Summary
Hier presenteren we een methode voor ex vivo cultuur van lange muizen botten op zowel foetale en pasgeboren stadia, geschikt voor het analyseren van bot-en kraakbeen ontwikkeling en homeostase in gecontroleerde omstandigheden, terwijl Recapitulerend het in vivo proces.
Abstract
Lange botten zijn complexe en dynamische structuren, die voortkomen uit endochondral ossificatie via een kraakbeen intermediair. De beperkte toegang tot gezonde menselijke botten maakt bijzonder waardevol het gebruik van zoogdieren modellen, zoals muis en rat, te kijken naar verschillende aspecten van de groei van botten en homeostase. Bovendien, de ontwikkeling van geavanceerde genetische hulpmiddelen in muizen maakt meer complexe studies van lange bot groei en vraagt om een uitbreiding van de technieken die worden gebruikt om de groei van botten te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor ex vivo muizen Bone Culture, die het mogelijk maakt de studie van bot en kraakbeen op een strak gecontroleerde wijze, terwijl Recapitulerend het grootste deel van de in vivo proces. De beschreven methode maakt de cultuur van een reeks van botten, met inbegrip van Tibia, femur, en metatarsale botten, maar we hebben vooral gericht op tibiaal cultuur hier. Bovendien kan het gebruikt worden in combinatie met andere technieken, zoals time-lapse Live Imaging of medicamenteuze behandeling.
Introduction
De orgaan groei moet strak worden afgestemd om de verschijning van groei wanorde te verhinderen, en impliceert de verordening van veelvoudige cel types, moleculaire wegen en overspraak onder verschillende delen van het lichaam. Imaging technieken zijn essentieel om de veranderingen die zich na verloop van tijd in een groeiend embryo, zowel in normale omstandigheden, als na een verstoring wordt geïnduceerd in het systeem aan te pakken. Embryo's met intra-uteriene ontwikkeling, zoals de veelgebruikte knaagdieren modellen, presenteren een extra uitdaging voor Live Imaging en medicamenteuze behandeling, die gedeeltelijk kan worden overwonnen met behulp van ex vivo cultuurtechnieken. Om de in vivo processen succesvol te recapituleren en zinvolle resultaten te verkrijgen, wordt het cruciaal om de juiste kweken voorwaarden te vinden voor elk orgaan of weefsel.
De meeste botten van het zoogdier skelet groeien door endochondral ossificatie, waar het embryonale kraakbeen (bestaande uit cellen genaamd chondrocyten) drijft longitudinale groei en wordt geleidelijk vervangen door het bot. Dit proces gebeurt op de groei platen, gelegen aan het einde van de lange botten, waar drie zones kunnen worden onderscheiden: rusten, proliferatie, en hypertrofische1,2. Ten eerste, de ronde voorloper chondrocyten in de rustzone overgang naar de wieler zuil chondrocyten in de proliferative zone. Tijdens het volgende stadium van differentiatie, worden deze chondrocyten hypertrofische en beginnen afscheidend type X collageen. Hypertrofische chondrocyten orkestreren de daaropvolgende stappen van ossificatie: ze scheiden belangrijke signalering moleculen, zoals bindweefsel groeifactor, bot morfogenetische eiwitten en Indiase egel, en direct de mineralisatie van de matrix, werven de bloedvaten aan het centrale deel van het been, en, op apoptosis, staan osteoblasten (been-vormende cellen) toe om de matrijs binnen te vallen om het primaire ossificatie centrum te vormen3,4. De minerale matrix vergemakkelijkt de penetratie van de bloedvaten waardoor osteoblasten migreren naar dit gedegradeerde kraakbeen te vervangen door een bone matrix5. De meeste osteoblasten binnenvallen het kraakbeen matrix van de perichondrium, een vezelige laag die het kraakbeen wraps6. Als alternatief, een deel van hypertrofische chondrocyten zijn in staat om te overleven en te transdifferentiëren naar osteoblasten7,8,9. De uiteindelijke lengte van het bot is te wijten aan de geaccumuleerde groei van de voorbijgaande kraakbeen, waarvan de groei op zijn beurt afhankelijk van het aantal en de grootte van de hypertrofische chondrocyten, en hun matrix productie10. Bovendien werd onlangs aangetoond dat de duur van de laatste hypertrofie fase correleert met de uiteindelijke lengte van het bot11. Daarom, strakke regulering van de proliferatie en differentiatie van deze cellen is vereist om een goede been grootte te garanderen.
Ondanks de wezenlijke kennis die in de loop van de jaren op de organisatie en de ontwikkeling van de de groei platen wordt verworven, zijn het grootste deel van deze conclusies gebaseerd op de observatie van vaste histologische secties. De sectie van het weefsel verstrekt waardevolle informatie over dit proces, maar kan met technische artefacten worden gereden, zodat kan het niet altijd betrouwbaar worden gebruikt om morfologisch of grootte veranderingen tussen verschillende stadia te schatten. Bovendien, als bot groei is een dynamisch proces, de statische twee-dimensionale (2D) beelden bieden een beperkt inzicht in de beweging van de cellen in de groei plaat, terwijl time-lapse beeldvorming op levend weefsel kan waardevolle informatie over het gedrag van de te bieden chondrocyten in de groei plaat.
Al deze beperkingen kunnen mogelijk worden opgelost met behulp van ex vivo Bone cultures. Terwijl de bot-cultuur protocollen zijn enige tijd geleden ontwikkeld, werden ze beperkt toegepast op muizen lange botten. De meeste studies gebruiken kuiken beenderen toe te schrijven aan de technische voordelen die door het kuiken model worden aangeboden12,13. Organotypic culturen (lucht/Liquid Interface) werden toegepast op kuiken embryonale femur, die werden gehandhaafd in de cultuur voor 10 dagen14. De geavanceerde genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in de muis maken dit model zeer aantrekkelijk om te worden gebruikt in ex vivo Bone cultuur. De studies die muizen gebruikt om te kijken naar de groei van het bot werkte meestal met metatarsale Bones15, waarschijnlijk te wijten aan hun kleine omvang en grotere aantallen verkregen per embryo16. Hoewel traditioneel beschouwd als lange botten, metatarsi Voer senescentie (gekenmerkt door een verminderde proliferatie en verwikkeling van de groei plaat17) eerder dan andere lange botten in vivo, en dus hun voortdurende groei ex vivo niet echt recapituleren het in vivo proces. Voor de toepassing van dit artikel, zullen we gebruik maken van de term lange botten voor botten uit de proximale en tussenliggende ledematen regio's. Verscheidene vorige studies gebruikten lange muizen beenderen, zoals Tibia, in ex vivo culturen en waargenomen een wezenlijke groei van het kraakbeen maar weinig ossificatie18. We hebben ook gebruikt tibiaal culturen onlangs, vooral om te studeren chondrocyten Dynamics19. Andere studies gebruikt femorale hoofden van jonge muizen20 of alleen het distale deel van het dijbeen voor cultuur21. Sommige recentere werken combineren met succes de ex vivo cultuur van volledige botten met time-lapse Imaging om driedimensionale (3D) films van chondrocyten te verwerven in het levende muis weefsel22,23. De auteurs slaagden erin om eerder ongemerkte gebeurtenissen in de herschikking van chondrocyten aan de proliferative streek23 in een goed voorbeeld van de potentiële toepassing van been ex vivo cultuur in acht te nemen. Het alternatief, dat wil zeggen, het analyseren van statische beelden, vereist indirecte en complexe technieken. Dit werd geïllustreerd door een recente studie het beoordelen van het belang van dwars-georiënteerde klonen voor kraakbeen groei, waar genetische tracering met multicolor reporter muis stammen in combinatie met wiskundige modellering werden gebruikt24. Daarom kan de ex vivo cultuur helpen om inzicht te krijgen in dynamische processen op een snellere en meer eenvoudige manier.
Hier presenteren we een methode voor muizen lange botten cultuur, die kan worden gecombineerd met verschillende moleculaire behandelingen en/of met time-lapse Live Imaging. Dit protocol past de methoden die worden gebruikt in eerdere rapporten15,18,25, maar adressen enkele extra problemen en richt zich op lange botten, zoals het scheenbeen, in plaats van metatarsale botten. Ten slotte onderzoekt het het potentieel van het gebruik van statistisch krachtige gepaarde vergelijkingen door kweken links en rechts botten afzonderlijk in de aanwezigheid van verschillende stoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten moeten worden uitgevoerd naar aanleiding van de lokale gouvernementele en institutionele richtsnoeren van de ethische behandeling van proefdieren.
1. preparaten voorafgaand aan de dag van de bone Culture
- Instellen getimede muis paringen om foetussen en pups te verkrijgen van de embryonale dag 14,5 (E 14.5) en verder.
Opmerking: De cultuur van lange beenderen kan met succes op verschillende muis spanningen worden toegepast; in het huidige protocol, worden de gekweekte Zwitserse Webster wild-type muizen gebruikt. - Bereid dissectie medium (aangepast van Houston et al.15): Verdun α-minimum essentieel middel (α-mem) of Dulbecco gemodificeerde adelaar medium (DMEM) 1/13 in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en 2 mg/ml boviene serum ALBUMINE (BSA) en filter steriliseren door middel van een 0,22 µm, 33 mm diameter spuit filter. Bewaar de hoeveelheid bij-20 °C.
- De dag voor de extractie van de foetussen, bereiden de serum-vrije Bone Culture medium bestaat uit DMEM bevattende 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutamine, 40 U/mL penicilline/streptomycine, 0,05 mg/mL ascorbinezuur, en 1 mM betaglycerophosphate. Filter steriliseren door middel van een 0,22 µm, 33 mm diameter spuit filter en op te slaan bij 4 ° c voor maximaal 1 maand.
- Op de dag van de cultuur en voorafgaand aan de muis ruiming, bereiden 24-Well platen en 60 mm gerechten met dissectie medium en houd ze ijskoud. Verwarm het been kweekmedium in een waterbad van 37 °C. Spray 80% (v/v) ethanol op de gereedschappen (pincet en kleine schaar) te worden gebruikt voor de behandeling van foetus. Breng een verrekijker Scope naar een klasse II bioveiligheid kabinet.
2. cultuur van foetus en pasgeboren Tibia en femur
- Ruiming van de zwangere muis door cervicale dislocatie op de gewenste zwangerschapsfase (variërend van E 14.5 tot E 18.5). Als pasgeboren pups worden gebruikt, verwijder ze van de moeder een voor een en ruiming door onthoofding.
- Plaats de muis op haar rug en steriliseren van de abdominale regio door het spuiten van 80% (v/v) ethanol op het oppervlak.
- Snijd de huid en de buikspier met kleine schaar om de baarmoeder hoorns toegang.
- Pak de baarmoeder uit de buikholte met behulp van een pincet en een kleine schaar, het verwijderen van de mesometrium en het snijden van de basis van de hoorns. Plaats de baarmoeder in een 60 mm Petri schaaltje met ijskoude dissectie medium en houd de cultuur schotel op ijs tijdens de hele procedure.
- Breng de Petri schaal met de baarmoeder naar het bioveiligheid kabinet en werk er vanaf nu.
- Aparte individuele foetussen met een schaar door te snijden tussen de zakjes.
- Overdracht individuele SAC onder een dissectie stereomicroscoop in een schone 60 mm schotel met dissectie medium en open ze met een pincet om de foetussen scheiden van de placenta en ze schoon te maken van membranen.
Opmerking: Werk met één embryo tegelijk, terwijl de rest op het ijs blijft. - Onthoofd de foetussen en breng het lichaam over op een schone nieuwe 60 mm schaal met een 1 mL geslepen steriele pipet.
- Verwijder de huid van de foetussen of pups met een pincet vanaf de achterkant en peeling het uit tot de tenen.
- Scheid de achterpoten van het lichaam door te snijden met de pincet dicht bij de wervelkolom en breng ze naar een schone schotel met ijskoud dissectie medium.
- Scheid het scheenbeen van het dijbeen met een pincet door zorgvuldig de invoering van hen tussen het oppervlak kraakbeen van distale femur en proximale tibia.
- Verwijder de heup botten uit de proximale femur en de calcaneus bot en de fibula uit het scheenbeen.
- Verwijder voorzichtig het zachte weefsel van het dijbeen en het scheenbeen door happen en trek het uit.
Opmerking: Het is belangrijk om zo veel zacht weefsel als mogelijk te verwijderen, waarbij speciale zorg in het verwijderen van het weefsel dat de twee kraakbeen palen verbindt, maar het vermijden van beschadiging van het kraakbeen, de perichondrium, en de botten. - Plaats de vier botten (links en rechts Tibia en femur) in de eerste put van de 24-Well plaat met een plastic 1 mL steriele pipet. Als alternatief, om het effect van verschillende behandelingen te vergelijken op links en rechts ledematen, plaats contralaterale ledematen in verschillende putten.
Opmerking: Extra zorg moet worden genomen wanneer de botten worden overgedragen aan de putten, omdat ze gemakkelijk kunnen vasthouden aan de pipet. - Ga op dezelfde manier met zo veel foetussen als nodig is.
Opmerking: Verander de schotel met de dissectie medium zodra het wordt te bewolkt, want het is belangrijk om duidelijk te zien de ontleed botten. -
Wanneer alle gewenste botten naar de putjes worden overgebracht, verwijder dan het dissectie medium met een plastic 1 mL steriele pipet en wees extra voorzichtig om de botten niet te aspireren.
- Afhankelijk van het doel van experiment, kunnen de beelden van de beenderen worden genomen alvorens het dissectie middel te verwijderen, als timepoint nul van het experiment. Neem Foto's met een Microscoop bevestigd aan een digitale camera en aantekeningen van de belichting en schaal gebruikt. Om te zorgen voor eenvoudige en betrouwbare metingen, Foto's nemen met een goed contrast om het mineraal deel te onderscheiden.
- Voeg 1 mL kweekmedium toe aan elk goed. Als een behandeling is bedoeld op de botten (doxycycline, tamoxifen, groeifactoren, enz.), moet het nu worden toegevoegd.
- Om te observeren het effect van de groeiremming in de cultuur voorwaarden, behandelen de linker Tibia met retinol zuur (RA, 500 nM), terwijl het incuberen van de juiste tibias met een gelijkwaardig volume van het voertuig (dimethyl sulfoxide [DMSO], eindconcentratie 0,1%) Als een controle.
- Laat de botten te groeien voor twee dagen of meer in een cel kweek incubator onder standaard cel cultuur voorwaarden (bij 37 ° c in een 5% CO2 incubator).
- Om de proliferatie te beoordelen, voegt u 5-ee-2'-deoxyuridine (EdU) of 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) toe aan het medium met een eindconcentratie van 10 µ M 1 − 2 h voor fixatie.
Opmerking: De voorraad concentratie van EdU is 20 mM.
Let op: EdU en BrdU zijn thymidine analogen en kunnen giftig en mutageen zijn. - Dooi 4% Paraformaldehyde (topsnelheid) en bevestig de botten door onderdompeling in de individuele 2 mL tubes.
Let op: De stof is giftig en aangewezen als een waarschijnlijk carcinogeen voor de mens. Vermijd ademhaling Paraformaldehyde poeder en dampen. EdU en BrdU zijn thymidine analogen en kunnen giftig en mutageen zijn. - Na een korte 10 min fixatie in de middel plaats bij kamertemperatuur, overdracht botten naar PBS voor foto acquisitie op Final timepoint. Plaats vervolgens de botten terug in de voor overnachting bevestiging bij 4 °C.
- Na fixatie botten kunnen worden verwerkt voor de gewenste downstream-toepassingen.
3. meting en analyse van de volledige lengte van het bot en van het mineraal gebied
- Gebruik een beeldbewerkingssoftware om de lengte van de botten te meten, rekening houdend met de schaal van de afbeelding. Meet zowel de totale lengte van het bot en het mineraal gebied. Begin de metingen van de eerste donkere cellen aan de ene kant tot de laatste aan de andere kant.
Opmerking: De minerale regio wordt gekenmerkt door de donkerdere kleur en is gemakkelijk te onderscheiden van het kraakbeen. - Voor de berekening van de groei, gedefinieerd als de gemiddelde stijging van de lengte per dag, verdelen het verschil tussen de uiteindelijke lengte van het bot en de initiële een door het aantal dagen in de cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De cultuur van het been kan beginnend van verschillende stadia worden uitgevoerd. In Figuur 1a-Dwordt een vergelijking weergegeven tussen gekweekte Tibia en vers geëxtraheerde exemplaren in gelijkwaardige stadia. De eerste waarneming is dat tot twee dagen van de cultuur van de bereikte grootte is vergelijkbaar met de in vivo bot groei voor zowel kraakbeen en mineraal bot (Figuur 1a, B, D). Langere cultuurperiodes leiden tot grotere verschillen tussen de gekweekte botten en de vers geëxtraheerde (figuur 1c). Bovendien, zoals vermeld in het Protocol, is het cruciaal om het zachte weefsel aansluiten van beide uiteinden van de botten te verwijderen, zoals anders de botten zal buigen. Figuur 1e toont een voorbeeld van een Tibia gekweekt met onvolledige verwijdering van zacht weefsel versus een Tibia zonder zacht weefsel.
Vervolgens tibias werden gekweekt voor 2 dagen en hun lengte werd gemeten. Zoals te zien is in Figuur 2a, B, kan de meting van de totale lengte en van het mineraal deel worden uitgevoerd met een beeldanalyse software. Zoals blijkt uit de Luca et al.26, behandeling met Ra heeft een sterk effect op de groei van de Tibia al na 2 dagen van de behandeling en een soortgelijk resultaat werd waargenomen in onze culturen (Figuur 2b-D). Belangrijk is dat het experiment werd uitgevoerd met behulp van gepaarde botten, met het rechterbeen als controle en de linker behandeld met RA (Figuur 2a, B, E), die helpt bij het overwinnen van de natuurlijke variabiliteit in het bot grootte tussen de verschillende specimens. Aldus, is de beschreven methode kweken geschikt om het effect van verschillende samenstellingen op beengroei te beoordelen.
Vervolgens werd het groeitempo van de botten na de cultuur beoordeeld. Botten werden geëxtraheerd, gemeten en gekweekt op E 15.5, 16,5 of P1, en vast en gemeten opnieuw twee dagen later. Zowel werd de totale verhoging van lengte als de lengte van het minerale deel gemeten (figuur 3c). Een voorbeeld van E 15.5 Tibia en femur voor cultuur (Figuur 3a) en aan het eindpunt van het experiment (Figuur 3b) worden getoond. Zoals kan worden waargenomen uit de grafiek en de tabel (figuur 3c, D), is er een consistente stijging van de totale lengte van het scheenbeen, wat overeenkomt met een geschatte stijging van 9 − 29% van de initiële lengte. Dit is minder groter dan de in vivo waargenomen; het belangrijkste verschil is waarschijnlijk te wijten aan het niveau van de proximale kraakbeen, groter dan de distale en minder toegankelijk voor voedingsstoffen. Inderdaad, EdU labeling toonde minder positieve cellen in deze regio na cultuur in vergelijking met vers uitgepakte botten van gelijkwaardige fase (figuur 4a, C). De EdU integratie in het distale scheenbeen was vergelijkbaar in de beschaafde en vers geëxtraheerde botten (figuur 4b, D) het distale kraakbeen draagt ongeveer eenderde bij aan de totale groei van het Tibia in vivo in dit stadium27, vergelijkbaar met de groei in de cultuur, dus we stellen voor dat de analyse moet worden gericht op dit deel van het bot. Daarnaast beoordeelden we de mineralisatie van de gekweekte botten, en observeren bijna geen verhoging van de lengte van deze regio. Het verschil kan te wijten zijn aan het ontbreken van een schip en osteoblasten invasie in de ex vivo cultuur. Dit suggereert dat studies van de kraakbeen groei kan verlengen voor meerdere dagen, terwijl als de regio van belang is het verbeend deel van het bot, de periode van cultuur moet korter zijn. Deze observatie werd bevestigd door Tibia in cultuur voor een langere periode (tot 6 dagen) te houden. Zoals kan worden gezien in Figuur 5, de totale lengte van het skelet element stijgt aanzienlijk, terwijl bijna geen toename in het mineraal gebied wordt waargenomen (figuur 5c).
Globaal, suggereren deze resultaten dat de cultuur van lange beenderen kan worden gebruikt om het effect van verschillende factoren op algemene beengroei te analyseren en in het bijzonder om kraakbeen dynamica te beoordelen. Terwijl de gevestigde metatarsale culturen ook met deze doeleinden kunnen worden gebruikt, stellen wij voor dat beide types van culturen elkaar aanvullen, gezien de intrinsieke verschillen tussen middenvoetsbeentjes en de rest lange beenderen.
Figuur 1: voorbeeld van gekweekte Tibia voor verschillende tijdsperiodes. (a-D) Vergelijking tussen vers geëxtraheerde Tibia (boven) en Tibia geëxtraheerd op E 14.5 (onder) en gekweekt voor 2 dagen (a), geëxtraheerd bij e 15.5 en gekweekt voor 2 dagen (B), geëxtraheerd bij e 16.5 en gekweekt voor 4 dagen (C) en vers geëxtraheerd op postnatale dag 2 (P2) en geëxtraheerd op postnatale dag 1 (P1) en gekweekt voor 1 dag (D). Merk op dat, terwijl de kraakbeen groei vrij fysiologisch blijft na verschillende kweken periodes, de verbeend deel toont een groeivertraging na cultuur tijd langer dan 2 dagen ten opzichte van de vers uitgepakte bot in de overeenkomstige fase. Schaalbalk = 1 mm. (e) Tibia gekweekt voor 2 dagen vanaf E 15.5; Merk op dat de onvolledige verwijdering van het zachte weefsel tussen de twee uiteinden van de botten leidt tot het buigen van het bot. Schaalbalk = 600 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: meting van de lengte van de botten bij retinoische zuur (RA) behandeling. (a-B) Tibias geëxtraheerd op E 15.5 en geteeld voor 2 dagen met 0,1% DMSO (a) en RA (B). Let op het verschil in zowel de totale lengte en van het mineraal deel. De staaf van de schaal = 1 mm. (c-D) veranderingen in totale lengte (c) of het mineraal deel (D) van Tibia over een periode van 6 dagen in controle situatie en in aanwezigheid van Ra. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD); vergelijking wordt gedaan door twee-weg analyse van variantie (ANOVA) met het type van de behandeling als variabele (p -waarden worden weergegeven in de grafiek). (E) vergelijking van de lengte van gepaarde botten gekweekt voor 2 dagen met ofwel DMSO (rechts Tibia) of RA (links Tibia); elke stip vertegenwoordigt een van de 3 biologische repliceert per voorwaarde. Gepaarde twee-tailed student t-test werd gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: vergelijking van de totale groei en mineralisatie van het scheenbeen na 48 uur van ex vivo cultuur. (A) e 15.5 Tibia en dijbeen van links (boven) en rechts (onderste) ledematen voorafgaand aan kweken. (B) dezelfde Tibia en dijbeen gevolgd na 2-daagse cultuur. Scale Bar = 600 µm. (C) grafiek die de groeisnelheid van tibias gekweekt in verschillende ontwikkelingsstadia. Zowel de totale groei als de groei van het mineraal deel werden beoordeeld. Dtabel met de begin-en eind lengte van het hele bot en het mineraal gedeelte vóór kweken bij e 15.5 en na 2 dagen in cultuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Volumineuze groei platen tonen niet veel proliferatie in cultuur. (a-B) EdU kleuring voor proximale (A) en distale (B) tibiale groei platen gekweekt van e 15.5 voor 2 dagen. (C-D) EdU kleuring voor proximale (C) en distale (D) tibiale groei platen vers geëxtraheerd op e 17.5. Let op het verschil in het aantal EdU (+) cellen in de proximale tibia. Gegevens omvatten 6 gekweekte paren van ledematen en 3 vers geëxtraheerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: langere periodes van Tibia cultuur tonen aanzienlijke kraakbeen groei, maar weinig mineralisatie. Vers geëxtraheerde Tibia bij E 15.5 (t = 0) (A) en na 6 dagen in cultuur (B). Let op de verschillen tussen kraakbeen groei en de groei van het mineraal deel. De staaf van de schaal = 1 mm (C) grafiek die de veranderingen in de totale lengte en het mineraal gebied over een periode van 6 dagen toont. n = 5 gekweekte Tibia; BR bij elk tijdpunt is als volgt: t = 0, volledige lengte = 0,0777, mineraal = 0,0213; t = 3 d, volledige lengte = 0,1495, mineraal = 0,056; t = 6 d, volledige lengte = 0,1193, mineraal = 0,0521. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Been ex vivo cultuur methoden zijn gebruikt voor enige tijd om de biologie van de groei van de botten28te beoordelen, maar zijn zelden toegepast op muizen lange botten. Met de ontwikkeling van Imaging technieken biedt ex vivo Bone Culture een aantrekkelijke manier om de beengroei in real time te bestuderen in een omgeving die sterk lijkt op de in vivo omstandigheden. In dit scenario is het belangrijk om de omstandigheden te definiëren waarin de groei van lange botten vergelijkbaar is met hun groei in vivo.
In de huidige studie, beschrijven we een eenvoudige en betaalbare protocol voor lange been cultuur, het aanpakken van de beperkingen en mogelijke toepassingen. De meest kritieke stap van deze methode is de isolatie van de botten, die intact moeten blijven en met als minder zacht weefsel tussen de uiteinden van het bot mogelijk. Het verlaten van zacht weefsel tussen de uiteinden van de botten zal de normale groei van het bot te voorkomen en te induceren buigen, zoals wordt geïllustreerd in Figuur 1e. Zacht weefsel aan de uiteinden van de botten kan worden overgelaten, want het zal uiteindelijk verdwijnen. Een andere stap die extra zorg vereist is de overdracht van de botten naar de kweken plaat, omdat ze gemakkelijk kunnen vasthouden aan de plastic pipet. Een mogelijke oplossing is pipetten op en neer dissectie medium met bloed en weefsel stukken, want het creëert een coating die helpt om de botten van het vasthouden aan de pipet.
Eenmaal geëxtraheerd, beenderen te bereiken vergelijkbare grootte van de overeenkomstige in vivo fase wanneer gekweekt voor maximaal 48 h. Afgezien van het meten van de lengte van het bot, de groeisnelheid (gemiddelde stijging van de lengte per dag) kan gemakkelijk worden geschat in deze omstandigheden. Deze aanpak voor de berekening van de groeisnelheid is echter niet geldig in langere kweken perioden, waarbij andere methoden, zoals calceïne labeling29, moeten worden gebruikt. Behandeling met retinol zuur, die vroegtijdige chondrocyten differentiatie bevordert, leidt tot een aanzienlijke vermindering van de groei van de botten, wat suggereert dat dit keer voor kweken is genoeg om het effect dat verschillende stoffen zou kunnen hebben op het bot te observeren Groei. Belangrijk is dat de vergelijking ook gedaan op gepaarde botten uit hetzelfde exemplaar, zodat de linker Tibia kreeg de RA behandeling en het recht was de controle. Dit is een voordeel van het model van de been cultuur, aangezien het het uitvoeren van gepaarde vergelijkingen toestaat, die statistisch krachtiger zijn.
Kweken voor langere tijd toont een significante groei van het kraakbeen deel, maar een vertraging in de groei van de minerale een, en het is belangrijk om dit resultaat te overwegen bij de keuze van de toepassing van de techniek. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in kuiken femurs gekweekt voor maximaal 10 dagen die een uitgebreide Epifysaire regio en een verminderde diaphyseal been kraag14, evenals in de muis Tibia gekweekt voor 6 dagen18show. Daarnaast is het belangrijk te vermelden dat in het kraakbeen gebied de groei is ook niet homogeen: de omvangrijke distale regio van het dijbeen en proximale regio van het scheenbeen niet efficiënt ontvangen voedingsstoffen door eenvoudige diffusie en kan niet goed groeien. In dit verband moet de studie zich richten op de tegenovergestelde teelt platen, die naar schatting een bijdrage leveren aan een derde van de totale groei27, vergelijkbaar met de waargenomen groei in cultuur. De vertraging in de groei van gekweekte botten werd ook beschreven voor metatarsale cultures15.
Een belangrijke overweging van dit type van cultuur is de afwezigheid van de groei van het verbeend deel van het been. Het is goed vastgesteld dat de osteoblasten binnenvallen de kraakbeenmatrix van de periost samen met de bloedvaten3,4 en dit proces is uiteraard verstoord wanneer het bot is geïsoleerd. Dit kan verklaren de afwezigheid van ossificatie onder cultuuromstandigheden. Hypertrofische chondrocyten transdifferentiatie werd ook getoond als een belangrijke bron van osteoblasten7,8,9, maar of dit proces vereist ook voor een deel de aanwezigheid van bloedvaten, zoals het lijkt te doen tijdens Fracture Healing30, of een andere weefsels niet aanwezig in ex vivo culturen, moet nader onderzoek. Daarnaast is het goed beschreven het belang van de mechanische belasting in het vormgeven van de bot-groei31,32, die invloeden lange botten en metatarsale botten anders, maar is afwezig in een ex vivo kweken Setup. Toch is de beschreven kweken methode geschikt voor het meten van chondrocyten dynamiek en veranderingen in longitudinale groei en kan dus gebruikt worden voor bepaalde toepassingen.
Globaal, verstrekt het beschreven protocol een eenvoudige en goedkope methode aan cultuur lange beenderen die van verschillende stadia beginnen, die met extra technieken kunnen worden gekoppeld om zeer belangrijke cellulaire en moleculaire mechanismen aan te pakken, zoals levende time-lapse beeldvorming13 , 23 of medicamenteuze behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen Alexandra Joyner bedanken voor haar steun toen dit protocol werd opgericht, Edwina McGlinn en Yi-Cheng Chang voor het delen van retinol zuur. Het Australische regeneratieve geneeskunde Instituut wordt gesteund door subsidies van de staatsoverheid van Victoria en de Australische overheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K.
- Kronenberg, H. M.
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
