Summary
Qui, il sangue del topo è stato raccolto in presenza di un anti-coagulante. Le piastrine sono state purificate dal mezzo gradiente di Ioexolo usando la centrifugazione a bassa velocità. Le piastrine sono state attivate con trombina per indagare se fossero vitali. La qualità delle piastrine purificate è stata analizzata mediante citometria a flusso e microscopia.
Abstract
Le piastrine vengono purificate dal sangue intero per studiare le loro proprietà funzionali, che dovrebbero essere prive di globuli rossi (RBC), globuli bianchi (WBC) e proteine plasmatiche. Descriviamo qui la purificazione delle piastrine dal sangue del topo utilizzando tre volte più Ioexolo gradiente medio rispetto al volume del campione di sangue e centrifugazione in un rotore a benna oscillante a 400 x g per 20 min a 20 ° c. Il recupero/rendimento delle piastrine purificate era 18,2-38,5%, e le piastrine purificate erano in uno stato di riposo, che non conteneva alcun numero significativo di RBC e WBC. Le piastrine purificate trattate con trombina hanno mostrato fino al 93% di attivazione, indicando la loro vitalità. Abbiamo confermato che le piastrine purificate sono sufficientemente puri utilizzando la valutazione citometria a flusso e microscopica. Queste piastrine possono essere utilizzate per l'espressione genica, l'attivazione, il rilascio del granulo, l'aggregazione e i saggi di adesione. Questo metodo può essere utilizzato per la purificazione delle piastrine dal sangue di altre specie pure.
Introduction
Le piastrine sono un componente di sangue che funge da iniziatore della coagulazione del sangue in risposta a danni nel vaso sanguigno. Si riuniscono nel sito di lesione per collegare la parete del vaso1. Le piastrine sono frammenti anucleati di citoplasma derivati dai megacariociti del midollo osseo sotto l'influenza della trombopoietina e entrano nella circolazione2. Sono considerati metabolicamente attivi e capaci di rilevare l'ambiente extracellulare attivando le cascate di segnalazione intracellulare che provocano la diffusione piastrinica, l'aggregazione e la formazione di spine emostatiche1,3. Oltre a emostasi/trombosi e guarigione delle ferite4, le piastrine svolgono un ruolo importante nelle risposte infiammatorie dell'ospite, nell'angiogenesi e metastatis3,5,6,7, 8. il
Le piastrine vengono purificate dal sangue per studiare le loro proprietà biochimiche e fisiologiche, che dovrebbero essere libere da altri componenti del sangue. Poiché i globuli rossi (RBC) e globuli bianchi (WBC) contengono significativamente più RNA e proteine rispetto alle piastrine9,10, la presenza di anche un piccolo numero di queste cellule può interferire con le analisi trascrittomiche e proteomica di RNA e proteine derivate dalle piastrine. Abbiamo scoperto che le piastrine purificate attivate con anticorpo trombina legano come anti-GPIIb/IIIa (JON/A) e anti-P-selectin in modo più efficiente rispetto alle piastrine intere del sangue.
Poiché le piastrine sono fragili, è importante trattare i campioni nel modo più delicato possibile. Se le piastrine sono attivate, rilasciano il loro contenuto di granulo e infine degradano. Pertanto, per mantenere intatte le proprietà funzionali delle piastrine, è importante mantenere la quiescenza piastrinica durante l'isolamento. Diversi protocolli hanno descritto l'isolamento delle piastrine dal primate umano, cane, ratto e non umano con vari metodi1,10,11,12. Alcuni dei metodi richiedono più passaggi, come la raccolta di plasma ricco di piastrine mediante centrifugazione, filtrazione per colonna di separazione, selezione negativa di piastrine con RBC-e anticorpo WBC-specifico coniugato a perle magnetiche, e così via, che sono che richiedono tempo e possono degradare le piastrine e il loro contenuto.
Ford e i suoi colleghi hanno descritto la purificazione piastrinica dal sangue umano usando Ioexolo medium11. Questo metodo utilizza un volume simile di campione di sangue e mezzo durante la purificazione. Poiché gli esseri umani producono un volume più elevato di sangue, è relativamente facile purificare le piastrine.
Iohexol è un mezzo inerti a gradiente universale che è liberamente solubile in acqua e utilizzato nel frazione di acidi nucleici, proteine, polisaccaridi e nucleoproteine13,14. Ha bassa osmolalità ed è atossico, rendendolo così un mezzo ideale per la purificazione delle cellule viventi intatte11. Si tratta di un mezzo non particolato; Pertanto, la distribuzione delle cellule in un gradiente può essere determinata utilizzando l'emocytometro, il citometro di flusso o lo spettrofotometro. Non interferisce con la maggior parte della reazione enzimatica o chimica delle cellule o frammenti cellulari dopo la diluizione.
Il topo funge da modello animale importante per molte malattie umane15,16,17,18. Ci sono alcuni articoli pubblicati che descrivono la purificazione delle piastrine del topo19,20. Tuttavia, il topo produce un volume relativamente più piccolo di sangue, il che rende difficile purificare le piastrine. Se si utilizza lo stesso piccolo volume di gradiente medio e campioni di sangue, lo strato piastrinico non può essere chiaramente separato dallo strato di RBC-WBC dopo la centrifugazione. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo rapido e semplice di purificazione piastrinica del topo con tre volte più Ioexolo gradiente medio rispetto al volume del campione di sangue e centrifugazione a bassa velocità. Abbiamo anche attivato le piastrine purificate con trombina e indagato la loro qualità con citometria di flusso e microscopia.
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Protocol
La raccolta del sangue del topo deve essere condotta con un'adeguata assistenza istituzionale e l'approvazione del Comitato di uso.
Nota: Il protocollo di purificazione piastrinica è descritto in un diagramma di flusso in Figura 1.
1. raccolta di sangue
- Aggiungere 25 μL di 3,2% citrato di sodio (pH 7,2) come un anticoagulante e 0,4 mM di Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in un tubo di polipropilene.
-
Raccogliere circa 200 μL di sangue dal mouse topi C57BL/6 usando un sanguinamento retro-orbitale.
Nota: il sangue può essere raccolto da qualsiasi tipo di ceppo del topo indipendentemente dall'età o dal sesso.- Utilizzare 2 mL di isoflurano in qualsiasi tipo di camera per anestetizzare il mouse.
Nota: La profondità dell'anestesia è verificata da segni di aumento della respirazione e diminuzione del movimento. Il mouse non deve rispondere al movimento della camera di anestesia, o di essere manipolato. Se il mouse è reattivo al movimento o alla manipolazione, allora richiede più tempo per tenere nella camera di anestesia. - 1.2.2 aprire la palpebra destra o sinistra del mouse e inserire un tubo capillare di 7,5 cm (0,12 cm di diametro) nel plesso vascolare dell'occhio.
- Ruotare il tubo capillare di un mezzo giro mentre si applica la pressione al tubo capillare per rompere i vasi e avviare il flusso sanguigno. Tenere l'animale capovolto sopra il flaconcino di raccolta per essere riempito con l'azione capillare.
- Una volta che il volume appropriato di sangue viene raccolto, rimuovere il tubo capillare e chiudere l'occhio applicando una lieve pressione per 30 s sulla palpebra con garza. Una volta che il sanguinamento è fermato, riportare il mouse alla sua gabbia e monitorare il sanguinamento.
- Controllare gli occhi per trauma 1-2 giorni dopo il sanguinamento retro-orbitale. Rimuovere qualsiasi topo dallo studio mostrando segni di trauma significativo per l'occhio a seguito della procedura e eutanasia.
Nota: Il topo non deve subire alcun tipo di trattamento che possa inibire le piastrine per almeno due settimane prima della raccolta del sangue. Il campione di sangue deve essere usato per la purificazione piastrinica entro un'ora dal sanguinamento del topo.
- Utilizzare 2 mL di isoflurano in qualsiasi tipo di camera per anestetizzare il mouse.
2. purificazione piastrinica
Nota: La purificazione piastrinica deve essere effettuata a temperatura ambiente per prevenirne la degradazione. Accertarsi che la temperatura dei reagenti e degli strumenti sia compresa tra 18 e 22 ° c. Per prevenire la degradazione piastrinica, il pipettaggio rapido e l'agitazione vigorosa devono essere evitati durante la procedura.
- Aggiungere 600 μl di Ioexolo gradiente medio (12% polvere di Ioexolo in 0,85% cloruro di sodio, 5 mm tRiCiNa, pH 7,2)11 in un tubo da 1,5 ml.
- Aggiungere 200 μl di campione di sangue lentamente lungo il lato del tubo sopra il supporto del gradiente con una punta di pipetta di ampio diametro in modo che il sangue e il mezzo di Ioexolo non si miscelino (Figura 2a).
- Centrifugare il campione contenente il tubo a 400 x g per 20 minuti a 20 ° c in un rotore a benna oscillante con accelerazione lenta e decelerazione.
- Raccogliere la maggior parte dello strato ricco di piastrine e una piccola frazione di strato povero di piastrine (Totale 300 a 400 μL) utilizzando una punta di pipetta largo foro senza disturbare gli strati di RBC e WBC (Figura 2B). Trasferire il campione di piastrine in un nuovo tubo.
Nota: Se la conta piastrinica è meno nel sangue o si utilizza un volume più piccolo di sangue, lo strato ricco di piastrine e lo strato povero di piastrine possono essere visti come un singolo strato. - Aggiungere 1 mL di PBS al campione piastrinico, mescolare invertendo e centrifugare a 800 x g per 10 min a 20 ° c in un rotore a benna oscillante. Eliminare completamente la soluzione e aggiungere 200 μL di PBS per risospendere le piastrine con un pipettaggio delicato.
Nota: Questo passaggio è facoltativo, in quanto rimuove il gradiente medio e le proteine plasmatiche e aumenta la sensibilità delle piastrine agli agonisti come la trombina. Poiché diverse centrifughe hanno programmi diversi, la lenta accelerazione/decelerazione può essere determinata leggendo il manuale d'uso della centrifuga. - Trasferire 30 μL di questo campione in un nuovo tubo per contare le piastrine. Le piastrine rimanenti possono essere utilizzate per saggi biochimici e fisiologici come l'attivazione piastrinica, l'aggregazione, il rilascio di granulo, ecc.
- Per l'estrazione di RNA o proteine, centrifugare il campione piastrinico a 800 x g per 10 minuti per pellet le piastrine. Scartare completamente il supernatante senza disturbare il pellet. Aggiungere il volume desiderato di RNA o tampone di lisi proteica per lizzare le piastrine.
3. conteggio delle piastrine
- Contare le cellule del sangue intere senza diluizione e piastrine purificate (diluito da 2 a 5 volte con PBS) utilizzando un analizzatore cellulare automatizzato. Utilizzare da 30 a 50 μL di campioni per il conteggio.
- Calcolare il numero totale di piastrine moltiplicando per il volume del campione.
- Calcolare la percentuale di rendimento/recupero delle piastrine depurata.
- Conta il RBC e il WBC nel campione piastrinico purificato (diluito 50 a 100 volte con PBS) con un emocytometro e un microscopio.
4. attivazione piastrinica
- In un tubo, aggiungere 1 a 2 milioni piastrine purificate in fino a 100 μL di tampone di colorazione (PBS con 2% siero bovino fetale, FBS).
- Per un numero multiplo di campioni, fare un Master mix di anticorpi con 1 μL (0,5 mg/mL) dei seguenti: PE-Cy7 Rat anti-topo TER 119, PE ratto anti-topo CD45, FITC Rat anti-topo CD41, e APC Rat anti-topo/CD62P umano (P-selectin) per rilevare RBC, WBC, piastrine, e piastrine attivate, rispettivamente. Aggiungere la miscela master ai tubi per la colorazione delle cellule. Non aggiungere trombina.
- In un altro tubo, aggiungere 1 a 2 milioni di piastrine purificate in fino a 100 μL di tampone di colorazione, e 0,4 mM GPRP peptide. Aggiungere la trombina per attivare le piastrine e macchiare le cellule dopo il passo 4,2.
Nota: GPRP deve essere aggiunto al campione prima di aggiungere la trombina per prevenire l'aggregazione o la formazione di coaguli attraverso l'attivazione piastrinica. La concentrazione di trombina deve essere ottimizzata per ottenere una buona attivazione delle piastrine. Dopo l'attivazione piastrinica, i conteggi degli eventi sono diminuiti durante l'acquisizione di campioni mediante citometria a flusso. - Come controllo positivo, aggiungere 1 μL di sangue intero in un buffer di colorazione fino a 100 μL in un tubo e 0,4 mM di peptide GPRP. Aggiungere la trombina per attivare le piastrine. Come controllo negativo, aggiungere 1 μL di sangue intero in un massimo di 100 μL di tampone di colorazione. Non aggiungere trombina nel campione di controllo negativo. Macchia le cellule seguendo il passo 4,2.
- Per il controllo degli isotipi di citometria a flusso, etichettare 5 provette con non macchiate, PE-Cy7, PE, FITC e APC. Aggiungere 100 μL di tampone di colorazione, 1 μL di sangue e 1 μL del rispettivo anticorpo ai tubi etichettati per macchiare le cellule.
- Incubare i campioni per macchiare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare i campioni aggiungendo 1 mL di tampone di colorazione a ciascun tubo. Centrifugare a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare accuratamente il tampone di colorazione senza rimuovere il pellet.
- Aggiungere 300 μL di tampone di colorazione a ciascun tubo, mescolare lievemente e trasferirlo in un tubo FACS. Conservare i campioni macchiati al buio fino a quando analizzati con un citometro di flusso.
5. analisi della citometria a flusso delle piastrine
-
Creare un nuovo esperimento e generare log in avanti dispersione vs log scatter dot plot e assegnare cancelli per Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (piastrine), e CD62P APC (piastrine attivate) popolazioni secondo la strategia di gating scelto per il sperimentare nel software FACS DIVA.
- Aprire la gerarchia di popolazione scegliendo Mostra gerarchia di popolazione nella scheda popolazioni . modificare la gerarchia di popolazione controllando la strategia di gating e rinominando correttamente i cancelli.
- Aprire la visualizzazione delle statistiche scegliendo Crea vista statistiche. Modificare la visualizzazione delle statistiche in base alle preferenze dell'utente facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla visualizzazione statistiche e selezionando Modifica vista statistiche.
- Scegliere un colore per ogni cancello che migliora l'aspetto visivo del layout facendo doppio clic sulla casella corrispondente alla popolazione.
- Nella finestra del cytometer , fare clic sulla scheda parametri e regolare le tensioni per i parametri per visualizzare la popolazione di interesse sui grafici.
- Regolare le tensioni per ciascuno dei parametri in modo che la popolazione negativa possa essere distinta dalla popolazione positiva. Prima di registrare i campioni per il controllo della compensazione, verificare che i controlli positivi a singola macchiatura siano su scala (assicurarsi che i picchi positivi siano visibili e non troppo distanti a destra).
Nota: Se i picchi positivi sono fuori scala, le tensioni devono essere regolate per vedere le popolazioni positive. - Registrare le celle colorate monocolore per i controlli di compensazione (non macchiate, PE-Cy7, PE, FITC e APC).
- Se i cancelli di controllo positivi non sono impostati correttamente, regolarli cambiando le tensioni.
- Passare all' esperimento ≫ impostazione della retribuzione ≫ calcola retribuzione. Scegliere applica solo nella finestra risultante.
- Passare al foglio di lavoro globale facendo clic sul pulsante di attivazione/disattivazione nella parte superiore, a sinistra della finestra del foglio di lavoro.
- Caricare il campione di controllo positivo e acquisire abbastanza celle per regolare la compensazione e le porte.
- Caricare nuovamente il campione e verificare che ogni trama mostri la popolazione cellulare prevista in base all'anticorpo macchiato fluorocromo. Acquisisci e registra 100.000 eventi per campioni di sangue interi e 10.000 eventi per piastrine depurata. Caricare i campioni uno per uno fino al completamento dell'acquisizione.
- Analizzare i dati di citometria del flusso con il software con trame e cancelli appropriati (Figura 3)
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Representative Results
Il riassunto della purificazione piastrinica è descritto in un diagramma di flusso (Figura 1). I passaggi includono la raccolta di sangue dal topo con sanguinamento retro-orbitale in presenza di un anticoagulante, aggiunta di campione di sangue sul mezzo di gradiente di ioexolo, centrifugazione in un rotore oscillante a benna a 400 x g per 20 minuti a 20 ° c. La qualità delle piastrine purificate è stata valutata con microscopia e citometria a flusso dopo colorazione con anticorpo per rilevare eventuali cellule contaminanti e piastrine attivate.
Il gradiente di Ioexolo e il campione di sangue formano due strati separati nel tubo se il sangue è stato lentamente aggiunto sul mezzo (Figura 2a). Tuttavia, se c'è ritardo in questo passaggio, la maggior parte del campione di sangue potrebbe diffondersi nel mezzo e potrebbe essere difficile purificare le piastrine. I puntali per pipette a foro largo non garantivano stress fisici alle piastrine, il che è importante per mantenere l'integrità delle piastrine e prevenirne la degradazione. Durante la centrifugazione, l'accelerazione lenta ha contribuito a prevenire la miscelazione involontata del campione di sangue con un rallentamento medio di Ioexolo e una lenta decelerazione ha contribuito a mantenere il gradiente dopo la centrifugazione. Il livello superiore (colore paglia) conteneva il plasma e non conteneva alcun tipo di cellule del sangue intatte, il secondo strato (biancastro) dalla parte superiore conteneva la maggioranza delle piastrine che è stata raccolta utilizzando una punta di pipetta ad ampio foro, il terzo strato (trasparente) è stato piastrinica povera che è stata parzialmente raccolta accuratamente per evitare l'aspirazione dello strato inferiore (rosso) RBC e WBC (Figura 2B). Lo strato ricco di piastrine e lo strato povero di piastrine non poteva essere visto separato se la conta piastrinica era bassa nel campione di sangue. Lo strato di RBC e WBC non poteva essere visto come strati separati dal momento che il volume del sangue era piccolo. Tuttavia, WBC forma uno strato bianco, chiamato Buffy Coat tra strato povero piastrinico e strato di RBC se un volume più grande di sangue viene utilizzato per la purificazione10, 11. È importante eseguire l'intera procedura a 18 a 22 ° c. Sia la temperatura più elevata che la refrigerazione dei campioni hanno prodotto una riduzione della conta piastrinica dovuta alla degradazione.
Abbiamo trovato 18,2 a 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) recupero/resa delle piastrine purificate. Per indagare la loro vitalità, campioni di piastrine purificati sono stati attivati con trombina. L'analisi citometria a flusso dei campioni di piastrine è stata effettuata dopo la colorazione con i marcatori per piastrine, piastrine attivate, RBC e WBC. Il sangue intero ha mostrato distinte popolazioni di RBC, WBC e piastrine su un grafico a dispersione logaritmica in avanti e a dispersione laterale (Figura 3A), mentre le piastrine purificate hanno mostrato una popolazione distinta con un numero trascurabile di RBC e WBC (Figura 3B ). Il sangue intero ha mostrato RBC e WBC dopo averli macchiandoli con anticorpi anti-topo Ter119 e anti-topo CD45 (Figura 3C), mentre le piastrine purificate hanno mostrato un numero trascurabile di RBC e WBC (Figura 3D). Abbiamo valutato il campione di piastrine purificata con un microscopio e non ha visto alcun numero significativo di RBC e WBC intatto. Pertanto, gli eventi RBC e WBC che sono stati mostrati in Figura 3D potrebbero essere i frammenti di RBC e WBC contenenti rispettivamente TER119 e CD45. Le piastrine purificate che non sono state trattate con trombina hanno mostrato quasi nessuna attivazione indicando il loro stato di riposo (Figura 3e), mentre le piastrine depurate trattate con trombina hanno mostrato un'attivazione del 71% (fino a 93% di attivazione è stata osservata in alcuni campioni) ( Figura 3F) indicando la loro redditività. Abbiamo anche effettuato una valutazione microscopica dei campioni di piastrine purificati non trattati con trombina che non hanno mostrato aggregazione piastrinica (Figura 4a), tuttavia, le piastrine purificate formate aggregati dopo essere state trattate con trombina (Figura 4B), che ne indicano ulteriormente la redditività. Sulla base di studi citometria di flusso e microscopici, abbiamo confermato che le nostre piastrine purificate erano di buona qualità.
Figura 1: diagramma schematico per la purificazione delle piastrine del topo. Il campione di sangue dal topo viene raccolto in presenza di un anticoagulante. Il campione di sangue viene lentamente aggiunto sul supporto del gradiente di iohexol e centrifugato a 400 x g per 20 minuti a 20 ° c. Lo strato piastrinico viene trasferito ad un nuovo tubo. La qualità delle piastrine depurata viene verificata con microscopia e citometria a flusso. Le piastrine possono essere utilizzate immediatamente o conservate a-80 ° c. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2:. Sangue del topo prima e dopo la centrifugazione con iohexol gradiente medium. A) iohexol e sangue formano due strati separati prima della centrifugazione se il campione di sangue viene aggiunto con attenzione. Il pannello sinistro mostra il diagramma schematico e il pannello destro Mostra l'immagine reale. B) quattro strati separati si vedono dopo la centrifugazione di sangue intero con mezzo gradiente. Il pannello sinistro mostra il diagramma schematico dei livelli e il pannello destro Mostra l'immagine reale. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: analisi citometria a flusso delle piastrine depurata. (A) sangue intero Mostra RBC, WBC, e popolazioni piastriniche. B) le piastrine purificate mostrano un numero minore di eventi RBC e WBC. (C) sangue intero Mostra RBC e WBC dopo la colorazione con anti-topo Ter119 e anti-topo CD45. (D) le piastrine purificate mostrano un numero trascurabile di eventi RBC e WBC dopo la colorazione con anti-topo Ter119 e anti-topo CD45. (E) piastrine purificate macchiate con anti-topo CD41 e anti-topo/umano P-selectin mostrano quasi nessuna attivazione piastrinica. F) piastrine purificate trattate con trombina e macchiate con anti-topo CD41 e anti-topo/P-selectina umana mostrano l'attivazione delle piastrine. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: valutazione microscopica delle piastrine depurata. A) le piastrine purificate non mostrano alcuna aggregazione. B) piastrine depurate trattate con aggregazione di trombina. Entrambe le figure sono ingrandimento 200x, lente oculare 10x e obiettivo 20x. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Comunemente, le piastrine sono isolate da centrifugazione a bassa velocità che produce plasma ricco di piastrine che contiene un numero significativo di cellule del sangue, detriti cellulari e proteine plasmatiche che possono interferire con i saggi biochimici e fisiologici e le esigenze ulteriore purificazione21. Pertanto, è importante utilizzare un metodo rapido e semplice che può produrre piastrine pure senza contaminanti principali. Il protocollo qui presentato descrive la purificazione delle piastrine dal sangue del topo utilizzando un mezzo gradiente con centrifugazione a bassa velocità. I parametri utilizzati in questo protocollo massimizzano la resa e riducono al minimo la degradazione delle piastrine. Il gradiente medio e le proteine plasmatiche possono essere rimossi includendo una fase di lavaggio dopo la raccolta piastrinica che può aumentare la sensibilità delle piastrine all'agonista o anticorpo. Soprattutto, le piastrine purificate sono in stato di riposo, ma possono essere attivate in presenza di un agonista, come la trombina. Abbiamo scoperto che l'attività della trombina varia da una fonte all'altra. Pertanto, la concentrazione di trombina deve essere ottimizzata empiricamente per ottenere una buona attivazione delle piastrine.
A causa di un piccolo volume di sangue di topo, è scomodo per purificare le piastrine perché le piastrine possono essere miscelate con RBC e WBC durante l'aspirazione. Abbiamo risolto questo problema ottimizzando il rapporto tra campione di sangue e gradiente medio. Abbiamo scoperto che tre volte più gradiente medio rispetto al volume del sangue può chiaramente separare lo strato piastrinico dal siero e strati di RBC-WBC che facilita la raccolta facile di piastrine pure.
La purificazione piastrinica deve essere effettuata a temperatura ambiente tra 18 e 22 ° c per prevenirne la degradazione. È stato riferito che le piastrine si degradano se conservate in frigorifero o temperature superiori a 27 ° c11. Il pipettaggio rapido e l'agitazione vigorosa devono essere evitati per prevenire la degradazione piastrinica durante la purificazione. Poiché diverse centrifughe hanno programmi diversi, l'accelerazione/decelerazione deve essere determinata empiricamente per mantenere il gradiente.
Se si utilizzano diversi campioni di sangue di topo nella purificazione, il sanguinamento deve essere fatto in meno di 1 h e la purificazione deve essere completata entro 1 h. Se i campioni di sangue sono lasciati per più di 2 h, le piastrine non possono essere purificate a causa della loro degradazione. Se sono necessarie più piastrine per qualsiasi studio, il sangue del topo può essere raccolto da procedure terminali come la puntura cardiaca o sanguinamento della vena cava inferiore, che producono 800 a 1.000 μL di sangue, e la purificazione piastrinica deve essere effettuata in più tubi e combinati dopo la purificazione.
In conclusione, abbiamo descritto un protocollo semplice e rapido per la purificazione piastrinica da un piccolo volume di sangue del topo. Questo metodo può essere utilizzato anche per la purificazione piastrinica da altre specie pure. Le piastrine purificate possono essere utilizzate per l'espressione genica, l'attivazione e il rilascio del granulo, l'aggregazione e i saggi di adesione su stimolazione con vari agonisti.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di Start-up della Cincinnati Children ' s Research Foundation e da una sovvenzione traslazionale pilota dell'Università di Cincinnati a M.N. Vorremmo ringraziare il Cincinnati Children ' s Hospital Research Flow citometria core per i loro servizi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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