Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vector Kompetanse Analyser på Aedes aegypti Mygg ved hjelp av Zika Virus

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

Den presenterte protokollen kan bestemme vektorkompetansen til Aedes aegypti myggpopulasjoner for et gitt virus, for eksempel Zika, i en inneslutningsinnstilling.

Abstract

Prosedyrene som presenteres beskriver en generalisert metodikk for å infisere Aedes aegypti mygg med Zika virus under laboratorieforhold for å bestemme infeksjonshastigheten, spre infeksjon og potensiell overføring av viruset i den aktuelle myggpopulasjonen. Disse prosedyrene er mye brukt med ulike modifikasjoner i vektorkompetanse evalueringer globalt. De er viktige for å bestemme den potensielle rollen som en gitt mygg (dvs. arter, befolkning, individ) kan spille i overføringen av et gitt middel.

Introduction

Vektorkompetanse er definert som evnen på nivået av arter, befolkning og til og med et individ, av en gitt leddyr som mygg, kryss eller phlebotomine sandflue, for å skaffe og overføre et middel biologisk med replikasjon eller utvikling i leddyr1,2. Med hensyn til mygg og leddyrbårne virus (dvs. arbovirus), er agenten imbibed fra en viremic vert av en kvinnelig mygg. Etter inntak må viruset produktivt infisere en av en liten populasjon av midgut epitelceller3, overvinne ulike fysiologiske hindringer som proteolytisk nedbrytning av fordøyelsesenzymer, tilstedeværelsen av mikrobiota (midgutinfeksjonsbarriere eller MIB), og den utskilte peritrofiske matrisen. Infeksjon av midgut epitelet må etterfølges av replikering av viruset og eventuell flukt fra midgut inn i myggens åpne sirkulasjonssystem, eller hemolymf, som representerer utbruddet av en spredt infeksjon som overvinne midgut escape barriere (MEB). På dette tidspunktet kan viruset etablere infeksjoner av sekundært vev (f.eks. nerver, muskler og fettlegemer) og fortsette å replikere, selv om slik sekundærreplikasjon kanskje ikke er strengt nødvendig for viruset å infisere acinarcellene i spyttkjertlene (overvinne spyttkjertelinfeksjonsbarrieren). Egress fra spyttkjertelen acinar celler inn i deres apikale hulrom og deretter bevegelse inn i spyttkanalen muliggjør inokulering av viruset i etterfølgende verter på biting, og fullfører overføringssyklusen1,2,4,5,6,7.

Gitt denne godt karakteriserte og generelt bevarte spredningsmekanismen i en myggvektor, er laboratorievektorkompetansevurderinger ofte metodisk like, selv om forskjeller i protokoller eksisterer1,2. Generelt, etter oral viruseksponering, blir mygg spredd slik at individuelle vev som midgut, ben, eggstokker eller spyttkjertler kan analysees for virusinfeksjon, spredt infeksjon, spredt infeksjon / potensiell transovarial overføring, og spredt infeksjon / potensiell overføringskompetanse, henholdsvis8. Bare tilstedeværelsen av et virus i spyttkjertlene er imidlertid ikke definitive bevis på overføringsevne, gitt bevis på en spyttkjertelflukt / utgående barriere (SGEB) i noen vektor / viruskombinasjoner1,2,4,5,7,9. Standardmetoden for å bevise overføringskompetanse forblir myggoverføring til et mottakelig dyr10,11,12. Men gitt at for mange arbovirus krever dette bruk av immunkompromitterte murinmodeller13,14,15,16, denne metoden er ofte kostnadsforbudende. Et vanlig brukt alternativ er samlingen av myggspytt, som kan analyseres ved omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) eller en smittsom analyse for å demonstrere tilstedeværelsen av henholdsvis viral genom eller smittsomme partikler. Det er verdt å merke seg at slike in vitro spytt innsamlingsmetoder kan overvurdere12 eller undervurdere17 mengden virus deponert under in vivo fôring, noe som indikerer at slike data må tolkes med forsiktighet. Likevel er in vitro-metoden svært verdifull når den analyseres fra perspektivet av bare tilstedeværelse av virus i spytt, noe som indikerer overføringspotensial.

To store tilnærminger eksisterer for å bestemme rollen som myggvektorer i arbovirale sykdomsutbrudd. Den første metoden innebærer feltovervåking, der mygg samles inn i sammenheng med aktiv overføring18,19,20,21,22,23,24. Men gitt at infeksjonsratene vanligvis er ganske lave (f.eks. den estimerte infeksjonsraten på 0,061% av mygg i områder med aktiv Zika-virus (ZIKV) sirkulasjon i USA21), kan inkriminering av potensielle vektorarter være sterkt partisk ved å fangemetodikk 25,26 og tilfeldig sjanse (f.eks. prøvetaking av et infisert individ av 1600 uinfiserte) . Med tanke på dette kan en gitt studie ikke skaffe tilstrekkelig mygg i både råtall eller artsmangfold for å nøyaktig prøve mygg involvert i overføring. Vektorkompetanseanalyser gjennomføres derimot i et laboratorium, noe som gir streng kontroll over parametere som oral dose. Selv om de ikke er fullt ut i stand til å representere den sanne kompleksiteten av mygginfeksjon og overføringsevne i et feltmiljø, forblir disse laboratorievurderingene kraftige verktøy innen arbovirologi.

Basert på ulike vektorkompetanseanalyser med ZIKV i flere myggarter, populasjoner og metoder27,28,29,30,31,32, samt en nylig gjennomgang av vektorkompetansevurderinger1, beskriver vi her flere av protokollene knyttet til en typisk vektorkompetansearbeidsflyt. I disse eksperimentene, tre Ae. aegypti befolkninger fra Amerika (byen Salvador, Brasil; Den dominikanske republikk; og den nedre Rio Grande Valley, TX, USA) ble utsatt for en enkelt stamme av ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) ved 4, 5 eller 6 logg10 fokusdannende enheter (FFU) / ml doser ved hjelp av kunstige blodmel. Deretter ble de analysert for bevis på infeksjon, formidlet infeksjon og overføringskompetanse etter ulike tider med ekstrinsisk inkubasjon (2, 4, 7, 10 og 14 dager) ved hjelp av formidling og en cellekulturbasert smittsom analyse. Selv om den nåværende arbeidsflyten / protokollene er optimalisert for ZIKV, er mange elementer direkte oversettbare til andre myggbårne arbovirus i leddyrblokkering og biosikkerhetsnivå 2 og 3 (ACL / BSL2 eller ACL / BSL3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer utført i disse protokollene ble utført i full overensstemmelse med protokoller godkjent av Institutional Biosafety Committee og Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Medical Branch ved Galveston.

1. Amplify ZIKV i Vero celler

  1. Vokse Vero celler (CCL-81 eller VeroE6) i Dulbecco modifikasjon av Eagle minimal essensielle medium (DMEM) supplert med 10% v / v varme-inaktivert foster bovine serum (FBS), og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (100 U / ml og 100 μg / ml, henholdsvis) i en fuktet 37 °C inkubator med 5 % CO2 til mellom 80–90 % konfluens i en 150 cm2 vevskulturflaske.
  2. I et biosikkerhetsskap (BSC) fjerner du mediet og avhendes enten i 10 % blekemiddel eller en arbeidsfortynning av dobbelt kvartært ammonium (Materialliste). Inokuler straks monolayeren med 1 ml viral lager, med sikte på 0,1-1 smittsom viral partikkel per celle. Agitate kolben umiddelbart slik at inoculum kontakter monolayer i sin helhet.
  3. Fyll opp mediet til et volum på 5 ml ved hjelp av DMEM supplert med 2% v / v varmeinaktivert FBS, og 1% (v / v) penicillin-streptomycin. Flytt deretter kolben inn i den fuktede inkubatoren på 37 °C med 5 % CO2 i 60 minutter.
  4. Fjern kolben fra inkubatoren og ta den inn i en BSC. Legg til ekstra medium til et totalt volum på 15 ml ved hjelp av DMEM supplert med 2% v / v varmeinaktivert FBS, og 1% (v / v) penicillin-streptomycin. Flytt kolben inn i en fuktet 37 °C inkubator med 5 % CO2.
  5. Undersøk kolben daglig under fasekontrastmikroskopi for tegn på cytopatiske effekter (CPE). Fortsett til viral høsting (trinn 1,7) når bare ca. 40-50% av cellene forblir i monolayeren, vanligvis 3-5 dager postinfeksjon avhengig av belastningen av ZIKV som brukes.
  6. Aspirer supernatanten og legg i et 50 ml konisk hetteglass. Klargjør supernatanten for cellulært rusk ved sentrifugering (3500 x g i 20 minutter).
    MERK: Hvis flere kolber ble infisert identisk, kan supernatanter fra flere kolber kombineres til 50 ml koniske rør.
  7. Fjern supernatanten fra det koniske røret på 50 ml til et nytt, pass på at du ikke forstyrrer pelletsen. Suppler supernatanten med varmeinaktivert FBS til en endelig konsentrasjon på 30% (v / v). Aliquot denne blandingen i individuelle skruehettrør og frys ved -80 °C til bruk.

2. Fremstilling av kunstige blodmel

  1. På dagen mygg skal utsettes for smittsomme blodmel, slå på strømkilden (Materialbord) i et leddyroppsamlingsanlegg slik at fôringsenhetene (Materialbord) forvarmes når myggene er forberedt på eksponering.
  2. Forbered kunstige blodmel ved hjelp av en av metodene beskrevet nedenfor.
    1. Metode 1: Kombiner nyhøstet (innen en uke) sitert eller heparinisert humant blod kjøpt kommersielt 1:1 v/v med viral lager (utarbeidet som beskrevet i avsnitt 1).
      MERK: Denne metoden er avhengig av fravær av antistoffer mot at virus/virusfamilien er til stede i blodet.
    2. Hvis fravær av antistoffer ikke kan bekreftes eller blodkilden er kjent for å ha tidligere flaviviruseksponering, vask og pakk erytrocytter manuelt.
      1. I en BSC legger du til 30 ml hel menneskelig blod til et 50 ml konisk rør og topper opptil 50 ml med fosfatbufret saltvann (PBS).
      2. Sentrifuge ved 3500 x g i 20 min.
      3. Aspirer supernatanten enten ved å helle forsiktig i en brettpanne som inneholder enten 10% blekemiddel eller arbeidsfortynning av dobbelt kvartær ammonium, og pass på at du ikke kaster erytrocyttpellets.
      4. Tilsett 10 ml PBS og trykk forsiktig på bunnen av det koniske røret mot bunnen av BSC slik at erytrocyttpelleten er rekonstituert. Ta volumet av suspensjonen opp til 50 ml med PBS. Bland ved mild inversjon.
      5. Gjenta trinn 2.2.2.1−2.2.2.4 totalt 4−6x. Kontroller at supernatanten er klar eller bare litt rosa og ikke lenger ugjennomsiktig. Fjern alt supernatant ved hjelp av en serologisk pipette. Resuspend erytrocyttpellets i 1-2 ml PBS.
      6. Monter blodmelet: 350 μL pakkede erytrocytter, 100 μL 10% sukrose, 200 μL varmeinaktivert FBS, 900 μM rekombinant ATP og 2 ml passende fortynnet virusbestand ved hjelp av DMEM supplert med 2% v / v varmeinaktivert FBS, og 1% (v / v) penicillin-streptomycin.
  3. Legg over en standard 3 ml reservoarenhet (Materialbord) med huden på en uinfisert mus (andre alternativer inkluderer parafinfilm, kollagenmembraner eller pølsehus).
  4. Plasser det tildekkede reservoaret på hvite papirhåndklær. Tilsett ~2 ml smittsomt blodmel i reservoaret 1 ml om gangen. Inspiser håndkleet under materen for eventuelle tegn på lekkasje. Hvis det er lekkasjer til stede, gjenoppretter du blodmelet fra matere og kaster dekslene. Forsegle matere med plugger. Nok en gang må du bekrefte at det ikke er noen lekkasjer til stede.

3. Backtitration av blodmetaler / plakkanalyse

  1. Bruk det gjenværende volumet av det tilberedte blodmelet, utfør en 10x seriell fortynningsserie (dvs. 6 fortynninger, alt fra fortynnet 10x til 1,000,000x) ved hjelp av DMEM supplert med 2% v / v varmeinaktivert FBS, og 1% (v / v) penicillin-streptomycin.
  2. Aliquot 100 μL av fortynningene i brønnene på 24 eller 12 brønnplater fra de mest fortynnede til mest konsentrerte.
  3. Inkuber i 1 time i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
  4. På slutten av inkubasjonsperioden på 1 t, ta platene tilbake i BSC og tilsett 1 ml eller 2 ml metylcelluloseoverlegg til de 24 brønn- eller 12 brønnplatene, tilsvarende.
  5. Plasser overlagte plater tilbake i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator og inkuber i 3–7 dager (virusstammeavhengig).
  6. Etter inkubasjon, fjern platene fra inkubatoren og ta inn i BSC. Kast metylcelluloseoverlegget i en brettpanne som inneholder 10 % blekemiddel eller dobbelt kvartært ammoniumdesinfeksjonsmiddel.
  7. Vask hver brønn 2x med PBS, kast vasken i en brettpanne som inneholder 10% blekemiddel eller dobbelt kvartær ammonium.
  8. Tilsett ~1 ml metanol:aceton (1:1 v:v) og la cellene feste seg på platen i minst 30 minutter i BSC ved romtemperatur (RT). Kast metanol:aceton i henhold til institusjonell politikk på organisk avfall.
  9. Visualiser ZIKV ved hjelp av en av to metoder beskrevet nedenfor.
    1. Etter fjerning av metanol: aceton, flekk umiddelbart med en krystallfiolett løsning (0,25% m / v i 30% metanol) i 5 min. Skyll 2x i vann fra springen og la det tørke, og visualiser deretter direkte ved øye for tegn på plakk eller ødeleggelse av monolayer.
    2. Alternativt kan du utføre fokusformingsanalyse.
      1. La platene lufttørke til det ikke er noe organisk fikseringsmiddel igjen.
        MERK: Dette bør ta ~2−3 timer utenfor BSC, men kan akselereres ved lufttørking i en BSC- eller kjemisk avtrekkshette.
      2. Vask hver brønn 3x i 15 min hver i ikke-steroide PBS (Mg2 + og Ca2 + gratis) på en orbital plate rocker. Fjern PBS og tilsett 1 ml blokkeringsløsning (PBS + 3% FBS) til hver brønn og rock i 15 min på RT.
      3. Tilsett 100 μL per brønn med α-ZIKV eller α-flavivirus primær antistoff (f.eks. flavivirusgruppe hybridoma D1-4G2-4-15 [4G2]) ved en 1:2000 fortynning i blokkeringsløsning. Inkuber med gynging i minst 4 timer (helst over natten, ikke over 18 timer) ved RT.
      4. Fjern det primære antistoffet og vask 3x i 15 minutter hver med PBS (Mg2 + og Ca2 + gratis) på en orbital plate rocker.
      5. Tilsett 100 μL per brønn av det sekundære antistoffet (geit α mus HRP-merket) fortynnet 1:2,000 i blokkeringsbuffer. Inkuber med rocking i 1 time på RT.
      6. Vask 3x i 15 min hver med PBS (Mg2+ og Ca2+ gratis) på en orbital plate rocker.
      7. Aliquot 100 μL substratutviklingsreagens (Materialliste) per brønn. Steinplater på RT i 15 min.
      8. Stopp reaksjonen ved utvikling av foci/plakk ved å fjerne substratet og skylle platene 2x med vann fra springen. Hell av vann fra springen og la platene lufttørke før kvantifisering.
      9. Tell viral foci for å bestemme antall FFU til stede i det gitte utvalget.

4. Administrering av blodmel

  1. Bruk Ae. aegypti mygg 2-4 dager etter eklosjon. Sorter kvinnelige mygg i 0,5 L pappkartonger med skjermede lokk og frata dem sukker (vanligvis 36-48 timer før det smittsomme blodmelet). Gi ad libitum vann via vannmettede bomullskuler.
  2. Fjern de vannmettede bomullsbollene om morgenen at myggene vil bli utsatt for det smittsomme blodmelet.
  3. Fest reservoarer som inneholder kunstige blodmelaler til fôringsenhetens ledninger i en klar plasthanskeboks.
  4. I hanskerommet plasserer du en 0,5 L pappkartong med skjermet lokk, som inneholder 50-100 utsultede Ae. aegypti mygg, under fôringsenheten festet til reservoaret.
    MERK: Passende sultne mygg vil vanligvis mate innen 20 min. Fôring kan forlenges etter behov for å øke prøvestørrelsen i langsommere populasjoner, selv om dette ikke bør strekke seg utover 60 min, fordi (ZIKV) viral titer kan reduseres i materen etter ~ 60 min.
  5. Etter ferdigstillelse av fôring, fjern reservoaret og senk det i nylaget 10% blekemiddel.
  6. Kaldbedøvelse mygg ved inkubasjon i 30 s ved -20 °C eller i 5 min i kjøleskap.
  7. I hanskerommet, hell myggene i en Petri-tallerken på is. Tell og sorter de engorgede kvinnene fra uengasjerte mygg. Kast de uengorgede myggene ved nedsenking i et 50 ml rør konisk rør fylt med 70% etanol. Mens myggene fortsatt er bedøvet, hell dem tilbake i 0,5 L pappkartong og dekk raskt med skjermen og lokket. Trim overflødig skjermnett av esken og fest nettet med tape.
  8. Tilsett en bomullskule mettet med steril filtrert 10% vandig sukrose på skjermen til hver kartong. Legg alle myggkartonger i en stor sekundær beholder av plast med en fuktig svamp for å opprettholde fuktighet.
  9. Plasser sekundærbeholder som inneholder esker med mygg i en inkubator med en temperatur på 27 ± 1 °C (eller etter behov for å simulere forhold i interesseområde) med 80 % ± 10 % relativ fuktighet og en lys:mørk syklus på 16:8). Oppretthold myggene med ad libitum tilgang til 10% sukrose til ferdigstillelse av forsøkene.

5. Prøveanskaffelse og behandling

  1. På angitte dager etter fôring aspirerer du et forhåndsbestemt antall mygg fra de aktuelle kartongene ved hjelp av en mekanisk aspirator i en hanskeboks. Cap oppsamlingsrøret med en bomullsrunde etter at det nødvendige antall mygg er anskaffet.
  2. Kaldbedøvelse mygg ved inkubasjon i 30 sekunder ved -20 °C eller i 5 minutter ved 4 °C.
  3. I hanskerommet, hell myggene i en Petri-tallerken på is. Ved hjelp av to par tang, fjern alle seks av hver myggs ben og legg i et forhåndsmerket 2 ml rund bunnmikrosenterrør som inneholder et sterilisert kulelager i rustfritt stål (7/32") og 500 μL myggoppsamlingsmedier (MCM) som består av DMEM, 2% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 2,5 μg /ml amphotericin.
  4. Plasser myggen forsiktig på en dråpe mineralolje for å begrense den, pass på at du ikke tillater kontakt mellom oljen og myggens hode og proboscis.
  5. Sett myggproboscis inn i en 10 μL pipettespiss fylt med 10 μL varmeinaktivert FBS.
    MERK: Pipetten kan eventuelt fylles med sukrose, blod eller mineralolje. Oljen muliggjør direkte visualisering av spyttbobler via lysmikroskopi.
  6. La mygga salivere i 30 min. Løs ut mikropipettespissen som inneholder FBS + spytt i et mikrocentrifugerør som inneholder 100 μL MCM, og plasser deretter slaktkroppen i et separat 2 ml rund bunnmikrosenterrør som inneholder et sterilisert stålkulelager og 500 μL MCM. Forsikre deg om at rørene som brukes til kropp, ben og spytt er merket slik at det er klart at alle tre prøvene stammer fra samme mygg.
  7. Mens mygg(e) saliver, utfør trinn 5,3-5,5 på de resterende myggene.
  8. Transport rørene som inneholder kroppene og bena til en perle frese vev homogenisering enhet som finnes i en BSC. Triturer alle kropps- og benprøver ved 26 Hz i 5 minutter for å frigjøre viruspartikler i supernatanten. Avklar alle prøver ved sentrifugering ved 200 x g i 5 minutter til pelletscelleavfall.
    MERK: På dette tidspunktet kan prøver fryses ved -80 °C, eller analysen umiddelbart.

6. Påvisning av ZIKV ved smittsom analyse

  1. I en BSC, forberede 24 brønnvev kulturplater med Vero celler (105 celler per brønn) 24 timer før utbruddet av den smittsomme analysen. Merk hver brønn med identiteten til en enkelt mygg / prøve.
  2. Hvis prøvene ble frosset ved -80 °C, må du la det tines.
  3. Fjern mediet fra Vero-celleplatene før inokulering med prøver én plate om gangen.
  4. For prøver som inneholder kropper eller ben, forsiktig aliquot 100 μL klargjort supernatant i hver brønn, pass på å ikke forstyrre myggcelleavfallet fra pellet.
    MERK: Spyttprøver kan fortynnes 1:1 (v/v) med MCM før inokulering på celler for å spare prøver for senere titrering, om nødvendig.
  5. Flytt platene inn i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator og inkuber i 1 time.
  6. Returner platene til BSC og tilsett ~ 1 ml metylcelluloseoverlegg til hver brønn. Plasser de overliggende platene tilbake i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator og inkuber i 3–7 dager (virus-/belastningsavhengig).
  7. Utfør fiksering og visualisering som beskrevet i trinn 3.6−3.9.
  8. Når det gjelder skåring via en fokusformingsanalyse, kvantifiserer du de positive brønnene ved undersøkelse under et lysmikroskop. Påvisning av intracytoplasmisk farging av celler i en brønn indikerer tilstedeværelsen av virus. Prøver skårer utelukkende som fokuspositive eller -negative.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre populasjoner av Ae. aegypti fra Amerika (Salvador, Brasil; Den dominikanske republikk; og Rio Grande Valley, TX, USA) ble utsatt for en utbruddsstamme av ZIKV fra Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexico, 2015) over en rekke blodmeltiter (4, 5 og 6 logg10 FFU / ml) presentert i en vasket menneskelig erytrocytbasert kunstig blodmel. På dag 2, 4, 7, 10 og 14 postinfeksjon ble undergrupper av mygg behandlet for å bestemme infeksjon, formidling og potensielle overføringshastigheter.

Ved en blodmeltiter på 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1−7, Ae. aegypti fra Salvador, Brasil ble smittet med priser på henholdsvis 12,5% og 11,1% etter 4 og 14 dager med ekstrinsisk inkubasjon, uten tegn på spredt infeksjon observert i de analyserte bena, og ingen virus oppdaget i spyttet (Figur 1a). Økning av titeret til 5 log10 FFU/ml resulterte i en marginal økning i infektivitet med rater på henholdsvis 22,2 %, 33,3 % og 22,2 % på henholdsvis dag 4, 10 og 14 etter infeksjon. I likhet med det som ble observert i kohorten eksponert for 4 logg10 FFU/ml, ble det ikke observert spredningsinfeksjoner eller overføringskompetanse på noe tidspunkt (Figur 1b). Ved den høyeste undersøkte titeren (6 logg10 FFU / ml) ble det ikke identifisert noen infeksjoner etter 2 dager med inkubasjon, men infeksjoner ble observert på alle andre tidspunkter, og toppet seg på 88,9% med 10 dager med ekstrinsisk inkubasjon. ZIKV ble påvist i myggbenene undersøkt ved henholdsvis 10 og 14 dager etter infeksjon (henholdsvis 22,2% og 66,7%), noe som indikerer at ZIKV hadde spredd seg inn i hemocoel, selv om smittsom ZIKV ble observert i spytt på disse tidspunktene (Figur 1c).

Ae. aegypti-befolkningen fra Den dominikanske republikk viste seg å være den mest utsatt for ZIKV-infeksjon og ble overførings kompetent etter eksponering for alle testede blodmeltitatorer. Noe infeksjonsnivå ble observert til enhver tid ved alle tre testede doser, med lavest observert hastighet 2 dager etter infeksjon ved 4 logg10 FFU/ml (25 %) (Figur 1d). Med blodmeltitler på 5 logg10 og 6 logg10 FFU / ml forhold smittetrater smittetatene på 100%, med 100% infeksjon observert så tidlig som 4 dager postinfection i populasjonen av mygg utsatt for 6 logg10 FFU / ml ZIKV (Figur 1e,f). Mygg matet alle tre dosene påvist formidling med 7 dager etter infeksjon, 44,4 % (4 log10 FFU/ml, 14 dagers etterinfeksjon), 88,9 % (5 logg10 FFU/ml, 1 og 14 dagers etterinfeksjon) og 100 % (6 logg10 FFU/ml, 10 dager etter infeksjon). Overføringskompetanse ble observert etter alle tre dosene (henholdsvis 11,1 %, 22,2 % og 22,2 % ved 4, 5 og 6 log10 FFU/ml), men bare etter en 14 dagers ekstrinsisk inkubasjonsperiode (EIP) (Figur 1d−f).

Ae. aegypti-befolkningen fra Rio Grande Valley, TX, viste seg å være relativt ildfast mot infeksjon med ZIKV. Mygg eksponert for blodmeltitatorer på 4 logg10 FFU/ml, ble smittet så tidlig som 4 dager etter infeksjon, med infeksjonsrater mellom 22,2% og 44,4%. Med disse eksponeringsbetingelsene ble det observert spredte infeksjoner ved 14 dagers postinfeksjon med en hastighet på 11,1%, og ingen overføringskompetanse ble observert (Figur 1g). En ti ganger økning i blodmelter ga et stort sett lignende resultat, med infeksjoner observert fra 4 dager posteksponering (33,3% og 44,4%), mens spredte infeksjoner ble funnet etter 14 dager med ekstrinsisk inkubasjon med en hastighet på 22,2% (Figur 1h). Til slutt, i kohorten utsatt for en 6 logg10 FFU / ml blodmel, ble infeksjon observert fra 2 dagers postinfeksjonstidspunkt (22,2%) og nådde topper på 4, 10 og 14 dager postinfeksjon (66,7%). Disseminerte infeksjoner i denne tilstanden begynte å bli observert ved 7 dager postinfeksjon (11,1%) og toppet seg på 44,4% ved 14 dagers postinfeksjon. Bare en enkelt mygg (11,1%) ble observert å være overføring i stand til 10 dagers postinfeksjon (Figur 1i).

Figure 1
Figur 1: Representative vektorkompetansedata for ulike Ae. aegyptipopulasjoner for ZIKV Mex 1−7. (a−c) Vektorkompetanse av Ae. aegypti fra Salvador, Brasil (F2). (d−f) Vektor kompetanse av Ae. aegypti fra Den dominikanske republikk (F6). (g−i) Vektorkompetanse av Ae. aegypti fra Rio Grande Valley, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti eksponert for 4 logg10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti eksponert for 5 logg10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti eksponert for 6 logg10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. På hvert tidspunkt (2, 4, 7, 10 og 14 dager etter infeksjon) ble en undergruppe av mygg samlet og samplet. Infeksjon, formidling og overføringshastighet presenteres som antall positive kadaver/ben/spyttprøver over antall mygg analysert på det tidspunktet. Infeksjon representert i blå, spredte infeksjoner representert i grønt, og overføringshastighet representert i rødt. Data i denne figuren er endret fra Roundy og Azar et al.32. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene beskrevet her gir en generalisert arbeidsflyt for å gjennomføre vektorkompetanseanalyser. Som et generelt rammeverk er mange av disse metodene bevart gjennom hele litteraturen. Det er imidlertid betydelig rom for modifikasjoner (gjennomgått i Azar og Weaver1). Virus (f.eks. viral avstamning, lagring av utfordringsvirus, viral passasjehistorie), entomologi (f.eks. laboratoriekolonisering av myggpopulasjoner, medfødt immunitet, myggmikrobiomet/virom) og eksperimentelle variabler (f.eks. blodmelsammensetning, sekvensiell blodfôring og inkubasjonstemperatur) er alle kjent for å påvirke vektorkompetansen. Metodisk variasjon i kompetansestudier har vist seg problematisk i sammenheng med ZIKV-utbruddet fordi det har utelukket formelle metaanalyser1,33.

Innenfor denne generelle metodikken kan viktigheten av riktig sult av mygg og blodmel sminke ikke overdrives. Dehydrering er kjent for å drive blodfôringsadferd av mygg i laboratorieparadigmer34, understreke verdien av sukker og vann sult før du tilbyr et smittsomt blodmel. Mens deprivasjon av sukker i 36-48 timer og vann i 2-4 timer før eksponering for blodmelet tolereres godt av Ae. aegypti, er det verdt å merke seg at disse myggene er notorisk enkle å jobbe med i laboratorieforhold2. Slike aggressive stivelsesregimer kan ikke på langt nær så godt tolereres av andre myggarter, noe som krever en viss grad av intern optimalisering. På samme måte kan blodmelinnhold informeres av vertens preferanse. For eksempel er bruk av menneskelig blod for å forberede et blodmel for antropofile mygg som Ae. aegypti helt hensiktsmessig, men menneskelige blodmelaler laget for ornithofile arter som Culex quinquefasciatus kan vise seg mindre effektive35. I tillegg, med hensyn til blodmelmontering, er bruk av relativt friske blodprodukter sterkt tilrådelig for å minimere hemolyse av erytrocytter.

En av de største begrensningene ved vektorkompetansevurdering som helhet og prosedyrene som er beskrevet her, er at disse studiene i stor grad er begrenset til å undersøke virus ved hjelp av mygg som kan opprettholdes under laboratorieforhold. Ae. aegypti, mens en svært relevant vektor for en rekke patogener av klinisk betydning, er også tilfeldigvis en av de enkleste myggene å bake og vedlikeholde i laboratoriekolonier1,31,36,37. Ikke overraskende er kompetansen til Ae. aegyptipopulasjoner ofte den beste karakterisert blant vanlige vektor mygg2. Dette er spesielt problematisk i sammenheng med arbovirus som opprettholder både enzootiske og urbane overføringssykluser38,39,40, da vektorkompetanse vanligvis bare utføres i sammenheng med de mer gjennomførbare urbane myggene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi anerkjenner staben til World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton og Divya Mirchandani, for deres utrettelige arbeid med å kuratere og gi mange av de virale stammene som brukes til våre og andre gruppers vektorkompetanseforsøk. Det presenterte arbeidet ble finansiert av McLaughlin Fellowship Fund (SRA) og NIH gir AI120942 og AI121452.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 159 mygg vektorkompetanse Aedes Aedes aegypti arbovirus Zika
Vector Kompetanse Analyser på <em>Aedes aegypti</em> Mygg ved hjelp av Zika Virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector… More

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter