Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מערכת תלת-ממדי תא צורב של צינור המרה extrahepatic העכבר. אלה organoids בכיס המרה יכול להישמר בתרבות ללמוד ביולוגיה cholangiocyte. Organoids בכיס המרה אקספרס סמנים של קדמון והן תאים בכיס המרה, המורכבת של תאי אפיתל מקוטב.
Abstract
Cholangiopathies, אשר משפיעים על צינורות המרה extrahepatic (EHBDs), כוללים בהכנת בכיס המרה, מחלת כבד כרונית חסימתית ו- cholangiocarcinoma. להם אין אפשרויות טיפולית יעילה. כלים ללמוד EHBD מוגבלים מאוד. המטרה שלנו הייתה לפתח מודל ייחודיים, תכליתי למבוגרים, תאי גזע, נגזר, פרה cholangiocyte זה ניתן להפיק בקלות של פראי סוג ועכברים מהונדסים גנטית. לפיכך, אנו מדווחים על הטכניקה הרומן של פיתוח מערכת תרבות תא צורב (EHBDO) EHBD מ- EHBDs העכבר למבוגרים. המודל הוא חסכוניים, מסוגל בקלות להיות מנותח, ויש לו מספר יישומים במורד הזרם. באופן ספציפי, אנו מתארים את המתודולוגיה של העכבר EHBD בידוד, דיסוציאציה תא בודד, חניכה תרבות תא צורב, הפצת, ואת תחזוקה לטווח הארוך ואחסון. כתב יד זה מתאר גם EHBDO עיבוד אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של mRNA שפע כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית-PCR). פרוטוקול זה יש יתרונות משמעותיים בנוסף לייצור organoids EHBD ספציפיים. השימוש במדיום ממוזגים מתאי L-WRN מפחית באופן משמעותי את העלות של מודל זה. השימוש העכבר EHBDs מספק רקמות כמעט בלתי מוגבל לדור תרבות, בניגוד רקמה אנושית. העכבר שנוצר EHBDOs להכיל אוכלוסיה טהור של תאים אפיתל עם סמנים של קדמון endodermal והוא הבדיל תאים בכיס המרה. Organoids בתרבית לשמור על מורפולוגיה הומוגנית דרך מעברים מרובים, ניתן לשחזר לאחר אחסון לטווח ארוך של חנקן נוזלי. המודל מאפשר לחקר התפשטות תאים קדמון בכיס המרה, ניתן לטפל בנושא פרמקולוגית, וכן עלול להיווצר מתוך עכברים מהונדסים גנטית. מחקרים עתידיים נחוצים כדי למטב את תרבות תנאים על מנת להגביר את היעילות יופיצ, להעריך תא פונקציונלי בגרות ולאחר ישירה תאית התמיינות. פיתוח מודלים של תרבות משותפת, מטריצה חוץ-תאית נייטרלי יותר ביולוגית הם גם רצוי.
Introduction
Cholangiopathies הן הפרעות פרוגרסיבית כרונית חשוכת מרפא המשפיעים על תאים בכיס המרה ממוקם אינטרה - ו צינוריות המרה extrahepatic (EHBDs)1. Cholangiopathies מסוימים, כמו מחלת כבד כרונית חסימתית, cholangiocarcinoma, בהכנת בכיס המרה, ציסטות choledochal, משפיעים בעיקר על EHBDs. ההתפתחות של טיפולים cholangiopathies הוא מוגבל על ידי המוגבל של מודלים פרה. בנוסף, מחקרים קודמים התמקדו cholangiopathies המקובצים יחד: הכבד, אינטרה- ו EHBDs. עם זאת, אינטרה - EHBDs של מקור עובריים שונים והם יהיו, לכן, צריך להיחשב פתולוגיות מולקולרית ברורים. צינורות המרה intrahepatic להתפתח הלוחות ductal intrahepatic והחלק הגולגולת של הסעיף הכבד, EHBDs כל לפתח מן החלק סימטרית של הסעיף הכבד2. הם גם להסתמך על תאים תאים קדמון שונים הומאוסטזיס למבוגרים, כולל תעלות של הרינג צינורות המרה intrahepatic ובלוטות peribiliary2,EHBDs3. השימוש במודלים ללימודי פרה מוגבל על ידי הוצאות, צריך להיות ממוזער מסיבות מוסריות. לכן, רדיוקציוניסטי, לשחזור, זמן ומודלים במבחנה חסכוניים הן רצוי מאוד.
רוב המחקרים מוקדמת של cholangiopathies מנוצל העכבר הרגיל או עכברוש סרטן מודלים, או שורות תאים אנושיים cholangiocarcinoma נגזר אינטרה - ו6,5,4,EHBDs7. אולם, אלו הם דגמי תאים טרנספורמציה, לא מסכם את הדברים cholangiocyte נורמלי ביולוגיה או הומאוסטזה במצב בריא. התקדמות האחרונות בפיתוח מודלים של תרבות organotypic אפשרה הפיתוח של מבנים תלת-ממדי של סוגי רקמות שונות, כולל רקמות כיס המרה, למרות העכבר הרגיל לא EHBDs8,9, 10. מבנים אלה "איברים כמו" מכוון מחקה רקמות העיקרי, גדלים בנישה מלאכותי תמיכה התחדשות עצמית של תאי גזע ייחודיים/קדמון11.
"תא צורב" היא רחבה בטווח זה רוב מתאר בדרך כלל מודלים תלת-ממדי רקמות שמקורם בתאי גזע. ניתן להפיק Organoids של pluripotent מחדש תאי גזע המיוצג על-ידי תאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent. הם גם ניתן להפיק תאי גזע בוגרים ייחודיים12. דגמים תא צורב cholangiocyte הוצעו במחקרים קודמים של המחקר. לפיכך, organoids שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושית כבר דווח על7,9,13 ולספק כלי רב ערך, זמן יעיל המאפשר לדור בו זמנית של סוגי תאים שונים. עם זאת, אלה organoids נגזר תאי גזע pluripotent אינן משקפות באופן מלא את המבנה ואת הפונקציונליות של ראשי cholangiocytes EHBD למבוגרים.
Organoids שמקורם בתאי גזע בוגרים של האדם9 , חתולים10 הכבד הוצעו גם. מודלים של חתולים אינם זמינים באופן נרחב, יש מוגבל כלי armamentarium למטרות מחקר. יתר על כן, אלה הכבד-derived מבוגרים נגזר תאי גזע organoids לא מודל extrahepatic cholangiocytes אבל cholangiocytes intrahepatic למדי.
EHBD תא צורב דור דווח בין אדם נורמלי EHBDs14 ו העכבר EHBD cholangiocarcinoma15. עם זאת, גישה EHBD-רקמה אנושית מוגבלת מאד ולאחר organoids נגזר מודל מאתר גנטי של cholangiocarcinoma15 אינם מייצגים הביולוגיה cholangiocyte בריא הומאוסטזיס נגזרים מתאי מהונדס גנטית.
כדי לטפל המגבלות של pluripotent תאי הגזע ואת הכבד-נגזר cholangiocyte תא צורב מודלים וגישה מוגבלת ברקמות אנושיות צורך במודלים פרה, פיתחנו מודל תא צורב EHBD מאתר (איור 1 א'). כתב יד זה מתאר את ההתפתחות של טכניקה עבור העכבר נגזר EHBD organoids מרקמות למבוגרים. אלה organoids EHBD בשם EHBDOs יהיה כלי במבחנה חשוב בחקר המנגנונים שבבסיס EHBDs cholangiocyte הומאוסטזיס ומחלות תהליכים, כגון cholangiopathies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
1. הכנת ציוד וחומרים לבידוד EHBD העכבר
- להכין בינונית זריעה, מאגר כביסה (טבלה של חומרים) ב- 50 מ ל צינורות חרוט ולשמור אותם ב 4 ° C או על קרח עד השימוש.
- בצע כיוונון טבלה כירורגי (איור 1B). להכין כלי כירורגי סטיריליים (איור 1C).
- מניחים צלחת 24-ובכן סטרילי בחממה תרביות רקמה 37 ° C כדי לחמם אותה.
- במקום של aliquot של מטריקס במרתף על קרח. השתמש במרתף מטריקס רק כאשר זה הוא נוזלי לגמרי.
2. EHBD בידוד ותרבות תא צורב בכיס המרה
-
בידוד והכנה של השעיה תא בודד של העכבר EHBD
- המתת חסד של העכבר למבוגרים (שגילן עולה על 2 חודשים) על פי הנחיות מוסדיים. הנח את העכבר במצב פרקדן. פתח הבטני תוך שימוש בגישה קו האמצע, תמשוך את הכבד על הסרעפת.
- לזהות את צינור המרה ממוקם ממש מתחת hilum בכבד על ידי משיכה עדינה התריסריון צינתור עם עוצר דימום. להפריד בין EHBD לבין הרקמות הסובבות באמצעות סכין ומהדקים. מחזיק בסוף צינור המרה צינתור עם מלקחיים, לנתח את זה יש מעל החיבור שלה עם התריסריון ולאחר מכן לנתח הסוף הפרוקסימלית של התעלה מהכבד (איור 1D). מיד מקום מבודד EHBD (איור 1E) אל תוך קר שטיפה מאגר.
- הסר את EHBD מתוך המאגר כביסה, מינצ למקטעים 0.5 מ מ בעזרת סכין האזמל סטרילי. מניחים את הרקמה על צלחת זכוכית על קרח במהלך ההליך (איור 1B).
- במקום הסעיפים EHBD לתוך צינור המכיל 500 µL של המאגר דיסוציאציה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C. לנטרל את המאגר דיסוציאציה על-ידי הוספת 500 µL תא קר כקרח תרבות בינוני.
- Triturate התליה תא למעלה ולמטה מתקדם באמצעות מחטים 18 G ו 20 גרם, 20 פעמים כל אחד. לסנן את המתלים תא דרך מסננת תא מיקרומטר 70 ולאסוף את הזרימה דרך צינור 50 מ.
הערה: תנאי קדם את מסננת עם µL 500 תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS) לפני הסינון כדי להקל את המעבר של התליה תא.
-
הקמת EHBD organoids
- צנטריפוגה הזרימה דרך מהשלב 2.1.5 ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C.
- הסר בזהירות את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 1 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח. להעביר את resuspension לתוך צינור 1.5 mL החדש. חזור על שלב 2.2.1.
- לאחר צנטריפוגה, הסר בזהירות את תגובת שיקוע מתאי שטף שנאספו בתחתית צינור. Resuspend בגדר תא ב- 120 µL של מטריקס המרתף כקרח נוזלי על-ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות P200 טיפים.
הערה: תא resuspension צנפה במטריצת המרתף חייב להתבצע על אמבטיית קרח. - צלחת µL 40 של resuspension תא במטריצה המרתף למרכז באר צלחת 24-ובכן ומחוממת מראש.
הערה: הימנע suctioning אוויר זמן מניפולציה מטריקס המרתף כדי למנוע היווצרות בועה. - להחזיר את הצלחת עם תאים resuspended במטריצת המרתף כדי החממה תרביות רקמה 37 º C למשך 15 דקות, או עד פני השטח למוצק המרתף מטריקס. הוסף 600 µL של המדיום זריעה חימם עד 37 ° C עד מכל קידוח (טבלה של חומרים). להחזיר את הצלחת החממה תרביות רקמה 37 º C.
- החלף את המדיום זריעה 600 µL של המדיום תרבות תא צורב טריים 3 ימים, כל 3 ימים לאחר מכן. צג צמיחה תא צורב עם מיקרוסקופ הפוכה. שימוש organoids עבור יישום במורד הזרם או פיצול כל 7 עד 9 ימים לפני הצטברות של צמצום פסולת, תא צורב intraluminal שנצפו (איור 2 א).
3. EHBD תא צורב מעבר ואחסון
-
מעבר של EHBD organoids 1:3 ל- 1:4 כל 7-9 ימים
- להסיר את המדיום מן הבאר ולהוסיף µL 400 ל- PBS קר כקרח. Resuspend את organoids על ידי בעדינות pipetting את התערובת למעלה ולמטה פי 10 בתוך הבאר. להעביר את התערובת צינור 1.5 מ.
- המעבר התערובת דרך מחט 25 גרם 4 פעמים לנתק את organoids. Centrifuge את התערובת ב x 400 g למשך 4 דקות ב 4 º C.
- הסר בזהירות את תגובת שיקוע resuspend התאים במטריצת המרתף (1:3 ל- 1:4) עבור נוסף culturing (שלב 2.2.4.) או לשטוף את התאים עם PBS קר קרח עיבוד נוסף.
הערה: בדרך כלל, 250-300 תאים הם מצופה על המשקולת 24-ובכן ליישומים במורד הזרם. ציפוי יעילות יכול להיות מוערך על ידי מיקרוסקופיית שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ הפוכה על יום 3-5 לאחר passaging על ידי ספירת מספר organoids וחישוב שלהם אחוזים ממספר תאים הראשונית. mRNA יכול להיות מבודד EHBDOs שטף ב- PBS באמצעות פרוטוקול סטנדרטי באמצעות guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם החילוץ.
-
אחסון לטווח ארוך של EHBD organoids
- להסיר את המדיום מן הבאר ולשטוף את organoids עם טמפרטורת החדר PBS. הסר PBS מן הבאר מבלי להפריע הירידה מטריקס במרתף.
- להוסיף 500 µL של תא קר כקרח קפוא בינוני אל הבאר. בעדינות resuspend את organoids מטריקס המרתף נוזלי, תא הקפאה בינוני ולהעביר את התערובת לתוך מבחנות הקפאה.
- אחסן הבקבוקונים ב-80 מעלות צלזיוס במשך 48 ה העברת את הבקבוקונים למיכל חנקן לאחסון לטווח ארוך שלב אדי.
4. EHBD Pprocessing תא צורב להטבעת פרפין
- Resuspend את EHBDOs ב µL 500 ל- PBS קר כקרח (4 ° C) על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 כדי 10 פעמים. איסוף EHBDO resuspended במטריצת המרתף נוזלי בשפופרת 1.5 mL.
הערה: כדי למנוע את שבירת organoids, לחתוך את החלק התחתון 2-3 מ מ טיפ P1000 ולהסיר את תגובת שיקוע בזהירות רבה. - צנטריפוגה organoids EHBD ב x 350 גרם במשך 5 דק הסר בזהירות את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא צורב.
- להוסיף 1 מ"ל של 4% קר כקרח paraformaldehyde (PFA) organoids, דגירה של organoids % 4 מחברים בין לילה ב 4 º C. להסיר 4% כדורגלן מ organoids באמצעות טיפ P1000 לאחר דגירה בין לילה.
- להוסיף 1000 µL של טמפרטורת החדר PBS ברכבת התחתית עם organoids, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). Centrifuge ברכבת התחתית עם organoids ב- PBS ב 350 x גרם במשך 5 דק. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות.
- הסר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של 30% כוהל organoids. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
- Centrifuge את הצינור ב x 350 גרם במשך 5 דקות-הסר RT. 30% אתנול. להוסיף 1 מ"ל אתנול 70% ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
- Centrifugate ב 350 x גרם במשך 5 דק הסר 70% אתנול. להוסיף 1 מ"ל אתנול 100%, נדרשת תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
הערה: Organoids ניתן לשמור ב- 100% אתנול בטמפרטורת החדר במשך עד 48 שעות לפני עיבוד נוסף. - מחממים ג'ל עיבוד הדגימה במיקרוגל 20 s או עד מעובה. הוסף µL 50 של הדגימה עיבוד ג'ל לתוך הצינור עם organoids. מניחים את הצינור על הקרח עד פני השטח למוצק הדגימה עיבוד ג'ל.
- הסר את טיפת הדגימה עיבוד ג'ל עם organoids ברכבת התחתית והציבו בין הידיות ספוג כחול ב קלטת לשם עיבוד נוסף במעבד רקמות. לשימוש 15 דקות בכל שלב ושלב embedder פרפין במהלך עיבוד נוסף.
- סעיף פרפין-מוטבע organoids הדגימה עיבוד ג'ל ב 4 מיקרומטר. להמשיך עם immunohistochemical מכתים כפי שתואר לעיל16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול שלנו מתאר את הדור של העכבר EHBD organoids רקמות ספציפיות, מבוגר נגזר תאי גזע. לאחר organoids מתורבתים, ניתן לצפות מוקדם ככל 1 יום לאחר הבידוד EHBD צורה מבנה פיברוזיס. זיהום עם fibroblasts לא נצפית בדרך כלל בעת יצירת תרבות. EHBDO יופיצ יעילות הוא כ 2% כאשר מבודד neonatal או למבוגרים (שגילם חודשיים) עכברים (איור 2B). ציפוי היעילות של EHBD organoids נגזר עכברים בוגרים גדל ל- 11% מעבר 2, נשאר יציב (איור 2B). הרוב המכריע של organoids להפגין מורפולוגיה פיברוזיס דרך כל מעברי, עם organoids "חריג" נדיר (איור 2C-E). Organoids להגיע לשיא הצמיחה ב 5-7 ימים לאחר מכן הם מתחילים צבירת פסולת intraluminal, להתדרדר (איור 2 א). לכן, לצורך תחזוקה של תרבות תא צורב, הם צריכים להתחלק כל 7-10 ימים (איור 2 א). הוקמה לאחר, כאשר מטופל כראוי, organoids יכול להישמר בתרבות כמעט ללא הגבלת זמן (תרבויות נצפו למעלה 14 חודשי). כדי למנוע התרבות זיהום עם תאים כמשימות מבידוד תא הראשונית, שימוש organoids passaged לפחות פעמיים לפני להשתמש בהם עבור יישום במורד הזרם. לאחסון לטווח ארוך, להשתמש organoids המעבר (עד פסקה 7) קודמת, שכן הם בעלי יעילות גבוהה יותר של ציפוי לאחר התאוששות אחסון.
בעת ניתוח עם immunofluorescence, EHBDOs מורכבים של אוכלוסיית תאי אפיתל מסומן על ידי E-קדהרין (איור 3 א-ג). תא צורב תאים להדגים סמנים של ובתאים בכיס המרה ונדירה (הלבלב, גנים Homeobox תריסריון 1 (PDX1); איור 3A) כמו גם סמנים של בידול בכיס המרה (cytokeratin 19 (CK19), קביעת מין באזור Y-Box 9 (SOX9); איור 3B, ג). חשוב, אחוז גבוה של תאי תא צורב להחזיק את ריסי הראשי המסומן acetylated α-טובולין (-; דמות תלת-ממד), אשר היא תכונה של cholangiocytes נורמלי, ומציעה קיטוב תא תא צורב המתאים. הביטוי של סמנים של קדמון (Pdx1) תאים בכיס המרה [Ck19, Sox9, Aquaporin 1 (Aqp1), פיברוזיס הרגולטור מוליכות Transmembrane(Cftr)] יכול להיות גם אישרו על ידי אמת שעתוק במהופך כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (לרביעיית-PCR) (טבלה 1). שילוב של סמנים אלה הוא מאפיין של cholangiocytes EHBDs14,17,18.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל תרבות תא צורב של מקוטב בתאי אפיתל בכיס המרה לבטא קדמון, הבדיל סמנים. מערכת זו יכול להישמר בתרבות במשך זמן ממושך ללא שינוי במורפולוגיה, המאוחסנים לטווח ארוך ולאחר שנותחה עם אימונוהיסטוכימיה ועם לרביעיית-PCR.
איור 1 : סכימטי של EHBD תא צורב תרבות הדור, האם הגדרת כירורגי (א)-דור תא צורב סכמטי של EHBD. (B)-האזור הכירורגי היה מוכן EHBD בידוד וכללה צלחת זכוכית (קו מנוקד) שמר על מגש של קרח בכל עת. (ג)-ציוד כירורגי סטרילי כלולים מספריים חדות, ישר, מעוקל מלקחיים משוננות, עוצר דימום, ומהדקים. ( Eו-D ) EHBD הוא מבודד המקיף רקמת חיבור, הלבלב ואחריו ניתוח זהיר הציר הקרוב את צינורות המרה intrahepatic הכבד (יח, חץ), ו יש מן התריסריון (יח, חץ). סימוני הסרגל = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תרבות EHBDO. (א)-תמונות מיקרוסקופיות של EHBDOs על מסלול 12 יום. (B). יופיצ היעילות של organoids נגזר neonatal (עכברים 2 לכל תרבות, n = 3 תרבויות) בוגר (> 2 חודשים הישן, העכבר 1 לכל תרבות, n = 3 תרבויות) עכברים לאחר ציפוי תאים 300 לאדם טוב בצלחת 24-ובכן ומניית נוסדה organoids ביום 5 של תרבות. (C ו- D) EHBDO פיברוזיס לעומת מורפולוגיה לא סדיר נותחה על ידי מיקרוסקופ. (E)-האחוזים של organoids בצורת פיברוזיס ולא סדירות נותחו ב מוקדם (< 10) ומעברים מאוחר (≥ 10) תא צורב. גודל ברים = 500 מיקרומטר. נתונים כמותיים הראה כמו ממוצע + /-שגיאת התקן של הממוצע (SEM), t-מבחן. NS = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : EHBDOs אקספרס סמנים של קדמון התאים בכיס המרה בוגרים. (A-C). EHBDOs נותחו על ידי צביעת עבור סמני אפיתל (A, B. E-קדהרין, אדום), קדמון (Aimmunofluorescence. PDX1, ירוק), ואת מבודלים (B. CK19, ירוק; ו- C. -AT, אדום) תאים בכיס המרה. גודל ברים = מיקרומטר 25. *, לומן. (D). EHBDOs נותחו לשפע של Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1ו- Cftr mRNA מאת לרביעיית-PCR (ממוצע + /-SEM יחסית הביטוי של Hprt). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ג'ין | מספר גישה | פריימר רצף | גודל המוצר | ||
| Hprt | NM_013556 | קדימה 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3' | 173. לחץ דם | ||
| הפוך 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | קדימה 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3' | 133. לחץ דם | ||
| הפוך 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | קדימה 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3' | 107. לחץ דם | ||
| הפוך 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | קדימה 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3' | 133. לחץ דם | ||
| הפוך 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | קדימה 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3' | 112. לחץ דם | ||
| הפוך 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3' | |||||
טבלה 1: צבעי יסוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת את הדור של מודל תלת-ממדי organotypic של העכבר EHBD cholangiocytes. צעדים חשובים בדור תרבות EHBDO כוללים ניתוח קפדני EHBD כדי למנוע זיהום תא לבלב, תחזוקת בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום חיידקים ופטריות, מניפולציה זהיר לאחר צנטריפוגה כדי למנוע אובדן חומר הסלולר. הדבקות קרוב בתנאי טמפרטורה שתואר נדרש. ישנן כמה מגבלות על הטכניקה. EHBDs של עכברים בוגרים הם קטנים (כ- 1 מ מ בקוטר; איור 1E), אשר דורשים עדינות לבידוד. מיקרוסקופ ניתוח יכול לשמש כדי לסייע עם לנתיחה.
מטריקס המרתף בשימוש פרוטוקול זה היא מטריצה ביולוגי המכיל גורמי גדילה ולא מוכרים19, ריכוז אשר יכול להשתנות הרבה הרבה. אנו ממליצים כי עבור משכפל טכני, מאותה ו/או aliquot של מטריקס במרתף של לשמש כדי להימנע השתנות. אנו גם ממליצים באופן שגרתי בדיקת תרבית תאים L-WRN עבור זיהום mycoplasma והמדיום ממוזגים עבור פעילות ונ ט11. המעבדה למחקר זה משמש זיהוי Mycoplasma ואת וזמינותו פעילות ונ ט בהתאמה. ראוי לציין, EHBDOs בינוני מכיל כמות נמוכה של סרום שור עוברית (0.5%; טבלה של חומרים).
פרוטוקול הציג מתאר תרבות תאים אפיתל תלת-ממדי המכיל תאים עם קדמון, הבדיל תא סמנים אופייניים עבור cholangiocytes, בנוי בנוכחות WNT3a R-spondin1, גורמי גדילה של הראש ומוגדר תוספי מזון (טבלה של חומרים). זהו איבר ספציפי, כפי הוא נגזר מן העכבר למבוגרים EHBDs. זה כנראה נגזר תאים בוגרים עם מאפייני תא גזע שמעידים תא ארגון עצמי מבנים תלת-ממדי, היכולת להיות שמרה והרחיבה לטווח ארוך. Organoids הם בעיקר פיברוזיס במבנה עם מינימלית "חברה, אשר עשוי להצביע על הפנוטיפ תא צורב יותר, כמו תאי גזע. זה אפשרי כי גורמים נישה נוספת בתאי גזע יכול להוביל יעילות גבוהה יותר ציפוי של organoids, כמו גם תואר גבוה יותר של בידול.
הטכניקה שלנו מייצרת תרבות תלת-ממדי תא צורב יכול להיווצר באופן זמן - ו וחסכוניים, אשר מצמצם את השימוש בבעלי חיים, הוא מאוד לשחזור, מאפשרת מספר יישומים במורד הזרם. הכלי החדש חשוב ללימודים EHBD, מכיוון כלים ללמוד EHBDs מבוגרים מוגבלים מאוד. זה יהיה של הטבות מיוחדות למעבדות לא תהיה גישה ברקמות אנושיות או רוצה לנצל מודלים מהונדס גנטית עכבר.
רקמת העכבר, בניגוד רקמה אנושית, נגיש מאוד. ישנם ריאגנטים מרובות, כולל אימונוהיסטוכימיה נוגדנים ללמוד העכבר רקמות. העלות של ריאגנטים תרבות למבוגרים רקמת organoids הצטמצמה משמעותית מאז טכניקה זו הוצג בתחילה. בנוסף, חומרים חדשים הופכים לזמינים, כולל המדיום תאים ממוזגים L-WRN בשימוש פרוטוקול זה, אשר בהמשך מפחית את עלות תרבות תא צורב. EHBDOs הם קל להפיץ, לאחסן, תהליך לניתוח. Immunohistochemical, מיקרוסקופיים, וניתוחים לרביעיית-PCR מוצגים דוגמאות כתב יד זה. בנוסף, הקבוצה שלנו תיאר לאחרונה הדור ואת השימוש EHBDOs של עכברים מהונדסים גנטית, כימות של התפשטות תאים EHBDO באמצעות 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו)16.
יישומים אפשריים במורד הזרם של EHBDOs כוללים אך אינם מוגבלים culturing של כמות כמעט בלתי מוגבל של cholangiocytes ללמוד מנגנוני הומאוסטזיס cholangiocyte EHBD. בעתיד, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במחקר של מצבי מחלה; כדי לבדוק את organoids cholangiocyte, כולל ניתוח של רפואה רגנרטיבית (intrabiliary-השרשה), מניפולציה גנטית, תרופתי,16; בדיקות סמים לחקור את ההשפעות של מדבקים12,20. תא-תא אינטראקציה ניתן יהיה ללמוד באמצעות תרבות משותפת של EHBD organoids עם סוגים אחרים תא21.
ניתן להשתמש בעכבר, נגזר organoids ללימודי טיס לפני הדור של האדם EHBDOs, מאז חומר אנושי הוא יקר ומוגבל. מחקרים עתידיים התמקדו גילוי של גורמים המקדמים יעילות ציפוי גבוהה יותר, תא צורב תאית התמיינות הם הרצויה עבור חקר האדם organoids. לימודי מתמשך החיפוש עבור מטריצה חוץ-תאית נייטרלי יותר ביולוגית לתרבות תא צורב גם הם הקשורה EHBDOs תרבות עידון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקאית את פרס מחקר של פסגת מחלות הכבד (ל. נ) מכוני הבריאות הלאומיים, במכון הלאומי של סוכרת ואת העיכול ומחלות כליה (פרסים P30 DK34933 נ, DK062041 P01 כדי J.L.M.). אנו מודים ד ר רמון Ocadiz-רואיז (אוניברסיטת מישיגן) על העזרה שלו עם פיתוח מתודולוגיה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
