Summary
यह प्रोटोकॉल फागोसिटोसिटोसोसिस के वीवो परख का वर्णन करता है जो युवा और वृद्ध ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर हीमोसाइट्स की फैगोसाइटोस बैक्टीरिया की क्षमता का आकलन और मात्रा निर्धारित करताहै।
Abstract
फागोसिटोसिस जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक आवश्यक कार्य है। यह प्रक्रिया फैगोसाइटिक हीमोसाइट्स द्वारा की जाती है जिसका प्राथमिक कार्य कणों की एक विस्तृत श्रृंखला को पहचानना और माइक्रोबियल रोगजनकों को नष्ट करना है। जीवों की उम्र के रूप में, इस प्रक्रिया में गिरावट शुरू हो जाती है, फिर भी अंतर्निहित तंत्र या इम्यूनोसेंसेंस के आनुवंशिक आधार के बारे में बहुत कम जानकारी है। यहां, वयस्क ड्रोसोफिला में हीमोसाइट्स में फैगोसाइटिक घटनाओं की मात्रा को निर्धारित करके, फागोसिटोसिस के विभिन्न पहलुओं में उम्र से संबंधित परिवर्तनों का आकलन करने के लिए वीवो फैगोसाइटोसिस परख में आधारित एक इंजेक्शन का उपयोग किया जाता है। ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर कई कारणों से जन्मजात प्रतिरक्षा समारोह में उम्र से संबंधित परिवर्तनों की जांच करने के लिए एक आदर्श मॉडल बन गया है। एक के लिए, कई आनुवंशिक घटकों और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्यों, phagocytosis सहित, विकासवादी ड्रोसोफिला और स्तनधारियों के बीच संरक्षित कर रहे हैं । इस वजह से, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से प्राप्त परिणाम विभिन्न जीवों में प्रतिरक्षा कार्य में आयु संबंधी परिवर्तनों को समझने के लिए व्यापक रूप से प्रासंगिक होने की संभावना है। इसके अतिरिक्त, हम ध्यान दें कि यह विधि हीमोसाइट फैगोसाइटिक क्षमता का मात्रात्मक अनुमान प्रदान करती है, जो विभिन्न प्रकार के शोध विषयों के लिए उपयोगी हो सकती है, और उम्र बढ़ने के अध्ययन तक सीमित होने की आवश्यकता नहीं है।
Introduction
जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली, जिसमें संक्रमण के साथ-साथ सेलुलर घटकों के लिए भौतिक और रासायनिक बाधाएं होती हैं, बहुकोशिकीय जीवों में संरक्षित विकासवादी है1,,2। रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली सभी जानवरों,1, 2, 3,2में रोगजनकों पर हमला करने का मुकाबला करने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातीहै। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के घटकों में कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल होती है जिन्हें इस आधार पर वर्गीकृत किया जाता है कि उनमें विशिष्टता और इम्यूनोलॉजिकल मेमोरी की कमी होती है2, 3,4.4 मनुष्यों में, इन कोशिका प्रकारों में फैगोसाइटिक मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, और साइटोटॉक्सिक प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं4,,5शामिल हैं। जबकि एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली होने मेजबान अस्तित्व के लिए जरूरी है, यह स्पष्ट है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्य उम्र के साथ गिरावट आती है, एक घटना इम्यूनोसेंसेंस5, 6,के रूप में जानाजाताहै । रोग प्रतिक्रिया में उम्र से संबंधित परिवर्तनों का आकलन करने में सक्षम होने के नाते, फागोसिटोसिस की प्रक्रिया के विभिन्न पहलुओं सहित, इम्यूनोसेंसेसेंसेंस की हमारी समझ में सहायता कर सकता है। हम यहां जिस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, वह ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर में हीमोसाइट्स द्वारा फैगोसाइटिक घटनाओं का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी और दोहराने योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता है।
ड्रोसोफिला कई कारणों से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। एक के लिए, आनुवंशिक उपकरणों का एक व्यापक सेट उपलब्ध है जो ऊतक-निर्भर तरीके से जीन अभिव्यक्ति में आसानी से हेरफेर करना संभव बनाता है7। इन उपकरणों में म्यूटेंट, आरएनए हस्तक्षेप स्टॉक्स, GAL4/UAS स्टॉक्स और ड्रोसोफिला जेनेटिक रेफरेंस पैनल का संग्रह शामिल है जिसमें 205 अलग-अलग इनब्रीड लाइनें हैं जिनके लिए पूरे जीनोम दृश्यों को8सूचीबद्ध किया गया है। ड्रोसोफिला का छोटा जीवन चक्र और उत्पादित व्यक्तियों की बड़ी संख्या शोधकर्ताओं को थोड़े समय में नियंत्रित वातावरण में कई व्यक्तियों का परीक्षण करने की अनुमति देती है। यह जीनोटाइप के बीच, लिंगों के बीच या उम्र भर में संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में सूक्ष्म अंतर की पहचान करने की क्षमता में बहुत सुधार करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि कई आनुवंशिक घटक और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्य, जिनमें फागोसिटोसिस शामिल है, ड्रोसोफिला और स्तनधारियों1, 2,के बीच विकासवादी रूप सेसंरक्षितहैं।
ड्रोसोफिला में, संक्रमण के बाद होने वाले फैगोसाइटोसिस की प्रक्रिया प्लाज्मोसाइट्स नामक फैगोसाइटिक हीमोसाइट्स द्वारा की जाती है, जो स्तनधारी मैक्रोफेज9के बराबर हैं। विभिन्न कणों को पहचानने और माइक्रोबियल रोगजनकों को साफ करने के लिए हेमोसाइट्स आवश्यक हैं9,10,11,12,,13. ये कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर्स व्यक्त करती हैं जिन्हें स्वयं को गैर- स्वयं से अलग करना चाहिए, और फागोसाइटिक प्रक्रिया,10 ,11, 12 ,13,,14,,15को पूरा करने के लिए आवश्यक संकेत घटनाओं की शुरुआत करनी चाहिए।1215 एक बार जब एक कण बाध्य हो जाता है, तो यह एक प्रकार का होता है, जो कण के चारों ओर विस्तार करने के लिए प्लाज्मा झिल्ली के एक्टिन साइटोस्केलेटन के पुनर्गठन और पुनः तैयार करके, एक फैगोसाइटिक कप11, 12,,13,,14,बनाने के लिए आंतरिक होजाताहै। इस प्रक्रिया के दौरान, संकेतों का एक अन्य सेट कोशिका को फागोसाइटिक कप को बंद करके कण को और आंतरिक बनाने के लिए कहता है, जिससे झिल्ली से बंधे फागोसोम11,12,,,13,14, 15,15होते हैं।, इसके बाद फागोसोम एक परिपक्वता प्रक्रिया से गुजरता है, जो विभिन्न प्रोटीनों से जोड़ता है और लाइसोसोम के साथ फ्यूजिंग करता है, जिससे अम्लीय फैगोलिसोम11,12,,,13,14, 15,15बनता है ।, इस बिंदु पर कणों को कुशलतापूर्वक नीचा दिखाया जा सकता है और 11 ,12,,13,14,15को समाप्त किया जासकताहै । ड्रोसोफिला अध्ययनों से पता चला है कि पुरानी मक्खियों (4 सप्ताह की उम्र) में छोटी मक्खियों (1-सप्ताह पुरानी) की तुलना में संक्रमण को साफ करने की क्षमता कम होती है, कम से कम भाग में, फागोसाइटोसिस16, 17,17के कुछ पहलुओं में गिरावट के कारण।
यहां वर्णित विधि दो अलग फ्लोरोसेंटी-लेबल वाली गर्मी-मारे गए ई. कोलाई कणों, एक मानक फ्लोरोफोर और एक जो पीएच संवेदनशील है, का उपयोग करता है, जो फागोसिटोसिस के दो अलग-अलग पहलुओं का आकलन करने के लिए है: कणों की प्रारंभिक चपेट, और फागोलिसोसोम में कणों का क्षरण। इस परख में, फ्लोरो-कण फ्लोरेसेंस तब नमूदार होता है जब कणों को हेमोसाइट्स से बांधा और घिरा होता है, जबकि पीएच संवेदनशील कण केवल फागोसोम की कम पीएच स्थितियों में फ्लोरोस करते हैं। फ्लोरोसेंट घटनाओं को तब हीमोसाइट्स में देखा जा सकता है जो पृष्ठीय पोत के साथ स्थानीयकरण करते हैं। हम पृष्ठीय पोत के लिए स्थानीय हीमोसाइट्स पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो हीमोसाइट्स का पता लगाने के लिए एक शारीरिक मील का पत्थर प्रदान करते हैं जो बैक्टीरियल क्लीयरेंस में योगदान करने के लिए जाना जाता है, और उन्हें लगातार अलग करने के लिए। हालांकि, शरीर के अन्य हिस्सों में हीमोसाइट्स और हीमोलिम्फ भी क्लीयरेंस के लिए महत्वपूर्ण हैं। यद्यपि हमने इस कोशिका आबादी का अध्ययन नहीं किया है, लेकिन हमारी सामान्य प्रक्रिया इन कोशिकाओं के फैगोसाइटिक परख के लिए भी लागू हो सकती है। हमारे दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि हम व्यक्तिगत हीमोसाइट्स के भीतर फैगोसाइटिक घटनाओं की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं, जिससे हमें फागोसाइटिक प्रक्रियाओं में सूक्ष्म भिन्नता का पता लगाने की अनुमति मिल सकती है। क्यूटिकल18, 19,19 के माध्यम से फ्लोरोसेंट घटनाओं की कल्पना करने वाले अन्य अध्ययनों में मौजूद हीमोसाइट्स की संख्या में अंतर नहीं है, जो हमारे मामले में विशेष रूप से विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि कुल हीमोसाइट गिनती17वर्ष की आयु के साथ बदलने की उम्मीद है।
Protocol
1. कलेक्ट और उम्र ड्रोसोफिला
- फागोसिटोसिस के परीक्षण के लिए समान वृद्ध F1 मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए, ताजा फ्लाई फूड युक्त शीशी में 5-10 कुंवारी मादाएं और उपयुक्त जीनोटाइप के 5 पुरुष जोड़ें। हम एक कॉर्नमील शीरा एगर आधारित भोजन 20 का उपयोग करते हैं, लेकिन मक्खियों को जिस प्रकार के आहार पर पाला जाता है,उसकी परवाहकिए बिना विधि काम करनी चाहिए। इस प्रयोग के लिए हमने हेमीज़ (वह)का उपयोग किया )GAL4; यूएएस-जीएफपी आनुवंशिक रूप से हीमोसाइट्स लेबल करने के लिए उड़ता है।
नोट: अधिक मक्खियों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन डी मेलनोगास्टर की कुछ लाइनें भीड़ होने पर अच्छी तरह से पेश नहीं हो सकती हैं, और भीड़-भाड़ का लार्वा विकास21 और फागोसिटोसिस पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है। - वांछित प्रायोगिक परिस्थितियों में मक्खियों को बनाए रखें। इस प्रयोग के लिए, वह-GAL4 बनाए रखें; यूएएस-जीएफपी 24 डिग्री सेल्सियस पर उड़ता है। वयस्क मक्खियों को एक सप्ताह के लिए दोस्त बनाने की अनुमति दें, और फिर वयस्कों को हटा दें। F1 मक्खियों तो प्रयोगात्मक उपयोग के लिए eclosion के बाद इन शीशियों से एकत्र किया जाएगा ।
- सप्ताह भर में कुंवारी मक्खियों को इकट्ठा करें, या जब तक मक्खियों की वांछित संख्या एकत्र नहीं की जाती है। कुंवारी की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, संभोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है। यदि F1 मक्खियों को कुंवारी के रूप में परीक्षण किया जाना है, तो eclosion के 8 घंटे के भीतर पुरुषों और महिलाओं को अलग करें और संभोग को रोकने के लिए अलग शीशियों में बनाए रखें। प्रति उम्र कम से कम 10 मक्खियों में फागोसिटोसिस के मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त मक्खियों को एकत्र करें।
- यदि मक्खियों को एक सप्ताह तक बूढ़ा करना है, तो प्रत्येक कण, या तो फ्लोरो-कणों या पीएच संवेदनशील कणों के लिए कम से कम 50 मक्खियों को प्रति उपचार स्थिति में इकट्ठा करें। यह प्रयोग के समय परख करने के लिए न्यूनतम 10 मक्खियों को सुनिश्चित करेगा।
- यदि उम्र बढ़ने से 3 सप्ताह से अधिक हो जाते हैं, तो कम से कम 100-150 मक्खियों को एकत्र करें, या प्रति उपचार स्थिति 50-75 मक्खियों को इकट्ठा करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि फागोसिटोसिस को मापने के लिए पर्याप्त मक्खियां उपलब्ध हैं। जब प्रयोगशाला में उम्र बढ़ने मक्खियों, हम आम तौर पर 12:12 एल: डी में 24 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा कीट पिंजरों का उपयोग करें स्थितियों, और हर दूसरे दिन भोजन बदल जाते हैं। यदि पिंजरों के बजाय शीशियों का उपयोग किया जा रहा है, तो शीशी में भोजन की स्थिति के आधार पर टिप हर 3-5 दिनों में नई शीशियों में उड़ता है। आवश्यक मक्खियों की संख्या इस बात पर निर्भर करेगी कि उम्र में कितनी देर से फगोसाइटोसिस का विश्लेषण किया जाएगा, और एक विशेष पर्यावरणीय स्थिति में उस जीनोटाइप की आयु-विशिष्ट जीवित रहने की दर।
- यदि युवा और वृद्ध मक्खियों का आकलन किया जाएगा, तो तदनुसार योजना बनाएं ताकि 1 सप्ताह की पुरानी और वृद्ध मक्खियों को उसी दिन इंजेक्शन दिया जाएगा । यह प्रयोगों के बीच कण एकाग्रता में भिन्नता को कम करेगा और यह सुनिश्चित करेगा कि फागोसिटिक माप पर उम्र का प्रभाव उस दिन के प्रभाव से चकित न हो जब परख की गई थी।
- एकत्र मक्खियों को 24 डिग्री सेल्सियस पर घर दें जब तक कि वे 5-7 दिन पुराने न हों, या मक्खियों को वांछित उम्र तक बनाए रखें।
2. फ्लोरोसेंटी लेबल वाले कण तैयार करें
- गर्मी से मारे गए ई. कोलाई फ्लोरो-कणों या पीएच संवेदनशील ई. कोलाई कणों को क्रमशः 20 मिलीग्राम/एमएल या 1 मिलीग्राम/एमएल की स्टॉक एकाग्रता के लिए पुनर्गठित करें । अन्य बैक्टीरिया उपयोग के लिए उपलब्ध हैं जो कुछ प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकते हैं, लेकिन उचित स्टॉक सांद्रता के लिए निर्माता के निर्देशों का उल्लेख करते हैं।
- फ्लोरो-कणों के लिए, 1x पीबीएस (पीएच 7.4) या पसंदीदा बफर के 990 माइक्रोन जोड़ें और 2 m m (20%) सोडियम एजाइड। भंवर मिश्रण करने के लिए।
नोट: सोडियम अज़ाइड एक परिरक्षक है जिसे छोड़ा जा सकता है; हालांकि, सोडियम एजाइड के बिना तैयार कण लंबे समय तक नहीं रहते हैं। फ्लोरो-कणों का उपयोग 24 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए और पीएच संवेदनशील कणों का उपयोग 7 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। - पीएच संवेदनशील कणों के लिए, 1x पीबीएस (पीएच 7.4) या पसंदीदा बफर के 1,980 माइक्रोन जोड़ें और 2 m m (20%) सोडियम एजाइड। भंवर मिश्रण करने के लिए।
- 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 20 माइक्रोल एलिकोट का मल्टीपल सिंगल-यूज करें। एक साल तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्लोरो-कणों की दुकान, और पीएच संवेदनशील कणों को 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर, प्रकाश से संरक्षित किया जाता है।
- फ्लोरो-कणों के लिए, 1x पीबीएस (पीएच 7.4) या पसंदीदा बफर के 990 माइक्रोन जोड़ें और 2 m m (20%) सोडियम एजाइड। भंवर मिश्रण करने के लिए।
- इंजेक्शन के दिन, उपयोग से पहले कणों से सोडियम एजाइड को हटा दें। ऐसा करने के लिए, कमरे के तापमान पर 15,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए कणों को अपकेंद्रित्र करें।
- 1x पीबीएस या पसंदीदा बफर के 50 माइक्रोन में पुनर्व्यवसस्ता द्वारा दो बार सुपरनैंट और वॉश कणों को हटा दें, और 15,000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
- दूसरे वॉश के बाद 1x पीबीएस या पसंदीदा बफर के 100 माइक्रोन में सुपरनैंट और रिसिपेंड कणों को हटा दें। समाधान को ट्यूब में रखें और पूरे प्रयोग में प्रकाश के संपर्क को कम करें। एक बार सोडियम एजाइड को हटा दिया जाता है, 24 घंटे के भीतर फ्लोरो-कणों का उपयोग करें, और 5-7 दिनों के भीतर उपयोग किए जाने वाले पीएच संवेदनशील कणों का उपयोग करें।
नोट: हमारे पिछले प्रयोगों में, हमने पाया कि कणों की इस एकाग्रता ने फागोसिटिक घटनाओं की गिनती की संख्या प्रदान की और हीमोसाइट्स द्वारा फैगोसाइटोसिस के लिए उपलब्ध कणों की संख्या17को सीमित नहीं कर रही थी। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ता अन्य सांद्रता का उपयोग करके परिणामों की तुलना करना चाहते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उनके प्रयोगों की स्थितियों में हीमोसाइट्स द्वारा फैगोसाइटोसिस के लिए पर्याप्त संख्या में कण उपलब्ध हैं।- यदि सोडियम azide छोड़ दिया गया था, कणों को पतला 1:5 एक ही बफर में कणों के साथ तैयार किए गए थे, इंजेक्शन के लिए ।
- कणों के लिए हरे रंग के भोजन के रंग की एक बूंद (~ 10 μL) जोड़ें। इससे यह सुनिश्चित करना आसान हो जाता है कि मक्खियों को इंजेक्शन दिया गया है।
3. मक्खियों को इंजेक्ट करें
- इंजेक्शन के लिए कांच की सुई तैयार करें।
- एक पिपेट खींचने वाला का उपयोग कर कांच की सुइयों को खींचें। पिपेट पुलर हीटर को 55 डिग्री सेल्सियस और सोनालिका को 45 तक सेट करें। इंजेक्टर के साथ प्रदान की गई केवल सुइयों का उपयोग करें, क्योंकि यह गारंटी नहीं है कि अन्य सुई एक ही परिशुद्धता के साथ काम करेंगे।
- खनिज तेल के साथ एक 1 एमएल बाँझ सिरिंज भरें, और नैनो इंजेक्टर के साथ प्रदान की 30 गेज हाइपोडर्मिक (जी) सुई देते हैं।
- बैकफिल खींचा कांच सुई के कुंद अंत में 30 जी सुई डालने और खनिज तेल के साथ भरने के द्वारा खींचा केशिका सुई । धीरे-धीरे 30 जी सुई को हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पूरे सुई में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं, क्योंकि यह गलत इंजेक्शन की मात्रा पैदा कर सकता है। सुई को बैकफिलिंग किए बिना इंजेक्टर ठीक से काम नहीं करेगा।
- संदंश का उपयोग करना, समाधान के इंजेक्शन की अनुमति देने के लिए एक खोलने बनाने के लिए सुई की नोक को तोड़ें।
- नैनो इंजेक्टर को असेंबल करें।
नोट: अन्य इंजेक्टर का उपयोग किया जा सकता है। नीचे वर्णित विधि नैनो इंजेक्टर पर लागू होता है। अन्य इंजेक्टरों के लिए, निर्देशों के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल से परामर्श करें।- इ इंजेक्टर को वांछित मात्रा (46 एनएल और 69 एनएल के बीच) में सेट करें।
- कोलेट निकालें और सीलिंग ओ-रिंग रखें, सुई के पीछे के अंत को प्राप्त करने के लिए सामना करने वाले इंडेंटेशन के साथ सफेद स्पेसर, और उस क्रम में धातु प्लंजर पर बड़ा ओ-रिंग। कोलेट को सख्त किए बिना फिर से संलग्न करें।
- तेल से भरे कांच की सुई के कुंद अंत में धातु प्लंजर डालें। धीरे-धीरे सुई को नीचे धकेलें, इसे बड़े ओ-रिंग में डालें। सुरक्षित होने तक कोलेट कस लें।
नोट: यदि धातु प्लंजर कोलेट पिछले विस्तार नहीं करता है, प्रेस और पकड़ ' खाली ' जब तक प्लंजर दिखाई दे रहा है । इससे यह सुनिश्चित करना आसान हो जाता है कि प्लंजर सुई में डाला जाता है। - इंजेक्टर बीप तक दबाएं और 'खाली' रखें। यह सुई से खनिज तेल के अधिकांश बाहर निकालता है, तेल की एक छोटी मात्रा को छोड़ने के लिए दो तरल पदार्थ के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करते हैं, साथ ही हवा के बुलबुले को हटा देता है ।
- तैयार कणों वाले माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कांच की सुई की नोक डालकर या तो फ्लोरो-कणों या पीएच संवेदनशील कणों से सुई भरें।
- इंजेक्टर बीप तक प्रेस और 'भरें' पकड़ो।
- इंजेक्शन
- एक खाली शीशी में इंजेक्ट किए जाने वाले मक्खियों को स्थानांतरित करें। बर्फ में शीशी रखकर मक्खियों को स्थिर करें। सीओ2 का उपयोग मक्खियों को स्थिर करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, ध्यान दें कि, पीएच संवेदनशील कणों का उपयोग करते समय, ऊंचा सीओ2 स्तर कृत्रिम रूप से उपयोग किए जा रहे किसी भी बफ़र्स को अम्लीय कर सकते हैं और पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को बढ़ा सकते हैं।
- छाती(चित्रा 1A)की स्टर्नोपलुरल प्लेट में मक्खियों को इंजेक्ट करते हैं। इंजेक्शन सफल है अगर हरे रंग की मक्खी में जा रहादेखा जाता है (चित्रा 1B)। यदि मक्खी हरी नहीं होती है, तो सुनिश्चित करें कि सुई भरा नहीं है।
नोट: वैकल्पिक रूप से, मक्खियों को पेट में इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन इंजेक्शन साइट को सभी प्रयोगों में सुसंगत रखें। - जगह एक नई भोजन शीशी में मक्खियों इंजेक्शन, समय है कि पहली और आखिरी मक्खी इंजेक्शन था टिप्पण । इंजेक्शन को पूरा करने में लगने वाले समय की मात्रा के कारण प्रयोगात्मक त्रुटि को कम करने के लिए, समय पर इंजेक्शन को पूरा करें। अभ्यास के साथ, मक्खियों के एक सेट को इंजेक्ट करने में 10 मिनट से अधिक समय नहीं लगना चाहिए। मक्खियों को भोजन में फंसने से रोकने के लिए, जब तक सभी मक्खियों बरामद नहीं हो जाते, तब तक शीशी को अपनी तरफ रखें।
- प्रयोगात्मक परिस्थितियों के आधार पर मक्खियों को 60-90 मिनट तक ठीक होने दें। यहां 60 मिनट की रिकवरी टाइम का इस्तेमाल किया गया। ध्यान दें कि यह वसूली समय सीमा हॉर्न एट अल अध्ययन17में प्रायोगिक परिस्थितियों में फैगोसाइटिक घटनाओं की गिनती के लिए इष्टतम थी। हालांकि, कुछ शर्तों के तहत, यह उपचार समूहों के बीच फैगोसाइटोसिस में सूक्ष्म मतभेदों का पता लगाने के लिए बहुत लंबा हो सकता है। यह समय पाठ्यक्रम प्रयोगों को पूरा करने के लिए उपयोगी हो सकता है जैसा कि पहले17 किया गया था ताकि वसूली का समय निर्धारित किया जा सके जो नियंत्रण और प्रयोगात्मक परिणामों के बीच अधिकतम अंतर प्रकट करेगा। जो भी वसूली समय चुना जाता है, सभी प्रयोगात्मक उपचारों में इस सुसंगत रखें।
- यदि एक ही दिन फ्लोरो-कणों और पीएच संवेदनशील कणों के साथ इंजेक्शन, प्रत्येक समाधान के लिए एक नई सुई का उपयोग करें । दोनों कणों के साथ व्यक्तिगत मक्खियों सुई नहीं है अगर वे दोनों फ्लोरोसे लाल, के बाद से परिणाम phagocytosis के दो पहलुओं के बीच अंतर नहीं होगा, कण बाध्यकारी/
4. पृष्ठीय पोत का विच्छेदन
- मक्खियों के 60-90 मिनट के लिए बरामद होने के बाद, सभी जीवित मक्खियों को एक खाली शीशी में स्थानांतरित करें और बर्फ पर स्थिर करें।
- एक समय में एक फ्लाई को सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन प्लेट पर स्थानांतरित करें।
नोट: विच्छेदन प्लेटें कम से कम 1 सप्ताह पहले उपयोग करने के लिए तैयार करें, अगर कमरे के तापमान पर इलाज। ऐसा करने के लिए, इलास्टोमर तैयार करें और इसे 33 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश में डालें, पकवान को आधे रास्ते में भर दें। हवा के बुलबुले को कम करने के लिए धीरे-धीरे एक सपाट सतह पर पकवान पर टैप करें। प्लेटों को कमरे के तापमान पर बैठने दें, अशान्त, कम से कम एक सप्ताह के लिए।- एक विच्छेदन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, फ्लाई वेंट्रल साइड को ऊपर उन्मुख करें।
- कीट पिन का उपयोग करके, छाती के माध्यम से एक पिन डालकर प्लेट पर फ्लाई पिन करें और दूसरा पिन पेट के सबसे पीछे के छोर के माध्यम से, जननांग(चित्रा 2A)के पास। नमूना लगाने से पहले पिनों को आधे में काटना उपयोगी हो सकता है ताकि विच्छेदन में बाधा न पड़े। विच्छेदन प्लेट प्रति 10 मक्खियों के साथ दोहराएं।
नोट: वैकल्पिक: प्लेट में उड़ने से पहले पंखों और पैरों को हटा दें। यह मीडिया जोड़े जाने पर फ्लाई के चारों ओर एक बुलबुला बनाने को रोकने में मदद करेगा। - एक बार जब सभी मक्खियों को प्लेट पर टिकी हो जाती है, तो स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके मक्खियों (~ 1 एमएल) को कवर करने के लिए पर्याप्त विच्छेदन मीडिया जोड़ें।
- संदंश या क्यूटिकल कैंची का उपयोग करके, सिर को हटा दें।
- क्यूटिकल कैंची का उपयोग करके, दो क्षैतिज चीरों को बनाएं: एक सीधे पेट में पीछे की पिन के ऊपर, और दूसरा पेट के सबसे पूर्वकाल के अंत में, जहां छाती और पेट मिलतेहैं (चित्रा 2बी, सी)। चित्र 2में, ओरिएंटेशन स्पष्ट करने के लिए सिर को बरकरार रखा गया था।
- एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाओ, दो क्षैतिज चीरों को जोड़ने (तीन कटौती पत्र मैं समान) । इससे पेट की गुहा(चित्रा 2डी)खुल जाएगी।
- संदंश का उपयोग करके, पृष्ठीय पोत से परहेज करते हुए आंतरिक अंगों और ऊतकों को हटा दें। यदि अविचलित, पारदर्शी पृष्ठीय पोत अक्सर पेट के पूर्वकाल के अंत के पास स्पंदन देखा जा सकता है। अतिरिक्त पिन का उपयोग क्यूटिकल(चित्रा 2ई, एफ)के नए कट सिरों को खोलने के लिए किया जा सकता है।
- क्यूटिकल कैंची का उपयोग करके, छाती को हटा दें। वैकल्पिक रूप से, छाती को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर विच्छेदित क्यूटिकल्स और पृष्ठीय पोत को बढ़ने से पहले हटाया जा सकता है।
- शेष मक्खियों के साथ दोहराएं। फागोसिटिक दर में संभावित विविधताओं को कम करने के लिए, समय पर मक्खियों को काटना। एक बार जब सभी मक्खियों को विच्छेदित कर लिया जाता है, तो प्लेट पर टिकी संलग्न पृष्ठीय पोत के साथ क्यूटिकल्स छोड़ दें। स्टेप 5 के सभी विच्छेदन प्लेट में किया जाएगा। यह चरणों के बीच क्यूटिकल को नुकसान पहुंचाने या गलती से त्यागने से रोकदेगा।
5. फिक्सेशन और धुंधला
- 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में संलग्न पृष्ठीय पोत के साथ विच्छेदित क्यूटिकल्स को ठीक करें।
- प्रत्येक चरण के लिए एक नए डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करना, विच्छेदन मीडिया को त्यागें, और 4% पीएफए के 1 मिलियन के साथ बदलें। निर्धारण और धुंधला भर में, विच्छेदन को जितना संभव हो उतना प्रकाश से संरक्षित रखें।
- 20 आरपीएम पर कमाल के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट । विच्छेदन को 20 मिनट से अधिक समय तक फिक्सेटिव में बैठने की अनुमति न दें, क्योंकि इससे ऊतक को नुकसान पहुंच सकता है।
- 1x पीबीएस + 0.1% ट्वीन (पीबीएसटी) में क्यूटिकल्स 2x धोएं।
- फिक्सेटिव निकालें और 1x PBST के 1 mL के साथ बदलें।
- कमाल के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धो लें।
- 1x दोहराएं।
नोट: विच्छेदित, निश्चित ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, 3 दिनों तक, प्रकाश से सुरक्षित, ताजा पीबीस्ट के साथ धोने को बदलकर पहले धोने के बाद। यदि एंटीबॉडी का उपयोग किया जाएगा तो निश्चित ऊतकों को स्टोर न करें। एंटीबॉडी का उपयोग सर्वोत्तम परिणामों के लिए ताजा ऊतक के साथ किया जाना चाहिए।
- वैकल्पिक: एंटीबॉडी धुंधला। एंटीबॉडी का उपयोग पृष्ठीय पोत को स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए(चित्रा 3)या हीमोसाइट विशिष्ट मार्कर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह सुनिश्चित कर सकता है कि केवल पृष्ठीय पोत के साथ कोशिकाओं की गणना की जाती है या हीमोसाइट्स की झिल्ली को चिह्नित किया जाता है।
- दूसरा वॉश निकालें, उचित कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट, कमाल के साथ।
- प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें, और कमाल के साथ 15 मिनट के लिए PBST के साथ दो बार धोएं।
- फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें। हम एक हरे-फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की सलाह देते हैं ताकि यह फ्लोरोसेंट कणों को अस्पष्ट न करे। कमाल के साथ, 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
- माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें, PBST के साथ प्रत्येक 15 मिनट के लिए दो बार धोएं।
- DAPI के साथ दाग।
- अंतिम धोने निकालें और PBST (1:1000) में पतला DAPI के 1 मिलील के साथ बदलें ।
- कमरे के तापमान पर कमाल के साथ 20 मिनट के लिए दाग ।
- DAPI निकालें, और 2x धोएं (दोहराने चरण 5.2)।
- ताजा 1x PBST के साथ अंतिम धोने की जगह ।
नोट: मक्खियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, 3 दिनों तक, प्रकाश से सुरक्षित, पहले धोने के बाद ताजा पीबीस्ट के साथ धोने की जगह ले सकते हैं।
6. माइक्रोस्कोप स्लाइड और इमेजिंग पर बढ़ते क्यूटिकल्स
- विच्छेदित क्यूटिकल तैयार करें।
- विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, अतिरिक्त क्यूटिकल को काट दें जो इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है।
- संदंश का उपयोग करके, संलग्न पृष्ठीय पोत के साथ क्यूटिकल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 70% ग्लिसरोल होता है। ग्लिसरोल में क्यूटिकल्स रखने से पीबीएएसटी को हटाने में मदद मिलेगी और इमेजिंग के दौरान एक स्पष्ट छवि के लिए अनुमति देता है।
- माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट क्यूटिकल्स।
- माइक्रोस्कोप स्लाइड में 70% ग्लिसरोल की कुछ बूंदें डालें।
- संदंश का उपयोग करके, ग्लिसरोल ट्यूब से क्यूटिकल्स निकालें और स्लाइड पर ग्लिसरोल में रखें।
- विच्छेदन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, पृष्ठीय पोत को सुनिश्चित करने के लिए, वेंट्रल साइड को उन्मुख करने के लिए संदंश का उपयोग करें। क्यूटिकल का गहरा वर्णक नीचे चेहरा होगा।
- यदि आवश्यक हो तो ग्लिसरोल की एक अतिरिक्त बूंद जोड़ें। यह हवा के बुलबुले को रोकने में मदद करता है और एक स्पष्ट छवि के लिए अनुमति देता है।
- धीरे-धीरे नाखूनों की पॉलिश के साथ क्यूटिकल्स और सील किनारों पर एक कवरलिप रखें। आगे बढ़ने से पहले 10-15 मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें। मक्खियों को तुरंत इमेज करें या 4 डिग्री सेल्सियस पर लाइटप्रूफ बॉक्स में स्टोर करें।
- पृष्ठीय पोत की छवि।
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, पृष्ठीय पोत के ऑप्टिकल खंडों को उत्पन्न करने के लिए संरचनात्मक हस्तक्षेप प्रणाली का उपयोग करें। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का वैकल्पिक रूप से उपयोग किया जा सकता है जो अतिरिक्त सटीकता प्रदान कर सकता है। 20x उद्देश्य और पसंदीदा इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पृष्ठीय पोत की जेड-स्टैक छवियां प्राप्त करें। एक 10 मिमी स्केल बार जोड़ें, और ठीक से लेबल और झगड़ा फ़ाइलों(चित्रा 4)या वांछित प्रारूप के रूप में छवियों को बचाने के लिए।
नोट: प्राप्त जेड-स्टैक छवियों की संख्या विच्छेदन के बीच भिन्न हो सकती है और इस बात पर निर्भर करती है कि पृष्ठीय पोत को कितनी अच्छी तरह से विच्छेदित किया गया था, और छवियों के बीच वांछित चरण आकार पर। यहां, चरण का आकार 0.49 मिमी तक सेट किया गया था। यह संख्या हमारे अनुभव में स्टैक प्रति 3 से 40 छवियों तक कहीं भी हो सकती है।
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, पृष्ठीय पोत के ऑप्टिकल खंडों को उत्पन्न करने के लिए संरचनात्मक हस्तक्षेप प्रणाली का उपयोग करें। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का वैकल्पिक रूप से उपयोग किया जा सकता है जो अतिरिक्त सटीकता प्रदान कर सकता है। 20x उद्देश्य और पसंदीदा इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पृष्ठीय पोत की जेड-स्टैक छवियां प्राप्त करें। एक 10 मिमी स्केल बार जोड़ें, और ठीक से लेबल और झगड़ा फ़ाइलों(चित्रा 4)या वांछित प्रारूप के रूप में छवियों को बचाने के लिए।
7. छवियों का विश्लेषण करें
- इमेजजे का उपयोग करके फ्लोरोसेंट घटनाओं की मात्रा निर्धारित करें।
- छवियों को खोलें और उन्हें ढेर करें: छवि à स्टैक à चित्र ढेर करने के लिएचित्र।
- प्रति फ्लाई कम से कम 10 कोशिकाओं से प्रत्येक घटना पर क्लिक करके एक DAPI-सकारात्मक नाभिक पर केंद्रित एक 10 मिमी व्यास के भीतर केवल ~ 1 मिमी आकार फ्लोरोसेंट संकेतों की गणना करें, कम से कम 10 मक्खियों प्रति उम्र प्रति कण प्रकार इंजेक्शन: प्लगइन्स à विश्लेषण à सेल काउंटर नोटिस (चित्रा 5A)। सेल काउंटर नोटिस टूल ट्रैक किए गए हर सेल को एक अलग रंग प्रदान करता है, जिसमें एक रंगीन बिंदु होता है जो उस कोशिका के भीतर क्लिक किए गए हर फ्लोरोसेंट इवेंट से मेल खाता है।
- प्रत्येक बिंदु से जुड़ी काउंटर और स्टैक स्थिति को सूचीबद्ध करने के लिए, 'एम' दबाएं या विश्लेषण टैब के तहत उपाय का चयन करें, या प्रत्येक सेल में गणना की गई घटनाओं की संख्या को परिणाम तालिका में प्रदर्शित करने के लिए, 'ऑल्ट +y'(चित्रा 5B) दबाएं।
- सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली स्प्रेडशीट में सेल की गिनती स्थानांतरित करें।
- सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
- या तो निश्चित प्रभाव ANOVA या मिश्रित मॉडल नेस्टेड ANOVA का उपयोग कर phagocytic घटनाओं में मतभेदों का विश्लेषण करें । मिश्रित मॉडल का उपयोग आयु और जीनोटाइप के मुख्य निश्चित प्रभावों और प्रत्येक जीनोटाइप17के भीतर नेस्टेड व्यक्तियों के यादृच्छिक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
नोट: जांचकर्ताओं को डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग की जाने वाली किसी भी सांख्यिकीय प्रक्रिया की मान्यताओं का परीक्षण करने में कठोर होना चाहिए।
- या तो निश्चित प्रभाव ANOVA या मिश्रित मॉडल नेस्टेड ANOVA का उपयोग कर phagocytic घटनाओं में मतभेदों का विश्लेषण करें । मिश्रित मॉडल का उपयोग आयु और जीनोटाइप के मुख्य निश्चित प्रभावों और प्रत्येक जीनोटाइप17के भीतर नेस्टेड व्यक्तियों के यादृच्छिक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
Representative Results
वर्णित इंजेक्शन विधियों को समझाने के लिए, चित्रा 1A ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर पर इंजेक्शन साइट दिखाता है, साथ ही साथ कैसे खाद्य डाई एक दृश्य पुष्टि के लिए अनुमति देता है कि फ्लाई इंजेक्शन(चित्रा 1B)था। खाद्य डाई के अलावा भी एक भरा सुई की मान्यता में एड्स। इंजेक्शन पेट में किया जा सकता है, लेकिन इंजेक्शन साइट प्रयोगों में संगत रखने के लिए। यह प्रत्येक प्रयोग के बीच संभावित विविधताओं को कम करने में मदद करेगा।
पृष्ठीय पोत के साथ निवासी हीमोसाइट्स के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कणों की कल्पना करने के लिए, हमने पृष्ठीय पोत को विच्छेदित किया और पेट की क्यूटिकल संलग्न की। चित्रा 2ए-एफ विच्छेदन विधियों को रेखांकित करता है।
फागोसिटोसिस करने के लिए युवा और वृद्ध मक्खियों की आयु-विशिष्ट क्षमता का आकलन करने के लिए, पृष्ठीय पोत के साथ हीमोसाइट्स को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की जाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पृष्ठीय पोत के साथ केवल कोशिकाओं की गणना की जाती है, कुछ रक्त कोशिका मार्कर या हृदय विशिष्ट कोलेजन, जैसे हेमीज और हेमोलेक्टिन, या पेरिकार्डिन(चित्रा 3)के लिए क्रमशः एंटीबॉडी या जीएफपी-टैग किए गए जीन का उपयोग22, 23,,,24किया जा सकता है।23 फ्लोरोसेंटली लेबल ई. कोलाई कणों की लंबाई में 1 मिमी हैं, जबकि हीमोसाइट्स व्यास 17 में10 मिमीहैं । केवल दापी-पॉजिटिव न्यूक्लियस पर केंद्रित 10 मिमी व्यास के भीतर स्थित उन फ्लोरोसेंट घटनाओं की गणना की जातीहै (चित्र 4)। फ्लोरोसेंट घटनाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग(चित्र 5)किया जाता है।
चित्रा 1: इंजेक्शन साइट और दृश्य सत्यापन। (क)छाती के पार्श्व पक्ष को खींचे गए केशिका सुई से छेदा जाता है । (ख)इंजेक्शन कण समाधान के लिए हरी खाद्य डाई जोड़कर नेत्रहीन सत्यापित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2: पृष्ठीय पोत विच्छेदन। (A)पिल्स को छाती और पीछे के पेट (काले तीर) में रखा जाता है। (बी-सी) पेट के पीछे के छोर(बी)और पूर्वकाल के अंत(सी)पर दो क्षैतिज चीरे (हरे तीर) बनाए जाते हैं। (घ)पेट के बीच में एक ऊर्ध्वाधर चीरा (हरा तीर) बनाया जाता है, जो दो क्षैतिज कटौती को जोड़ता है। (ई)वैकल्पिक पिन (*) का उपयोग आंतरिक ऊतकों को उजागर करते हुए पेट की गुहा को खोलने के लिए किया जाता है। (च)आंतरिक ऊतक (फसल, आंत, गर्भाशय, अंडाशय, वसा शरीर) को हटा दिया जाता है, जो पृष्ठीय पोत को उजागर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: पीएच संवेदनशील कणों के साथ इंजेक्शन वाली 5 सप्ताह की मादा से एक विच्छेदित पृष्ठीय पोत का वेंट्रल दृश्य, पेरिकार्डिन (ए)के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी से सनाहुआ। बिंदीदार सफेद रेखा पृष्ठीय पोत के पार्श्व पक्ष को रेखांकित करती है, जिसमें तीर पूर्वकाल क्षेत्र की ओर इशारा करता है। (ख)की बढ़ी हुई छवि(ए):हीमोसाइट्स (नीले तीर) के समूह जो पृष्ठीय पोत के पहले महाधमनी कक्ष के भीतर सक्रिय रूप से अपमानजनक बैक्टीरिया थे। (ग)की बढ़ी हुई छवि(ए)बाहेतीदार मैट्रिक्स (ईसीएम) कोलेजन जैसे प्रोटीन, पेरिकार्डिन (हरा तीर) को रेखांकित करती है, जो पृष्ठीय पोत को24जगह रखती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: एक मादा फ्लाई से विच्छेदित पृष्ठीय पोत और संबद्ध हेमोसाइट्स पीएच संवेदनशील कणों, या फ्लोरो-कणों के साथ इंजेक्शन देते हैं। (क)पृष्ठीय पोत और संबद्ध hemocytes के साथ घिरा पीएच संवेदनशील लेबल ई. कोलाई कणों (लाल), या(ई)फ्लोरो लेबल ई. कोलाई कणों (लाल), एक 1 सप्ताह पुरानी मक्खी से अलग, ६० मिनट के लिए ठीक होने के बाद (बी, एफ)के बढ़ाया इनसेट(ए)और(ई)(सफेद बॉक्स), क्रमशः, दो व्यक्तिगत hemocys दिखा। (ग)पृष्ठीय पोत और संबद्ध hemocytes के साथ घिरा हुआ पीएच संवेदनशील लेबल ई. कोलाई कणों (लाल), या (जी)फ्लोरो लेबल ई. कोलाई कणों (लाल), एक 5 सप्ताह पुरानी मक्खी से अलग, ६० मिनट के लिए ठीक होने के बाद ।(D, H)के बढ़ाया इनसेट(सी)और(जी)(सफेद बॉक्स), क्रमशः, दो व्यक्तिगत hemocys दिखा बिंदीदार सफेद रेखा पृष्ठीय पोत के पार्श्व पक्ष को रेखांकित करती है, जिसमें तीर पूर्वकाल क्षेत्र की ओर इशारा करता है। नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5: इमेजजे में सेल काउंटर का उपयोग करके 10 मिमी हीमोसाइट्स के भीतर फैगोसाइटिक घटनाओं की मात्रा निर्धारित करना। (क)इमेजजे में इमेज (एस) खोलने के बाद, सेल काउंटर नोटिस टूल का उपयोग प्रति सेल फैगोसाइटिक घटनाओं का ट्रैक रखने के लिए किया जा सकता है। (ख)यह उपकरण प्रत्येक कोशिका को गिना जाने के लिए चयनित एक अलग रंग प्रदान करेगा, जिसमें प्रत्येक बिंदु उस कोशिका के भीतर फ्लोरोसेंट घटना के अनुरूपहोगा। 'alt+y' दबाने से प्रति सेल गिने जाने वाले कार्यक्रमों की संख्या दिखाने वाली तालिका प्रदर्शित होगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल नियंत्रित प्रायोगिक परिस्थितियों में फागोसिटोसिस के विभिन्न पहलुओं की मात्रा निर्धारित करने का एक विश्वसनीय तरीका है। हम ध्यान दें कि हम केवल ग्राम नकारात्मक जीवाणु कणों के साथ इस प्रक्रिया का परीक्षण किया है और परिणाम अलग हो सकता है अगर ग्राम सकारात्मक जीवाणु कणों का उपयोग किया जाता है । दरअसल, विभिन्न प्रायोगिक परिस्थितियों में ग्राम नकारात्मक और ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया दोनों के लिए फैगोसाइटिक प्रतिक्रियाओं की तुलना करना दिलचस्प होगा। नैनो-इंजेक्टर का उपयोग इंजेक्शन की मात्रा पर सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक फ्लाई कणों की एक ही मात्रा के साथ इंजेक्ट की जाती है। प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा कण की तैयारी में विसंगतियों से आता है । कण एक बार जमे हुए एकत्र हो जाएंगे, इसलिए कमजोर पड़ने की मात्रा में छोटे बदलाव, या भंवर की कमी, प्रयोगों के बीच कण एकाग्रता को प्रभावित कर सकते हैं। उम्र के बीच कण सांद्रता में संभावित विविधताओं को कम करने के लिए, एक ही सुई और कण समाधान का उपयोग करके, एक ही दिन में 1-और 5 सप्ताह पुरानी मक्खियों को इंजेक्ट करना फायदेमंद है। एक और संभावित खामी यह है कि विच्छेदन के दौरान, पृष्ठीय पोत और/या क्यूटिकल आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है अगर पिन ठीक से संभाला नहीं कर रहे हैं । पृष्ठीय पोत को बाधित करने से बचने के लिए, प्रति विच्छेदन उपयोग किए जाने वाले पिनों की संख्या को कम करें। इस विच्छेदन विधि का लाभ यह है कि विच्छेदन प्लेट में सभी निर्धारण, धोने और धुंधला कदम किए जा सकते हैं। क्योंकि क्यूटिकल्स नीचे टिकी होती हैं, यह क्यूटिकल्स को चरणों के बीच खोने से रोकती है।
मौजूदा तरीकों की तुलना में18,,19,,25,,26,,27, 28,,,29,वर्णित प्रोटोकॉल के फायदे और सीमाएं हैं।28 पृष्ठीय पोत को विच्छेदन करके, हम इस स्थान पर व्यक्तिगत हीमोसाइट्स की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने में सक्षम हैं। इससे प्रायोगिक समूहों के बीच फैगोसाइटिक गतिविधि में सूक्ष्म विविधताओं का पता लगाना संभव हो जाता है। ,28,अन्य विधियां ब्लीड/स्क्रैप परख19 , 25 , 26 , 27 , या अक्षुण्ण वेंट्रल क्यूटिकल 18 ,,,19,2826,29के माध्यम से हेमोसाइट्स एकत्र करके फ्लोरोसेंटी लेबल वाले कणों की कल्पना करतीहैं।1919 हालांकि, पृष्ठीय क्यूटिकल के माध्यम से कल्पना किए जाने पर व्यक्तिगत हीमोसाइट्स का आकलन नहीं किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का लाभ, जब Bleed/परिमार्जन विधि की तुलना में यह है कि हमारी विधि हमें केवल उन पृष्ठीय पोत से जुड़े hemocytes का आकलन करने की अनुमति देता है, और कोशिकाओं या शरीर की दीवार है, जो कार्यात्मक रूप से अलग हो सकता है के साथ उन परिसंचारी के लिए खाते करता है । पृष्ठीय पोत को विच्छेदन करने से फ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ इंजेक्शन के दूसरे दौर को शामिल करने की आवश्यकता भी दूर हो जाता है, जैसे ट्राइपैन ब्लू19,,26। इसका कारण यह है कि किसी कोशिका से बंधे या घिरा हुआ कोई भी कण धोने के चरणों के दौरान बह जाएगा। इसके विपरीत, वैकल्पिक तरीकों को प्रदर्शन करना आसान हो सकता है क्योंकि उन्हें विच्छेदन की आवश्यकता नहीं होती है। पृष्ठीय पोत को विच्छेदन करते समय सीखना आसान है, यह कदम जटिलता का एक स्तर जोड़ता है जो कुछ प्रयोगात्मक डिजाइनों में व्यवहार्य नहीं हो सकता है।
यद्यपि वीवो फागोसिटोसिस परख में इसका वर्णित उपयोग विभिन्न उम्र के बीच फागोसाइटिक घटनाओं का आकलन और मात्रा बताना है, यह प्रोटोकॉल अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसका उपयोग जीनोटाइप, सेक्स या ऊतक प्रकार के बीच फागोसिटोसिस के विभिन्न पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। अधिकांश बहुकोशिकीय जानवरों के लिए फैगोसाइटोसिस केंद्रीय महत्व के होने के साथ, यह समझना कि उम्र के साथ इस प्रक्रिया में गिरावट कैसे आती है, उम्र बढ़ने की आबादी के लिए बेहतर चिकित्सीय उपचार का कारण बन सकती है। यह दृष्टिकोण रोग प्रतिक्रिया में उम्र से संबंधित परिवर्तनों के पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए दीर्घकालिक क्षमता प्रदान करता है, जिसमें फैगोसाइटोसिस पर विशेष ध्यान दिया जाता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को स्वास्थ्य R03 AG03 AG061484-02 और प्राकृतिक और गणितीय विज्ञान के UMBC कॉलेज बेक्टन डिकिंसन संकाय अनुसंधान कोष के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
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