Summary
Her præsenterer vi en metode til ex vivo kultur af lange murine knogler på både føtale og nyfødte stadier, egnet til at analysere knogle-og brusk udvikling og homøostase under kontrollerede forhold, mens rekapitulere in vivo-processen.
Abstract
Lange knogler er komplekse og dynamiske strukturer, som opstår fra endokondral ossifikation via en brusk mellemprodukt. Den begrænsede adgang til sunde menneskelige knogler gør særlig værdifuld brug af pattedyr modeller, såsom mus og rotte, for at se på forskellige aspekter af knoglevækst og homøostase. Derudover, udvikling af sofistikerede genetiske værktøjer i mus giver mere komplekse undersøgelser af lang knoglevækst og beder om en udvidelse af teknikker, der anvendes til at studere knoglevækst. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for ex vivo murine knogle kultur, som tillader studiet af knogle og brusk på en stramt kontrolleret måde, mens rekapitulere det meste af in vivo-processen. Den beskrevne metode tillader kulturen i en række knogler, herunder skinneben, femur og metatarsale knogler, men vi har primært fokuseret på tibial kultur her. Desuden kan det bruges i kombination med andre teknikker, såsom time-lapse levende billedbehandling eller narkotikabehandling.
Introduction
Organ vækst skal være stramt afstemt for at forhindre fremkomsten af vækstforstyrrelser, og indebærer regulering af flere celletyper, molekylære veje og krydstale mellem forskellige dele af kroppen. Imaging teknikker er afgørende for at løse de ændringer, der sker over tid i et voksende embryo, både under normale forhold, samt efter et forstyrrelse er induceret i systemet. Embryoner med intrauterin udvikling, såsom de udbredte gnaver modeller, udgør en yderligere udfordring for levende billedbehandling og narkotikabehandling, som kan delvist overvindes ved hjælp af ex vivo kultur teknikker. For at kunne rekapitulere in vivo processer og opnå meningsfulde resultater, bliver det afgørende at finde de rigtige dyrkningsbetingelser for hvert organ eller væv.
De fleste knogler i pattedyrs skelet vokser gennem endokondral ossifikation, hvor den embryonale brusk (sammensat af celler kaldet chondrocytter) driver langsgående vækst og gradvist erstattes af knogle. Denne proces sker på vækst pladerne, placeret i slutningen af de lange knogler, hvor tre zoner kan skelnes: hvile, proliferative, og hypertrofisk1,2. Første, den runde progenitorchondrocytter i hvile zonen overgang til cykling enkelt kolonne chondrocytter i den proliferativ zone. I den næste fase af differentiering, disse chondrocytter bliver hypertrofisk og begynde at udskilning type X kollagen. Hypertrofiske chondrocytter organiserer de efterfølgende trin af ossifikation: de udskiller vigtige signalerings molekyler, såsom bindevævs vækstfaktor, knogle morfogenetiske proteiner og indisk pindsvin, og direkte mineralisering af matrixen, rekruttere blodkar til den centrale del af knoglen, og ved apoptose, tillade osteoblaster (knogledannende celler) at invadere matrixen til at danne den primære ossifikation Center3,4. Den mineraliserede matrix letter indtrængning af blodkar, hvorigennem osteoblaster migrerer for at erstatte denne nedbrudte brusk med en knoglematrix5. De fleste osteoblaster invaderer brusk matrixen fra perikondrium, et fibrøst lag, der omslutter brusk6. Alternativt, en andel af hypertrofisk chondrocytter er i stand til at overleve og omdifferentiere til osteoblaster7,8,9. Den endelige længde af knoglen skyldes den akkumulerede vækst af den forbigående brusk, hvis vækstrate igen afhænger af antallet og størrelsen af hypertrofisk chondrocytter, og deres matrix produktion10. Derudover, det blev for nylig vist, at varigheden af den sidste hypertrofi fase korrelerer med den endelige længde af knoglen11. Derfor er der behov for stram regulering af spredningen og differentieringen af disse celler for at sikre korrekt knogle størrelse.
På trods af den betydelige viden, der i årenes løb er opnået om vækst plades organisation og udvikling, er de fleste af disse konklusioner baseret på observation af faste histologiske sektioner. Vævs skæring giver værdifulde oplysninger om denne proces, men kan rides med tekniske artefakter, så det kan ikke altid pålideligt bruges til at estimere morfologiske eller størrelsesændringer mellem forskellige stadier. Desuden, som knoglevækst er en dynamisk proces, de statiske to-dimensionelle (2D) billeder giver et begrænset indblik i bevægelsen af cellerne i vækstpladen, mens time-lapse Imaging på levende væv kunne tilbyde værdifulde oplysninger om opførsel af chondrocytter i vækstpladen.
Alle disse begrænsninger kan potentielt løses ved hjælp af ex vivo knogle kulturer. Mens knogle kultur protokoller er blevet udviklet for nogen tid siden, blev de begrænset anvendt til murine lange knogler. De fleste af undersøgelserne bruger chick knogler på grund af de tekniske fordele, der tilbydes af chick model12,13. Organotypiske kulturer (luft/flydende grænseflade) blev anvendt til chick embryonale femurs, som blev opretholdt i kultur i 10 dage14. De sofistikerede genetiske værktøjer til rådighed i mus gør denne model meget tiltalende at blive brugt i ex vivo knogle kultur. De undersøgelser, der brugte mus til at se på knoglevækst arbejdede mest med metatarsal knogler15, sandsynligvis på grund af deres lille størrelse og større antal opnået pr. embryo16. Selv om traditionelt betragtes lange knogler, metatarsi indtaste senescens (karakteriseret ved reduceret proliferation og involution af vækstpladen17) tidligere end andre lange knogler in vivo, og derfor deres fortsatte vækst ex vivo ikke virkelig rekapitulere in vivo-processen. Med henblik på denne artikel, vil vi bruge udtrykket lange knogler til knogler fra den proximale og mellemliggende lemmer regioner. Flere tidligere undersøgelser anvendte lange murine knogler, såsom skinneben, i ex vivo kulturer og observerede en betydelig vækst i brusk, men lidt ossifikation18. Vi har også brugt tibial kulturer for nylig, primært at studere Chondrocyt dynamik19. Andre undersøgelser anvendte femoral hoveder fra unge mus20 eller kun den distale del af femur for kultur21. Nogle nyere værker med held kombinere ex vivo kultur af fuld knogler med time-lapse Imaging til at erhverve tre-dimensionelle (3D) film af chondrocytter i levende muse vævet22,23. Forfatterne formåede at observere tidligere ubemærkede begivenheder i omorganiseringen af chondrocytter til den proliferativ zone23 i et godt eksempel på den potentielle anvendelse af knogle ex vivo kultur. Alternativet, dvs analysere statiske billeder, kræver indirekte og komplekse teknikker. Dette blev eksemplificeret ved en nylig undersøgelse, der vurderede betydningen af transversally-orienterede kloner for brusk vækst, hvor genetisk sporing med multifarvet reporter muse stammer kombineret med matematisk modellering blev brugt24. Derfor kan ex vivo-kulturen hjælpe med at få indblik i dynamiske processer på en hurtigere og mere ligetil måde.
Her præsenterer vi en metode til murine lange knogler kultur, som kan kombineres med forskellige molekylære behandlinger og/eller med time-lapse Live imaging. Denne protokol tilpasser de metoder, der anvendes i tidligere rapporter15,18,25, men løser nogle yderligere problemer og fokuserer på lange knogler såsom skinneben, snarere end metatarsal knogler. Endelig udforsker det potentialet ved at bruge statistisk kraftfulde parrede sammenligninger ved at kulturere venstre og højre knogler separat i tilstedeværelsen af forskellige stoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgene bør gennemføres efter de lokale statslige og institutionelle retningslinjer for etisk håndtering af forsøgsdyr.
1. forberedelser forud for dagen for knogle kultur
- Indstil tidsindstillede muse parring for at opnå fostre og unger fra embryonale dag 14,5 (E 14.5) og fremefter.
Bemærk: Kulturen i lange knogler kan med held anvendes til forskellige muse stammer; i denne protokol, er udavlede schweiziske Webster Wild-type mus anvendes. - Forbered dissektions medium (tilpasset fra Houston et al.15): fortyndet α-minimum essentiel medium (α-MEM) eller dulbecco's modificerede eagle's medium (DMEM) 1/13 i fosfat-Buffered saltvand (PBS) og 2 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) og filter sterilisering 0,22 μm, 33 mm diameter sprøjte filter. Der skal opbevares aliquoter ved-20 °C.
- Dagen før ekstraktion af fostre forberedes det serum frie knogle kulturmedium bestående af DMEM, der indeholder 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutamin, 40 e/mL penicillin/streptomycin, 0,05 mg/mL ascorbinsyre og 1 mM betaglycerophosphat. Filtret steriliseres gennem et sprøjte filter med 0,22 μm, 33 mm i diameter og opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- På dagen for kulturen og før musen nedslagning, forberede 24-brønd plader og 60 mm retter med dissektion medium og holde dem iskold. Forvarm knogle dyrkningsmediet i et 37 °C vandbad. Spray 80% (v/v) ethanol på værktøjerne (pincet og lille saks), der skal anvendes til føtus håndtering. Overfør et Binokulært område til et klasse II biosikkerhedskabinet.
2. kultur af fosteret og nyfødte Tibia og femur
- Udsætter den drægtige mus gennem cervikal dislokation i den ønskede gestationsled (fra E 14.5 til E 18,5). Hvis der anvendes nyfødte unger, skal de fjernes fra moderen én efter én og aftages af halshugning.
- Placer musen på ryggen og sterilisere maveregionen ved at sprøjte 80% (v/v) ethanol på dens overflade.
- Skær huden og abdominalmusklen med en lille saks for at få adgang til livmoder hornene.
- Uddrag livmoderen fra bughulen ved hjælp af pincet og lille saks, fjerne mesometrium og skære bunden af hornene. Livmoderen anbringes i en 60 mm Petri skål med iskolde dissektions medium og holder kultur skålen på is under hele proceduren.
- Overføre Petri skålen med livmoderen til biosikkerhed kabinet og arbejde der fra nu af.
- Adskil de enkelte fostre med en saks ved at skære mellem sæerne.
- Overfør individuelle sæk under en dissektion stereomicroskop i en ren 60 mm skål med dissektion medium og åbne dem op med pincet til at adskille fostre fra indsamlingerne og rense dem fra membraner.
Bemærk: Arbejd med et foster ad gangen, og hold resten på is. - Halsudskæring af fostre og overføre kroppen til en ren ny 60 mm skål med en 1 mL skåret steril pipette.
- Fjern huden af fostre eller unger med pincet starter fra ryggen og skrælle det ud indtil tæerne.
- Adskille bagbenene fra kroppen ved at skære med pincet tæt på rygsøjlen og overføre dem til en ren skål med is-koldt dissektion medium.
- Adskil skinneben fra femur med pincet ved omhyggeligt at introducere dem mellem overfladen brusk af distale femur og proksimal skinneben.
- Fjern hofte knoglerne fra den proximale femur og calcaneus knogle og fibula fra skinneben.
- Fjern forsigtigt det bløde væv fra femur og skinneben ved at nippe og trække det af.
Bemærk: Det er vigtigt at fjerne så meget blødt væv som muligt, idet der udvises særlig omhu i at fjerne vævet, der forbinder de to brusk stænger, men undgå at beskadige brusk, perichondrium, og knoglerne. - Placer de fire knogler (venstre og højre skinneben og femurs) i den første brønd af 24-brønd pladen med en plastik 1 ml steril pipette. Alternativt kan man sammenligne virkningen af forskellige behandlinger på venstre og højre lemmer ved at placere kontralaterale lemmer i forskellige brønde.
Bemærk: Der skal udvises ekstra forsigtighed, når knoglerne overføres til brøndene, da de let kan holde sig til pipetten. - Fortsæt på samme måde med så mange fostre som nødvendigt.
Bemærk: Ændre skålen med dissektion medium, så snart det bliver for uklar, da det er vigtigt at se klart de dissekterede knogler. -
Når alle de ønskede knogler overføres til brøndene, fjernes dissektions mediet med en plastik 1 mL steril pipette, og der tages ekstra omhu for ikke at Aspirér knoglerne.
- Afhængigt af formålet med eksperimentet, kan billeder tages af knoglerne, før du fjerner dissektion medium, som tidspunkt nul af eksperimentet. Tag billeder med et mikroskop fastgjort til et digitalt kamera, og annoter den anvendte eksponering og skala. For at sikre nemme og pålidelige målinger skal du tage billeder med god kontrast for at skelne den mineraliserede del.
- Tilsæt 1 mL kulturmedium til hver brønd. Hvis nogen behandling er beregnet på knoglerne (doxycyclin, Tamoxifen, vækstfaktorer, osv.), det skal tilføjes nu.
- For at observere effekten af væksthæmning i dyrkningsbetingelserne, behandle venstre skinneben med retinsyre (RA, 500 nm), mens inkuletering af den rigtige skinneben med en ækvivalent volumen af køretøj (dimethylsulfoxid [DMSO], slutkoncentration 0,1%) som en kontrol.
- Lad knoglerne vokse i to dage eller mere i en cellekultur-inkubator under standard celle dyrkningsbetingelser (ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator).
- Til vurdering af proliferation tilsættes 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) eller 5-Bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) til mediet ved en slutkoncentration på 10 μM 1 − 2 timer før fiksering.
Bemærk: Bestands koncentrationen af EdU er 20 mM.
Forsigtig: EdU og BrdU er thymidinanaloger og kan være giftige og mutagene. - Tø 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og fastgør knoglerne ved nedsænkning i PFA i individuelle 2 mL rør.
Forsigtig: PFA er giftigt og betegnes som et sandsynligt humant carcinogen. Undgå indånding af PARAFORMALDEHYD pulver og dampe. EdU og BrdU er thymidinanaloger og kan være giftige og mutagene. - Efter en kort 10 min fiksering i PFA ved stuetemperatur, overføre knogler til PBS for billed erhvervelse på sidste tidspunkt. Derefter anbringes knoglerne tilbage i PFA til fastgøring ved 4 °C.
- Efter fiksering knogler kan behandles for ønskede downstream applikationer.
3. måling og analyse af den fulde længde af knoglen og af den mineraliserede region
- Brug et billedredigeringsprogram til at måle længden af knoglerne under hensyntagen til billedets størrelse. Mål både den totale længde af knoglen og den mineraliserede region. Start målingerne fra de første mørke celler i den ene ende, indtil de sidste i den anden ende.
Bemærk: Den mineraliserede region er karakteriseret ved den mørkere farve og er let skelnes fra brusken. - For at beregne vækstraten, defineret som den gennemsnitlige stigning i længden pr. dag, dividere forskellen mellem den endelige længde af knoglen og den oprindelige en af antallet af dage i kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Knogle kultur kan udføres startende fra forskellige stadier. I figur 1a-Dvises en sammenligning mellem kultiveret skinneben og frisk ekstraherede på tilsvarende stadier. Den første observation er, at op til to dages kultur den opnåede størrelse er sammenlignelig med in vivo knoglevækst for både brusk og mineraliseret knogle (figur 1a, B, D). Længere kultur perioder fører til større forskelle mellem de kultiverede knogler og den frisk ekstraherede (figur 1c). Derudover, som nævnt i protokollen, er det afgørende at fjerne det bløde væv forbinder begge ender af knoglerne, som ellers knoglerne vil bøje. Figur 1E viser et eksempel på en skinneben dyrket med ufuldstændig fjernelse af blødt væv versus en skinneben uden blødt væv.
Dernæst blev skinneben dyrket i 2 dage, og deres længde blev målt. Som det fremgår af figur 2a, B, kan målingen af den totale længde og af den mineraliserede del udføres med en billedanalyse software. Som det fremgår af de Luca et al.26, har behandling med RA en stærk virkning på væksten af skinneben allerede efter 2 dages behandling, og et lignende resultat blev observeret i vores kulturer (figur 2b-D). Det er vigtigt, at eksperimentet blev udført ved hjælp af parrede knogler, med højre knoglen som kontrol og venstre behandlet med RA (figur 2a, B, E), som hjælper med at overvinde den naturlige variation i knogle størrelse mellem forskellige enheder. Således er den beskrevne dyrkningsmetode egnet til at vurdere virkningen af forskellige forbindelser på knoglevækst.
Dernæst blev vækstraten for knoglerne efter kulturen vurderet. Knoglerne blev udvundet, målt og kultiveret ved E 15.5, 16,5 eller P1, og fast og målt igen to dage senere. Både den totale stigning i længden og længden af den mineraliserede del blev målt (figur 3c). Et eksempel på e 15,5 skinneben og femur før kultur (figur 3a) og ved forsøgets slutpunkt (figur 3b) er vist. Som det fremgår af grafen og tabellen (figur 3c, D), er der en konsekvent stigning i den samlede længde af skinneben, svarende til en omtrentlig stigning på 9 − 29% fra den oprindelige længde. Dette er en mindre stigning end den observerede in vivo; den væsentligste forskel er sandsynligvis på grund af niveauet af den proksimale brusk, større end den distale og mindre tilgængelig for næringsstoffer. Faktisk viste EdU-mærkning færre positive celler i denne region efter kultur sammenlignet med nyudtrukne knogler i tilsvarende fase (figur 4a, C). EdU-inkorporeringen i distale skinneben var ens i de dyrkede og nyudtrukne knogler (figur 4b, D) den distale brusk bidrager med ca. en tredjedel til den totale vækst af skinneben in vivo på dette stadie27, sammenlignelig med den vækstrate, der er observeret i kulturen, så vi foreslår, at analysen koncentreres om denne del af knoglen. Derudover vurderede vi mineraliseringen af de kultiverede knogler, og observere næsten ingen stigning i længden af denne region. Forskellen kan skyldes fraværet af fartøj og osteoblaster invasion i ex vivo kultur. Dette tyder på, at undersøgelser af brusk vækst kan strække sig over flere dage, mens den region af interesse er den forbenet del af knoglen, bør perioden med kultur være kortere. Denne observation blev bekræftet ved at holde skinneben i kulturen i en længere periode (op til 6 dage). Som det fremgår af figur 5, øges den samlede længde af skelet elementet betydeligt, mens næsten ingen stigning i den mineraliserede region observeres (figur 5c).
Samlet set tyder disse resultater på, at kulturen i lange knogler kan bruges til at analysere effekten af forskellige faktorer på den samlede knoglevækst og især til at vurdere brusk dynamik. Mens veletablerede metatarsale kulturer også kan anvendes med disse formål, vi fremsætter, at begge typer af kulturer supplerer hinanden, i betragtning af de iboende forskelle mellem metatarsaler og resten af lange knogler.
Figur 1: eksempel på kultiveret skinneben i forskellige perioder. (a-D) Sammenligning mellem frisk udvundet skinneben (top) og skinneben ekstraheret ved E 14.5 (bund) og dyrket i 2 dage (a), udvundet ved e 15.5 og dyrket i 2 dage (B), udvundet ved e 16.5 og dyrket i 4 dage (C) og frisk ekstraheret ved postnatal dag 2 (P2) og ekstraheret på postnatal dag 1 (P1) og dyrket i 1 dag (D). Bemærk, at mens brusk vækst forbliver ganske fysiologisk efter forskellige dyrkningsperioder, den forbenet del viser en vækst forsinkelse efter kultur tid længere end 2 dage i forhold til den frisk ekstraherede knogle i den tilsvarende fase. Skala stang = 1 mm. (e) skinneben, der dyrkes i 2 dage fra og med e 15.5; Bemærk, at den ufuldstændige fjernelse af det bløde væv mellem de to ender af knoglerne fører til bøjning af knoglen. Skaleringsbar = 600 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: måling af længden af knoglerne ved behandling med retinoinsyre (RA). (a-B) Tibias ekstraheret ved E 15.5 og dyrkes i 2 dage med 0,1% DMSO (A) og RA (B). Bemærk forskellen i både Total længde og mineraliseret del. Skala stang = 1 mm. (c-D) ændringer i den totale længde (c) eller den mineraliserede del (d) af skinneben over en periode på 6 dage i kontrolsituationen og ved tilstedeværelse af ra. Resultaterne vises som middel ± standardafvigelse (SD); sammenligning sker ved tovejs analyse af varians (ANOVA) med typen af behandling som variable (p -værdier er vist i grafen). E) sammenligning af længden af parrede knogler, der dyrkes i 2 dage med enten DMSO (højre skinneben) eller RA (venstre skinne) hver prik repræsenterer en af de 3 biologiske replikater pr. tilstand. Der blev anvendt en parret tosidet t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af den totale vækst og mineralisering af skinneben efter 48 timers ex vivo-kultur. (A) e 15,5 skinneben og lårben fra venstre (øverst) og højre (nederst) arme før dyrkning. (B) den samme skinneben og lårben fulgt op efter 2-dages kultur. Skaleringsbar = 600 μm. (C) graf, der repræsenterer vækstraten for skinneben, der dyrkes på forskellige udviklingsstadier. Både den samlede vækst og væksten i den mineraliserede del blev vurderet. D) tabel, der viser den oprindelige og endelige længde af hele knoglen og den mineraliserede del før dyrkning på e 15.5 og efter 2 dage i kulturen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Voluminøse vækst plader viser ikke megen spredning i kulturen. (a-B) EdU-farvning for proximale (A) og distale (B) tibiale vækst plader, der dyrkes fra e 15.5 i 2 dage. (C-D) EdU farvning af proksimale (C) og distale (D) tibiale vækst plader frisk ekstraheret på e 17.5. Bemærk forskellen i antallet af EdU (+)-celler i det protalale skinneben. Data omfatter 6 kultiverede par lemmer og 3 frisk ekstraheret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: længere perioder med skinneben kultur viser betydelig brusk vækst, men lidt mineralisering. Frisk udvundet skinneben ved E 15.5 (t = 0) (a) og efter 6 dage i kultur (B). Bemærk forskellene mellem brusk vækst og væksten af den mineraliserede del. Skala bjælke = 1 mm (C) graf, der viser ændringerne i den samlede længde og den mineraliserede region over en periode på 6 dage. n = 5 dyrkede tibias; SD på hvert tidspunkt er som følger: t = 0, fuld længde = 0,0777, mineraliseret = 0,0213; t = 3 d, fuld længde = 0,1495, mineraliseret = 0,056; t = 6 d, fuld længde = 0,1193, mineraliseret = 0,0521. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Knogle ex vivo kultur metoder har været anvendt i nogen tid til at vurdere biologi knoglevækst28, men har været sjældent anvendt til murine lange knogler. Med udviklingen af billedbehandlings teknikker, tilbyder ex vivo knogle kultur en attraktiv måde at studere knoglevækst i realtid i en indstilling, der ligner de in vivo betingelser. I dette scenario er det vigtigt at definere de betingelser, hvorunder væksten af lange knogler er sammenlignelig med deres vækst in vivo.
I nærværende undersøgelse beskriver vi en enkel og overkommelig protokol for lang knogle kultur, der omhandler begrænsningerne og mulige anvendelser. Det mest kritiske trin i denne metode er isoleringen af knoglerne, som skal forblive intakt og med så mindre blødt væv mellem enderne af knoglen som muligt. Efterlader blødt væv mellem enderne af knoglerne vil forhindre normal vækst af knoglen og fremkalde bøjning, som er eksemplificeret i figur 1E. Blødt væv i enderne af knoglerne kan efterlades, da det i sidste ende vil forsvinde. Et andet skridt, der kræver ekstra omhu, er overførslen af knoglerne til dyrknings pladen, da de nemt kan holde sig til plastik pipetten. En mulig løsning er pipettering op og ned dissektion medium, der indeholder blod og væv stykker, da det skaber en belægning, der hjælper med at forhindre knoglerne i at klæbe til pipetten.
Når knoglerne er udvundet, når de op på samme størrelse som de tilsvarende in vivo-stadier, når de dyrkes i op til 48 timer. ud over at måle længden af knoglen kan vækstraten (gennemsnitlig stigning i længden pr. dag) let vurderes under disse forhold. Denne metode til beregning af vækstraten er dog ikke gyldig over længere dyrkningsperioder, hvor der bør anvendes andre metoder, såsom kalcein-mærkning29. Behandling med retinsyre, som fremmer for tidlig kondrocyt differentiering, fører til en betydelig reduktion i væksten af knoglerne, tyder på, at denne tid til dyrkning er nok til at observere den virkning, at forskellige stoffer kan have på knogle Vækst. Det er vigtigt, at sammenligningen også blev udført på parrede knogler fra samme præparat, således at venstre skinneben fik RA-behandlingen, og retten var kontrol. Dette er en fordel ved knogle kulturmodel, da det giver mulighed for at udføre parret sammenligninger, som er statistisk mere kraftfulde.
Culturing for længere tid viser betydelig vækst i brusk del, men en forsinkelse i væksten af mineraliseret en, og det er vigtigt at overveje dette resultat, når du vælger anvendelsen af teknikken. Lignende resultater blev observeret i chick lårben kulturperler i op til 10 dage, som viser en forstørret epifyseal region og en reduceret diafyseale knogle krave14, samt i mus skinneben dyrkes i 6 dage18. Derudover er det vigtigt at nævne, at væksten i brusk regionen heller ikke er homogen: den voluminøse distale region af skinneben og proksimale region af skinnebenet modtager ikke næringsstoffer effektivt ved simpel diffusion og kan ikke vokse ordentligt. I denne sammenhæng bør undersøgelserne fokusere på de modsatte vækst plader, som skønnes at bidrage til en tredjedel af den samlede vækst på27, svarende til den observerede vækst i kulturen. Forsinkelsen i væksten af kultiverede knogler blev også beskrevet for metatarsale kulturer15.
En vigtig overvejelse af denne type kultur er fraværet af vækst i den forbenet del af knoglen. Det er veletableret, at osteoblaster invaderer brusk matrixen fra periosteum sammen med blodkarrene3,4 og denne proces er tydeligvis forstyrret, når knogle er isoleret. Dette kan forklare manglen på ossifikation under dyrkningsbetingelser. Hypertrofisk Chondrocyt transdifferentiering blev også vist som en vigtig kilde til osteoblaster7,8,9, men om denne proces også kræver til dels tilstedeværelsen af blodkar, som det ser ud til at gøre under fraktur heling30eller visse andre væv, der ikke findes i ex vivo-kulturer, skal undersøges nærmere. Desuden er det godt beskrevet betydningen af den mekaniske belastning i forme knoglevækst31,32, som påvirker lange knogler og metatarsal knogler forskelligt, men er fraværende i en ex vivo dyrkning setup. Ikke desto mindre er den beskrevne dyrkningsmetode velegnet til måling af Chondrocyt dynamik og ændringer i langsgående vækst og kan derfor anvendes til visse anvendelser.
Samlet set giver den beskrevne protokol en enkel og billig metode til kultur lange knogler begyndende fra forskellige stadier, som kan kombineres med yderligere teknikker til at løse centrale cellulære og molekylære mekanismer, såsom levende time-lapse Imaging13 , 23 eller narkotikabehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Alexandra Joyner for hendes støtte, da denne protokol blev etableret, Edwina McGlinn og Yi-Cheng Chang for at dele retinoinsyre. Den australske regenerative Medicine Institute er støttet af tilskud fra staten regeringen i Victoria og den australske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K.
- Kronenberg, H. M.
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
