慢性沙门氏菌感染诱发肠纤维化

Summary

该协议描述了沙门氏菌驱动的肠道纤维化的小鼠模型，类似于克罗恩病的关键病理特征，包括跨体炎症和纤维化。该方法可用于评估使用维持在C57Bl/6遗传背景的突变小鼠改变纤维化结果的宿主因素。

Abstract

组织纤维化的特点是细胞外基质（如胶原蛋白）的病理积累是持续炎症和失调修复的结果。在炎症性肠病（IBD）中，纤维化导致复发性严格性形成，除了手术切除，没有其他有效的治疗方法。由于其发病较晚，驱动纤维化的过程较少研究，而且在很大程度上是未知的。因此，纤维化并发症是IBD的一大挑战。在本议定书中，描述了肠道纤维化的强健体内模型，其中对C57Bl/6小鼠进行链霉素预处理，然后口服带有疫苗级沙门氏菌的口角，即阿罗阿突变体导致持久性病原体殖民化和纤维化。准备S.解释用于接种、定量囊肿和脾脏中的病原体负荷以及评估肠道组织中胶原蛋白沉积的Typhimurium_AroA。这种实验性疾病模型可用于检查增强或加剧CD样肠道纤维化的宿主因素。

Introduction

溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是IBD的两种主要形式，并被定性为胃^肠道1、2的慢性和复发性炎症性疾病。这些疾病对患者的生活质量有重大影响。IBD的症状包括腹痛，腹泻，恶心，体重减轻，发烧和^疲劳3。最近的研究已经确定了导致疾病发病机制的遗传和环境因素;据认为，这些危险因素导致上皮屏障的中断，导致发光^抗原4的易位或过采样。因此，这启动一个异常的炎症反应，由肠道免疫^细胞4介导的共体菌群。IBD相关并发症的特征可能延伸到胃肠道以外的部位，影响各种器官，包括关节、皮肤和^{肝脏1，2。}UC的标记包括严重和弥漫性炎症，通常局部在^结肠1。疾病病理学影响肠道的粘膜和亚粘膜，导致表面粘膜溃^疡1。相反，CD可以影响胃肠道的任何部分，虽然疾病的证据常见于结肠和远端回^肠2。此外，CD中的炎症是跨体，影响肠壁的所有^层2。

已识别的几个IBD易感基因将表明上皮屏障或免疫调节失调是疾病^进展5的关键贡献者。发现单核细胞表达的核苷酸寡聚域2（NOD2）中的突变与CD易感性增加有关;这突出了细菌成分的先天免疫检测与^疾病6之间的联系。最近的全基因组关联研究（GWAS）揭示了其他可能参与IBD发病机制的通路，包括：STAT1、NKX2-3、IL2RA、IL23R依赖途径的遗传变异与适应性免疫、MUC1、MUC19和PTGER4在肠道屏障维护中，以及ATG16L介导自噬7，8，9。虽然这些基于人群的遗传学研究增强了我们对IBD的理解，但仅仅易感等位基因可能不足以引发和维持^{慢性疾病3。}其他非遗传因素，包括肠道微生物群的改变和多样性的减少都与肠道炎症有关。然而，目前还不清楚肠道消化不良是先于或是否是免疫反应不良^{的后果3。}虽然IBD的病因尚不明确，但^{通过10、11}的实验性小鼠模型，我们加强了对疾病发病机制的了解。这些模型单独并不完全代表人类疾病的复杂性，但它们对于阐明与IBD相关的病理生理学途径和验证试探性治疗^策略10具有^{价值。 11}.这种小鼠模型通常依赖于通过化学诱导或感染、免疫细胞转移或基因操作引发炎症。此外，这些策略往往涉及上皮完整性的扰动或先天或适应性免疫的调制。

肠沙门氏菌是肠道病原体，可以感染人类和小鼠。摄入后，沙门氏菌可以通过直接侵入上皮细胞、M细胞或抗原呈现^细胞12来殖民肠道。被S口头感染的老鼠。Typhimurium导致主要在系统位点的殖民化，如脾脏淋巴结，在GI^区12中丰度相对较低。然而，对使用链霉素的小鼠进行预处理，通过减少正常微生物^群13的宿主保护作用，提高了肠道沙门氏菌的殖民化效率。该模型的病理特征包括上皮屏障的中断或溃疡、粒细胞招募和严重水^肿13。或者，感染S级疫苗。Typhimurium _AroA 突变体导致慢性殖民化的 cecum 和结肠，持续到感染¹⁴后的第 40 天。S.Typhimurium_AroA菌株在芳香氨基酸的生物合成中存在缺陷;这使得突变菌株具有阿维性，并可用作高效^疫苗15。小鼠的口腔感染导致Th1-和Th17细胞因子相关的炎症反应、广泛的组织重塑和胶原蛋白沉积。组织病理学与亲纤维化因子（如TGF-β1、CTGF和IGF^14）的升高有关。该模型中报告的跨壁画纤维化疤痕让人联想到IBD中经常观察到的严格性形成。沙门氏菌引起的纤维化需要由沙门氏菌致病性岛屿（SPI）-1和2 ¹²编码的毒性。重要的是，这个S.Tymphimurium_AroA感染模型是研究在C57/Bl6背景下维持的突变小鼠纤维化反应的有用系统。C57/Bl6 应变对 S 极其敏感。由于基因编码自然抗药性相关巨噬平板蛋白（NRAMP）-1^16、17的功能丧失而感染。我们发现IL-17A和ROR®依赖性先天淋巴细胞是本^模型18中发病机制的重要贡献者。

CD的一个主要并发症是细胞外基质（ECM）的调节失调和过度沉积，包括胶原^{蛋白2，19。}虽然胃肠道具有相对较高的再生能力，纤维化疤痕可能会出现由于未解决的伤口愈合反应，与慢性和严重^{炎症20，21。}在CD中，这导致对组织结构的有害影响，导致严重的器官^{损伤21，22。}在CD中观察到的炎症的跨面性质最终先于肠壁的增厚与症状性狭窄或严格^形成21相关。约三分之一的CD患者需要肠道切除这种^{并发症22。}IBD没有有效的抗纤维化疗法，因为使用免疫抑制剂，如阿扎西普林或抗TNF®生物制剂没有影响，或只是适度减少手术干预的需求^19，23.虽然纤维化被认为是慢性炎症的结果，但中质细胞（如成纤维细胞和围细胞）被认为是纤维化疤^痕21、24中ECM的主要细胞来源。慢性S.Typhimurium _AroA 感染是肠道纤维化的一种强大的小鼠模型，可提供对 CD 样特征的发病机制的见解。

Protocol

所有动物协议都得到不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准。

1. 为小鼠口服腹腔培养沙门氏菌的制备[AroA培养物]

1. 从S的冷冻甘油库存。Typhimrium _AroA，使用含有100μg/mL链霉素的LB琼脂剂制备条纹板，具有无菌接种回路。在37°C下孵育过夜。条纹板可在 4°C 下存储长达一周。
2. 感染前一天，在2.5 mL水中溶解0.5克链霉素，制备抗生素。过滤灭菌链霉素溶液后，口服使用灯泡尖22G加韦奇针和1 mL注射器与100 μL链霉素溶液（20毫克链霉素/剂量）的小鼠。使用接种回路，在具有单个菌落的培养管中接种 3 mL 的 LB 汤（50 μg/mL 链霉素）。在37°C过夜，在200RPM下摇动，有氧孵育沙门氏菌。
3. 在感染当天，通过在无菌PBS中连续进行2次1/10隔夜沙门氏菌培养物稀释，准备最终感染剂量。这将导致 100 μL 接种，包含大约 3 x 10⁶ CFU。
4. 使用灯泡尖的22G加夫塔针和1mL注射器，用100μL的制备沙门氏菌对每只小鼠进行加盖。
   注：使用无菌技术制备沙门氏菌培养物。沙门氏菌的最终接种浓度可以通过用链霉素在LB琼脂上电镀连续稀释来验证。通过联系麦克纳格尼教授（kelly@brc.ubc.ca）可获得Typhimurium_AroA菌株。

2. 组织沙门氏菌负担的评估

1. 准备 2 mL 安全锁、圆底显微管，带 1 mL 无菌 PBS 和高压不锈钢珠。在组织收集之前对管子进行预称重。
2. 从通过二氧化碳暴露安乐死小鼠中分离cecal和splee组织。从单个动物的组织中收集组织。称量管以确定组织重量。
3. 使用混合器轧机设备在 30 Hz 下进行 15 分钟的均质化，在 96 口 2 mL 兆块中每口井传输 900 μL 的 PBS。将100μL的组织均匀化成第一口井，混合均匀，并通过向后续井中加入100μL进行连续稀释，直到^得到10-6的稀释。将每片稀释剂的板10μL分在含有100微克/mL链霉菌的LB琼脂上。
4. 计数平均CFU乘以100因子，因为1000μL样品的10μL被镀，并适当的稀释因子。将组织重量总 CFU 除以组织重量，以确定每克组织的 CFU。
   注：在组织处理过程中，将所有样品保存在冰上或4°C。使用组织均质进行连续稀释时，请使用宽孔移液器吸头。提前准备包含 PBS 的 96 井巨型块。

3. 皮罗西狼红染色和胶原蛋白定量。

1. 在10%缓冲形式素中一夜之间修复cecal组织，并准备石蜡嵌入。切割5μm部分为皮罗西狼红色染色如^前25所述。
2. 在明场显微镜上捕获整个切卡横截面的复合图像。
3. 打开斐济 （ImageJ），并将 .tif 图像文件拖放到工具栏上。
4. 在菜单栏上，选择"图像 > 类型 > RGB 堆栈"，将图像拆分为红色、绿色和蓝色通道。滑动面板底部的水平栏，将通道设置为绿色。
5. 打开图像 > 调整 > 阈值工具。调整最小和最大限制，以消除任何背景信号。设置所需阈值后，关闭阈值工具并转到"分析>设置测量值"。选中"区域"、"面积分数"、"阈值限制"和"显示标签"。
6. 使用"手绘"或"多边形选择"工具将组织部分栅极，并通过单击"分析 > 测量"来测量胶原蛋白的 % 区域正数。
7. 使胶原蛋白染色的绝对区域阳性正常化到组织区域。
   注：斐济（ImageJ）是一个开源程序，可以在https://fiji.sc下载。具有相同捕获条件（即亮度和对焦）的图像必须具有相同的阈值限制，以便进行精确定量。如果所选组织内有任何背景染色，测量绝对面积，并从整个组织胶原蛋白的面积中减去。

Representative Results

链霉素治疗后，口服感染S.Typhimurium _AroA 导致强健的肠道炎症和纤维化，特别是在 cecum 中（图 1）。典型的病原体负担为每1克1克1至10⁹ CFU，每1克脾脏可获10⁴ CFU，可从受感染动物中恢复（图2）。在皮罗西里乌斯红染色剖腹产的纤维化评估表明，感染后21天出现纤维化，而大部分病理在第42 pi（图3和图4）下得到解决。胶原蛋白沉积在肠子粘囊中最为明显，而粘部纤维化较温和。

图 1.用于方法学、沙门氏菌负担评估和细胞因子定量的剖腹产图。
表示 cecal 尖端的片段 1 可用于基因表达分析，而段 2 将固定在 10% 缓冲形式中，用于用于成体学，第 3 段将同质化以进行细菌枚举。

图 2.切卡和脾脏的病原体负担。
沙门氏菌感染过程中组织每重量的CFU。这个数字已由Lo^等人26日修改。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3.皮罗西狼红斑的肠道组织横截面。
在S之后21天和42天，来自未受感染动物和动物的ceca的明亮现场图像。Typhimiumrium _AroA 感染。刻度条，200 μm。这个数字已由Lo^等人26日修改。

图 4.通过形态分析对胶原蛋白沉积进行定量化。
（A） PSR® 染色归化为组织区域。重要性由单向ANOVA克鲁斯卡尔-瓦利斯测试与邓恩斯后测试确定。*， P < 0.01， N.S.， P > 0.05.这个数字已由Lo^等人26日修改。（B） 使用斐济在头细胞组织中胶原蛋白定量的例子。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

我们对IBD发病机制的理解已经大大增强了小鼠的肠道炎症模型。虽然这些个体模型并不概括复杂和多因素人类疾病的所有特征，但它们有助于确定疾病进展的关键特征。与IBD相关的纤维化严格仍然是一个主要未满足的临床需要，因为目前的治疗在逆转疾病发展方面是无效的。此外，由于目前动物模型的限制，肠纤维化在实验室环境中很难研究。BALB/c小鼠长期接触TNBS已被证明诱导由IL-13和TGF-B1^{信号27、28}驱动的结肠中强健的胶原蛋白沉积。然而，肠道纤维化不常见于其他常用的实验室实验室模型，如DSS治疗，IL-10缺陷，或采用T细胞转移模型。Grassl等人证明，C57Bl6慢性胃肠道感染与衰减的βAroA突变沙门氏菌株导致粘膜^和12的粘膜和亚粘膜区域发生强纤维化。他们报告说，峰纤维化发生在感染后三周，并与Th1和Th17免疫和升高的亲纤维化因子TGF-B1，CTGF和IGF-112相关。这种病理学让人想起CD，因为严重的炎症和纤维化是跨的。虽然IBD通常是渐进的，慢性沙门氏菌感染模式的一个重要限制是纤维化免疫病理学的瞬时性质。在C57Bl/6小鼠中，肠道疾病通常在感染后第6周解决。尽管存在这个缺点，这种感染模式的后期阶段可以用来确定参与促进疾病缓解的因素或^过程26。

虽然细菌病原体驱动的结肠炎模型研究得很好，但沙门氏菌和CD之间没有关联。然而，有人提出，在慢性沙门氏菌殖民化的后期阶段，纤维化疾病的严重程度与病原体负担没有直接关系，这表明一旦严重肠道，病理学是"自我传播"炎症是由^{沙门氏菌29}引起的。相比之下，粘附性大肠杆菌（AIEC）的病变与CD的发展密切相关，因为它^在30例患者的肠粘管中高流行。此外，包括C57Bl/6在内的几种小鼠菌株的回肠、囊素和结肠的持久性AIEC殖民化（长达9周）导致通过鞭环表达在肠道中产生强健的基质积累，从而证明这一种纤维生成诱导电位巴波约翁^{特31，32。}最近肠道纤维化感染驱动模型的发展为IBD提供了强大的实验模型。这些都提供了新的系统来剖析肠道细菌物种之间的关系，包括其毒性因素，以及宿主易感性因素，这些因子可能增强我们对IBD相关纤维化的理解。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM