Summary
이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.
Abstract
Cholangiopathies, extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)에 영향을 미치는 담 즙이 폐쇄 증, 기본 차 경화 담 관 염, 및 cholangiocarcinoma 포함 됩니다. 그들은 효과적인 치료 옵션이 있다. EHBD를 공부 하는 도구는 매우 제한 됩니다. 우리의 목적은 야생 유형 및 유전자 조작된 생쥐에서 쉽게 생성 될 수 있는 기관 특정, 다목적, 성인 줄기 세포 유래, 전 임상 cholangiocyte 모델을 개발 했다. 따라서, 우리는 성인 마우스 EHBDs에서 EHBD organoid (EHBDO) 문화 시스템 개발의 새로운 기술에 보고 합니다. 모델은 비용 효율적이 고 쉽게 분석할 수 있으며 여러 다운스트림 응용 프로그램. 특히, 마우스 EHBD 절연 및 단일 세포 분리, organoid 문화 개시, 전파, 그리고 장기적인 유지 관리 및 저장의 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 EHBDO를 실시간 양이 많은 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (qRT-PCR) immunohistochemistry, 형광 현미경 검사 법, 그리고 mRNA 풍부 정량에 대 한 처리를 설명 합니다. 이 프로토콜 EHBD 특정 organoids를 생산 하는 것 외에도 중요 한 장점이 있습니다. L WRN 셀에서 조건 화 된 매체의 사용은 크게이 모델의 비용을 줄일 수 있습니다. 마우스 EHBDs 사용 하 여 거의 무제한 조직을 문화 세대, 인간의 조직 달리 합니다. 생성 된 마우스 EHBDOs endodermal 조상의 표식이 있는 상피 세포의 순수한 인구를 포함 하 고 담 즙 세포 분화. 교양된 organoids 여러 통로 통해 동일한 형태를 유지 하 고 액체 질소에는 장기 저장 후 복구할 수 있습니다. 모델 담 즙 조상 세포 증식의 연구에 대 한, 약리학, 조작할 수 있으며 유전자 조작된 생쥐에서 생성 될 수 있습니다. 미래 연구는 도금 효율을 평가 하는 기능 세포 성숙, 직접 세포 분화 배양 조건 최적화 필요 합니다. 개발 공동 문화 모델과 더 생물학적으로 중립 세포 외 매트릭스의 바람직한 있습니다.
Introduction
Cholangiopathies는 내부-및 extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)1에 있는 담 즙 셀에 영향을 주는 불 치 만성 진보적인 장애. 기본 차 경화 담 관 염, cholangiocarcinoma, 담 즙이 폐쇄 증, choledochal cysts 같은 일부 cholangiopathies EHBDs에 주로 영향을 줍니다. Cholangiopathies에 대 한 치료의 개발 전 임상 모델의 제한 된 가용성에 의해 제한 됩니다. 또한, 이전 연구 cholangiopathies 그룹화에 초점: 간, 내부 및 EHBDs. 그러나, 내부-및 EHBDs 다른 배아 기원 있고, 따라서, 명료한 분자 병 리도 고려 되어야 한다. Intrahepatic 담 즙 덕트 intrahepatic ductal 접시와 간장 계실의 두개골 부분에서 개발, 전체 EHBDs 간 계실2의 꼬리 부분에서 개발. 그들은 또한 성인 항상성, intrahepatic 담 즙 덕트 및 EHBDs2,3peribiliary 동맥에서 Hering의 운하를 포함 하 여에 대 한 다른 조상 세포 구획에 의존. 전 임상 연구를 위한 동물 모델의 사용 비용에 의해 제한 하 고 윤리적인 이유로 최소화 한다. 따라서, reductionist, 재현성, 시간 및 비용 효율적인 체 외 모델은 매우 바람직하다.
Cholangiopathies의 대부분의 이전 연구 활용 일반 마우스 또는 쥐 암 모델, 또는 인간의 cholangiocarcinoma 셀 라인 내부-및 EHBDs4,5,,67에서 파생 된. 그러나,이 변형 된 세포의 모델 이며 정상적인 cholangiocyte 생물학 항상성 또는 정상 상태에서를 정리 하지 않습니다. Organotypic 문화 모델의 개발에 최근 진행 다른 조직 종류, 하지만 하지 일반 마우스 EHBDs8,9, 간담 조직를 포함 하 여 3 차원 구조의 개발을 허용 했다 10. 이러한 "기관" 구조로 기본 조직을 흉내 낸 겨냥 하 고 기관 특정 줄기/뿌리 세포11의 자기 갱신을 지 원하는 인공 틈새에서 성장 된다.
"Organoid"는 광범위 한 용어는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 파생 된 3 차원 조직 모델을 설명 합니다. Organoids 재설정된 pluripotent 줄기 세포 배아 줄기 세포로 표현 하 고 유도 만능 줄기 세포에서에서 생성 될 수 있습니다. 그들은 또한 기관 특정 성인 줄기 세포12에서 생성 될 수 있습니다. 일부 cholangiocyte organoid 모델 이전 연구에서 제안 되었습니다. 따라서, 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 보고7,,913 이었고 다른 세포 유형의 동시 세대에 대 한 수 가치, 시간 효율적인 도구를 제공. 그러나, 이러한 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 구조와 기본 성인 EHBD cholangiocytes의 기능 완벽 하 게 반영 하지 않습니다.
인간의9 의 성인 줄기 세포에서 파생 된 Organoids 그리고 고양이10 간도 제안 했다. 고양이 모델 널리 사용 되지 않으며 도구 armamentarium 연구 목적에 대 한 제한. 또한, 이러한 간 파생 성인 줄기 세포 유래 organoids extrahepatic cholangiocytes 하지만 오히려 intrahepatic cholangiocytes 모델 하지 않습니다.
EHBD organoid 세대는 인간의 정상적인 EHBDs14 와 마우스 EHBD cholangiocarcinoma15에서 보고 되었다. 그러나, 인간의 EHBD 조직에 대 한 액세스는 매우 제한 된, 그리고 cholangiocarcinoma15 의 유전자 murine 모델에서 파생 된 organoids 항상성에서 건강 한 cholangiocyte 생물학을 대표 하지 않는다 유전자 변형 세포에서 파생 됩니다.
만능 줄기 세포 및 간 파생 된 cholangiocyte organoid 모델 및 전 임상 모델에서 필요한 인간의 조직에 대 한 제한 된 액세스의 한계를 해결 하기 위해 우리는 murine EHBD organoid 모델 (그림 1A)를 개발 했다. 이 원고 마우스 성인 조직에서 EHBD 파생 된 organoids에 대 한 기술 개발을 설명합니다. EHBDOs 라는이 EHBD organoids EHBDs cholangiocyte 항상성 및 질병 과정, cholangiopathies 같은 기본 메커니즘의 연구에 대 한 중요 한 생체 외에서 도구가 될 것입니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 EHBD 절연 용 장비 및 재료의 준비
- 시드 매체 및 세척 버퍼 (자료 테이블) 50 ml에서 원뿔 관을 준비 하 고 그들에 게 사용까지 4 ° C에서 또는 얼음에 계속.
- 수술 테이블 (그림 1B)를 설정 합니다. 멸 균된 수술 도구 (그림 1C)을 준비 합니다.
- 미리 그것을 따뜻하게 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 살 균 24-잘 접시를 놓습니다.
- 얼음에 지 매트릭스의 약 수를 놓습니다. 지 매트릭스를 사용 하 여 완전히 액 화 하는 경우에.
2. EHBD 절연 및 담 즙 Organoid 문화
-
절연 및 마우스 EHBD의 단일 세포 현 탁 액의 준비
- 기관 지침에 따라 (2 개월 이상)는 성인 마우스 안락사 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 복 부 구멍 중간 접근을 사용 하 여 열고 철회 횡 경 막에 간.
- 부드럽게 당겨 한 hemostat와 근 위 십이지 간 hilum 아래 바로 있는 일반적인 담 관을 식별 합니다. 메스 블레이드를 사용 하 여 주변 조직에서 EHBD를 구분 합니다. 집게와 일반적인 담 관의 근 위 끝을 잡고, 바로 그 시점으로 십이지 장, 위의 distally 부 다음 간 (그림 1D)에서 덕트의 근 위 끝을 해 부. 즉시 버퍼를 세척 하는 감기에 고립 된 EHBD (그림 1E) 장소.
- 세척 버퍼에서는 EHBD를 제거 하 고 살 균 메스 블레이드를 사용 하 여 0.5 m m 섹션으로 말하다. 절차 (그림 1B) 동안 조직 얼음 유리 접시에 놓습니다.
- 분리 버퍼의 500 µ L을 포함 하는 튜브에 EHBD 섹션을 놓습니다. 37 ° c.에 20 분 동안 품 어 얼음 처럼 차가운 세포 배양 매체의 500 µ L을 추가 하 여 분리 버퍼를 중화.
- 20 번 각각 18 G와 G 20 바늘을 통해 진행 위아래로 세포 현 탁 액 triturate 세포 현 탁 액 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링을 50 mL 튜브에서 흐름 통해 수집 합니다.
참고: 미리의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 세포 현 탁 액의 흐름을 촉진 하기 위해 필터링 전에 500 µ L와 스 트레이너 상태.
-
EHBD organoids 설정
- 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g 에 단계 2.1.5에서에서 흐름 통해 원심 분리기
- 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 살 균 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL에 셀 resuspend 새로운 1.5 mL 튜브에는 물의 resuspension 전송. 2.2.1 단계를 반복 합니다.
- 원심, 후 조심 스럽게 씻어 셀 튜브 하단에 수집에서 상쾌한 제거. P200 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 액 화 차가운 지 매트릭스의 120 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
참고: 셀 공 물의 resuspension 지 매트릭스에서 얼음 목욕에서 수행할 수 있다. - 미리 데워 진된 24-잘 접시에 잘의 중심에 지 매트릭스에서 셀 물의 resuspension의 40 µ L 플레이트.
참고: 거품 형성을 방지 지 매트릭스를 조작 하는 동안 공기를 suctioning 하지 마십시오. - 지하실 또는 지하실 매트릭스 경화 될 때까지 15 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터를 매트릭스에 resuspended 세포와 접시를 반환 합니다. 시드 매체의 600 µ L을 각 영역 (자료 테이블) 37 ° C까지 예 열을 추가 합니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
- 시드 중간을 3 일에 그 후에 3 일 마다 신선한 organoid 문화 매체의 600 µ L에 바꿉니다. 거꾸로 현미경으로 모니터 organoid 성장입니다. 다운스트림 응용 프로그램 또는 분할 intraluminal 파편과 organoid 붕괴의 축적 하기 전에 모든 7 ~ 9 일에 대 한 사용 organoids (그림 2A) 관찰 된다.
3. EHBD Organoid 통로 및 저장
-
EHBD organoids 1:3 1:4 7 9 일 마다 통과
- 우물에서 매체를 제거 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS의 400 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 pipetting 혼합물을 위아래로 10 배는 잘에서 여는 organoids resuspend. 1.5 mL 튜브에 혼합물을 전송.
- 통로 4 25g 바늘을 통해 혼합물은 organoids 해리를 시간. 400 x g 4 ° c.에 4 분 대에서 혼합물을 원심
- 조심 스럽게 제거는 상쾌한 지 매트릭스 (1:3 1:4) 추가 (2.2.4 단계.) 경작에서 셀 resuspend 또는 추가 처리를 위해 얼음 차가운 PBS 가진 세포를 씻어.
참고: 일반적으로, 250-300 셀 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 24-잘 접시에 도금 된다. 효율성을 도금 하는 것은 organoids의 수를 세 초기 세포 수에서 그들의 %를 계산 하 여 뿌리고 후 3-5 일째에는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 밝은 분야 현미경 검사 법에 의해 평가할 수 있습니다. mRNA는 EHBDOs guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬 적 출을 사용 하 여 표준 프로토콜을 사용 하 여 PBS로 세척 으로부터 격리 될 수 있습니다.
-
EHBD organoids의 장기 저장
- 우물에서 매체를 제거 하 고 실내 온도 PBS와 organoids 세척. 지하실 매트릭스 드롭 방해 하지 않고 잘에서 PBS를 제거 합니다.
- 매체는 잘 얼어 얼음 처럼 차가운 셀의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 액상된 지 매트릭스와 매체를 동결 하는 셀에 organoids resuspend과 극저온 튜브에 혼합물을 전송.
- 수증기 단계에서 48 h. 전송-80 ° C에서 튜브 장기 저장을 위한 질소 탱크 병을 저장 합니다.
4. EHBD Organoid Pprocessing 파라핀 포함
- 5 ~ 10 배 아래로 pipetting으로 얼음 처럼 차가운 PBS (4 ° C)의 500 µ L에서 EHBDOs를 resuspend. 1.5 mL 튜브에 액 화 지 매트릭스에서 resuspended EHBDO를 수집 합니다.
참고: Organoids 위반을 피하기 위해, 하단의 P1000 팁의 2-3 m m 잘라 고는 상쾌한을 매우 신중 하 게 제거. - 5 분에 대 한 350 x g 에서 원심 분리기 EHBD organoids 조심 스럽게 organoid 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 제거.
- 얼음 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL는 organoids에 추가 하 고 4% PFA 4 ° c.에서 하룻밤에 organoids를 품 어 4% 제거 PFA 하룻밤 부 화 후 P1000 팁을 사용 하 여 organoids에서.
- organoids와 함께 튜브를 실내 온도 PBS의 1000 µ L을 추가 하 고 실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어. 원심 350 x g 5 분 반복에서 PBS에 organoids와 튜브가이 과정 두 번 더.
- PBS를 제거 하 고는 organoids에 30% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 실시간에서 5 분 동안 품 어
- 실시간 제거 30% 에탄올에 5 분 동안 350 x g 에서 튜브 원심 70% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어
- 350 x g 5 분 제거 70% 에탄올에 centrifugate. 100% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어
참고: Organoids 추가 처리 전에 최대 48 h에 대 한 실 온에서 100% 에탄올에 보관할 수 있습니다. - 견본 프로세싱 젤 20 전자 레인지에가 열 s 또는 액 화 될 때까지. 표본 처리 organoids와 튜브로 젤의 50 µ L를 추가 합니다. 젤을 처리 하는 견본 경화 될 때까지 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 표본 튜브에서 organoids 젤 처리 방울을 제거 하 고 조직 프로세서에서 추가 처리를 위해 카세트에 파란색 스폰지 패드 사이 장소. 파라핀 embedder의 각 단계에 대 일 분을 사용 하 여 처리 하는 동안...
- 섹션 파라핀 포함 organoids 견본 처리에서 앞에서 설명한16얼룩 immunohistochemical와 4 µ m. 진행 젤.
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Representative Results
우리의 프로토콜 마우스 EHBD organoids는 조직 관련 성인 줄기 세포 유래의 생성을 설명 합니다. 후에 organoids 교양, 낭 성 구조 형성 빠르면 1 일 EHBD 격리 후 관찰할 수 있습니다. 섬유 아 세포와 오염 문화 생성 하는 동안 일반적으로 관찰 하지. EHBDO 도금 효율은 약 2% (2 개월 이상) 신생아 또는 성인에서 고립 된 쥐 (그림 2B). EHBD organoids의 효율성을 도금 파생 성인 쥐에서 증가에 통로 2와 남아 안정 (그림 2B)에 11%. Organoids의 대다수는 드문 "불규칙 한" organoids (그림 2C-E)와 함께 모든 구절을 통해 낭 성 형태를 보여 줍니다. Organoids 5-7 일 후 그들은 축적 intraluminal 파편을 시작 하 고 (그림 2A) 악화에 성장이 피크에 도달. 따라서, organoid 문화의 유지 보수, 그들은 한다 분할 매 7-10 일 (그림 2A). 일단 설립 하 고 적절 하 게 처리 하는 때, organoids (문화 관찰 했다 최대 14 개월) 문화를 거의 무한정 유지할 수 있습니다. 문화를 피하기 위해 차별화 된 세포 오염 초기 세포 격리, 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들을 사용 하기 전에 적어도 두 번 passaged를 사용 하 여 organoids에서에서 월. 장기 저장을 위한 저장소에서 복구 후 높은 도금 효율 때문 이전 (최대 7 통로) 통로 organoids를 사용 합니다.
면역 형광 분석 때 EHBDOs E-cadherin (그림 3A-C)에 의해 표시 하는 상피 세포의 순수한 인구 구성 됩니다. Organoid 세포 (췌 장 및 십이지 장 Homeobox 1 (PDX1); 담 즙 조상 세포의 표식 설명 그림 3A) 담 즙 차별화의 마커 뿐만 아니라 (cytokeratin 19 (CK19)와 지역 Y 상자 9 섹스 결정 (SOX9); 그림 3B, C)입니다. 중요 한 것은, organoid 셀의 높은 비율을가지고 기본 cilium acetylated α-tubulin (-AT;에 의해 표시 그림 3D), 일반 cholangiocytes의 기능 그리고 적절 한 organoid 셀 분극 제안. 조상 (Pdx1)과 담 즙 차별화 된 셀의 표시의 식 [Ck19, Sox9, Aquaporin 1 (Aqp1), 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터(Cftr)] 또한 확인 될 수 있다 양이 많은 반전 녹음 방송 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) (표 1) 여. 이 표시의 조합 cholangiocytes EHBDs14,,1718에 대 한 특징입니다.
요약 하자면,이 프로토콜 조상 표현 편광된 담 즙 상피 세포의 organoid 문화 모델의 생성을 설명 하 고 마커를 분화. 이 시스템 유지할 수 있습니다 문화에서 형태학, 저장에 있는 변화 없이 장기간 동안 장기, 그리고 immunohistochemistry와 qRT-PCR 분석.
그림 1 : EHBD organoid 문화 발전과 수술 설정된 최대의 도식 (A). EHBD의 도식 organoid 세대. (B). 외과 영역 EHBD 격리 설정 되었고 항상 얼음 트레이 보관 유리 접시 (점선)을 포함. (C). 메 마른 외과 장비 바로 날카로운가 위를 포함 하 고 곡선 톱니 모양의 핀셋, hemostat, 그리고 메스. (D 및 E) EHBD 연결 하 고 췌 장 조직 이어서 조심 해 부 proximally intrahepatic 담 관 그리고 간 (D, 화살표), 그리고 distally 십이지 (D, 화살표)에서 주변에서 격리 됩니다. 눈금자 표시 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : EHBDO 문화. (A). 12 주 과정을 통해 EHBDOs의 현미경 이미지. (B).는 신생아에서 파생 된 organoids의 효율성을 도금 (문화, n 당 2 쥐 3 문화 =)와 성인 (> 2 개월, 문화, n 당 1 마우스 = 3 문화) 24-잘 접시에 잘 당 300 셀 도금 및 열거 organoids 설립 후 마우스 문화의 하루 5. (C 와 D) 불규칙 한 형태 대 낭 성 EHBDO 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다. (E). 낭 성 및 불규칙 한 모양의 organoids % 초기에 분석 (< 10)과 후반 (≥10) organoid 구절. 바 규모 500 µ m. 양적 데이터 평균 (SEM), t의 표준 오차 ± 의미로 보였다 =-테스트. NS = 중요 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : EHBDOs 익스프레스의 뿌리 및 성숙한 담 즙 셀 표식. (A-C)입니다. EHBDOs 면역 형광 마커 상피 (A, B. E-cadherin, 레드), 조상 (A얼룩에 의해 분석 되었다. PDX1, 녹색), (B를 분화 하 고. CK19, 녹색; 그리고 C. -AT, 빨간색) 담 즙 셀. 스케일 바 = 25 µ m. *, 루멘. (D). EHBDOs qRT-PCR ( Hprt표현의 상대적인 SEM + 평균)에 의해 Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1및 Cftr mRNA의 풍부에 대 한 분석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 | 승인 번호 | 뇌관 순서 | 제품 크기 | ||
| Hprt | NM_013556 | 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3 앞으로 ' | 173 혈압 | ||
| 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3 역 ' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3 앞으로 ' | 133 혈압 | ||
| 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3 역 ' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3 앞으로 ' | 107 혈압 | ||
| 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3 역 ' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3 앞으로 ' | 133 혈압 | ||
| 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3 역 ' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3 앞으로 ' | 112 혈압 | ||
| 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3 역 ' | |||||
표 1: 뇌관.
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Discussion
이 작품의 마우스 EHBD cholangiocytes organotypic 3 차원 모델의 생성을 설명합니다. 췌 장 세포 오염, 세균 및 곰 팡이 오염 및 피하기 위해 원심 분리 후 주의 조작 방지 하기 위해 살 균 조건의 유지 보수를 방지 하려면 세심 한 EHBD 해 부를 포함 하는 EHBDO 문화 세대의 중요 한 단계는 세포질 물자의 손실입니다. 설명된 온도 조건에 가까운 준수가 필요 합니다. 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 성인 생쥐의 EHBDs는 작은 (약 1 m m 직경; 그림 1E)는 격리 기교가 필요합니다. 해 부 현미경 해 부 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용 되는 지하실 매트릭스 알려진 및 알 수 없는 성장 요인19의 농도 로트에서 다를 수 있습니다 포함 된 생물학 매트릭스가입니다. 기술 복제, 동일한 많은 또는 약 수 지 매트릭스의 사용 변화를 피하기 위해 하는 것이 좋습니다. 정기적으로 WNT 활동11에 대 한 바른된 매체 mycoplasma 오염에 대 한 L WRN 세포 배양 검사 것이 좋습니다. 이 연구에 대 한 실험실 Mycoplasma 검출 키트 및 WNT 활동 분석 결과 각각 사용. EHBDOs 매체 소 태아 혈 청 (0.5%;의 낮은 금액을 포함 하는 특히, 자료의 테이블)입니다.
제시 프로토콜 설명 3 차원 상피 세포 배양 시 조에 포함 된 셀을 포함 하 고 셀 마커 cholangiocytes에 대 한 특성 및 WNT3a, R-spondin1, 및 머리 성장 요인의 존재 형성 분화 및 정의 보충 (자료 테이블)입니다. 그것은 기관 특정 성인 마우스 EHBDs에서에서 파생 됩니다. 그것은 가능성이 3 차원 구조와 능력을 유지 하 고 확장 장기에서 세포 자기 조직에 의해 입증 하는 줄기 세포 특성을 가진 성인 세포에서 파생 된다. organoids는 더 줄기 세포 같은 organoid 표현 형을 나타낼 수 있는 최소한의 "신진," 구조에서 주로 낭 성. 줄기 세포 추가 틈새 요인 organoids, 차별화의 높은 학위의 더 높은 도금 효율으로 이어질 수 가능 하다.
우리의 기술은 동물 사용을 최소화, 높은 재현성 이며 여러 다운스트림 응용 프로그램 허용 시간 및 비용 효율적인 방식으로 생성 될 수 있는 3 차원 organoid 문화를 생성 합니다. 이 새로운 도구는 이후 성인 EHBDs를 공부 하는 도구는 매우 제한 된 EHBD 연구, 중요 합니다. 그것은 인간의 조직에 대 한 액세스 권한이 하지 않거나 유전자 변형된 마우스 모델의 이용 하 고 싶은 실험실에 특별 한 혜택 될 것입니다.
마우스 조직, 인체 조직, 달리는 매우 액세스할 수입니다. 마우스 조직 연구 immunohistochemistry 항 체를 포함 하 여 여러 시 약을 확인 하 고 있습니다. 문화 성인 조직 organoids에 시 약의 비용 때문에이 기술을 처음 도입에 크게 감소 했다. 또한, 새로운 재료 줄어듭니다 organoid 문화 비용이이 프로토콜에 사용 된 L WRN 셀 조절 매체를 포함 하 여 사용할 수 있게 있다. EHBDOs 전파, 저장 하기 쉽고 프로세스 분석에 대 한 있습니다. QRT-PCR 분석 및 immunohistochemical, 현미경,이 원고에 예제로 표시 됩니다. 또한, 우리의 그룹은 최근 생성 및 유전자 조작된 쥐에서 EHBDOs의 사용과 정량 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀)16를 사용 하 여 EHBDO 세포 증식의 설명.
EHBDOs의 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램을 포함 하지만 EHBD cholangiocyte 항상성의 메커니즘을 연구 하는 cholangiocytes의 거의 무제한의 경작에 국한 되지 않습니다. 미래에이 프로토콜 질병 상태;의 연구에 적용할 수 있는 cholangiocyte organoids, 재생 의학 (intrabiliary 주입), 유전 약리학 적인 조작, 마약16; 검사의 분석을 포함 하 여 테스트 하려면 그리고 전염 성 요원12,20의 효과 공부 합니다. 셀 상호 작용 다른 세포 유형21EHBD organoids의 공동 문화를 사용 하 여 공부 될 수 있다.
소중 하 고 제한 된 인간의 소재 이므로 인간 EHBDOs의 생성 이전 파일럿 연구 마우스 파생 된 organoids는 사용할 수 있습니다. 미래 연구는 높은 도금 효율을 촉진 하는 요인의 발견에 초점을 맞춘 고 organoid 세포 분화 인간 organoids의 연구에 대 한 원하는 됩니다. 지속적인 연구 organoid 문화에 대 한 더 많은 생물학으로 중립 기질에 대 한 검색 EHBDOs 문화 세련미에 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 간 질병 피나 클의 연구 상 (N.R.)에 국립 보건원, 국립 연구소의 당뇨병과 소화기를 위한 미국 협회 및 신장 질병 (N.R., J.L.M. P01 DK062041 P30 DK34933 수상)에 의해 지원 되었다. 이 방법론의 발달로 그의 도움에 감사 박사 라몬 Ocadiz-루이즈 (미시간 대학) 하 고.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
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