Summary
该方案描述了小鼠肝外胆管三维器官系统的产生。这些胆道有机物质可以维持在培养中, 以研究胆管细胞生物学。胆道有机体表达的标志物的祖先和胆道细胞, 是由偏振上皮细胞。
Abstract
胆管病变, 影响肝外胆管 (Ehbd), 包括胆道闭锁, 原发性硬化性胆管炎, 和胆管癌。他们没有有效的治疗选择。研究 EHBD 的工具非常有限。我们的目的是开发一种特定于器官、多才多艺的成人干细胞衍生的、临床前的胆管细胞模型, 该模型可从野生小鼠和基因工程小鼠中轻松生成。因此, 我们报告了从成年小鼠 Ehbd 中开发 EHBD 有机体 (EHBDO) 培养系统的新技术。该模型具有成本效益, 能够轻松进行分析, 并具有多个下游应用。具体而言, 我们描述了小鼠 EHBD 分离和单细胞离解、有机体培养的启动、繁殖以及长期维护和储存的方法。本文还介绍了 EHBDO 的免疫组织化学、荧光显微镜和 mRNA 丰度定量的实时定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR)。该协议除了生产 ehbd 特异性有机体外, 还具有显著的优势。使用来自 L-WRN 细胞的条件介质可显著降低该模型的成本。与人体组织不同, 小鼠 Ehbd 的使用为培养生成提供了几乎无限的组织。生成的小鼠 Ehbdo 含有纯群体的上皮细胞, 具有内皮祖细胞和分化胆道细胞的标记。培养的有机生物通过多个通道保持均匀形态, 并可在液氮长期储存后恢复。该模型允许研究胆道祖细胞增殖, 可以在药理上操纵, 也可以从基因工程小鼠中产生。需要进行进一步的研究, 以优化培养条件, 以提高电镀效率, 评估功能细胞成熟度, 并直接分化细胞。开发共培养模型和更中性的细胞外基质也是可取的。
Introduction
胆管病变是一种不治之症, 影响位于肝内和肝外胆管 (Ehbd)的胆道细胞1。一些胆管疾病, 如原发性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道闭锁和胆总管囊肿, 主要影响乙二苯醚。由于临床前模型有限, 胆管病治疗的发展受到限制。此外, 以前的研究侧重于分类的胆管疾病: 肝脏、肝内和乙二苯醚。然而, 内和乙二苯醚具有明显的胚胎起源, 因此, 应被视为不同的分子病理。肝内胆管从肝内导管板和肝室的颅骨部分发展, 整个 EHBDs 从肝室2的尾部发育.他们还依靠不同的祖细胞隔间进行成人稳态, 包括 ehbd2,3中肝内胆管和胆道周围的海灵管。使用动物模型进行临床前研究受到费用的限制, 出于伦理原因, 应尽量减少。因此, 在体外模型中, 还原性、重现性、时间和成本效益是非常可取的。
以前对胆管病变的大多数研究都使用了正常的小鼠或大鼠癌症模型, 或来自乙二苯并 4、5、6、7的人胆管癌细胞系.然而, 这些都是转化细胞的模型, 并不重述正常的胆管细胞生物学在稳态或处于健康状态。最近在发展的有机型培养模型的进展, 使三维结构的发展, 从不同的组织类型, 包括肝胆组织, 虽然不是正常的小鼠 ehbd8,9, 10个。这些 "器官样" 结构旨在模仿原代组织, 生长在一个人工生态位, 支持器官特异性干细胞的自我更新, 11。
"有机体" 是一个宽泛的术语, 通常描述从干细胞中获得的三维组织模型。有机体可以从胚胎干细胞和诱导多能干细胞所代表的重新编程的多能干细胞中产生。它们也可以从器官特异性的成人干细胞12中产生。在以往的研究中, 已经提出了一些胆管细胞有机体模型。因此, 从人类多能干细胞中提取的有机生物已被报道为7、9、13, 并提供了一个宝贵的、时间高效的工具, 可以同时生成不同的细胞类型。然而, 这些多能干细胞衍生的有机体并不能完全反映原发性成人 EHBD 胆管细胞的结构和功能。
还提出了从人9和猫10肝的成虫干细胞中提取的有机体。猫科车型并不普遍, 用于研究目的的工具设备有限。此外, 这些肝源性成人干细胞衍生的有机体不模拟肝外胆管细胞, 而是肝内胆管细胞。
人类正常 Ehbd14和小鼠 ehbd 胆管癌15报告了 EHBD 有机体的产生。然而, 获得人类 EHBD 组织的机会极为有限, 从胆管癌的遗传小鼠模型15中获得的有机物质并不代表体内的健康胆管细胞生物学, 而是来自基因修饰细胞。
为了解决多能干细胞和肝脏衍生的胆管细胞组织模型的局限性以及临床前模型所需的对人体组织的访问有限的问题, 我们开发了一个小鼠 EHBD 有机体模型 (图 1a)。这份手稿描述了一种从成人组织中提取的小鼠 ehbd 衍生的有机体技术的发展。这些名为 Ehbdo 的 EHBD 有机体将是研究 Ehbd 胆管局稳态和疾病过程 (如胆管病变) 机制的重要体外工具。
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Protocol
这里描述的所有方法都已得到密歇根大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。
1. 小鼠 EHBD 分离设备和材料的制备
- 在50毫升锥形管中准备播种介质和洗涤缓冲液 (材料表), 并将其保持在4°c 或冰上, 直至使用。
- 设置手术表 (图 1 b)。准备消毒的手术器械 (图 1c)。
- 在37°c 组织培养孵化器中放置一个无菌的24孔板, 使其预热。
- 在冰上放置一个基底矩阵。只有在完全液化时, 才使用基底矩阵。
2. EHBD 分离与胆道有机体培养
-
小鼠 EHBD 单细胞悬浮液的分离与制备
- 根据机构指南对成年老鼠 (2个月以上) 进行安乐死。将鼠标置于仰角位置。使用中线入路打开腹腔, 并收回肝脏, 使其在横隔膜上休息。
- 通过用止血剂轻轻拉近端十二指肠的胆总管, 确定位于肝门下方的胆总管。使用手术刀刀片将 EHBD 与周围组织分离。用钳子固定胆总管的近端, 将其与十二指肠的连接在其远端解剖, 然后从肝脏解剖导管的近端 (图 1d)。立即将隔离的 EHBD (图 1e) 放入冷洗涤缓冲液中。
- 使用无菌手术刀刀片将 EHBD 从洗涤缓冲液中取出, 切成 0.5 mm 的部分。在手术过程中, 将组织放在玻璃板上 (图 1b)。
- 将 EHBD 切片放入含有500Μl 的离解缓冲液的管中。在37°c 下孵化20分钟。加入500Μl 的冰凉细胞培养基, 中和离解缓冲液。
- 在 18 G 和 20 G 针的上下中, 追踪细胞悬浮液的进展, 每次20次。通过70μm 的细胞过滤器过滤细胞悬浮液, 并将流动通过在50毫升管中收集。
请注意:在过滤前, 用500μl 的无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 对过滤器进行预置, 以方便细胞悬浮液的通过。
-
建立 EHBD 有机体
- 在4°C 下, 以 300 x g的速度将步进2.1.5 离心5分钟。
- 小心地取出上清液。将细胞在1毫升的冰凉无菌 PBS 中重新移植。将重新悬浮液转移到新的 1.5 mL 管中。重复步骤2.2.1。
- 离心后, 小心地从管底收集的洗涤细胞中取出上清液。利用 P200 吸头上下移液, 将细胞颗粒重新注入120Μl 的液化冷基底基质中。
请注意:基底基质中的细胞颗粒再悬浮必须在冰浴中进行。 - 板40Μl 的细胞重新悬浮在基底基质中进入一个井的中心在预热的24孔板。
请注意:在操纵基底基质时, 避免吸气, 以防止气泡形成。 - 将细胞重新悬浮在基底基质中的板返回37°c 组织培养孵化器15分钟或直到基底基质凝固。在每口井上加入600μl 的加热至37°c 的播种介质 (材料表)。将钢板返回37°c 组织培养孵化器。
- 在3天内, 并在3天后, 每3天将播种培养基更换为600μl 的新鲜有机体培养基。用倒置显微镜监测有机体的生长。在观察到内部碎片和有机体塌陷之前, 每7至9天使用有机体进行下游应用或分裂一次 (图 2 a)。
3. EHBD 有机通道和储存
-
EHBD 有机生物的通过时间为1:3 至 1: 4, 每7至9天
- 从井中取出培养基, 加入400Μl 的冰凉 PBS。通过将混合物在井中上下轻轻移移 10次, 重新输送有机生物。将混合物转移到 1.5 mL 管中。
- 通过 25 G 针通过混合物4次分离的有机生物。在4°C 条件下, 以 400 x g离心混合物4分钟。
- 小心地取出上清液, 将细胞重新悬浮在基底基质 (1: 3 至 1: 4) 中, 以便进一步培养 (步骤 2.2.4.), 或用冰凉 PBS 清洗细胞进行进一步处理。
请注意:通常情况下, 250-300 个电池被镀制成24孔板, 用于下游应用。通过计算有机生物的数量并计算其初始细胞数量的百分比, 可以在传代后第3-5 天用倒置显微镜用明亮的现场显微镜来评估镀层的效率。利用使用鸟嘌呤硫氰酸酯-苯酚-氯仿萃取的标准协议, 可以从在 PBS 中清洗的 Ehbdo 中分离出 mRNA。
-
长期储存 EHBD 有机生物
- 从井中取出培养基, 用室温 PBS 清洗有机体。在不干扰基底基质落差的情况下, 从井中取出 PBS。
- 在井中加入500Μl 的冰凉细胞冷冻培养基。轻轻地将有机物质重新悬浮在液化基底基质和细胞冷冻培养基中, 并将混合物转移到低温小瓶中。
- 将小瓶存放在-80°c, 保存 48小时. 将小瓶转移到氮气罐中, 在气相中长期储存。
4. 石蜡嵌入的 EHBD 有机处理
- 通过向上和向下移液5至 10次, 在500Μl 的冰凉 PBS (4°c) 中重新使用 Ehbdo。在 1.5 mL 管中的液化基底基质中收集重新悬浮的 EHBDO。
请注意:为了避免破坏有机生物, 切断 P1000 尖端的底部2-3 毫米, 并非常小心地去除上清液。 - 在 350 x g 的条件下离心 EHBD 有机体 5分钟, 小心地去除上清液, 而不会干扰有机体颗粒.
- 在有机化合物中加入1毫升冰凉的4% 甲醛 (PFA), 并在4°C 隔夜孵育 4% PFA 中的有机生物。隔夜孵育后, 使用 P1000 尖端从有机体中取出4% 的 PFA。
- 将1000Μl 的室温 PBS 加入与有机物质一起的试管中, 在室温 (RT) 下孵育5分钟。在 PBS 中以 350 x g 的速度用有机体离心管 5分钟, 重复这个过程两次。
- 取出 PBS, 在有机化合物中加入1% 的30% 乙醇。在 RT 孵化5分钟。
- 在 rt 以 350 x g离心管 5分钟, 去除30% 的乙醇。加入1毫升的70% 乙醇, 在 RT 孵育5分钟。
- 以 350 x g离心 5分钟, 去除70% 的乙醇。加入1毫升的100% 乙醇, 在 RT 孵育5分钟。
请注意:在进一步加工之前, 有机物质可以在室温下100% 乙醇保存48小时。 - 在微波炉中加热样品处理凝胶20秒或直到液化。在有有机化合物的试管中加入50Μl 的样品加工凝胶。将管子放在冰上, 直到试样加工凝胶凝固。
- 取下用有机体从试管中取出样品加工凝胶的落差, 并将其放置在蓝色海绵垫之间的盒式磁带中, 以便在组织处理器中进行进一步处理。在进一步处理过程中, 对石蜡嵌入器中的每一步使用15分钟。
- 切片石蜡嵌入有机生物在样品加工凝胶在 4μm. 进行免疫组织化学染色, 如前面所述16。
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Representative Results
我们的协议描述了小鼠 EHBD 有机体的产生, 这些有机体是组织特异性和成体干细胞衍生的。在培养有机体后, 早在 EHBD 分离后1天就可以观察到囊性结构的形成。在培养过程中, 通常不会观察到成纤维细胞的污染。从新生儿或成人 (2个月以上) 小鼠中分离, EHBDO 的电镀效率约为 2% (图 2B)。从成年小鼠身上提取的 EHBD 有机体的电镀效率在第2段增加到 11%, 并保持稳定 (图 2B)。大多数有机体在所有通道中表现出囊性形态, 罕见的 "不规则" 有机体 (图22-e)。有机生物在5-7 时达到生长高峰, 之后开始积累腔内碎片并变质 (图 2 a)。因此, 为了维持有机体培养, 应每7-10 将其分割一次 (图 2 a)。一旦建立并得到适当处理, 有机体几乎可以无限期地在文化中维持 (文化被观察到长达 14个月)。为了避免培养污染与分化细胞结转从最初的细胞隔离, 使用有机生物通过至少两次之前使用它们的下游应用。对于长期储存, 使用较早的通道 (直到通道 7) 有机体, 因为它们有更高的电镀效率后从储存中回收。
用免疫荧光分析时, Ehbdo 由以 E-cadherin 为特征的纯上皮细胞组成 (图 3a-c)。有机细胞显示胆道祖细胞的标记 (胰腺和十二指肠同源 1 (PDX1);图 3 a)以及胆道分化的标记 (细胞角蛋白 19 (CK19) 和性别决定区域 y 盒 9 (SOX9);图 3b, c)。重要的是, 很高比例的有机细胞拥有以乙酰化α-管蛋白 (a-AT 为特征的原代纤毛;图 3d), 这是正常胆管细胞的特征, 并建议适当的有机细胞极化。祖细胞 (pdx1) 和胆道分化细胞的标志物的表达 [ck19、 sox9、aquaporin 1 (aqp1)、囊性纤维化跨膜电导调节剂(cftr)] 也可以得到证实通过实时定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) (表 1)。这些标记的组合是 ehbd14,17, 18中胆管细胞的特征。
总之, 该协议描述了一个有机培养模型的偏振胆道上皮细胞表达祖细胞和分化标记。该系统可在培养过程中长期维持, 无形态学改变, 长期储存, 并应用免疫组织化学和 qRT-PCR 进行分析。
图 1: EHBD 有机体培养的产生和手术建立示意图.(A). EHBD 有机体生成示意图。(B). 为 EHBD 隔离设立了手术区, 并在任何时候都将玻璃板 (虚线) 保存在冰盘上。(C). 无菌手术设备包括锋利的剪刀、直的和弯曲的锯齿式推子、止血器和手术刀。(D和e) ehbd 从周围的结缔组织和胰腺组织中分离, 然后从肝内胆管和肝脏 (d, 箭头) 的近端仔细解剖, 并从十二指肠 (d, 箭头) 的远端仔细解剖。标尺标记 = 1 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: Ehbdo 培养.(A). 在为期12天的课程中, Ehbdo 的显微图像。(B). 在24井板中每井镀300细胞并列举已建立的有机生物后, 从新生儿 (每培养2只小鼠, n = 3 种培养物) 和成年 (gt;2 月大, 每培养1个小鼠, n = 3个培养物) 中提取的有机体的电镀效率在文化的第5天。(C和d) 用显微镜分析了 ehbdo 与不规则形态。(E). 分析了囊性和不规则形状的有机体在早期 (lt;10) 和晚期 (≥10) 有机体通道中的百分比。标度柱 = 500μm. 定量数据显示为均值 (SEM) 的均值 +/标准误差, t-测试。NS = 不显著。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:Ehbdo 表达了祖细胞和成熟胆道细胞的标记.(A-C)。用免疫荧光染色对标记上皮 (a, b. e-钙粘蛋白, 红色)、祖细胞 (a.) 进行了 ehbdo 分析。PDX1, 绿色), 和区分 (b。CK19, 绿色;和c。-----------------------------刻度柱 = 25μm. *, 流明。(D). 用 qRT-PCR (平均 +/-sem 相对于hprt的表达) 分析了ehbdo 对 pdx1、 ck19、 sox9、aqp1和cftr mrna 的丰度。请点击这里查看此图的较大版本.
| 基因 | 加入编号 | 底漆序列 | 产品尺寸 | ||
| Hprt | NM_013556 | 前进 5 '-AACTTGCCCTCTTATGTTG-3 ' | 173 bp | ||
| 反向 5 '-AGGACCCTCAGTTGGGGA-3 ' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | 前进 5 '-GAATTCTCCCCTCTCCA-3 ' | 133 bp | ||
| 反向 5 '-GATGAATACCCACCCACCACCA-3 ' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | 前进 5 '-TCCACGAGGCTCTCTC-3 ' | 107 bp | ||
| 反向 5 '-AGGAGCTGGACACACAGTA-3 ' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | 前进 5 '-TCATGATCACCCA-3 ' | 133 bp | ||
| 反向 5 '-ACCCCCCCAGATACACC-3 ' | |||||
| Aagp1 | NM_007472 | 前进 5 '-CAGCACCCCCGGGGGC-3 ' | 112 bp | ||
| 反向 5 '-CATCCCCTCCTCATGG-3 ' | |||||
表 1: 引物。
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Discussion
这项工作描述了小鼠 EHBD 胆管细胞的组织型三维模型的产生。EHBDO 培养过程中的重要步骤包括: 细致的 EHBD 解剖, 以避免胰腺细胞污染, 维护无菌条件, 以防止细菌和真菌污染, 以及离心后的精心操作, 以避免细胞材料的丢失。需要密切坚持所描述的温度条件。该技术存在一些限制。成年小鼠的乙二苯醚较小 (直径约1毫米;图 1e), 需要很巧妙的隔离。解剖显微镜可以用来协助解剖。
本协议中使用的基底矩阵是一种生物基质, 包含已知和未知的生长因子19, 其浓度因批次而异。对于技术复制, 我们建议使用相同的批次和基底矩阵的等位, 以避免可变性。我们还建议定期检查 L-WRN 细胞培养是否有支原体污染, 并为 WNT 活动11 的条件培养基进行检查。本研究的实验室分别使用支原体检测试剂盒和 WNT 活性测定。值得注意的是, Ehbdo 培养基中含有少量的胎儿牛血清 (0.5%;材料表)。
该方案描述了一种三维上皮细胞培养, 其中含有具有原代细胞和胆管细胞分化细胞标记特征, 并在 WNT3a、R-bostin1 和 Noggin 生长因子存在的情况下形成, 并定义了补充剂 (材料表)。它是特定于器官的, 因为它来自成年小鼠 Ehbd。它很可能来自于成体细胞, 干细胞的特性体现在细胞的三维结构和长期维持和扩大的能力上。有机体主要是囊性结构, 最小的 "萌发", 这可能表明更多的干细胞样的有机体表型。有可能是额外的干细胞生态位因素可以导致更高的有机体电镀效率, 以及更高的分化程度。
我们的技术产生了一种三维有机体培养, 可以以具有时间和成本效益的方式生成, 最大限度地减少动物的使用, 具有高度的重现性, 并允许多种下游应用。这一新工具对 EHBD 研究很重要, 因为研究成人 Ehbd 的工具非常有限。这将对无法接触人体组织或希望利用转基因小鼠模型的实验室产生特殊好处。
与人体组织不同的是, 小鼠组织是高度容易接近的。有多种试剂, 包括免疫组织化学抗体来研究小鼠组织。自最初采用这种技术以来, 培养成人组织有机体的试剂成本显著降低。此外, 还提供了新的材料, 包括本协议中使用的 L-WRN 细胞调节培养基, 这进一步降低了有机体培养成本。Ehbdo 易于传播、存储和处理以进行分析。本文以免疫组织化学、微观和 qRT-PCR 分析为例。此外, 我们的小组最近描述了基因工程小鼠 Ehbdo 的产生和使用情况, 以及使用 5-乙基-2 β-脱氧尿嘧啶 (EdU)16定量 EHBDO 细胞增殖的方法。
Ehbdo 的潜在下游应用包括但不限于培养几乎无限数量的胆管细胞, 以研究 EHBD 胆管细胞稳态的机制。今后, 该方案可应用于疾病状态的研究;检测胆管细胞有机体, 包括再生医学 (胆道内植入) 分析、遗传和药理操作、药物检测16;并研究 12,20的传染因子的影响.利用 EHBD 有机体与其他21型细胞的联合培养, 可以研究细胞细胞相互作用。
在人类 Ehbdo 产生之前, 药物衍生的有机体可用于试点研究, 因为人类物质是有价值的, 也是有限的。今后的研究重点是发现促进更高电镀效率和有机细胞分化的因素, 以研究人类有机体。正在进行的研究, 寻找一个更生物中性的细胞外基质的有机体培养也是相关的 Ehbdo 培养细化。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国肝病研究协会 (致 n. r.) 和国家卫生研究院、国家糖尿病和消化系统和肾脏疾病研究所 (p30 DK34933 颁发给 n. r.、P01 DK062041 至 j. l. m.) 的支持。我们感谢 Ramon Oacadiz-ruiz 博士 (密歇根大学) 协助制定这一方法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
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