1 לאחר הניתוח, קבוצת משנה של פרוסות נחשף לקרינה 5 ג ' ושמרו עבור 2, 4, או 8 ימים לאחר הניתוח (מתאים לימים 1, 3, ו 7 פוסט קרינה). Immunofluorescent כתמים של סעיפים מטופל וללא הוקרן לקרינה כדי לקבוע רמות של (א) Ki67 (ירוק)-תאים חיוביים, (ב ) לבשל caspase 3 (אדום)-תאים חיוביים, (C) phalloidin (ציאן)-תאים חיוביים, (ד) עמילאז (אדום)-תאים חיוביים, ו- (ה) e-קדהרין (אדום) תאים חיוביים. כל הצביעת גרעינית מנוצל DAPI (כחול). תמונות מיקוד של הנציג נבחרו מתוך מחסנית z מרובים לכל נקודת זמן. קנה מידה של סרגלים = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: שינויים סלולאריים בעקבות הקרנה של פרוסות רקמה בצורת הלסת התחתונה. בלוטות הלסת התחתונה של עכברים fvb הנשי (4-8 שבועות בן) היו גזור, חתוך ל 50 יקרומטר עובי, ו תרבותי במדיה בתוספת עם 2.5% fvb על מוסיף תרבות תא אורגאותית. ביום 1 לאחר הניתוח, קבוצת משנה של פרוסות הוקרן עם 5Gy ונשמר עבור 2, 4, או 8 ימים לאחר הניתוח (מתאים לימים 1, 3, ו 7 פוסט קרינה). Immunofluorescent כתמים של סעיפים תת הלסת מטופל והוקרן כדי לקבוע רמות של (א) Ki67 (ירוק)-תאים חיוביים, (ב ) לבשל caspase 3 (אדום)-תאים חיוביים, (C) phalloidin (ציאן)-תאים חיוביים, (ד) אקופורטל 5 (Aqp5) (ירוק)-תאים חיוביים ו- (e) e-קדהרין (אדום) תאים חיוביים. כל הצביעת גרעינית מנוצל DAPI (כחול). תמונות מיקוד של הנציג נבחרו מתוך מחסנית z מרובים לכל נקודת זמן. קנה מידה של סרגלים = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: סמנים בעלי שכבתית פונקציונליים בתוך הפרוטיד לקרינה ופרוסות של רקמת הלסת התחתונה. בלוטות הלסת התחתונה ואת הבלוטות של הנקבה fvb עכברים (4-8 שבועות בן) היו גזור, חתוכים ל 50 יקרומטר עובי, ו תרבותי במדיה בתוספת 2.5% fvb על מוסיף תרבות תא אורגאותית. ביום 1 לאחר הניתוח, ערכת משנה של פרוסות הוקרן עם 5Gy ונשמר 14 ימים לאחר ההקרנה. כתמים immunofluorescent מקטעי מטופל (UT) ומקטעים שעברו הקרינה (IR) שימשו כדי לקבוע רמות של (א) aquAqp5 in-5 (ירוק)-תאים חיוביים ו (ב) עמיקלז (אדום)-חיובי) תאים. כל הצביעת גרעינית מנוצל DAPI (כחול). תמונות מיקוד של הנציג נבחרו מתוך מחסנית z מרובים לכל נקודת זמן. קנה מידה של סרגלים = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר בלוטת הרוק השתמשו במספר דגמי תרבות, כולל תרבויות דו-ממד מונצח, תרבויות דו-מימד ראשיות, תרבויות תלת-מימד, ותרבויות תלת-מימד מפני מתקנים עובריים כדי לברר שאלות על הביולוגיה הבסיסית והפיזיולוגיה. המודלים התרבותיים הללו הניבו מידע תובנה על פני מגוון מגוון של שאלות מחקר וימשיכו להיות כלים חשובים במחקר הרוק. המגבלות של דגמי התרבות הללו כוללות אפנון של פעילות p53 בזמן ההתמוללות, הכדאיות הארעית של התרבויות הראשיות, אובדן הבידול וחלבונים הפרשה בתרבות, וחוסר יכולת להעריך תא תא, תא-ECM וקוטביות אינטראקציות ברקמות למבוגרים. הראשונה לתרבות הפרוסה התלת-ממדית של המשולש (התרביות מנות מנות) שיטת בלוטות הרוק פורסמה ב 200818; עם זאת, טכניקה זו מנוצל במידה רבה בתחום זה למרות שימוש תכוף בתחומים אחרים. העבודה סעיפים הפרוטיד תרבותית עבור 48 h, אשר מגביל את היכולת ללמוד סעיפים אלה עבור אפקטים כרוניים בעקבות הטיפול בקרינה או להשתמש בפרוטוקולים העברה או התמרה פרוטוקול עבור פנוטיפים לאחר מניפולציה של גנים ספציפיים. השיטה המתוארת כאן הייתה ממוטבת לאפשר זמן רב יותר בתרבות, להניב תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, לספק שיטה לחקר הדינמיקה הפנים-תאית במקטע תלת-ממדי, ולהעריך שינויים המושרה באמצעות קרינה במהלך תקופת תרבות של לפחות 14 ימים.
כאשר כל שלב נדרש ליישום הטכניקה, מספר צעדים חיוניים לפריסה מוצלחת ולתחזוקת התרבות. אלה כוללים חיתוך פרוסות בלוטת הרוק, שמירה על הפרוסות בתרבות, וכתמים והדמיה של הפרוסות בעזרת מיקרוסקופיה קונפוקלית. הפרוטוקול המוצג מציב כמה אתגרים הדורשים סבלנות ותרגול כדי להשיג פרוסות אופטימליות לצורך ניתוח. ההצעות הבאות יסייעו בביצוע פרוטוקול זה בהצלחה. זה הכרחי לבודד לחלוטין את בלוטת הרוק מתוך רקמת החיבור שמסביב לאחר ניתוח. רקמת חיבור שיורית גורם הלהב הרטט כדי לגרור את הבלוטה החוצה מן הבלוק agarose ודורש את הרקמה להיות מוטבע מחדש ב-agarose. זה יכול להיות מגבלה גדולה מאז הטבעה מחדש מרובים יכול להגביר את הסיכויים של זיהום ולהקטין את הכדאיות של הפרוסות. זה חיוני במיוחד עבור בלוטות הפרוטיד מקולף, מאז בלוטות הפרוטיד הם יותר המבוניים במבנה, ולכן יש סבירות גבוהה יותר רקמות.
תוספת של 1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוריטיצין B (PSA) על כל הנוזלים כולל מגש המאגר, את הצלחת אוסף הפרוסה, ואת התקשורת הרטט ממזער זיהום של הפרוסות לאחר הניתוח. הגיוון של ריכוז agarose שימש כדי לייעל גזירה מוצלחת. בשל הצפיפות של בלוטות הרוק, 1.9% agarose היה רך מדי, ואת בלוטות היו בקלות יצאה מן הבלוק. התאמת הרטט בשדות אחרים השתמשה ב-5.0% agarose; עם זאת, פעולה זו גרמה לחתכים ופרוסות משוננים באופן תת-אופטימלי. לאחר בדיקת מספר התנאים אחוזים, 3% agarose היה האופטימלי ביותר לתמוך במשקל ומוצקות של הרקמה. בעיקר, הריכוז האגקם נוצל ב וורנר et al. ו-Su et al היה גם 3%19,20.
בנוסף, את הזווית, תדירות הרטט, ומהירות ההתקדמות של הלהב ניתן לשנות בהתבסס על הרקמה להיות מנות. לקבלת הלסת התחתונה ובלוטות הרוק הפרוטיד, זווית של 15 °, מהירות של 0.075 מ"מ/s, ותדירות של 100 הרץ היו מתאימים לצורך הרחבה. בשל הרכות של בלוטות הרוק, תנאי החיתוך האופטימלי נדרש את הלהב כדי להתקדם לאט דרך הרקמה ברטט גבוה. עבור הכתמים האימונולואוורייזציה, החדירות, משך הincubations ושטיפת הצעדים חיוניים לכתמי כתמים אופטימליים. אם כתמים חיוביים מופיע רק בשכבות החיצוניות של פרוסת הרקמה, החדירות מחמירות יותר עם פרוטאינאז K עשוי להיות צורך, בעוד מכתים לא אחיד או רקע גבוה מכתים עשוי לדרוש כתמים מחמירים פחות עם 0.2% טריטון X-100. זמני הדגירה היו ממוטבים עבור אות גבוהה ורקע נמוך, אשר עשויים להיות מותאמים לנוגדנים ראשוניים ספציפיים. שלבי השטיפה הארוכים חיוניים להפחתת הרקע הגבוה, והדבר עשוי להיות מותאם לנוגדנים הספציפיים המשמשים.
אחד היישומים העיקריים של מתודולוגיה זו הוא ניתוח קינטי מורחב לאחר חשיפה לקרינה של בלוטות הרוק. עבודה קודמת הקימה הן שינויים בפאזה חריפה וכרונית בבלוטות הרוק הקרינה6,24,25,26, ואת מערכת התרבות הרטט יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לנתח את הקריטי מולקולרית אירועים בזמן מסוים נקודות לאחר הטיפול. לדוגמה, שינויים סלולריים המושרה בבלוטת הרוק שדווחו בספרות, כולל הפחתות עמילאז, אפופטוזיס של תאים משבינרי, התפשטות מפצה של תאים שכבתית, אובדן קוטביות ושיבושים ב מבנה השלד הציטומי. בעיקר, בתרבויות הרטט הקרינה לשעבר vivo התערוכה שינויים דומים בסמנים אלה.
בנוסף, התגובה שלב אקוטי בלוטות הרוק הצירים סביב פעילות p53; עם זאת, לא ברור מה התפקיד p53 משחק בנקודות זמן מאוחרות יותר בשל הכדאיות ~ 5 יום של התרבויות הראשיות. מערכת זו תאפשר vivo ex, מבוקרת הפרעה של פעילות p53 בזמן מאוחר יותר לחשוף תפקיד בנזק כרוני או תגובות התחדשות. יתרה מזאת, תגובת ההפצה הפיצוי מתחילה 5 ימים לאחר טיפול בקרינה, וקשה להתוות את הרגולטורים המולקולריים של תגובה זו בתרבויות הראשיות הזמניות. היישום הנפוץ ביותר של מתודולוגיה זו עלול לכלול תא תא, תא ECM, ואינטראקציות קוטביות ברקמות למבוגרים. מחקרים מאריכות נערכו בתרבויות תלת-ממד של איברים מבלוטות עובריים כדי לחשוף את האינטראקציה מורכבת בין פיתוח בלוטות הרוק לבין הרשת נוירוונאליות או כלי דם27,28,29, 30,31.
השיטה המתוארת כאן עולה כי יש צורך במיטוב נוסף לעבודה עצבית או כלי דם בתרביות הלסת התחתונה ואולי לתרבויות הפרומאליות. נזק קרינה גם משבש junctional רגולטורים, מעורר התצהיר הקולגן, משנה F-actin ארגון, ו מודולים הפרשה בגרגרים26,30,32. לימודי התחדשות בלוטת הרוק הם נכים על ידי העדר מודל מבוגר כדי להעריך את האינטראקציות האלה. שיטת התרבות האורגנותית הזאת יכולה לספק מערכת להחלת טכניקות מולקולריות מתקדמות ומחקר נוסף על הרגולציה של מגשרים אלה בהקשר תלת-ממדי ולגלות ביעילות טיפולים חדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מימון פיילוט שסופקו על ידי אוניברסיטת אריזונה המשרד של מחקר וגילוי והמכון הלאומי לבריאות (R01 DE023534) כדי קירסטן לימסנד. מלגת ההכשרה לביולוגיה של סרטן, T32CA009213, סיפקה תמיכה של הקצבה ון יו וונג. המחברים רוצים להודות מ ' רייס על התרומה הטכנית היקר שלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
