Summary
Det här protokollet beskriver produktionen av en mus extrahepatiska gallvägar 3-dimensionell organoid system. Dessa biliär organoids kan upprätthållas i kulturen att studera cholangiocyte biologi. Gallan organoids express markörer både stamceller och biliär celler och består av polariserade epitelceller.
Abstract
Cholangiopathies, som påverkar extrahepatiska gallgångarna (EHBDs), inkluderar biliär atresi, primär skleroserande kolangit och cholangiocarcinoma. De har inga effektiva behandlingsalternativ. Verktyg för att studera EHBD är mycket begränsade. Vårt syfte var att utveckla en organ-specifika, mångsidig, vuxna stamceller-derived, preklinisk cholangiocyte modell som enkelt kan genereras från vildtyp och genetiskt modifierade möss. Således rapportera vi om roman tekniken för att utveckla ett EHBD organoid (EHBDO) kultur system från vuxen mus EHBDs. Modellen är kostnadseffektiva, kunna analyseras lätt, och har flera nedströms tillämpningar. Specifikt, beskriver vi metodiken av mus EHBD isolering och enda cell dissociation, organoid kultur initiering, förökning, och långsiktigt underhåll och lagring. Detta manuskript beskriver också EHBDO bearbetning för immunohistokemi, fluorescerande Mikroskopi och mRNA överflöd kvantitering av realtid kvantitativa omvänd transkription polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR). Detta protokoll har betydande fördelar förutom att producera EHBD-specifika organoids. Användning av en betingad medium från L-VARN celler minskar kostnaden för denna modell. Användningen av musen EHBDs ger nästan obegränsad vävnad för kultur generation, till skillnad från mänsklig vävnad. Genererade mus EHBDOs innehåller en ren population av epitelceller med markörer för endodermal stamceller och differentierade biliär celler. Odlade organoids upprätthålla homogen morfologi genom flera passager och kan återställas efter en långvarig lagringstid i flytande kväve. Modellen möjliggör studiet av biliär progenitor cell spridning, kan manipuleras farmakologiskt och kan genereras från genetiskt modifierade möss. Framtida studier behövs för att optimera odlingsbetingelserna för att öka effektiviteten i bordläggningen, utvärdera funktionella cell mognad och direkta celldifferentiering. Utveckling av samarbete kultur modeller och en mer biologiskt neutrala extracellulärmatrix är också önskvärt.
Introduction
Cholangiopathies är obotlig kronisk progressiv störningar som påverkar biliär celler ligger i intra- och extrahepatiska gallvägar kanaler (EHBDs)1. Vissa cholangiopathies, såsom primär skleroserande kolangit, cholangiocarcinoma, biliär atresi och choledochal cystor, påverkar huvudsakligen EHBDs. Utvecklingen av behandlingar för cholangiopathies begränsas av den begränsade tillgången på prekliniska modeller. Dessutom tidigare studier fokuserat på cholangiopathies grupperade: lever, intra- och EHBDs. Dock intra- och EHBDs har en distinkt embryonala ursprung och således anses vara distinkta molekylär patologier. Intrahepatisk gallgångarna utvecklas från intrahepatisk duktal plattorna och den kraniella delen av nedsatt divertikel, hela EHBDs utvecklas från den kaudala delen av nedsatt divertikel2. De förlitar sig också på olika progenitor cell fack för vuxna homeostas, inklusive kanalerna i Hering i intrahepatisk gallgångarna och peribiliary körtlar i EHBDs2,3. Användning av djurmodeller för prekliniska studier begränsas av bekostnad och bör minimeras av etiska skäl. Därför, reduktionistiska, reproducerbara, tids och kostnadseffektiva in vitro-modeller är mycket önskvärda.
De flesta tidigare studier av cholangiopathies utnyttjade normal mus eller råtta cancer modeller eller mänskliga cholangiocarcinoma cellinjer som härstammar från intra- och EHBDs4,5,6,7. Men dessa är modeller av celler och sammanfatta inte normala cholangiocyte biologi vid homeostas eller i felfritt tillstånd. Senaste framsteg i utvecklingen av organotypic kultur modeller har tillåtit utvecklingen av 3-dimensionella strukturer från olika vävnadstyper, inklusive hepatobiliära vävnader, även om inte normal mus EHBDs8,9, 10. Dessa ”orgel-liknande” strukturer som syftar till att härma primära vävnad och odlas i en konstgjord nisch stödja självförnyelse organ-specifika stamceller/stamceller celler11.
”Organoid” är en bred term som de flesta vanligen beskriver 3-dimensionell vävnad modeller härrör från stamceller. Organoids kan genereras från omprogrammerade pluripotenta stamceller representeras av embryonala stamceller och inducerade pluripotenta stamceller. De kan också genereras från organ-specifika stamceller12. Vissa cholangiocyte organoid modeller har föreslagits i tidigare studier. Således organoids som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller har varit rapporterade7,9,13 och ge ett värdefullt, tid effektivt verktyg som möjliggör samtidig framställning av olika celltyper. Dock återspeglar dessa pluripotenta stamceller-derived organoids inte helt strukturen och funktionaliteten i primär vuxen EHBD cholangiocytes.
Organoids härrör från stamceller av mänskliga9 och felint10 lever föreslogs också. Feline modeller är inte allmänt tillgänglig och har begränsade verktyg Arsenal i studiesyfte. Dessutom dessa lever-derived vuxna stamceller-derived organoids inte modell extrahepatiska cholangiocytes men ganska intrahepatisk cholangiocytes.
EHBD organoid generation rapporterades från människans normala EHBDs14 och mus EHBD cholangiocarcinoma15. Men tillgång till mänsklig EHBD vävnad är mycket begränsad, och organoids som härrör från en genetisk murina modell av cholangiocarcinoma15 representerar inte friska cholangiocyte biologi vid homeostas och härrör från genetiskt modifierade celler.
För att lösa begränsningarna av pluripotenta stamceller - och lever-derived cholangiocyte organoid modeller och begränsad tillgång till mänskliga vävnader behövs i prekliniska modeller, utvecklat vi en murina EHBD organoid modell (figur 1A). Detta manuskript beskriver utvecklingen av en teknik för mus EHBD-derived organoids från adult vävnad. Dessa EHBD organoids med namnet EHBDOs blir en viktig in vitro-verktyg för att studera mekanismerna bakom EHBDs cholangiocyte homeostas och sjukdom processer, såsom cholangiopathies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av The University of Michigan.
1. beredning av utrustning och material för mus EHBD isolering
- Förbereda sådd medium och tvätt buffert (Tabell för material) i 50 mL koniska rör och hålla dem vid 4 ° C eller på is fram till användning.
- Ställa in ett operationsbord (figur 1B). Förbereda steriliserad kirurgiska instrument (figur 1 c).
- Placera en steril 24-well platta i 37 ° C vävnadsodling inkubatorn pre värma den.
- Placera en alikvot av källaren matris på is. Använda källaren matrix endast när det är helt flytande.
2. EHBD isolering och biliär Organoid kultur
-
Isolering och förberedelse av en enda cellsuspension av mus EHBD
- Avliva en vuxen mus (äldre än 2 månader) enligt anvisningar. Placera musen i ryggläge. Öppna bukhålan med en mittlinjen metod och dra in levern att vila på membranet.
- Identifiera den gemensamma gallgången ligger omedelbart nedanför lever hilum genom att försiktigt dra den proximala tolvfingertarmen med en hemostat. Separera EHBD från omgivande vävnader med hjälp av en skalpell blad. Hålla den proximala änden av gallgången med pincett, dissekera det distalt precis ovanför dess tidpunkt med tolvfingertarmen och sedan dissekera den proximala änden av kanalen från levern (figur 1 d). Placera omedelbart isolerade EHBD (figur 1E) i kall tvätt buffert.
- Ta bort EHBD från tvätt bufferten och färs i 0,5 mm sektioner med hjälp av en steril skalpell blad. Placera vävnaden på en glasskiva på is under förfarandet (figur 1B).
- Placera i EHBD avsnitt i en tub innehållande 500 µL av dissociation bufferten. Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C. Neutralisera dissociation bufferten genom att lägga till 500 µL av iskall cellodlingsmedium.
- Pulverisera cellsuspensionen upp och ner framåt genom 18 G och 20 G nålar, 20 gånger vardera. Filtrera cellsuspensionen genom en 70 µm cell sil och samla genomströmmande i en 50 mL tub.
Obs: Pre-villkor Silen med 500 µL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) före filtrering för att underlätta passagen av cellsuspensionen.
-
Om inrättande av EHBD organoids
- Centrifugera genomströmmande från steg 2.1.5 på 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten. Att resuspendera cellerna i 1 mL iskallt steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Över resuspension till en ny 1,5 mL tub. Upprepa steg 2.2.1.
- Efter centrifugering, ta försiktigt bort supernatanten från tvättade cellerna samlas längst ned röret. Återsuspendera cellpelleten i 120 µL av flytande iskall källare matris av pipettering upp och ner med hjälp av P200 tips.
Obs: Cell pellets resuspension i källaren matris måste utföras på isbad. - Platta 40 µL av cell resuspension i källaren matris in i centrera av en brunn i en pre värmde 24-bra platta.
Obs: Undvika sugning luft medan manipulera källaren matris för att förhindra bubbla bildandet. - Tillbaka plattan med celler resuspended i källaren matris till 37 ° C vävnadsodling inkubatorn i 15 min eller tills källaren matris är stelnat. Lägga till 600 µL av sådd mediet värms upp till 37 ° C till varje brunn (Tabell för material). Tillbaka plattan till 37 ° C vävnadsodling inkubatorn.
- Ersätta sådd medium med 600 µL av färska organoid odlingssubstratet i 3 dagar och varje 3 dagar därefter. Övervaka organoid tillväxt med ett inverterat Mikroskop. Använd organoids för en efterföljande ansökan eller split varje 7-9 dagar före ansamling av intraluminal skräp och organoid kollaps observeras (figur 2A).
3. EHBD Organoid Passage och lagring
-
Tidens EHBD organoids 1:3 till 1:4 varje 7 till 9 dagar
- Ta bort mediet från brunnen och tillsätt 400 µL av iskall PBS. Återsuspendera organoids av försiktigt pipettering blandningen upp och ner 10 gånger i brunnen. Överför blandningen till en 1,5 mL tub.
- Passagen blandningen genom en 25 G nål 4 gånger för att sära organoids. Centrifugera blandningen vid 400 x g under 4 minuter vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellerna i källaren matris (1:3 till 1:4) för vidare odling (steg 2.2.4.) eller tvätta cellerna med is kallt PBS för vidare bearbetning.
Obs: 250-300 celler är vanligtvis klädd i 24-väl plattan för nedströms tillämpningar. Plätering effektivitet kan utvärderas av ljusa fält mikroskopi med ett inverterat Mikroskop dag 3-5 efter passaging genom att räkna antalet organoids och beräkna deras procent från första cell nummer. mRNA kan isoleras från EHBDOs tvättas i PBS med standard-protokollet använder guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform extraktion.
-
Långsiktig lagring av EHBD organoids
- Ta bort mediet från brunnen och tvätta organoids med rumstemperatur PBS. Ta bort PBS från brunnen utan att störa källaren matrix drop.
- Tillsätt 500 µL av iskall cell frysning medium till brunnen. Försiktigt omsuspendera organoids i flytande källaren matris och cell frysning medium och överför blandningen till Kryogen injektionsflaskor.
- Lagra flaskorna vid-80 ° C för 48 h. överföring flaskorna till en kväve tank för långsiktig lagring i en gasfasen.
4. EHBD Organoid Pprocessing för Paraffin inbäddning
- Återsuspendera EHBDOs i 500 µL iskall PBS (4 ° C) genom pipettering upp och ner 5 till 10 gånger. Samla återsuspenderade EHBDO i flytande källaren matris i en 1,5 mL tub.
Obs: För att undvika att bryta organoids, skär av botten 2-3 mm av en P1000 spets och avlägsna supernatanten mycket noggrant. - Centrifug EHBD organoids på 350 x g i 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa organoid pelleten.
- Tillsätt 1 mL iskallt 4% paraformaldehyd (PFA) till organoids och inkubera i organoids i 4% PFA övernattning vid 4° C. Ta bort 4% PFA från den organoids som använder ett P1000 tips efter natten inkubation.
- Lägga till 1000 µL av rumstemperatur PBS i röret med organoids och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (RT). Centrifugera röret med organoids i PBS vid 350 x g för 5 min. Upprepa denna process två gånger.
- Ta bort PBS och tillsätt 1 mL 30% etanol till organoids. Inkubera i 5 min på RT.
- Centrifugera röret vid 350 x g i 5 min på RT. ta bort 30% etanol. Tillsätt 1 mL 70% etanol och inkubera i 5 min på RT.
- Centrifugate vid 350 x g i 5 min. ta bort 70% etanol. Tillsätt 1 mL 100% etanol och inkubera i 5 min på RT.
Obs: Organoids kan hållas i 100% etanol i rumstemperatur i upp till 48 h innan vidare behandling. - Värma preparatet bearbetning gel i en mikrovågsugn för 20 s eller tills flytande. Tillsätt 50 µL prov bearbetning gel i röret med organoids. Placera röret på is tills preparatet bearbetning gel är stelnat.
- Ta bort släpp av preparatet bearbetning gel med organoids från röret och placera mellan blå svamp dynorna i en kassett för vidare bearbetning i vävnad processorn. Använda 15 min för varje steg i den paraffin embedder under vidare bearbetning...
- Avsnitt paraffin-inbäddat organoids i prov bearbetning gel på 4 µm. Fortsätt med immunhistokemisk färgning som tidigare beskrivits16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra protokollet beskriver generationen av mus EHBD organoids som är vävnadsspecifika och vuxna stamceller-derived. Efter organoids odlas, kan en cystisk struktur formation observeras så tidigt som 1 dag efter EHBD isolering. Kontaminering med fibroblaster observeras inte vanligtvis under generering av kultur. EHBDO plätering effektivitet är cirka 2% när isolerade från neonatal eller vuxen (äldre än 2 månader) möss (figur 2B). Plätering effektiviteten i EHBD organoids härrör från vuxna möss ökar till 11% i passagen 2 och förblir stabil (figur 2B). Majoriteten av organoids visar cystisk morfologi genom alla passager, med sällsynta ”oregelbundna” organoids (figur 2 c-E). Organoids nå en tillväxt-topp 5-7 dagar varefter de börjar ackumulera intraluminal skräp och försämras (figur 2A). Därför, för underhåll av organoid kultur, de bör delas varje 7-10 dagar (figur 2A). När etablerade och hanteras korrekt, kan organoids upprätthållas i kultur nästan på obestämd tid (kulturer observerades upp till 14 månader). För att undvika kultur kontaminering med differentierade celler som överförts från initial cell isolering, användning organoids överförda minst två gånger innan du använder dem för en efterföljande ansökan. För långsiktig lagring, Använd tidigare passage (upp till passagen 7) organoids, eftersom de har högre plätering effektivitet efter återhämtning från lagring.
När analyserat med immunofluorescens, består EHBDOs av en ren population av epitelceller som präglas av E-cadherin (figur 3A-C). Organoid celler visar markörer av biliär stamceller (pankreas och Duodenal Homeobox 1 (PDX1); Figur 3A) samt markörer för biliär differentiering (cytokeratin 19 (CK19) och Sex-bestämma Region Y-Box 9 (SOX9); Figur 3B, C). Ännu viktigare, en hög andel av organoid celler besitter en primära cilier präglas av Acetylerade α-tubulin (a-AT; Figur 3D), som är en funktion av normala cholangiocytes, och föreslår lämpliga organoid cell polarisering. Uttrycket av markörer för stamceller (Pdx1) och biliär differentierade celler [Ck19, Sox9, Akvaporin 1 (Aqp1),, cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator(Cftr)] kan bekräftas också av realtid kvantitativa omvänd transkription polymeraskedjereaktion (qRT-PCR) (tabell 1). Kombinationen av dessa markörer är karakteristiska för cholangiocytes i EHBDs14,17,18.
Sammanfattningsvis, detta protokoll beskriver generering av en organoid kultur modell av polariserade galla epitelceller uttrycker stamceller och differentierade markörer. Detta system kan bibehållas i kultur under en längre tid utan förändringar i morfologi, lagras långsiktig och analyserade med immunhistokemi och qRT-PCR.
Figur 1 : Schematisk av EHBD organoid kultur generering och kirurgiska set upp (A). Schematisk av EHBD organoid generation. (B). kirurgiska området var inställd för EHBD isolering och inkluderade en glasskiva (streckad linje) som hålls på en ISLÅDA hela tiden. (C). sterila kirurgiska utrustning ingår vass sax, raka och böjda sågtandade pincett, hemostat och skalpell. (D och E) EHBD är isolerad från omgivande bindväv och bukspottskörteln vävnad följt av noggrann dissektion proximalt från intrahepatisk gallgångarna och levern (D, pil) och distalt från tolvfingertarmen (D, pil). Linjalmarkeringar = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : EHBDO kultur. (A). mikroskopiska bilder av EHBDOs över en 12-dagars kurs. (B). plätering effektivitet av organoids härrör från den neonatala (2 möss per kultur, n = 3 kulturer) och vuxna (> 2 månader gammal, 1 mus per kultur, n = 3 kulturer) möss efter plätering 300 celler per brunn i plattan 24 brunnar och enumerating etablerat organoids på dag 5 av kultur. (C och D) EHBDO cystisk kontra oregelbunden morfologi analyserades av mikroskopi. (E). procenten av cystisk och oregelbundet formade organoids analyserades i tidigt (< 10) och sena (≥10) organoid passager. Skala barer = 500 µm. kvantitativa data visade som medelvärde +/-standardavvikelsen för medelvärdet (SEM), t-test. NS = inte betydande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : EHBDOs express markörer av stamceller och mogen biliär celler. (A-C). EHBDOs analyserades av immunofluorescens färgning för markörer epitelial (A, B. E-cadherin, röd), stamfader (A. PDX1, grön), och differentierade (B. CK19, grön; och C. a-AT, röd) biliär celler. Skala barer = 25 µm. *, lumen. (D). EHBDOs analyserades för överflöd av Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1och Cftr mRNA av qRT-PCR (medelvärde +/-SEM i förhållande till uttryck för Hprt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gene | Anslutningen nummer | Primer sekvens | Produktstorlek | ||
| HPRT | NM_013556 | Framåt 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3' | 173 bp | ||
| Omvänd 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | Framåt 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3' | 133 bp | ||
| Omvänd 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | Framåt 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3' | 107 bp | ||
| Omvänd 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | Framåt 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3' | 133 bp | ||
| Omvänd 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | Framåt 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3' | 112 bp | ||
| Omvänd 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3' | |||||
Tabell 1: Primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver generationen av en organotypic 3-dimensionell modell av mus EHBD cholangiocytes. Viktiga steg i EHBDO kultur generation inkluderar noggranna EHBD dissekering för att undvika bukspottkörteln cell kontaminering, underhåll av sterila förhållanden att förhindra bakterie- och svampinfektioner förorening och försiktig manipulation efter centrifugeringen att undvika den förlust av cellulära material. Det krävs en nära anslutning till beskrivs temperaturförhållanden. Det finns vissa begränsningar till tekniken. EHBDs av vuxna möss är små (ca 1 mm i diameter; Figur 1E), som kräver finess för isolering. Dissektion Mikroskop kan användas för att hjälpa till med dissektion.
Källaren matris används i detta protokoll är en biologisk matris som innehåller kända och okända tillväxtfaktorer19, koncentrationen av som kan variera från parti till parti. Vi rekommenderar att tekniska replikat, den samma parti eller alikvot av källaren matris användas för att undvika variationer. Vi rekommenderar också rutinmässigt kontrollera L-VARN cellodling för mycoplasma kontaminering och konditionerat medium för WNT aktivitet11. Lab för denna studie använde Mycoplasma upptäckt kit och WNT aktivitet assay respektive. Särskilt, innehåller EHBDOs medium låg mängd fetalt bovint serum (0,5%. Tabell över material).
Presenterade protokollet beskriver en 3-dimensionell epitelial cellkultur som innehåller celler med stamceller och differentierad cell markörer karakteristiska för cholangiocytes och bildas i närvaro av WNT3a, R-spondin1 och skalle tillväxtfaktorer och definierade kosttillskott (Tabell för material). Det är organ-specifika, eftersom den härrör från vuxen mus EHBDs. Det är sannolikt härrör från vuxna celler med stamceller egenskaper framgår av cell självorganisering i 3-dimensionella strukturer och förmåga att bibehållas och utökas långsiktiga. Organoids är främst cystisk struktur med minimal ”spirande”, vilket kan tyda på en mer stamceller-liknande organoid fenotyp. Det är möjligt att ytterligare stamceller nisch faktorer kan leda till en högre plätering effektivitet av organoids, liksom en högre grad av differentiering.
Vår teknik ger en 3-dimensionell organoid kultur som kan genereras i ett tids - och kostnadseffektiva sätt, vilket minimerar användning av djur, är mycket reproducerbara och tillåter flera efterföljande program. Detta nya verktyg är viktigt för EHBD studier, eftersom verktyg att studera vuxen EHBDs är mycket begränsade. Det skulle vara särskilda förmåner till laboratorier som inte har tillgång till mänskliga vävnader eller vill dra nytta av genetiskt modifierade musmodeller.
Mus vävnad, till skillnad från mänsklig vävnad, är mycket lättillgänglig. I området i närheten finns det flera reagenser, inklusive immunohistokemi antikroppar för att studera mus vävnader. Kostnaden för reagenser till kultur adult vävnad organoids har minskat betydligt sedan denna teknik introducerades ursprungligen. Dessutom har nya material blir tillgängliga, inklusive det L-VARN cell luftkonditionerade medium som används i detta protokoll, som ytterligare minskar organoid kultur kostnad. EHBDOs är lätt att propagera, lagra och bearbeta för analys. Immunhistokemisk, mikroskopiska, och qRT-PCR-analyser presenteras som exempel i detta manuskript. Dessutom beskrivit vår grupp nyligen generering och användning av EHBDOs från genmanipulerade möss och kvantitering av EHBDO cellproliferation med 5-ethynyl-2´-deoxiuridin (EdU)16.
Potentiella nedströms tillämpningar av EHBDOs inkluderar men begränsas inte till odling av ett nästan obegränsat antal cholangiocytes att studera mekanismer för EHBD cholangiocyte homeostas. I framtiden, kan detta protokoll tillämpas på studiet av sjukdomstillstånd; att testa cholangiocyte organoids, inklusive analys av regenerativ medicin (intrabiliary implantation), genetiska och farmakologisk manipulation, drogtester16; och för att studera effekterna av smittämnen12,20. Cell-cell interaktioner kan studeras med samtidig kultur av EHBD organoids med andra cell typer21.
Mus-derived organoids kan användas för pilotstudier före generering av mänskliga EHBDOs, eftersom humant material är värdefull och begränsad. Framtida studier fokuserat på upptäckten av faktorer som främjar högre plätering effektivitet och organoid celldifferentiering önskas för studiet av mänskliga organoids. Pågående studier som söker en mer biologiskt neutrala extracellulär matrix för organoid kultur är också relevant för EHBDOs kultur förfining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av American Association for den studie av levern sjukdomar Pinnacle award (till Norberg) och National Institutes of Health, nationella institutet för Diabetes och mag och njursjukdomar (awards P30 DK34933 till Norberg, P01 DK062041 till J.L.M.). Vi tackar Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) för hans hjälp med utvecklingen av denna metod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
