Summary
Ved hjelp av tredimensjonale organotypic kulturer for å visualisere morfologi og funksjonelle markører for spyttkjertler kan gi romanen innsikt i mekanismer for vevsskade etter stråling. Beskrevet her er en protokoll til del, kultur, irradiate, beis, og bilde 50-90 μm tykke spyttkjertel seksjoner før og etter eksponering for ioniserende stråling.
Abstract
Hyposalivation og xerostomia skape kroniske muntlige komplikasjoner som reduserer livskvaliteten i hode og nakke kreftpasienter som er behandlet med strålebehandling. Eksperimentelle tilnærminger til forståelse mekanismer av spyttkjertel dysfunksjon og restaurering har fokusert på in vivo-modeller, som er handikappet av en manglende evne til systematisk skjermen terapeutiske kandidater og effektivitet i transfeksjoner evne til å manipulere spesifikke gener. Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. Vi benyttet immunofluorescent farging og konfokalmikroskopi mikroskopi for å avgjøre når bestemte celle populasjoner og markører er til stede under en 30-dagers kultur periode. I tillegg blir celle markører som tidligere er rapportert i in vivo stråling-modeller evaluert i kulturer som er bestrålt ex vivo. Fremover, denne metoden er en attraktiv plattform for rask ex vivo vurdering av murine og menneskelig spyttkjertel vev reaksjoner på terapeutiske midler som forbedrer spytt funksjon.
Introduction
Riktig spyttkjertel funksjon er avgjørende for oral helse og endres etter hode og nakke kreft behandling med strålebehandling1. I 2017 ble nesten 50 000 nye tilfeller av hode-og nakke kreft rapportert i USA2. På grunn av vev-ødeleggende og ofte irreversible effekter av strålebehandling på omkringliggende normalt vev som spyttkjertler, pasienter er ofte igjen med alvorlige bivirkninger og redusert livskvalitet2,3, firetil. Vanlige komplikasjoner forårsaket av stråle skade manifesterer i symptomer som xerostomia (den subjektive følelsen av tørr munn), tannråte, nedsatt evne til å tygge og svelge, tale nedsatt funksjonsevne, og kompromittert oral microbiomes2, 3 andre priser , 4. disse symptomene kollektivt kan føre til underernæring og nedsatt overlevelse i berørte individer5. Mens spyttkjertel dysfunksjon i denne populasjonen har vært godt dokumentert, har de underliggende mekanismene for skade på acinar celler vært omstridt, og det er lite integrasjon mellom ulike dyremodeller6,7.
Den nåværende metoder for å studere spyttkjertel funksjon og stråling-indusert skade inkluderer bruk av in vivo-modeller, udødeliggjort cellelinjer, todimensjonal (2-D) primær cellekulturer, og tredimensjonale (3-D) salisphere kulturer8, 9,10,11,12. Tradisjonelt vil cellekultur modeller fra udødeliggjort cellelinjer og 2D-kulturer involvere enkelt lags celler kultivert på flate overflater og er verdifulle for rask, enkel og kostnadseffektiv eksperimentering. Imidlertid kan kunstig cellekultur forhold endre differensiering status og fysiologiske reaksjoner av celler eksponert for ulike forhold, og resultatene ofte ikke å oversette til hele organismen modeller14,15. I tillegg udødeliggjort cellekulturer krever modulering av p53 aktivitet, noe som er avgjørende for spyttkjertel respons på DNA skade16,17.
3-D salisphere kulturer er beriket for Stem og stamceller ved tidlig tidspunkt i kultur og har vært nyttig for å forstå radiosensitivity av denne undergruppe av spyttkjertel celler9,18. En kritisk begrensning av alle disse kultur modeller er de er ineffektive i å visualisere 3-D strukturen i spyttkjertel, inkludert ekstracellulære matrise (ECM) og celle-celle interaksjoner over ulike lag, som er avgjørende i modulerende spytt sekresjon15. Behovet for en metode som omfatter virkemåten til vevet som helhet, men kan også manipuleres under laboratorieforhold for å studere virkningene av behandlingen er nødvendig for å ytterligere oppdage de underliggende mekanismene for stråling-indusert spyttkjertel Dysfunksjon.
Levende vev snitting og kultur har blitt dokumentert tidligere19,20 og brukes ofte til å studere hjerne-vev interaksjoner21. I tidligere studier, parotid (PAR) spyttkjertel vev fra mus ble delt på ca 50 μm og kultivert for opp til 48 h, og analyse av levedyktighet, celle død, og funksjonen ble utført deretter19. Su et al. (2016) utvidet på denne metodikken ved dyrking humant submandibular kjertler (SMGs) delt på 35 μm eller 50 μm for 14 dager20. Den foreslåtte metoden er en fremgang i at det inkluderer både parotid og submandibular spyttkjertler delt på 50 μm og 90 μm og evaluering av kulturer i 30 dager. Evnen til å kutte en rekke vev tykkelse er viktig i å evaluere celle-celle og Cell-ECM interaksjoner som er relevante for cellulære prosesser inkludert apikale-basolateral polaritet og innervasjon for sekresjon. Videre spyttkjertel skiver var bestrålt mens i kultur for å bestemme muligheten for denne kulturen modellen for å studere stråling-indusert spyttkjertel skade.
Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. For å bestemme maksimal tid seksjoner som er levedyktig post-disseksjon, trypan blå farging, levende celle farging, og immunhistokjemiske farging for celle død ble utført. Konfokalmikroskopi mikroskopi og immunofluorescent farging ble benyttet for å evaluere spesifikke celle populasjoner, morfologiske strukturer, og nivåer av spredning. Vevs-delen kulturer ble også utsatt for ioniserende stråling å bestemme virkningene av stråling på ulike markører i denne 3-D modellen. Induksjon av celle død, cytoskjelettkomponenter avbrudd, tap av differensiering markører, og kompenserende spredning i bestrålt ex vivo kulturer ble sammenlignet med tidligere studier av in vivo-modeller. Denne metoden gir et middel til å undersøke hvilken rolle celle-celle interaksjoner etter stråling skader og gir en eksperimentell modell for å effektivt evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner (Gen manipulasjoner eller farmakologiske midler ) som kan være mindre egnet for in vivo-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av vibratome
- Spray avtakbare komponenter av vibratome inkludert bufferbrettet, blad vedlegg, agarose blokk mold, og laboratorie film med 70% etanol, deretter UV-sterilisere i minst 30 min.
- Plasser og fest et ekstra ark med laboratorie film over bufferbrettet for å hindre at isen faller inn.
- Fyll isen kammer med knust is, fjerne laboratoriet filmen fra bufferbrettet, og fyll bufferbrettet med 100 mL iskald 1x fosfat bufret saltvann (PBS) løsning supplert med 1% penicillin-Streptomycin-Ampicillin (PSA).
- Plasser et barberblad i rustfritt stål i bladholderen. Bruk skrutrekkeren til å stramme/løsne og endre vinkelen på bladet.
2. utarbeidelse av Vevsprøve i agarose blokk og snitting ved hjelp av vibratome
- Autoklav alle nødvendige disseksjon-og skjæreverktøy, inkludert pinsett, saks og malekoster.
- Forbered 3% lavt Smeltepunkt agarose i steril 1x PBS og mikrobølgeovn til agarose oppløses i løsningen. Sørg for at oppløsningen ikke koker over og virvel flasken med jevne mellomrom for å blande.
Merk: forhindre at lav smeltende agarose fra solidifying ved å holde den i et varmt vannbad. Lav smelte agarose er væske ved 37 ° c og sett ved 25 ° c. Imidlertid bør vannbad være under 40 ° c for å helle agarose rundt vevet ved fysiologisk temperatur. - Isoler Spyttkjertlene og plasser dissekert vevet i 2 mL iskald 1x PBS supplert med 1% PSA i en steril, 30 mm kultur rett.
- Bruke autoklaveres tang, fjerne spyttkjertler fra 1x PBS + 1% PSA løsning og posisjon på bunnen av en embedding mold. Fyll mold med flytende 3% lavt Smeltepunkt agarose å dekke vevet.
- Bruke tang, justere vevet til midten av blokken og plassere spyttkjertel i riktig plan. Den beste tverrsnitt for submandibular og parotid kjertler er i vertikalplanet.
- Plasser agarose blokk på isen i 10 min å stivne.
- Kjør forsiktig et barberblad rundt ytterkanten av agarose for å løsne og la blokken gli ut på den UV-sterilisert laboratorie filmen fra trinn 1,1.
- Bruk et barberblad til å skjære ut en agarose eske som inneholder spyttkjertelen. Sørg for at flyet av seksjonen er rett og parallelt med den motsatte siden av blokken (overflaten som vil limes ned). Siden agarose ikke infiltrere vevet, ikke trimme av for mye agarose rundt vevet slik at vevet vil være godt støttet.
- Bruk superlim for å feste blokken til skjære flaten.
- Seksjon for 50 μm eller 90 μm tykkelse ved vibratome med en hastighet på 0,075 mm/s og hyppigheten av 100 Hz.
Merk: innstilling av vibratome ved høyeste frekvens og laveste blad hastighet gir de mest optimale skiver. - Samle seksjoner i en 24-brønn vev kultur parabolen inneholder ~ 1 mL iskald PBS per brønn ved hjelp av en autoklaveres, naturlig hår pensel, plassere børsten i 70% etanol mellom Slice samlinger for å opprettholde sterilitet.
3. dyrking seksjoner
- Autoklav en mikro-spatel og tang.
- Lag lager vibratome kultur medier med eller uten Foster storfe serum (FBS): DMEM/F12 Media supplert med 1% PSA, 5 μg/mL transferrin, 1,1 μM Hydrocortisone, 0,1 μM retinoic syre, 5 μg/mL insulin, 80 ng/mL epidermal vekstfaktor, 5 mM L-glutamin, 50 μg/mL Gentamicin sulfat, og 10 μL/mL sporstoffet blanding. Legg til en passende mengde FBS for å gjøre 0%, 2,5%, 5,0% eller 10% løsninger.
- Før snitting, tilsett 300 μL av pre-varmet medier og plassere en 12 mm diameter, 0,4 μm pore-størrelse membran sette inn i hver brønn av en 24-brønn vev kultur plate. Mediene skal nå membranen bunnen for å skape en væske-luft grensesnitt for kultur.
- Forsiktig lå spytt seksjoner på toppen av membranen sette inn ved hjelp av mikro spatel og kultur ved 37 ° c i fuktet 5% CO2 og 95% luft atmosfære inkubator.
- Tilsett ca. 300 μL primær kultur medier i brønnen og noen få dråper i membran innsatsene (ca. 40 μL) annenhver dag eller etter behov. Riktig dyrking viste at cellene er i stand til å overleve og opprettholdes i opptil 30 dager ex vivo.
4. bestråling av spyttkjertel seksjoner
- Behandle seksjoner med en enkelt dose stråling (5 gy) ved bruk av kobolt-60 (eller tilsvarende) irradiator.
- Transport seksjoner til irradiator anlegg ved hjelp av en dekket Styrofoam beholder for å unngå svingninger i temperatur. I tillegg må det utvises forsiktighet under transport tilbake til laboratorie inkubator for å sikre at mediene ikke sprute på kultur lokket og indusere forurensning.
- Plasser 24-brønn plate som inneholder spyttkjertel seksjoner 80 cm fra strålings kilden, i sentrum av en 32 "x 32" stråling feltet. Stråling dose beregninger og tilsvarende tid i irradiator vil variere etter instrument og kobolt-60 forfall.
- Fortsett å overvåke og dyrking disse avsnittene som beskrevet i avsnitt 3.
5. levedyktighet farging
- Aspirer gamle medier og vask skiver to ganger med steril, forvarmet 1x PBS.
- Stain seksjoner med trypan blå farge.
- Bruk en mikro-spatel for å flytte stykket fra kulturen til et glass lysbilde.
- Tilsett 0,4% trypan blå oppløsning på vibratome skive med nok volum til å dekke vevet (10 – 20 μL).
- Ruge skiver ved romtemperatur (RT) i trypan blå for 1 – 2 min for fargestoff å trenge gjennom vevet. Uholdbare celler vil bli farget blå, og levedyktige celler vil bli unstained.
- Stain seksjoner med calcein, AM Live-cellefarge stoff.
- Tilsett nok volum av flekken for å dekke den delen i en brønn av en 24 brønn plate (200 – 300 μL).
- Ruge skiver ved RT for 15 min å tillate fargestoff penetrasjon.
- Fjern forsiktig den delen fra brønnen og plasser på et glass lysbilde. Monter skiver med 1 dråpe monterings medium.
- Bilde seksjoner på et fluorescerende mikroskop ved eksitasjon/utslipps bølgelengder på 488 NM og 515 NM.
6. antistoff farging vibratome seksjoner
Merk: følgende gir en generell fargeprotokoll for antistoff som er spesifikk for KI-67; denne protokollen kan imidlertid brukes med alle antistoff. Alle vasker utføres ved RT med mindre annet er angitt.
- I multi-brønnen vev kultur parabolen, aspirer av media og vask minst 2x med steril 1x PBS.
- Fiks seksjoner med 4% paraformaldehyde (PFA) over natten ved 4 ° c.
- Aspirer av 4% PFA og vask 3x med PBT [1x PBS, 1% storfe serum albumin (BSA), 0,1% Triton X-100].
Merk: seksjoner kan lagres i 1x PBS ved 4 ° c og farget på et senere tidspunkt. Maksimal lagringstid som ble testet i dette manuskriptet var 3 uker. Lengre lagringstid må optimaliseres av den enkelte brukeren hvis det er ønskelig. - Permeabilize seksjoner med 0,3% Triton X-100 i 1x PBS i 30 min.
Merk: dette trinnet kan endres og optimaliseres for spesifikke antistoff farging og permeabilization. - Pipet av permeabilization løsning.
- Vask skiver 3x i 5 minutter med 1x PBS, 1% BSA og 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Blokker skiver med blokkering agent med 1% normal geit serum for 1 t.
- Vask skivene 3x i 5 minutter med PBT.
- Ruge skivene over natten ved 4 ° c med 500 μL anti-Ki67 kanin monoklonale antistoff fortynnet i 1% BSA i 1x PBS.
Merk: for phalloidin farging, hopp over trinn 6,9 og Fortsett å bruke protokollen for den spesifikke phalloidin som brukes. For DNA-counterstain, hopp til trinn 6,15. - Aspirer anti-Ki67 kanin monoklonale antistoff.
- Vask skivene 6 ganger i 5 minutter i 1x PBS.
- Ruge skiver i 500, μL av fluorescensmerkete bøyd sekundært antistoff som var kompatibelt med anti-Ki67-antistoff, fortynnet i 1% BSA i 1x PBS ved RT for 1,5 t som dekkes av lys.
Merk: basert på sekundært antistoff som brukes, kan inkubasjonstid med sekundært antistoff bli ytterligere optimalisert av den enkelte brukeren. I tillegg er sekundær antistoff lysfølsom. Alle påfølgende vask må utføres i mørket. - Aspirer sekundære antistoff.
- Vask skiver for 3x i 5 minutter med 1x PBS.
- Vask skiver i 5 min i deionisert vann.
- Counterstain skiver med DAPI (1μg/mL) for 20 min ved RT.
- Vask skiver (en gang) i 5 min i deionisert vann.
- Monter skiver med en dråpe (~ 40 μL) av monterings mediene. For å unngå overflødige bobler, plasser dekkglass langsomt på monterings mediene på lysbildet, og start med en 45 ° vinkel.
- For å unngå å knuse de tykke seksjonene med dekkglass, Monter hver skive med en spacer. En spacer kan lages ved å plassere en felg av vakuum fett i en firkant rundt vevs delen.
- Ved legging av dekkglass kan kantene på dekkglass tettes med vakuum fett. Trykk ned kantene på dekkglass med tommelen for å feste det godt til lysbildet. Du kan også forsegle dekkglass på objektglasset med klar neglelakk.
7. Imaging vibratome seksjoner
- Image den fargede lysbilder innen 5 dager med farging.
- Skaff optiske deler av farget vibratome skiver ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop. Med et konfokalmikroskopi mikroskop, få en z-stabel på en definert trinn størrelse eller ta individuelle bilder avhengig av brukerens eksperimentelle design. Bilder kan undersøkes på en hvilken som helst dataskjerm etter konfokalmikroskopi samling.
Merk: på grunn av tykkelsen av vibratome skiver, anbefales det at et konfokalmikroskopi mikroskop eller et omfang med z-stack evne brukes til å visualisere detaljer i prøvene. For bildene som brukes i dette manuskriptet, ble det brukt et 63x olje mål; Dette kan imidlertid skreddersys og videre endres av den enkelte bruker og det bestemte omfanget som brukes. Anbefalt piksel oppløsning for hver målsetting og zoomfaktor med antatt Nyquist-sampling på 2,5 piksler i X og Y for den minste optisk kan løses-strukturen ble brukt. Men noen kommentatorer antyder 2,3 piksler, mens andre foreslår 2,8 piksler. Vennligst referer til Handbook of Biological Konfokalmikroskopi mikroskopi22 for mer informasjon om hvordan du gjør disse beregningene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primær 2-D kulturer dyrkes i fosterets storfe serum (FBS) supplert Media mens primær 3-D salisphere kultur er vanligvis kultivert i serum-frie betingelser10,11. I tillegg har de to tidligere studier utnytte vibratome kulturer fra spyttkjertler kultivert sine seksjoner i 0% eller 10% FBS supplert Media19,20. Mus submandibular skiver ble delt med en tykkelse på 50 μm ved hjelp av en vibratome og optimale kultur forhold ble bestemt ved hjelp av en rekke FBS konsentrasjoner (0%, 2,5%, 5,0% og 10%). For å bestemme overlevelses egenskaper ble bilder med lyse felt tatt på kultur dager 1, 4, 7, 14 og 30 etter snitting (figur 1). I tillegg ble kjertel seksjoner farget med 0,4% trypan blått fargestoff og avbildet med en lys-feltet mikroskop på 40x på det angitte tidspunktet poeng (figur 2a). Ikke-levedyktige celler ble farget blå og levedyktige celler forble klar.
På samme måte, for å bestemme overlevelse egenskapene til tykkere skiver delt på 90 μm, lyse felt mikroskop bilder med og uten trypan blå flekker ble tatt på dag 30 i kulturer supplert med 2,5% FBS (figur 2b). På grunn av skive tykkelse, 90 μm seksjoner farget med trypan blå fargestoff ble avbildet hele deretter halvert for å evaluere midten av stykket (figur 2b). Som en bekreftelse, en levende cellefarge stoff ble benyttet for å evaluere celle overlevelse i ulike FBS dyrking forhold (figur 2C). I lyse felt bilder, høye nivåer av gjennomskinnelig, overlevende celler i vev delt på både 50 μm og 90 μm ble observert. Interessant, ble seksjoner mørkere og generelle vev området kondenserer over tid i kulturen, men en betydelig del av den delen ser ut til å overleve den 30-dagers kultur periode (figur 1, figur 2). Denne kondens var mest tydelig i 0% og 10% FBS dyrking forhold. Trypan blå positive celler ble observert på omkretsen av alle seksjoner uavhengig av dyrking forhold, og det var en økning i Trypan blå positive celleområde i 0% FBS kultur forhold sammenlignet med høyere FBS dyrking forhold (figur 2a , 2b).
Ved hjelp av levende celle flekken, viste inndelingene i 0% den laveste mengden farging, og tillegg av FBS til kultur mediene forbedret mengden av levende celler. Til sammen, seksjoner kultivert i 0% FBS viste synlig vev kondens, forhøyede trypan blå beiset områder, og de laveste nivåene av levende celle farging. Tillegg av 2,5% FBS til kulturer forbedret mengden av gjennomskinnelig vev, redusert trypan blå positive området, og økte nivåene av levende celle farging. Ytterligere økninger i FBS konsentrasjon synes ikke å forbedre overlevelsesevne av vevet; 2,5% FBS i vibratome Media var derfor den optimale FBS-konsentrasjonen og benyttet som kultur tilstand for alle etterfølgende eksperimenter.
For å bestemme levedyktigheten til de submandibular ex vivo vev skiver post-disseksjon, proliferativ og apoptotisk markører ble evaluert på dag 1, 3, 7, 14 og 30 i kulturen. Proliferativ aktiviteten ble vurdert av Ki67 immunostaining i et delsett av kultur skiver (figur 3a). Ki67 positive celler ble observert på alle tidspunkt poeng evaluert og fortsatte å være tilstede på dag 30 i kultur, med minimale forskjeller mellom tid poeng. Tilsvarende ble graden av apoptose evaluert av kløyvde ordtak-3 immunostaining i et eget delsett av seksjoner (figur 3b). Et lavt nivå av kløyvde ordtak-3 positive celler ble observert til enhver tid poeng opp til dag 14 i kulturen, mens dag 30 forhold syntes å ha en liten økning i antall kløyvde ordtak-3 positive celler i enkelte områder. Evaluering av vevet kantene ikke avslører høyere nivåer av kløyvde ordtak-3, som ikke recapitulate ikke den trypan blå farging (figur 2). Samlet sett disse resultatene tyder på at signaler for spredning og levedyktighet forble til stede i vibratome kulturer i løpet av 30-dagers evalueringsperioden.
Tykke delen vibratome kulturer tillate muligheten til å evaluere interaksjoner mellom cellulære bestanddeler av et bestemt vev i en dybde som omfatter mer enn én epitel celle tykkelse i hver retning. I tillegg er det viktig å kunne kultur både store spyttkjertler, som de skiller seg i sammensetningen av spytt proteiner produsert, histologiske arkitektur, radiosensitivity, og andre viktige funksjoner. For å bestemme ulike cellulære populasjoner i submandibular kjertel kulturer, submandibular seksjoner ble farget med E-cadherin (E-CAD) for å oppdage epitelceller, glatt muskel utgangen (SMA) for å oppdage myoepithelial celler, og utgangen filamenter (phalloidin) til oppdage cytoskjelettkomponenter strukturer i løpet av 30 dager i kulturen (figur 4a).
E-cadherin farging ble observert på membraner av et flertall av celler og oppdaget i løpet av 30-dagers kultur perioden. SMA + celler ble oppdaget i hele kultur perioden, med tilsvarende nivåer på hvert tidspunkt. Cytoskjelettkomponenter organisering av utgangen filamenter også syntes å bli opprettholdt på hvert tidspunkt vurderes. I kontrast var det cellulære markører som ikke ble konsekvent opprettholdt i løpet av hele evalueringsperioden og disse inkluderte CD31 (blodkar), TUBB3 (neurons), og Aquaporin-5 (Aqp-5, acinar markør) (figur 4b). Vaskulære strukturer gjennom konfokalmikroskopi stabler ble tydelig observert ved dag 1 og 3 post-kultur; men disse strukturene dukket fragmentert på dag 7. Tilsvarende var neuronal prosesser intakt i løpet av den første dagen av kulturen, dukket redusert på dag 3, og ble senere tapt på dag 7 i kulturen. Aqp5 + celler ble observert ved dag 1, 3, 7 og 14 i kultur; Riktignok, på dag 14, den generelle farging nivå syntes å være redusert, med en mer detaljert likhet i de resterende positive celler. Disse dataene tyder på at submandibular kulturer inneholder mangfoldet av vevs bestanddeler med vedlikehold av vaskulære og neuronal celletyper for kortere kultur perioder, og epitel og myoepithelial celletyper for lengre kultur perioder.
Mens vibratome-delt kulturer har vært tidligere rapportert for parotid spyttkjertel, kulturer ble opprettholdt for 48 h, begrenser tidsrammen da de kunne bli studert. For at avgjøre hvorvidt parotid kjortelen kan holdt for lengere, murine parotid kjortelen var delt og kultivert for 1, 3, 7, eller 14 dager. Færre seksjoner ble innhentet fra parotid kjertel på grunn av sin mindre størrelse i mus; Derfor ble det ikke forsøkt å ha en 30-dagers kultur periode. Skiver ble evaluert for spredning ved å immunofluorescent flekker ved hjelp av antistoff mot Ki67. I likhet med submandibular kulturer ble Ki67 positive celler observert på alle tidspunkt, noe som tyder på at cellene opprettholder en grad av spredning i kulturen (figur 5a).
I tillegg ble vedlikehold av funksjonelle acinar markører (α-Amylase og Aqp5), en epitel markør (E-CAD), og vaskulær (CD31) og neuronal (TUBB3) celle populasjoner evaluert. Amylase er en av de mest tallrike proteiner produsert av differensiert parotid epitelceller og ofte tapt under 2-D dyrking av primære parotid celler. I de vibratome kulturene ble Amylase observert i de acinar cellene og ekskludert fra de ductal cellene i hele 14-dagers kultur perioden (figur 5B). Ligner på submandibular kulturer, Aqp5 + celler var til stede i parotid kulturer på hvert tidspunkt, med dagen 14 kulturer stille reduserte nivåer sammenlignet med tidligere tidspunkt poeng (figur 5c). E-cadherin nivåer ble også opprettholdt på membraner av et flertall av celler i løpet av 14-dagers kultur periode (figur 5D). Neuronal strukturer syntes å være opprettholdt i løpet av 7 dagers kultur periode og ble ikke vurdert på senere tidspunkt (figur 5e). I kontrast, vaskulære strukturer dukket intakt i løpet av den første dagen i kulturen, og bare mindre strukturer var til stede på dag 3 og 7 i kultur (figur 5F). Disse dataene tyder på at parotid kulturer opprettholder sine proliferativ evner og mest funksjonelle evner for 7-14 dager i kultur og potensielt viser en mer intakt vev struktur for en lengre tidsramme.
Den funksjonelle nytten av vibratome kultur modellen ble adressert ved å behandle parotid eller submandibular kulturer med en enkelt dose av stråling (figur 6, figur 7, Figur 8). Tidligere arbeid i bestrålt mus modeller har fokusert på parotid kjertel og demonstrerte induksjon av apoptose som topper på 24 h, induksjon av kompenserende spredning starter på dag 5, forstyrrelse av utgangen filamenter som starter på dag 5, og tap av differensiering markører (f. eks Amylase) etter dag 1423,24,26. Bestråling av parotid vibratome kulturer førte til økninger i apoptose på dag 1, økning i spredning på dag 7, avbrudd av utgangen filamenter på dag 7, og reduksjoner i Amylase på dag 7 (figur 6). Bestråling av submandibular vibratome kulturer førte til økninger i apoptose ved dag 1 og 3, økning i spredning på dagen 7, og avbrudd av utgangen filamenter på dag 7 (figur 7). E-cadherin nivåer dukket opp relativt intakt i både parotid og submandibular kulturer, som var lik in vivo observasjoner26. De funksjonelle acinar celle markørene Aqp-5 i submandibular kjertel seksjoner og Amylase i parotid kjertel-seksjoner gikk ned på dag 14, sammenlignet med tilsvarende ubehandlede tids punkter (Figur 8). Disse dataene tyder på at strålings induserte vevs endringer som ble observert i Vivo, også ble observert i bestrålt vibratome kulturer.
Figur 1: Bright-felt mikroskop bilder av 50 μm submandibular seksjoner. Submandibular kjertler fra kvinnelige FVB mus (4-8 uker gamle) var dissekert, delt til 50 μm tykkelse, og kultivert på organotypic cellekultur innsatser for 1, 4, 7, 14, og 30 dager etter disseksjon på 0%, 2,5%, 5,0%, og 10% fosterets storfe serum (FBS) i Media til bestemme kultur egenskaper og optimalisere kultur forhold. Skala stolper = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: levedyktighet farging av submandibular seksjoner. (A) lyse-feltet mikroskop bilder av 50 μm submandibular dissekert fra 4-til 8-ukers gamle kvinnelige FBV mus og beiset med trypan blå (0,4%) ved 1, 3, 7, 14, og 30 dager i kultur med medier som inneholder 2,5% fosterets storfe serum (FBS). (B) Bright-feltet mikroskop bilder av 90 μm submandibular seksjoner (venstre panel), beiset med trypan blå (midten panel), halvert og beiset med trypan blå (høyre panel), deretter kultivert til 30 dager etter disseksjon i Media som inneholder 2,5% FBS. (C) fluorescerende bilder av 50 μm submandibular seksjoner kultivert i ulike FBS-konsentrasjoner (0%, 2,5%, 5%, 10%) beiset med calcein AM å indikere levende celler (grønn) på kultur dag 7. Skala stolper = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Evaluering av proliferativ og apoptotisk markører i submandibular organotypic vev skiver. Submandibular kjertler fra kvinnelige FVB mus (4-8 uker gamle) ble dissekert, skiver til 50 μm tykkelse, og kultivert i Media supplert med 2,5% FBS på organotypic cellekultur inserts for 1, 3, 7, 14, og 30 dager etter disseksjon. På det angitte tidspunktet punktene, ble skiver fast og beiset for proliferativ (Ki67) og apoptotisk (kløyvde ordtak-3) markører. (A) Immunofluorescent farging av Ki67-positive celler (grønn) og kjernen (blå). (B) Immunofluorescent farging av kløyvde ordtak-3-postive celler (rød) og kjernen (blå) fra to synspunkter av en skive. Den øverste rad panelet viser kløyvde ordtak-3-positive celler på kanten av en skive, og nederste rad panelet viser kløyvde ordtak-3-positive celler fra midten av en skive. Representative konfokalmikroskopi bilder ble valgt fra flere z-stabler per tidspunkt punkt. Skala bars = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Tilstedeværelsen av cellulære strukturer inne i submandibular organotypic vev skiver . Submandibular kjertler fra kvinnelige FVB mus (4-8 uker gamle) ble dissekert, skiver til 50 μm tykkelse, og kultivert i Media supplert med 2,5% FBS på organotypic cellekultur setter inn for 1, 3, 7, 14, eller 30 dager etter disseksjon. På det angitte tidspunktet poeng, ble skiver fast og beiset for sine tilsvarende markører med kjernen (blå). (A) submandibular seksjoner ble evaluert ved dag 1, 7, 14 og 30 post-disseksjon for nivåene av E-cadherin, glatt muskel utgangen (sma), og F-utgangen (phalloidin). (B) submandibular seksjoner ble evaluert ved dag 1, 3 og 7 for nivåer av CD31 (blodkar) og TUBB3 (neurons). Aquaporin-5 (Aqp5) ble evaluert ved dag 1, 3, 7 og 14. Representative konfokalmikroskopi bilder ble valgt fra flere z-stabler per tidspunkt punkt. Vektstenger = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Evaluering av proliferativ og funksjonelle markører i par organotypic vev skiver. Parotid kjertler fra kvinnelige FVB mus (4-8 uker gamle) ble dissekert, skiver til 50 μm tykkelse, og kultivert i Media supplert med 2,5% FBS på organotypic cellekultur setter inn for 1, 3, 7 eller 14 dager etter disseksjon. På det angitte tidspunktet poeng, ble skiver fast og beiset for sine tilsvarende markører med kjernen (blå). (A) Immunofluorescent farging av Ki67-positive celler (grønn). (B) Immunofluorescent farging av Amylase-positive celler (rød). (C) Immunofluorescent farging av aquaporin-5 (Aqp5)-positive celler (grønn). (D) Immunofluorescent farging av E-cadherin (røde) positive celler. (E) Immunofluorescent farging av neurons INDIKERT av TUBB3 (Magneta) positive celler. (F) Immunofluorescent farging av blodkar INDIKERT med CD31 (rød) positive celler. Representative konfokalmikroskopi bilder ble valgt fra flere z-stabler per tidspunkt punkt. Skala stolper = 30 μm; d = ductal celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: cellulære endringer etter bestråling av parotid organotypic vev skiver. Parotid kjertler fra kvinnelige FVB mus (4-8 uker gamle) ble dissekert, skiver til 50 μm tykkelse, og kultivert i supplert med 2,5% FBS på organotypic cellekultur inserts. På dag 1 post-disseksjon ble et delsett av skiver eksponert for 5 gy stråling og opprettholdt for 2, 4 eller 8 dager post-disseksjon (tilsvarer dager 1, 3 og 7 etter stråling). Immunofluorescent farging av ubehandlede og bestrålt parotid seksjoner for å bestemme nivåer av (A) Ki67 (grønn)-positive celler, (B) kløyvde ordtak 3 (rød)-positive celler, (C) phalloidin (cyan)-positive celler, (D) Amylase (rød)-positive celler, og (e) e-cadherin (rød) positive celler. Alle kjernefysiske flekker benyttes DAPI (blå). Representative konfokalmikroskopi bilder ble valgt fra flere z-stakk per gang punkt. Vektstenger = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: cellulære endringer etter bestråling av submandibular organotypic vev skiver. Submandibular kjertler fra kvinnelige FVB mus (4-8 uker gamle) ble dissekert, skiver til 50 μm tykkelse, og kultivert i Media supplert med 2,5% FBS på organotypic cellekultur inserts. På dag 1 post-disseksjon ble et delsett av skiver bestrålt med 5Gy og opprettholdt for 2, 4 eller 8 dager etter disseksjon (tilsvarer dag 1, 3 og 7 etter stråling). Immunofluorescent farging av ubehandlede og bestrålt submandibular seksjoner for å bestemme nivåer av (A) Ki67 (grønn)-positive celler, (B) kløyvde ordtak 3 (rød)-positive celler, (C) phalloidin (cyan)-positive celler, (D) aquaporin 5 (Aqp5) (grønn)-positive celler, og (e) E-cadherin (rød) positive celler. Alle kjernefysiske flekker benyttes DAPI (blå). Representative konfokalmikroskopi bilder ble valgt fra flere z-stakk per gang punkt. Vektstenger = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: funksjonell acinar markører i bestrålt parotid og submandibular organotypic vev skiver. Submandibular og parotid kjertler fra kvinnelige FVB mus (4-8 uker gamle) ble dissekert, skiver til 50 μm tykkelse, og kultivert i Media supplert med 2,5% FBS på organotypic cellekultur inserts. På dag 1 post-disseksjon ble et delsett av skiver bestrålt med 5Gy og opprettholdt i 14 dager etter bestråling. Immunofluorescent farging av ubehandlede (UT) og bestrålt (IR) seksjoner ble brukt til å bestemme nivåer av (A) aquaporin-5 (Aqp5) (grønn)-positive celler og (B) Amylase (rød)-positive) celler. Alle kjernefysiske flekker benyttes DAPI (blå). Representative konfokalmikroskopi bilder ble valgt fra flere z-stakk per gang punkt. Vektstenger = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spyttkjertel forskning har benyttet en rekke kultur modeller, inkludert udødeliggjort 2-D kulturer, primære 2-D kulturer, 3-D salisphere kulturer, og 3-D orgel kulturer fra embryonale explants å konstatere spørsmål om underliggende biologi og fysiologi. Disse kultur modeller har gitt innsiktsfull informasjon på tvers av et variert utvalg av forskning spørsmål og vil fortsette å være viktige verktøy i spytt forskning. Begrensningene i disse kultur modellene inkluderer modulering av p53 aktivitet under immortalization, transient levedyktighet av primære kulturer, tap av differensiering og sekretoriske proteiner i kultur, og manglende evne til å evaluere celle-celle, Cell-ECM og polaritet interaksjoner i voksen vev. Den første 3-D organotypic skive kultur (vibratome delt kulturer) metode for spyttkjertler ble utgitt i 200818; men denne teknikken har vært i stor grad underutilized i dette feltet til tross for hyppig bruk i andre felt. Arbeidet kultivert parotid seksjoner for 48 h, som begrenser evnen til å studere disse delene for kroniske virkninger etter strålebehandling eller utnytte transfeksjoner eller Transduction protokoller for fenotyper etter manipulering av spesifikke gener. Metoden beskrevet her er optimalisert for å tillate lengre tid i kulturen, gir høyoppløselige bilder gjennom konfokalmikroskopi mikroskopi, gir en metode for å studere intra-og intercellulære dynamikk på en 3-D-delen, og evaluere stråling-indusert endringer under en kultur periode på minst 14 dager.
Selv om hvert trinn er nødvendig for gjennomføringen av teknikken, er noen trinn avgjørende for vellykket skjæring og kultur vedlikehold. Disse inkluderer å kutte spyttkjertel skiver, opprettholde skiver i kulturen, og farging og Imaging skivene med konfokalmikroskopi mikroskopi. Den presenterte protokollen utgjør noen utfordringer som krever tålmodighet og praksis for å oppnå optimale skiver for analyse. Følgende forslag vil bistå i gjennomføringen av denne protokollen vellykket. Det er viktig å fullstendig isolere spyttkjertel fra omkringliggende bindevev etter disseksjon. Resterende bindevev fører til at vibratome bladet å dra kjertel ut fra agarose blokken og krever at vevet skal re-innebygd i agarose. Dette kan være en stor begrensning siden flere re-embedding kan øke sjansene for forurensning og redusere levedyktigheten til skiver. Dette er spesielt viktig for dyrking parotid kjertler, siden parotid kjertlene er mer lobular i struktur og derfor mer sannsynlig å ha overflødig vev.
Tillegg av 1% penicillin-Streptomycin-amfotericin B (PSA) til alle væsker, inkludert bufferbrettet, stykket samlingen parabol, og vibratome Media minimerer forurensning av skiver post-disseksjon. Variasjon av agarose konsentrasjon ble brukt for å optimalisere vellykket skjæring. På grunn av tettheten av Spyttkjertlene, 1,9% agarose var for myk, og kjertlene var lett forskyves fra blokken. Vibratome snitting i andre felt har brukt 5,0% agarose; men dette forårsaket taggete kutt og skiver ble suboptimal. Etter å ha testet flere agarose prosent forhold, var 3% agarose den mest optimale for å støtte vekten og fasthet i vevet. Spesielt benyttet agarose konsentrasjon i Warner et al. og Su et al. var også 3%19,20.
I tillegg kan vinkelen, hyppigheten av vibrasjon, og fremme hastigheten på bladet endres basert på vevet som skal delt. For submandibular og parotid spyttkjertler, en 15 ° vinkel, hastighet på 0,075 mm/s, og hyppigheten av 100 Hz var passende for snitting. På grunn av mykhet på Spyttkjertlene, den optimale skjære forhold krevde bladet å avansere langsomt gjennom vevet på en høy vibrasjon. For immunofluorescent farging er permeabilization, varigheten av incubations og vaske trinnene avgjørende for optimale flekker. Hvis positive flekker bare vises i de ytre lag av vevet skive, en strengere permeabilization med proteinase K kan være nødvendig, mens ujevn farging eller høy bakgrunn flekker kan kreve en mindre strenge farging med 0,2% Triton X-100. Inkubasjons tider var optimalisert for høy signal og lav bakgrunn, som kanskje må skreddersys til bestemte primære antistoffer. Lengre vasketrinn er avgjørende for å redusere høy bakgrunn, og dette kan skreddersys til de spesifikke Antistoffene som brukes.
En stor anvendelse av denne metodikken er utvidet kinetisk analyse etter stråling eksponering av spyttkjertler. Tidligere arbeid har etablert både akutte og kroniske fase endringer i bestrålt spyttkjertler6,24,25,26, og vibratome kultur system kan være et kraftig verktøy for å analysere ut den kritiske molekylære hendelser på bestemte tidspunkt etter behandling. For eksempel, stråling-indusert cellulære endringer i spyttkjertel som har blitt rapportert i litteraturen, inkludert reduksjoner i Amylase, apoptose av acinar celler, kompenserende spredning av acinar celler, tap av polaritet og forstyrrelser i cytoskjelettkomponenter struktur. Spesielt, vibratome kulturer bestrålt ex vivo utstillingen liknende endringer i disse markørene.
I tillegg er den akutte fase responsen i spyttkjertler pivots rundt p53 aktivitet; Det er imidlertid uklart hvilken rolle p53 spiller i senere tidspunkt poeng på grunn av ~ 5-dagers levedyktighet av primære kulturer. Dette systemet vil tillate ex Vivo, kontrollert forstyrrelse av p53 aktivitet på senere tidspunkt poeng og avdekke en rolle i kroniske skader eller regenererende reaksjoner. Videre er kompenserende spredning respons initiert 5 dager etter strålebehandling, og det er vanskelig å avgrense den molekylære regulatorer av dette svaret i forbigående primære kulturer. Den mest brukte anvendelsen av denne metodikken vil trolig innebære celle-celle, Cell-ECM, og polaritet interaksjoner i voksen vev. Slagkraftige studier har vært gjennomført i 3-D orgel kulturer fra embryonale kjertler å avdekke intrikate samspillet mellom utvikle spyttkjertler og neuronal eller vaskulær nettverk27,28,29, 30,31.
Metoden beskrevet her indikerer at ytterligere optimalisering er nødvendig for neuronal eller vaskulær arbeid i submandibular kulturer og muligens parotid kulturer. Stråling skader også forstyrrer junctional regulatorer, induserer kollagen deponering, endrer F-utgangen organisasjon, og modulerer sekretoriske granulater26,30,32. Spyttkjertel gjenfødelse studier er handikappet ved fravær av en voksen modell for å evaluere disse interaksjoner. Denne organotypic kulturen metoden kan gi et system for å søke avanserte molekylære teknikker og videre studere regulering av disse meglere i en 3-D sammenheng og effektivt oppdage nye terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av piloten finansiering levert av University of Arizona Office of Research and Discovery og National Institutes of Health (R01 DE023534) til Kirsten Limesand. Den Cancer biologi Training Grant, T32CA009213, forutsatt stipend støtte for Wen Yu Wong. Forfatterne vil gjerne takke M. Rice for hans verdifulle tekniske bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
