Summary
Denne protokollen beskriver produksjon av en mus extrahepatic galle duct 3-dimensjonale organoid system. Disse biliær organoids kan vedlikeholdes i kultur å studere cholangiocyte biologi. Biliær organoids express markører for både stamfar og biliær celler og består av polarisert epitelceller.
Abstract
Cholangiopathies, som påvirker extrahepatic galle kanaler (EHBDs), inkluderer biliær atresia, primær skleroserende kolangitt og cholangiocarcinoma. De har ingen effektiv behandlingsalternativer. Verktøy for å studere EHBD er svært begrenset. Vårt formål var å utvikle en organ-spesifikke, allsidig, voksen Stamcelle-avledet, preklinisk cholangiocyte modell som lett kan genereres fra vill type og genmodifiserte mus. Derfor rapportere vi om teknikken for å utvikle en EHBD organoid (EHBDO) kultur-systemet fra voksen mus EHBDs. Modellen er kostnadseffektiv, kunne analyseres lett, og har flere nedstrøms programmer. Spesielt beskrive vi metodikk musen EHBD isolasjon og enkelt celle dissosiasjon, organoid kultur innvielsen, overføring, og langsiktig vedlikehold og lagring. Dette manuskriptet beskriver også EHBDO behandling for immunohistochemistry og fluorescerende mikroskopi mRNA overflod kvantifisering av sanntids kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR). Denne protokollen har betydelige fordeler i tillegg til å produsere EHBD-spesifikke organoids. Bruk av et betinget medium fra L-ADV celler reduserer kostnadene for denne modellen. Bruk av mus EHBDs gir nesten ubegrensede vev kultur generasjon, i motsetning til menneskelig vev. Genererte musen EHBDOs inneholder rene innbyggere epitelceller med markører for endodermal stamfar og differensiert biliær celler. Kultivert organoids opprettholde homogen morfologi gjennom flere passasjer og kan gjenopprettes etter en langsiktig lagringsperiode i flytende nitrogen. Modellen muliggjør studiet av biliær stamfar celle spredning, kan manipuleres farmakologisk, og kan genereres fra genmodifiserte mus. Fremtidige studier for å optimere oppdrettsforholdene for å øke plating effektivitet, evaluere funksjonelle celle modenhet og direkte celledifferensiering. Utvikling av co kultur modeller og en mer biologisk nøytral ekstracellulær matrix er også ønskelig.
Introduction
Cholangiopathies er uhelbredelig kronisk progressiv lidelser som påvirker biliær celler i intra- og extrahepatic biliær kanaler (EHBDs)1. Noen cholangiopathies, som primær skleroserende kolangitt, cholangiocarcinoma, biliær atresia og choledochal cyster, påvirker hovedsakelig EHBDs. Utviklingen av terapi for cholangiopathies er begrenset av den begrensede tilgjengeligheten av prekliniske modeller. I tillegg tidligere studier fokuserte på cholangiopathies gruppert: leveren, intra- og EHBDs. Imidlertid intra- og EHBDs har en distinkt embryonale opprinnelse og dermed bør betraktes som ulike molekylær patologi. Intrahepatic galle kanaler utvikle fra intrahepatic ductal platene og kraniale del av hepatisk divertikkel, hele EHBDs utvikle fra caudal del av hepatisk divertikkel2. De er også avhengige av ulike stamfar celle rom for voksen homeostase, inkludert kanalene i Hering i intrahepatic galle kanaler og peribiliary kjertler i EHBDs2,3. Bruk av dyremodeller for prekliniske studier er begrenset av utgifter og bør minimaliseres etiske grunner. Derfor er reduksjonistisk, reproduserbare, tid og kostnadseffektiv i vitro modeller svært ettertraktet.
De fleste tidligere studier av cholangiopathies benyttet normal mus eller rotte kreft modeller, eller menneskelig cholangiocarcinoma cellelinjer intra - og EHBDs4,5,6,7. Men disse er modeller av transformert celler og er recapitulate ikke normal cholangiocyte biologi homeostase eller sunne. Framskritt i utviklingen av organotypic kultur modeller har tillatt utviklingen av 3-dimensjonale strukturer fra ulike vev typer, inkludert sykdommer i lever og vev, men ikke normal mus EHBDs8,9, 10. Disse "orgel-like" strukturer å etterligne primære vev og dyrkes i en kunstig nisje støtte selvtillit fornyelse organ-spesifikke stem/stamfar celler11.
"Organoid" er et bredt begrep som de fleste vanligvis beskriver 3-dimensjonale vev modeller Hentet fra stamceller. Organoids kan genereres fra omprogrammeres pluripotent stamceller representert av embryonale stamceller og indusert pluripotent stamceller. De kan også genereres fra organ-spesifikke voksen stilk celler12. Noen cholangiocyte organoid modeller har blitt foreslått i tidligere undersøkelser. Dermed organoids avledet fra menneskelige pluripotent stamceller har vært rapportert7,9,13 og gi en verdifull, tid effektivt verktøy som lar for samtidige generasjon av forskjellige celletyper. Men gjenspeiler disse pluripotent Stamcelle-avledet organoids ikke fullt strukturen og funksjonaliteten av primære voksen EHBD cholangiocytes.
Organoids stammer fra voksen stilk celler av menneskelig9 og feline10 leveren ble foreslått. Feline modeller er ikke allment tilgjengelig, og har begrenset verktøyet armamentarium for øyemed. Videre er modell ikke disse lever-avledet voksen Stamcelle-avledet organoids extrahepatic cholangiocytes men heller intrahepatic cholangiocytes.
EHBD organoid generasjon ble rapportert fra menneskelige normal EHBDs14 og mus EHBD cholangiocarcinoma15. Imidlertid tilgang til menneskelig EHBD vev er svært begrenset, og organoids fra en genetisk murine modell cholangiocarcinoma15 representerer ikke sunt cholangiocyte biologi ved homeostase og er avledet fra genetisk endret celler.
For å løse begrensningene for pluripotent stamceller - og lever-avledet cholangiocyte organoid modeller og begrenset tilgang til menneskelig vev behov i preklinisk modeller, utviklet vi en murine EHBD organoid modell (figur 1A). Dette manuskriptet beskriver utviklingen av en teknikk for mus EHBD-avledet organoids fra voksen vev. Disse EHBD organoids kalt EHBDOs vil være et viktig i vitro verktøy for studiet av mekanismene bak EHBDs cholangiocyte homeostase og sykdom prosesser, for eksempel cholangiopathies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av The University of Michigan.
1. utarbeidelse av utstyr og materialer for mus EHBD isolasjon
- Forberede seeding medium og vask buffer (Tabell for materiale) i 50 mL konisk rør og holde dem i 4 ° C eller på isen før bruk.
- Definere en kirurgisk tabell (figur 1B). Forberede sterilisert Kirurgiske instrumenter (figur 1 c).
- Sted en steril 24-vel plate i 37 ° C vev kultur inkubator å forvarme den.
- Plass en aliquot av kjelleren matrise på isen. Bruke kjelleren matrix når det er helt flytende.
2. EHBD isolasjon og biliær Organoid kultur
-
Isolasjon og utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon av musen EHBD
- Euthanize en voksen mus (eldre enn to måneder) i henhold til institusjonelle retningslinjer. Plass musen i supine posisjon. Åpne bukhulen med en midtlinjen tilnærming og trekke leveren til å hvile på membranen.
- Identifisere felles galle duct plasseres rett nedenfor den lever hilum ved å trekke forsiktig proksimale tolvfingertarmen med en hemostat. Skille EHBD fra omkringliggende vev ved hjelp av en skalpell blad. Holder den proksimale enden av felles galle duct med tang, dissekere den distally like over sin tidspunktet med tolvfingertarmen og dissekere den proksimale enden av røret fra leveren (figur 1 d). Umiddelbart plassere isolert EHBD (figur 1E) i kulde vasking buffer.
- Fjerne EHBD fra vaske bufferen og hakke i 0,5 mm seksjoner med et sterilt skalpell blad. Plass vev på en glassplate på is under prosedyren (figur 1B).
- Plass delene EHBD i et rør som inneholder 500 µL av dissosiasjon bufferen. Inkuber etter 20 min på 37 ° C. Nøytralisere dissosiasjon bufferen ved å legge 500 µL av iskalde celle kultur medium.
- Triturate celle suspensjon opp og ned fremdrift gjennom 18 G og 20 G nåler, 20 ganger hver. Filtrere celle suspensjon gjennom en 70 µm celle sil og samle gjennomflytsenhet i en 50 mL tube.
Merk: Pre tilstand silen med 500 µL sterilt fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) før filtrering for å lette passering av cellen suspensjon.
-
Etablere EHBD organoids
- Sentrifuger gjennomflytsenhet fra trinn 2.1.5 på 300 x g i 5 min på 4 ° C.
- Fjern forsiktig nedbryting. Resuspend cellene i 1 mL av iskalde sterilt PBS. Overfør rørets til en ny 1,5 mL tube. Gjenta trinn 2.2.1.
- Etter sentrifugering, nøye fjerne nedbryting fra vasket celler samlet nederst rør. Resuspend celle pellet i 120 µL av flytende iskald kjelleren matrise av pipettering opp og ned bruke P200 tips.
Merk: Cellen pellet rørets i kjelleren matrise må utføres på isbadet. - Plate 40 µL av cellen rørets i kjelleren matrise i midten av en brønn i en forvarmes 24-vel-plate.
Merk: Unngå utsuging luften mens manipulere kjelleren matrise for å hindre boble formasjon. - Returnere platen med celler resuspended i kjelleren matrise til 37 ° C vev kultur inkubator i 15 minutter eller til kjelleren matrise er styrket. Legge til 600 µL av seeding medium varmet opp til 37 ° C i hver brønn (Tabell for materiale). Returnere platen til 37 ° C vev kultur inkubator.
- Erstatte seeding mediet med 600 µL av fersk organoid kultur medium i 3 dager og hver 3 dager etterpå. Overvåke organoid vekst med en invertert mikroskop. Bruk organoids for en nedstrøms program eller delt hver 7-9 dager før akkumulering av intraluminal rusk og organoid kollaps er observert (figur 2A).
3. EHBD Organoid passasje og lagring
-
Tidens EHBD organoids 1:3 til 1:4 hver 7-9 dager
- Fjerne mediet fra brønnen og legge til 400 µL av iskalde PBS. Resuspend organoids av forsiktig pipettering blanding opp og ned 10 ganger i brønnen. Overføre blandingen til en 1,5 mL tube.
- Passasje blandingen gjennom en 25 G nål 4 ganger for å dissociate i organoids. Sentrifuge blandingen på 400 x g for 4 min på 4 ° C.
- Fjern forsiktig nedbryting og resuspend cellene i kjelleren matrise (1:3 til 1:4) for ytterligere dyrking (trinn 2.2.4.) eller vaske cellene med isen kalde PBS for videre behandling.
Merk: 250-300 cellene er vanligvis belagt inn i 24-vel plate for nedstrøms programmer. Kontaktflate effektiviteten kan evalueres av lysende felt mikroskopi bruker en invertert mikroskopet på dag 3-5 etter passaging ved å telle antall organoids og beregne prosent fra første celle nummer. mRNA kan isoleres fra EHBDOs vasket i PBS bruke standardprotokollen bruker guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform utvinning.
-
Langsiktig lagring av EHBD organoids
- Fjerne mediet fra brønnen og vask organoids med romtemperatur PBS. Fjern PBS fra brønnen uten å forstyrre kjelleren matrix drop.
- Legg til 500 µL iskald cellen frysing middels til brønnen. Forsiktig resuspend organoids i flytende kjelleren matrise og celle frysing medium og overføre blandingen i Kryogenisk hetteglass.
- Hold flasker på-80 ° C i 48 h. overføring hetteglass til en nitrogen tank for langtidslagring i damp fase.
4. EHBD Organoid Pprocessing for parafin innebygging
- Resuspend EHBDOs i 500 µL av iskalde PBS (4 ° C) av pipettering opp og ned 5 til 10 ganger. Samle resuspended EHBDO i flytende kjelleren matrise i en 1,5 mL tube.
Merk: Å unngå å bryte organoids, kuttet av nederst 2-3 mm av et P1000 tips og fjerne nedbryting nøye. - Sentrifuger EHBD organoids på 350 x g for 5 min. fjerne forsiktig nedbryting uten å forstyrre organoid pellets.
- Legg 1 mL av iskalde 4% paraformaldehyde (PFA) til organoids og ruge organoids 4% PFA overnatting på 4° C. Fjerne 4% PFA fra organoids bruke et P1000 tips etter overnatting inkubasjon.
- Legge til 1000 µL av romtemperatur PBS røret med organoids og ruge i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Sentrifuge røret med organoids i PBS 350 x g for 5 min. Gjenta denne prosessen to ganger.
- Fjern PBS og tilsett 1 mL av 30% etanol til organoids. Inkuber i 5 min på RT.
- Sentrifuge røret 350 x g i 5 min på rett fjerne 30% etanol. Legg 1 mL av 70% etanol og ruge i 5 min på RT.
- Centrifugate på 350 x g for 5 min. Fjern 70% etanol. Legg 1 mL av 100% etanol og ruge i 5 min på RT.
Merk: Organoids lagres i 100% etanol ved romtemperatur for opptil 48 timer før videre behandling. - Varme prøven behandling gel i mikrobølgeovn for 20 s eller til flytende. Legge til 50 µL av behandling gel inn i røret med organoids. Sett røret på is inntil prøven behandling gel er styrket.
- Fjern dråpe prøven behandling gel med organoids fra røret og plasser mellom blå svamp pads i en kassett for ytterligere behandling i vev prosessoren. Bruke 15 min for hvert trinn i parafin-embedder under videre behandling.
- Delen parafin-embedded organoids i prøven behandling gel på 4 µm. Fortsett med immunohistochemical flekker som beskrevet tidligere16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre protokollen beskriver generering av musen EHBD organoids som er vev-spesifikke og voksen Stamcelle-avledet. Etter at organoids er kultivert, kan en cystisk struktur formasjon observeres så tidlig som en dag etter EHBD isolasjon. Forurensning med fibroblaster er ikke vanligvis observert under kultur generasjon. EHBDO plating effektiviteten er ca 2% når isolert fra neonatal eller voksen (eldre enn to måneder) mus (figur 2B). Kontaktflate effektiviteten av EHBD organoids avledet fra voksen mus øker til 11% i avsnitt 2 og forblir stabil (figur 2B). Fleste organoids viser cystisk morfologi gjennom alle passasjer, med sjeldne "uregelmessig" organoids (figur 2C-E). Organoids nå en vekst topp 5-7 dager etter som de begynner samler intraluminal rusk og forverres (figur 2A). Derfor for vedlikehold av organoid kultur, skal de deles hver 7-10 dager (figur 2A). Når etablert, og når behandles, kan organoids vedlikeholdes i kultur nesten i det uendelige (kulturer ble observert opp til 14 måneder). Unngå kultur forurensning med differensierte celler overført fra første cellen aisolering, bruk organoids passaged minst to ganger før du bruker dem for en nedstrøms program. For langvarig oppbevaring, bruk tidligere passasje (til passering 7) organoids, siden de har høyere plating effektivitet etter utvinning fra lager.
Når analysert med immunofluorescence, består EHBDOs av rene innbyggere epitelceller preget av E-cadherin (figur 3A-C). Organoid celler vise markører for biliær progenitor celler (Pancreatic og duodenalsår Homeobox 1 (PDX1); Figur 3A) og markører for biliær differensiering (cytokeratin 19 (CK19) og Sex-bestemme regionen Y-boks 9 (SOX9); Figur 3B, C). Viktigst, en høy andel av organoid celler har en primær Flimmerhår preget av acetylated α-tubulin (en-AT; Figur 3D), som er en funksjon i normal cholangiocytes, og foreslår riktig organoid celle polarisering. Uttrykk for markører stamfar (Pdx1) og biliær differensierte celler [Ck19, Sox9, Aquaporin 1 (Aqp1), cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator(Cftr)] kan bekreftes også av sanntids kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR) (tabell 1). Kombinasjonen av disse markørene er karakteristisk for cholangiocytes i EHBDs14,17,18.
I sammendraget, denne protokollen beskriver generering av en organoid kultur modell av polarisert biliær epitelceller uttrykke stamfar og differensiert markører. Dette systemet kan vedlikeholdes i kultur for en lengre tid uten endringer i morfologi, lagret langsiktige og analysert med immunohistochemistry og qRT PCR.
Figur 1 : Skjematisk av EHBD organoid kultur generasjon og kirurgisk sett opp (A). skjematisk av EHBD organoid generasjon. (B). inngrep område er angitt for EHBD isolasjon og inkludert en glassplate (stiplet linje) holdt en is-skuffen til alle tider. (C). Sterile kirurgisk utstyr inkludert skarp saks, rett og buet taggete pinsett, hemostat og skalpell. (D og E) EHBD er isolert fra omkringliggende connective og bukspyttkjertelen vev etterfulgt av forsiktig disseksjon proximally fra intrahepatic galle kanaler og leveren (D, pil), og distally fra tolvfingertarmen (D, pil). Linjalmerker = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : EHBDO kultur. (A). mikroskopiske bilder av EHBDOs over en 12-dagers kurs. (B). Plating effektiviteten av organoids avledet fra den nyfødte (2 mus per kultur, n = 3 kulturer) og voksen (> 2 måneder gammel, 1 musen per kultur, n = 3 kulturer) mus etter plating 300 celler per brønn i 24-vel plate og opplisting opprettet organoids på dag 5 av kultur. (C og D) EHBDO cystisk versus uregelmessig morfologi ble analysert av mikroskopi. (E). prosent av cystisk og uregelmessig formet organoids ble analysert i tidlig (< 10) og slutten (≥10) organoid passasjer. Skalere barer = 500 µm. kvantitative data viste som +/-standard feil av gjsnitt (SEM), t-test. NS = ikke betydelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : EHBDOs express markører for stamfar og modne biliær celler. (A-C). EHBDOs ble analysert av immunofluorescence flekker for markører epiteliale (A, B. E-cadherin, rød), stamfar (A. PDX1, green), og differensiert (B. CK19, grønt; og C. en-AT, rød) biliær celler. Skalere barer = 25 µm. *, lumen. (D). EHBDOs ble analysert for overflod av Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1og Cftr mRNA av qRT PCR (gjennomsnitt +/-SEM i forhold til uttrykk for Hprt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gene | Tiltredelse nummer | Primer sekvens | Produktet størrelse | ||
| Hprt | NM_013556 | Videresende 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3 " | 173 bp | ||
| Omvendt 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3 " | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | Videresende 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3 " | 133 bp | ||
| Omvendt 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3 " | |||||
| Sox9 | NM_011448 | Videresende 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3 " | 107 bp | ||
| Omvendt 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3 " | |||||
| Ck19 | NM_008471 | Videresende 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3 " | 133 bp | ||
| Omvendt 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3 " | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | Videresende 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3 " | 112 bp | ||
| Omvendt 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3 " | |||||
Tabell 1: primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette verket beskriver generering av en organotypic 3-dimensjonal modell av musen EHBD cholangiocytes. Viktige skritt i EHBDO kultur generasjon inkluderer grundig EHBD disseksjon for å unngå bukspyttkjertelen celle forurensning, vedlikehold av sterile forhold å hindre bakterier og sopp forurensning og forsiktig manipulasjon etter sentrifugering å unngå det tap av mobilnettet materiale. En nær overholdelse beskrevet temperaturer kreves. Det er noen begrensninger med teknikken. EHBDs av voksen mus er små (ca 1 mm i diameter; Figur 1E), som krever finesse isolering. Disseksjon mikroskop kan brukes til å hjelpe med disseksjon.
Kjelleren matrix brukes i denne protokollen er et biologisk matrise som inneholder kjente og ukjente vekstfaktorer19, konsentrasjonen av som kan variere fra parti til parti. Vi anbefaler at for teknisk gjentak, den samme mye og/eller aliquot av kjelleren matrise brukes til å unngå variasjon. Vi anbefaler også rutinemessig sjekke L-ADV cellekultur for mycoplasma forurensning og betinget medium for WNT aktivitet11. Laboratorium for denne studien brukte en Mycoplasma oppdagelsen utstyr og WNT aktivitet analysen henholdsvis. Spesielt inneholder EHBDOs mediet lav mengde fosterets bovin serum (0,5%. Tabell av materialer).
Presentert protokollen beskriver en 3-dimensjonal tarmepitelet kultur inneholder celler med stamfar og differensiert celle markører karakteristisk for cholangiocytes og dannet i nærvær av WNT3a, R-spondin1 og Noggin vekstfaktorer og definert kosttilskudd (Tabell for materiale). Det er organ-spesifikke, som det er avledet fra voksen mus EHBDs. Det er sannsynligvis avledet fra voksen celler med stilk celleegenskaper dokumentert av cellen selvstendig organisasjon i 3-dimensjonale strukturer og muligheten til å bli opprettholdt og utvidet langsiktig. Organoids er hovedsakelig cystisk struktur med minimal "spirende," som kan tyde på en mer stilk cellen-like organoid fenotypen. Er det mulig at flere stamcelleforskningen nisje faktorer kan føre til en høyere plating effektivitet av organoids, samt en høyere grad av differensiering.
Våre teknikk produserer en 3-dimensjonal organoid kultur som kan genereres i en tid - og kostnadseffektiv måte, som minimerer dyr bruk svært reproduserbare og tillater flere nedstrøms programmer. Dette nye verktøyet er viktig for EHBD studier, siden verktøy å studere voksen EHBDs er svært begrenset. Det ville være spesielle fordeler til laboratorier som ikke har tilgang til menneskelig vev eller vil dra nytte av genmodifiserte musen modeller.
Musen vev, i motsetning til menneskelig vev, er svært tilgjengelig. Det er flere reagenser, inkludert immunohistochemistry antistoffer for å studere musen vev. Kostnaden av reagenser kultur voksen vev organoids har betydelig redusert siden denne teknikken ble opprinnelig introdusert. I tillegg blir nye materialer tilgjengelig, inkludert L-ADV celle betinget mediet som brukes i denne protokollen, noe som ytterligere reduserer organoid kultur kostnader. EHBDOs er lett å overføre, lagre og behandle for analyse. Immunohistochemical, mikroskopiske, og qRT PCR analyser presenteres som eksempler i dette manuskriptet. I tillegg beskrevet vår gruppe nylig generasjon og bruk av EHBDOs fra genmodifiserte mus og kvantifisering av EHBDO celle spredning med 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU)16.
Nedstrøms bruksmuligheter av EHBDOs inkluderer men er ikke begrenset til dyrking av en nesten ubegrenset mengde av cholangiocytes å studere mekanismer EHBD cholangiocyte homeostasis. I fremtiden, kan denne protokollen brukes til studiet av sykdomstilstander; teste cholangiocyte organoids, inkludert analyse av regenerativ medisin (intrabiliary implantasjon), genetisk og pharmacologic manipulasjon, narkotikatesting16; og for å studere virkningene av smittestoffer12,20. Celle-celle samhandling kan studeres co kultur EHBD organoids med andre cellen typer21.
Mus-avledet organoids kan brukes for pilotstudier før generering av menneskelig EHBDOs, siden menneskelige materiale er verdifull og begrenset. Fremtidige studier fokuserte på oppdagelsen av faktorer som fremmer høyere plating effektivitet og organoid celledifferensiering er ønsket for studiet av menneskelig organoids. Pågående studier som søker etter en mer biologisk nøytral ekstracellulær matrix for organoid kultur er også relevant for EHBDOs kultur raffinement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Association for studie av lever sykdommer Pinnacle prisen (til N.R.) og National Institutes of Health, National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer (priser P30 DK34933 til N.R., P01 DK062041 til J.L.M.). Vi takker Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) for hans hjelp med utvikling av denne metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
