Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Abstract

De gepresenteerde procedures beschrijven een gegeneraliseerde methodologie om Aedes aegypti-muggen te infecteren met het Zika-virus onder laboratoriumomstandigheden om de infectiesnelheid, gedissemineerde infectie en mogelijke overdracht van het virus in de betreffende muggenpopulatie te bepalen. Deze procedures worden op grote schaal gebruikt met verschillende wijzigingen in vectorcompetentie-evaluaties wereldwijd. Ze zijn belangrijk bij het bepalen van de potentiële rol die een bepaalde mug (d.w.z. soort, populatie, individu) kan spelen bij de overdracht van een bepaald middel.

Introduction

Vectorcompetentie wordt gedefinieerd als het vermogen op het niveau van soort, populatie en zelfs een individu van een bepaalde geleedpotige zoals een mug, teek of flebotomine zandvlieg, om een agens biologisch te verwerven en over te dragen met replicatie of ontwikkeling in de geleedpotige1,2. Met betrekking tot muggen en door geleedpotigen overgedragen virussen (d.w.z. arbovirussen), wordt het middel door een vrouwelijke mug uit een viremische gastheer geïmpregneerd. Na inname moet het virus productief een van een kleine populatie midgut-epitheelcellen infecteren3, waarbij verschillende fysiologische obstakels worden overwonnen, zoals proteolytische afbraak door spijsverteringsenzymen, de aanwezigheid van de microbiota (midgut-infectiebarrière of MIB) en de uitgescheiden peritrofische matrix. Infectie van het midgut-epitheel moet worden gevolgd door replicatie van het virus en uiteindelijk ontsnapping uit het midgut in de open bloedsomloop van de mug, of hemolymfe, wat het begin vertegenwoordigt van een gedissemineerde infectie die de midgut-ontsnappingsbarrière (MEB) overwint. Op dit punt kan het virus infecties van secundaire weefsels (bijv. Zenuwen, spieren en vetlichamen) vaststellen en zich blijven vermenigvuldigen, hoewel een dergelijke secundaire replicatie mogelijk niet strikt noodzakelijk is voor het virus om de acinaire cellen van de speekselklieren te infecteren (het overwinnen van de speekselklierinfectiebarrière). Uitgaan van de speekselklier acinar cellen in hun apicale holtes en vervolgens beweging in het speekselkanaal maakt inenting van het virus in volgende gastheren bij bijten mogelijk en voltooit de transmissiecyclus1,2,4,5,6,7.

Gezien dit goed gekarakteriseerde en over het algemeen geconserveerde mechanisme van verspreiding binnen een muggenvector, zijn laboratoriumvectorcompetentiebeoordelingen vaak methodologisch vergelijkbaar, hoewel er verschillen in protocollen bestaan1,2. Over het algemeen worden muggen na orale blootstelling aan het virus ontleed, zodat individuele weefsels zoals het midgut, benen, eierstokken of speekselklieren kunnen worden getest op virale infectie, gedissemineerde infectie, gedissemineerde infectie / potentiële transovariale overdracht en gedissemineerde infectie / potentiële overdrachtscompetentie, respectievelijk8. De loutere aanwezigheid van een virus in de speekselklieren is echter geen definitief bewijs van overdrachtsvermogen, gezien het bewijs van een speekselklier ontsnapping / uitgang barrière (SGEB) in sommige vector / virus combinaties1,2,4,5,7,9. De standaardmethode om overdrachtscompetentie aan te tonen blijft muggenoverdracht op een vatbaar dier10,11,12. Aangezien dit voor veel arbovirussen echter het gebruik van immuungecompromitteerde muizenmodellen13,14,15,16vereist, is deze methode vaak onbetaalbaar. Een veelgebruikt alternatief is het verzamelen van het muggenspeeksel, dat kan worden geanalyseerd door reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) of een infectieuze test om de aanwezigheid van respectievelijk het virale genoom of infectieuze deeltjes aan te tonen. Het is vermeldenswaard dat dergelijke in vitro speekselverzamelingsmethoden12 kunnen overschatten of17 de hoeveelheid virus die tijdens in vivo voeding wordt afgezet, kunnen onderschatten, wat aangeeft dat dergelijke gegevens met de nodige voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd. Niettemin is de in vitro-methode zeer waardevol wanneer geanalyseerd vanuit het perspectief van de loutere aanwezigheid van virus in het speeksel, wat wijst op transmissiepotentieel.

Er bestaan twee belangrijke benaderingen voor het bepalen van de rol van muggenvectoren bij uitbraken van arbovirale ziekten. De eerste methode omvat veldbewaking, waarbij muggen worden verzameld in het kader van actieve overdracht18,19,20,21,22,23,24. Aangezien de infectiepercentages echter doorgaans vrij laag zijn (bijv. de geschatte 0,061% infectiegraad van muggen in gebieden met actieve Zika-virus (ZIKV) circulatie in de Verenigde Staten21), kan de beschuldiging van potentiële vectorsoorten sterk worden beïnvloed door vangmethode25,26 en willekeurige kans (bijv. Bemonstering van één geïnfecteerd individu op 1.600 niet-geïnfecteerden)21 . Hiermee rekening houdend, kan een bepaald onderzoek mogelijk niet voldoende muggen verwerven in zowel ruwe aantallen als soortendiversiteit om muggen die betrokken zijn bij overdracht nauwkeurig te bemonsteren. Vectorcompetentieanalyses worden daarentegen uitgevoerd in een laboratoriumomgeving, waardoor strikte controle van parameters zoals orale dosis mogelijk is. Hoewel ze niet volledig in staat zijn om de ware complexiteit van muggeninfectie en overdrachtscapaciteit in een veldomgeving weer te geven, blijven deze laboratoriumbeoordelingen krachtige hulpmiddelen op het gebied van arbovirologie.

Op basis van verschillende vectorcompetentieanalyses met ZIKV in verschillende muggensoorten, populaties en methoden27,28,29,30,31,32,evenals een recent overzicht van vectorcompetentiebeoordelingen1,beschrijven we hier verschillende protocollen die verband houden met een typische vectorcompetentieworkflow. In deze experimenten werden drie Ae. aegypti-populaties uit Amerika (de stad Salvador, Brazilië; de Dominicaanse Republiek; en de lagere Rio Grande-vallei, TX, VS) blootgesteld aan een enkele stam van ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) bij 4, 5 of 6 log10 focusvormende eenheden (FFU) / ml-doses door middel van kunstmatige bloedmeel. Vervolgens werden ze geanalyseerd op bewijs van infectie, gedissemineerde infectie en transmissiecompetentie na verschillende tijden van extrinsieke incubatie (2, 4, 7, 10 en 14 dagen) door middel van dissectie en een op celcultuur gebaseerde infectieuze test. Hoewel de huidige workflow/protocollen zijn geoptimaliseerd voor ZIKV, zijn veel elementen direct vertaalbaar naar andere door muggen overgedragen arbovirussen in geleedpotige insluiting en bioveiligheidsniveaus 2 en 3 (ACL/BSL2 of ACL/BSL3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures die in deze protocollen werden uitgevoerd, werden uitgevoerd in volledige overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee en het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Texas Medical Branch in Galveston.

1. Versterk ZIKV in Vero-cellen

  1. Kweek Vero-cellen (CCL-81 of VeroE6) in Dulbecco's modificatie van Eagle's minimal essential medium (DMEM) aangevuld met 10% v/v warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% (v/v) penicilline-streptomycine (respectievelijk 100 E/ml en 100 μg/ml) in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2 tot tussen 80−90% confluïtentie in een 150 cm2 weefselkweekkolf.
  2. Verwijder in een bioveiligheidskast (BSC) het medium en gooi het weg in 10% bleekmiddel of een werkverdunning van dubbel quaternair ammonium(Tabel van materialen). Ent de monolaag onmiddellijk in met 1 ml virale bouillon, gericht op 0,1−1 infectieus viraal deeltje per cel. Roer de kolf onmiddellijk zodanig dat het entmateriaal in zijn geheel in contact komt met de monolaag.
  3. Vul het medium aan tot een volume van 5 ml met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine. Verplaats vervolgens de kolf in de bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 60 minuten.
  4. Haal de kolf uit de couveuse en breng deze in een BSC. Voeg extra medium toe aan een totaal volume van 15 ml met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine. Verplaats de kolf in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2.
  5. Onderzoek de kolf dagelijks onder fasecontrastmicroscopie op bewijs van cytopathische effecten (CPE). Ga verder met de virale oogst (stap 1.7) wanneer slechts ongeveer 40−50% van de cellen in de monolaag achterblijft, over het algemeen 3-5 dagen na de infectie, afhankelijk van de stam van ZIKV die wordt gebruikt.
  6. Aspiraleer het supernatant en plaats het in een conische injectieflacon van 50 ml. Verduidelijk het supernatant van cellulair puin door centrifugering (3.500 x g gedurende 20 minuten).
    OPMERKING: Als meerdere kolven identiek zijn geïnfecteerd, kunnen supernatanten uit meerdere kolven worden gecombineerd tot conische buizen van 50 ml.
  7. Verwijder het supernatant van de conische buis van 50 ml naar een verse buis en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Vul het supernatant aan met warmte-geïnactiveerde FBS tot een eindconcentratie van 30% (v/v). Voeg dit mengsel toe aan afzonderlijke schroefdopbuizen en vries tot gebruik in bij -80 °C.

2. Bereiding van kunstmatige bloedmeel

  1. Op de dag dat muggen moeten worden blootgesteld aan infectieus bloedmeel, schakelt u de stroombron(Tabel van materialen)in een insluitingsfaciliteit voor geleedpotigen zodanig in dat de voedingseenheden(Tabel met materialen)zijn voorverwarmd tegen de tijd dat de muggen worden voorbereid op blootstelling.
  2. Bereid kunstmatige bloedmeel met behulp van een van de hieronder beschreven methoden.
    1. Methode 1: Combineer vers geoogst (binnen een week) geciteerd of gehepariniseerd menselijk bloed dat commercieel 1:1 v/v is gekocht met virale bouillon (bereid zoals beschreven in rubriek 1).
      OPMERKING: Deze methode is afhankelijk van de afwezigheid van antilichamen tegen de virus/virusfamilie die in het bloed aanwezig zijn.
    2. Als de afwezigheid van antilichamen niet kan worden bevestigd of als bekend is dat de bloedbron eerder aan het flavivirus is blootgesteld, was en pak erytrocyten dan handmatig in.
      1. Voeg in een BSC 30 ml vol menselijk bloed toe aan een conische buis van 50 ml en vul tot 50 ml aan met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
      2. Centrifugeer bij 3.500 x g gedurende 20 minuten.
      3. Zuig het supernatant op door voorzichtig in een bakpan met 10% bleekmiddel of door verdunning van dubbel quaternair ammonium te gieten, waarbij u ervoor zorgt dat de erytrocytkorrel niet wordt weggegooid.
      4. Voeg 10 ml PBS toe en tik voorzichtig de bodem van de conische buis tegen de bodem van de BSC, zodat de erytrocytenkorrel opnieuw is samengesteld. Breng het volume van de suspensie op 50 ml met PBS. Meng door zachte inversie.
      5. Herhaal stap 2.2.2.1−2.2.2.4 in totaal 4−6x. Bevestig dat het supernatant helder of slechts lichtroze en niet langer ondoorzichtig is. Verwijder al het supernatant met een serologische pipet. Resuspend de erytrocytenkorrel in 1−2 ml PBS.
      6. Monteer het bloedmeel: 350 μL verpakte erytrocyten, 100 μL 10% sucrose, 200 μL warmte-geïnactiveerde FBS, 900 μM recombinant ATP en 2 ml op de juiste manier verdunde virusvoorraad met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine.
  3. Overlay een standaard reservoireenheid van 3 ml (tabel metmaterialen)met de huid van een niet-geïnfecteerde muis (andere opties zijn paraffinefilm, collageenmembranen of worstomhulsel).
  4. Plaats het afgedekte reservoir op witte papieren handdoeken. Voeg ~ 2 ml infectieus bloedmeel toe aan het reservoir 1 ml per keer. Inspecteer de handdoek onder de feeder op tekenen van lekkage. Als er lekken aanwezig zijn, haal dan het bloedmeel terug uit de feeders en gooi de deksels weg. Sluit de feeders af met pluggen. Bevestig nogmaals dat er geen lekken aanwezig zijn.

3. Backtitratie van bloedmeel/plaque-assay

  1. Gebruik het resterende volume van het bereide bloedmeel om een serie van 10x seriële verdunning uit te voeren (d.w.z. 6 verdunningen, variërend van verdund 10x tot 1.000.000x) met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine.
  2. Aliquot 100 μL van de verdunningen in de putten van 24 of 12 putplaten van de meest verdunde tot meest geconcentreerde.
  3. Incubeer gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2.
  4. Breng aan het einde van de incubatietijd van 1 uur de platen terug in de BSC en voeg 1 ml of 2 ml methylcellulose-overlay toe aan de 24 put- of 12 putplaten, dienovereenkomstig.
  5. Plaats de overlayplaten terug in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en incubeer gedurende 3−7 dagen (afhankelijk van de virusstam).
  6. Verwijder na incubatie de platen uit de couveuse en breng in de BSC. Gooi de methylcellulose-overlay weg in een bakpan met 10% bleekmiddel of dubbel quaternair ammoniumdesinfectiemiddel.
  7. Was elk putje 2x met PBS en gooi de was weg in een dienblad met 10% bleekmiddel of dubbel quaternair ammonium.
  8. Voeg ~1 ml methanol:aceton (1:1 v:v) toe en laat de cellen gedurende ten minste 30 minuten in de BSC bij kamertemperatuur (RT) op de plaat bevestigen. Methanol:aceton weggooien volgens het institutionele beleid inzake organisch afval.
  9. Visualiseer ZIKV met behulp van een van de twee methoden die hieronder worden beschreven.
    1. Na het verwijderen van methanol:aceton, onmiddellijk beitsen met een kristalviolette oplossing (0,25% w/v in 30% methanol) gedurende 5 min. Spoel 2x in leidingwater en laat drogen, visualiseer dan direct met het oog op bewijs van plaques of vernietiging van monolaag.
    2. U kunt ook een focusvormende test uitvoeren.
      1. Laat de platen aan de lucht drogen tot er geen organisch fixeermiddel overblijft.
        OPMERKING: Dit duurt ~ 2−3 uur buiten de BSC, maar kan worden versneld door luchtdroging in een BSC- of chemische zuurkast.
      2. Was elke put 3x gedurende 15 minuten elk in niet-steriel PBS (Mg2+ en Ca2+ vrij) op een orbitale plaat rocker. Verwijder PBS en voeg 1 ml blokkeringsoplossing (PBS + 3% FBS) toe aan elke put en rock gedurende 15 minuten bij RT.
      3. Voeg 100 μL per putje α-ZIKV of α-flavivirus primair antilichaam (bijv. flavivirusgroephybridoom D1-4G2-4-15 [4G2]) toe bij een verdunning van 1:2.000 in blokkerende oplossing. Incubeer met schommelen gedurende minimaal 4 uur (bij voorkeur 's nachts, niet langer dan 18 uur) bij RT.
      4. Verwijder het primaire antilichaam en was 3x gedurende 15 minuten elk met PBS (Mg2+ en Ca2+ vrij) op een orbitale plaat rocker.
      5. Voeg 100 μL per putje van het secundaire antilichaam (geit α muis HRP-gelabeld) verdund 1:2.000 toe in blokkeerbuffer. Incubeer met schommelen gedurende 1 uur bij RT.
      6. Was 3x gedurende 15 minuten elk met PBS (Mg2+ en Ca2+ vrij) op een orbitale plaat rocker.
      7. Aliquot 100 μL substraatontwikkelingsreagens (Tabel van Materialen) per put. Rockplaten bij RT gedurende 15 min.
      8. Stop de reactie bij het ontstaan van foci/plaques door het substraat te verwijderen en de platen 2x af te spoelen met leidingwater. Giet kraanwater af en laat de platen aan de lucht drogen voordat u ze kwantificeert.
      9. Tel virale foci om het aantal FFU in het gegeven monster te bepalen.

4. Toediening van bloedmeel

  1. Gebruik Ae. aegypti muggen 2−4 dagen na eclosie. Sorteer vrouwelijke muggen in kartonnen dozen van 0,5 L met afgeschermde deksels en beroof ze van suiker (over het algemeen 36−48 uur voorafgaand aan het besmettelijke bloedmeel). Geef ad libitum water via met water verzadigde wattenbollen.
  2. Verwijder de met water verzadigde wattenbollen op de ochtend dat de muggen worden blootgesteld aan het besmettelijke bloedmeel.
  3. Bevestig reservoirs met kunstmatig bloedmeel aan voedingskabels in een doorzichtig plastic handschoenenkastje.
  4. Plaats in het dashboardkastje een kartonnen doos van 0,5 L met een afgeschermd deksel, met daarin 50−100 uitgehongerde Ae. aegypti-muggen, onder de voedingseenheid die aan het reservoir is bevestigd.
    OPMERKING: Op de juiste manier uitgehongerde muggen zullen zich over het algemeen binnen 20 minuten voeden. Het voeren kan indien nodig worden verlengd om de steekproefomvang in langzamere populaties te vergroten, hoewel dit niet langer mag duren dan 60 minuten, omdat (ZIKV) virale titer na ~ 60 minuten in de feeder kan afnemen.
  5. Verwijder na voltooiing van het voeren het reservoir en dompel onder in vers gemaakt 10% bleekmiddel.
  6. Verdoving muggen koud door incubatie gedurende 30 s bij -20 °C of gedurende 5 minuten in een koelkast.
  7. Giet in het dashboardkastje de muggen in een petrischaaltje op ijs. Tel en sorteer de opgezwollen vrouwtjes van ongeengorganiseerde muggen. Gooi de ongeïnteresseerde muggen weg door onderdompeling in een conische buisbuis van 50 ml gevuld met 70% ethanol. Terwijl de muggen nog steeds verdoofd zijn, giet je ze terug in de kartonnen doos van 0,5 L en dek je ze snel af met het scherm en het deksel. Knip overtollig zeefgaas van de doos af en zet het gaas vast met tape.
  8. Voeg een watje verzadigd met steriel gefilterde 10% waterige sucrose toe aan het scherm van elke doos. Plaats alle muggendozen in een grote plastic secundaire container met een vochtige spons om de luchtvochtigheid te behouden.
  9. Plaats secundaire container met dozen muggen in een incubator met een temperatuur van 27 ± 1 °C (of, indien van toepassing om omstandigheden in het betreffende gebied te simuleren) met 80% ± 10% relatieve vochtigheid en een 16:8 licht:donker cyclus). Onderhoud de muggen met ad libitum toegang tot 10% sucrose totdat de experimenten zijn voltooid.

5. Monsterverwerving en -verwerking

  1. Op bepaalde dagen na het voeden, aspirateer een vooraf bepaald aantal muggen uit de juiste dozen met behulp van een mechanische aspirator in een dashboardkastje. Bedek de verzamelbuis met een katoenen ronde nadat het vereiste aantal muggen is verkregen.
  2. Verdoving muggen door incubatie gedurende 30 seconden bij -20 °C of gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  3. Giet in het dashboardkastje de muggen in een petrischaaltje op ijs. Verwijder met behulp van twee paar tangen alle zes de poten van elke mug en plaats deze in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis met ronde bodem van 2 ml met een gesteriliseerd roestvrijstalen kogellager (7/32 ") en 500 μl muggenopvangmedium (MCM) bestaande uit DMEM, 2% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 2,5 μg / ml amfotericine.
  4. Plaats de mug voorzichtig op een druppel minerale olie om hem in bedwang te houden, zorg ervoor dat er geen contact is tussen de olie en het hoofd en de proboscis van de mug.
  5. Plaats de muggenslurf in een pipetpunt van 10 μL gevuld met 10 μL warmte-geïnactiveerde FBS.
    OPMERKING: Als alternatief kan de pipet worden gevuld met sucrose, bloed of minerale olie. De olie maakt directe visualisatie van speekselbellen mogelijk via lichtmicroscopie.
  6. Laat de mug 30 min kwijlen. Werp de micropipettepunt met FBS + speeksel uit in een microcentrifugebuis met 100 μL MCM en plaats het karkas vervolgens in een afzonderlijke microcentrifugebuis met ronde bodem van 2 ml met een gesteriliseerd stalen kogellager en 500 μL MCM. Zorg ervoor dat de buizen die worden gebruikt voor de lichamen, benen en speeksel zijn gelabeld, zodat het duidelijk is dat alle drie de monsters afkomstig zijn van dezelfde mug.
  7. Terwijl de mug(s) kwijlen, voert u stappen 5,3−5,5 uit op de resterende muggen.
  8. Transporteer de buizen met de lichamen en poten naar een homogenisatie-apparaat voor het frezen van het weefsel dat zich in een BSC bevindt. Triturateer alle lichaams- en beenmonsters op 26 Hz gedurende 5 minuten om virale deeltjes vrij te maken in het supernatant. Reinig alle monsters door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten om cellulair afval te pelleteren.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen monsters worden ingevroren bij -80 °C of onmiddellijk worden getest.

6. Detectie van ZIKV door infectieuze assay

  1. Bereid in een BSC 24 putweefselkweekplaten voor met Vero-cellen (105 cellen per put) 24 uur voorafgaand aan het begin van de infectieuze test. Label elke put met de identiteit van een enkele mug / monster.
  2. Als de monsters bij -80 °C zijn ingevroren, laat dan ontdooien.
  3. Verwijder de media van de Vero-celplaten vóór inenting met monsters één plaat per keer.
  4. Voor monsters die lichamen of poten bevatten, moet u zorgvuldig 100 μL geklaard supernatant in elke put aliquoteren, waarbij u ervoor moet zorgen dat het muggencelafval van de pellet niet wordt verstoord.
    OPMERKING: Speekselmonsters kunnen 1:1 (v/v) worden verdund met MCM voorafgaand aan inenting op cellen om monsters te conserveren voor latere titratie, indien nodig.
  5. Verplaats de platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator en incubeer gedurende 1 uur.
  6. Breng de platen terug naar de BSC en voeg ~ 1 ml methylcellulose-overlay toe aan elke put. Plaats de overlayplaten terug in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en incubeer gedurende 3−7 dagen (virus-/stamafhankelijk).
  7. Voer fixatie en visualisatie uit zoals beschreven in stap 3.6−3.9.
  8. Met betrekking tot het scoren via een focusvormende test, kwantificeert u de positieve putten door onderzoek onder een lichtmicroscoop. Detectie van intracytoplasmatische kleuring van cellen in een put duidt op de aanwezigheid van virus. Monsters worden uitsluitend gescoord als focus-positief of -negatief.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Drie populaties van Ae. aegypti uit Noord- en Zuid-Amerika (Salvador, Brazilië; de Dominicaanse Republiek; en de Rio Grande Valley, TX, VS) werden blootgesteld aan een uitbraakstam van ZIKV uit Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexico, 2015) over een reeks bloedmeeltiters (4, 5 en 6 log10 FFU / ml) gepresenteerd in een gewassen menselijk erytrocytengebaseerd kunstmatig bloedmeel. Op dag 2, 4, 7, 10 en 14 na infectie werden subgroepen van muggen verwerkt om infectie, verspreiding en potentiële overdrachtssnelheden te bepalen.

Bij een bloedmeeltiter van 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1−7 werden Ae. aegypti uit Salvador, Brazilië geïnfecteerd met snelheden van 12,5% en 11,1% na respectievelijk 4 en 14 dagen extrinsieke incubatie, zonder bewijs van gedissemineerde infectie waargenomen in de geteste benen en geen virus gedetecteerd in het speeksel (figuur 1a). Het verhogen van de titer tot 5 log10 FFU / ml resulteerde in een marginale toename van de infectiviteit met percentages van respectievelijk 22,2%, 33,3% en 22,2% op dag 4, 10 en 14 na infectie. Vergelijkbaar met wat werd waargenomen in het cohort dat werd blootgesteld aan 4 log10 FFU / ml, werden op geen enkel moment gedissemineerde infecties of transmissiecompetentie waargenomen(figuur 1b). Bij de hoogste onderzochte titer (6 log10 FFU/ml) werden na 2 dagen incubatie geen infecties geïdentificeerd, maar infecties werden op alle andere tijdstippen waargenomen, met een piek van 88,9% na 10 dagen extrinsieke incubatie. ZIKV werd gedetecteerd in de benen van muggen die 10 en 14 dagen na de infectie werden onderzocht (respectievelijk 22,2% en 66,7%), wat aangeeft dat ZIKV zich in de hemocoel had verspreid, hoewel infectieuze ZIKV op deze tijdstippen in speeksel werd waargenomen (figuur 1c).

De Ae. aegypti-populatie uit de Dominicaanse Republiek bleek het meest vatbaar voor ZIKV-infectie en was transmissie competent na blootstelling aan alle geteste bloedmeeltiters. Een bepaald niveau van infectie werd op alle tijdstippen waargenomen bij alle drie de geteste doses, met het laagste percentage waargenomen 2 dagen na infectie bij 4 log10 FFU / ml (25%)(figuur 1d). Met bloedmeeltiters van 5 log10 en 6 log10 FFU / ml condities piekten de infectiepercentages op 100%, met 100% infectie waargenomen al 4 dagen na infectie in de populatie van muggen blootgesteld aan 6 log10 FFU / ml ZIKV (Figuur 1e,f). Muggen die alle drie de doses kregen, vertoonden verspreiding 7 dagen na de infectie, met een piek van 44,4%(4 log 10 FFU / ml, 14 dagen na infectie), 88,9% (5 log10 FFU / ml, 1 en 14 dagen na infectie) en 100% (6 log10 FFU / ml, 10 dagen na infectie). Transmissiecompetentie werd waargenomen na alle drie de doses (respectievelijk 11,1%, 22,2% en 22,2% bij respectievelijk 4, 5 en 6 log10 FFU / ml), maar alleen na een extrinsieke incubatietijd van 14 dagen (EIP) (figuur 1d−f).

De Ae. aegypti-populatie uit de Rio Grande-vallei, TX, bleek relatief ongevoelig voor infectie met ZIKV. Muggen blootgesteld aan bloedmeeltiters van 4 log10 FFU / ml, werden al 4 dagen na de infectie geïnfecteerd, met infectiepercentages tussen 22,2% en 44,4%. Bij deze blootstellingscondities werden gedissemineerde infecties waargenomen 14 dagen na de infectie met een snelheid van 11,1% en werd er geen transmissiecompetentie waargenomen(figuur 1g). Een vertienvoudiging van de bloedmeeltiter leverde een grotendeels vergelijkbaar resultaat op, waarbij infecties werden waargenomen vanaf 4 dagen na blootstelling (33,3% en 44,4%), terwijl gedissemineerde infecties werden gevonden na 14 dagen extrinsieke incubatie met een snelheid van 22,2%(figuur 1 uur). Ten slotte werd in het cohort dat werd blootgesteld aan een 6 log10 FFU / ml bloedmeel, infectie waargenomen vanaf het 2-daagse tijdstip na de infectie (22,2%) en bereikte pieken op 4, 10 en 14 dagen na infectie (66,7%). Gedissemineerde infecties in deze aandoening begonnen te worden waargenomen op 7 dagen na de infectie (11,1%) en piekten op 44,4% 14 dagen na de infectie. Slechts een enkele mug (11,1%) bleek 10 dagen na de infectie overdrachtsvermogen te hebben(figuur 1i).

Figure 1
Figuur 1: Representatieve vectorcompetentiegegevens van verschillende Ae. aegypti populaties voor ZIKV Mex 1−7. (a−c) Vectorcompetentie van Ae. aegypti uit Salvador, Brazilië (F2). (d−f) Vectorcompetentie van Ae. aegypti uit de Dominicaanse Republiek (F6). (g−i) Vectorcompetentie van Ae. aegypti uit de Rio Grande-vallei, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti blootgesteld aan 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti blootgesteld aan 5 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti blootgesteld aan 6 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. Op elk tijdstip (2, 4, 7, 10 en 14 dagen na de infectie) werd een subset van muggen verzameld en bemonsterd. Infectie-, verspreidings- en transmissiesnelheden worden gepresenteerd als het aantal positieve karkas- / been - / speekselmonsters over het aantal muggen dat op dat moment is getest. Infectie weergegeven in blauw, gedissemineerde infecties weergegeven in groen en transmissiesnelheid weergegeven in rood. Gegevens in deze figuur zijn gewijzigd van Roundy en Azar et al.32. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methoden bieden een gegeneraliseerde workflow om vectorcompetentieanalyses uit te voeren. Als algemeen kader worden veel van deze methodologieën in de literatuur bewaard. Er is echter aanzienlijke ruimte voor wijzigingen (besproken in Azar en Weaver1). Van virussen (bijv. virale afstamming, opslag van challenge-virus, virale passagegeschiedenis), entomologie (bijv. laboratoriumkolonisatie van muggenpopulaties, aangeboren immuniteit, het muggenmicrobioom / viroom) en experimentele variabelen (bijv. Bloedmeelsamenstelling, sequentiële bloedtoevoer en incubatietemperatuur) zijn allemaal bekend om de vectorcompetentie te beïnvloeden. Methodologische variabiliteit in competentiestudies is problematisch gebleken in de context van de ZIKV-uitbraak omdat het formele meta-analyses1,33heeft uitgesloten.

Binnen deze algemene methodologie kan het belang van de juiste uithongering van muggen en bloedmeelmake-up niet worden overschat. Van uitdroging is bekend dat het het bloedvoedingsgedrag van muggen in laboratoriumparadigma'sstimuleert 34, wat de waarde van suiker en watergebrek onderstreept voordat een infectieus bloedmeel wordt aangeboden. Hoewel ontbering van suiker gedurende 36-48 uur en water gedurende 2-4 uur voorafgaand aan blootstelling aan het bloedmeel goed wordt verdragen door Ae. aegypti,is het vermeldenswaard dat deze muggen notoir gemakkelijk zijn om mee te werken in laboratoriumomstandigheden2. Dergelijke agressieve regimes van uithongering worden misschien lang niet zo goed verdragen door andere muggensoorten, waardoor een zekere mate van interne optimalisatie nodig is. Evenzo kan de bloedmeelinhoud worden geïnformeerd door de voorkeur van de gastheer. Het gebruik van menselijk bloed om een bloedmeel te bereiden voor antropofiele muggen zoals Ae. aegypti is bijvoorbeeld volkomen geschikt, maar menselijke bloedmeel gemaakt voor ornithofiele soorten zoals Culex quinquefasciatus kan minder effectief zijn35. Bovendien is het gebruik van relatief verse bloedproducten met betrekking tot bloedmeelassemblage zeer aan te raden om hemolyse van erytrocyten te minimaliseren.

Een van de grootste beperkingen van vectorcompetentiebeoordeling als geheel en de hierin beschreven procedures is dat deze studies grotendeels beperkt zijn tot het onderzoeken van virussen met behulp van muggen die in laboratoriumomstandigheden kunnen worden onderhouden. Ae. aegypti, hoewel een zeer relevante vector voor een groot aantal pathogenen van klinisch belang, is toevallig ook een van de gemakkelijkste muggen om op te voeden en te onderhouden in laboratoriumkolonies1,31,36,37. Het is niet verwonderlijk dat de competentie van Ae. aegypti-populaties daarom vaak het best wordt gekenmerkt door gewone vectormuggen2. Dit is met name problematisch in de context van arbovirussen die zowel enzoötische als stedelijke transmissiecycli38,39,40in stand houden, omdat vectorcompetentie over het algemeen alleen wordt uitgevoerd in de context van de meer handelbare stedelijke muggen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We erkennen het personeel van het World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton en Divya Mirchandani, voor hun onvermoeibare werk bij het samenstellen en leveren van veel van de virale stammen die worden gebruikt voor de vectorcompetentie-experimenten van ons en andere groepen. Het gepresenteerde werk werd gefinancierd door het McLaughlin Fellowship Fund (SRA) en NIH-subsidies AI120942 en AI121452.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Immunologie en Infectie Nummer 159 mug vector competentie Aedes Aedes aegypti arbovirus Zika
Vectorcompetentieanalyses op <em>Aedes aegypti-muggen</em> met behulp van het Zika-virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector… More

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter