Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vektorkompetensanalyser på Aedes aegypti myggor med Zika Virus

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

Det presenterade protokollet kan bestämma vektorkompetensen hos Aedes aegypti myggpopulationer för ett visst virus, såsom Zika, i en inneslutningsmiljö.

Abstract

De förfaranden som presenteras beskriver en generaliserad metod för att infektera Aedes aegypti myggor med Zika virus under laboratorieförhållanden för att bestämma graden av infektion, spridad infektion och potentiell överföring av viruset i myggpopulationen i fråga. Dessa procedurer används i stor utsträckning med olika modifieringar i vektorkompetensutvärderingar globalt. De är viktiga för att bestämma den potentiella roll som en viss mygga (dvs. art, population, individ) kan spela vid överföring av ett visst medel.

Introduction

Vektorkompetens definieras som förmågan på art-, populations- och till och med en individs nivå hos en viss leddjur som mygga, fästing eller phlebotomine sandfluga, att förvärva och överföra ett medel biologiskt med replikering eller utveckling i leddjuret1,2. När det gäller myggor och leddjurburna virus (dvs. arbovirus) är medlet insuperat från en viremic värd av en kvinnlig mygga. Efter intag måste viruset produktivt infektera en av en liten population av midgut epitelceller3, övervinna olika fysiologiska hinder som proteolytisk nedbrytning av matsmältningsenzymer, närvaron av mikrobiota (midgut infektionsbarriären eller MIB) och den utsöndrade peritrofiska matrisen. Infektion av midgut epitel måste följas av replikering av viruset och eventuell flykt från midguten till myggans öppna cirkulationssystem, eller hemolymph, som representerar uppkomsten av en spridad infektion övervinna midgut escape barrier (MEB). Vid denna tidpunkt kan viruset fastställa infektioner i sekundära vävnader (t.ex. nerver, muskler och fettkroppar) och fortsätta att replikera, även om sådan sekundär replikering kanske inte är absolut nödvändig för att viruset ska infektera salivkörtlarnas acinära celler (övervinna salivkörtelinfektionsbarriären). Utgående från salivkörtelacincellerna i deras apikala håligheter och sedan rörelse i salivkanalen möjliggör inokulering av viruset till efterföljande värdar vid bitning och slutför överföringscykeln1,2,4,5,6,7.

Med tanke på denna väl karakteriserade och allmänt bevarade spridningsmekanism inom en myggvektor är laboratorievektorkompetensbedömningar ofta metodologiskt lika, även om skillnader i protokoll finns1,2. I allmänhet, efter oral virusexponering, dissekeras myggor så att enskilda vävnader som midgut, ben, äggstockar eller salivkörtlar kan analyseras för virusinfektion, spridad infektion, spridad infektion / potentiell transovariell överföring och spridad infektion / potentiell överföringskompetens, respektive8. Blotta förekomsten av ett virus i salivkörtlarna är dock inte definitiva bevis på överföringsförmåga, givet bevis på en salivary gland escape /egress barrier (SGEB) i vissa vektor/ viruskombinationer1,2,4,5,7,9. Standardmetoden för att bevisa överföringskompetens förblir myggöverföring till ett mottagligt djur10,11,12. Men med tanke på att för många arbovirus kräver detta användning av immunkomprometterade murinmodeller13,14,15,16, är denna metod ofta kostnadsöverkomlig. Ett vanligt alternativ är insamlingen av myggsaliv, som kan analyseras genom omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) eller en infektiös analys för att visa närvaron av virusgenomet respektive infektiösa partiklar. Det är värt att notera att sådana in vitro-metoder för insamling av saliv kan överskatta12 eller underskatta17 mängden virus som deponeras under in vivo-utfodring, vilket indikerar att sådana uppgifter måste tolkas med försiktighet. In vitro-metoden är dock mycket värdefull när den analyseras ur perspektivet av blotta närvaron av virus i saliven, vilket indikerar överföringspotential.

Två viktiga metoder finns för att bestämma myggvektorernas roll vid utbrott av arboviralsjukdomar. Den första metoden innebär fältövervakning, där myggor samlas in i samband med aktiv överföring18,19,20,21,22,23,24. Med tanke på att infektionsfrekvensen vanligtvis är ganska låg (t.ex. den uppskattade 0,061% infektionshastigheten för myggor i områden med aktiv Zika-virus (ZIKV) cirkulation i USA21), kan inskrivning av potentiella vektorarter vara kraftigt partisk genom fångstmetod25,26 och slumpmässig slump (t.ex. provtagning av en infekterad individ av 1 600 oinfekterade)21 . Med hänsyn till detta får en viss studie inte förvärva tillräckligt med myggor i både råantal eller artmångfald för att noggrant prova myggor som är involverade i överföring. Däremot görs vektorkompetensanalyser i laboratoriemiljö, vilket möjliggör strikt kontroll av parametrar som oral dos. Även om de inte är fullt kapabla att representera den verkliga komplexiteten hos mygginfektion och överföringskapacitet i en fältmiljö, förblir dessa laboratoriebedömningar kraftfulla verktyg inom arbovirologi.

Baserat på olika vektorkompetensanalyser med ZIKV i flera myggarter, populationer och metoder27,28,29,30,31,32, samt en nyligen genomgång av vektorkompetensbedömningar1, beskriver vi här flera av protokollen i samband med ett typiskt vektorkompetensarbetsflöde. I dessa experiment utsattes tre Ae. aegypti populationer från Amerika (staden Salvador, Brasilien; Dominikanska republiken; och den nedre Rio Grande Valley, TX, USA) för en enda stam av ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) vid 4, 5 eller 6 log10 fokusbildande enheter (FFU) / ml doser genom konstgjorda blodmjöl. Därefter analyserades de för bevis på infektion, spridas infektion och överföring kompetens efter olika tider av extrinsic inkubation (2, 4, 7, 10 och 14 dagar) med hjälp av dissekering och en cell kultur-baserade infektiös analys. Även om det nuvarande arbetsflödet/protokollen är optimerade för ZIKV, kan många element direkt översättas till andra myggburna arbovirus i leddjursinneslutning och biosäkerhetsnivåer 2 och 3 (ACL/BSL2 eller ACL/BSL3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer som utfördes i dessa protokoll utfördes i full överensstämmelse med protokoll som godkänts av Institutional Biosafety Committee och Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Texas Medical Branch i Galveston.

1. Förstärk ZIKV i Vero-celler

  1. Odla Vero-celler (CCL-81 eller VeroE6) i Dulbeccos modifiering av Eagles minimala essentiella medium (DMEM) kompletterat med 10% v/v värmeinaktiverat fetalt bovinserum (FBS), och 1% (v/v) penicillin-streptomycin (100 U/mL respektive 100 μg/mL) i en fuktad 37 °C inkubator med 5% CO9%
  2. I ett biosäkerhetsskåp (BSC), ta bort mediet och kassera det i antingen 10% blekmedel eller en arbetsutspädning av dubbelt kvartär ammonium(Materialtabell). Omedelbart inokulera monolagret med 1 ml viruslager, med sikte på 0,1−1 infektiös viruspartikel per cell. Omrör kolven omedelbart så att inokulaten kommer i sin helhet i sin helhet.
  3. Fyll på mediet till en volym på 5 ml med DMEM kompletterat med 2% v/v värmeinaktiverad FBS och 1% (v/v) penicillin-streptomycin. Flytta sedan kolven till den fuktade inkubatorn 37 °C med 5% CO2 i 60 min.
  4. Ta bort kolven från inkubatorn och ta in den i en BSC. Tillsätt ytterligare medium till en total volym på 15 ml med DMEM kompletterat med 2% v/v värmeinaktiverad FBS och 1% (v/v) penicillin-streptomycin. Flytta kolven till en fuktad 37 °C inkubator med 5% CO2.
  5. Undersök kolven dagligen under faskontrastmikroskopi för tecken på cytopatiska effekter (CPE). Fortsätt till virusskörden (steg 1,7) när endast cirka 40−50% av cellerna finns kvar i monolagret, i allmänhet 3−5 dagar efterktion beroende på vilken stam zikv som används.
  6. Aspirera supernatanten och placera i en 50 mL konisk flaska. Förtydliga supernatanten av cellulärt skräp genom centrifugering (3 500 x g i 20 min).
    OBS: Om flera flaskor har smittats på samma sätt kan supernatanter från flera flaskor kombineras till koniska rör på 50 ml.
  7. Ta bort supernatanten från 50 ml koniskt rör till ett nytt, var försiktig så att du inte stör pelleten. Komplettera supernatanten med värmeinaktiverad FBS till en slutlig koncentration på 30% (v/v). Aliquot denna blandning i enskilda skruvlocksrör och frys vid -80 °C tills den används.

2. Beredning av konstgjorda blodmjöl

  1. På dagen myggor ska utsättas för infektiösa blodmjöl, slå på kraftkällan (Tabell av material) i en leddjur inneslutningsanläggning så att utfodringsenheterna(Table of Materials) förvärms när myggorna är beredda för exponering.
  2. Förbered konstgjorda blodmjöl med en av de metoder som beskrivs nedan.
    1. Metod 1: Kombinera nyskördat (inom en vecka)citerat eller hepariniserat humant blod som köpts kommersiellt 1:1 v/v med viruslager (berett enligt beskrivningen i avsnitt 1).
      OBS: Denna metod är beroende av att det inte finns några antikroppar mot den virus-/virusfamilj som finns i blodet.
    2. Om frånvaro av antikroppar inte kan bekräftas eller om blodkällan är känd för att ha tidigare exponering för flavivirus, tvätta och packa erytrocyter manuellt.
      1. I en BSC, tillsätt 30 ml helblod till ett 50 ml koniskt rör och fyll på upp till 50 ml med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
      2. Centrifug vid 3 500 x g i 20 min.
      3. Aspirera supernatanten antingen genom att försiktigt hälla i en bricka som innehåller antingen 10% blekmedel eller arbetsutspädning av dubbelt kvartär ammonium, var noga med att inte kasta erytrocytpelletsen.
      4. Tillsätt 10 ml PBS och knacka försiktigt botten av det koniska röret mot botten av BSC så att erytrocytpelleten har rekonstituerats. Ta upp fjädringsvolymen till 50 ml med PBS. Blanda med mild inversion.
      5. Upprepa steg 2.2.2.1−2.2.2.4 totalt 4−6x. Bekräfta att supernatanten är klar eller bara något rosa och inte längre ogenomskinlig. Ta bort all supernatant med en serologisk pipett. Resuspend erytrocyt pellet i 1−2 ml PBS.
      6. Montera blodmjölet: 350 μL förpackade erytrocyter, 100 μL 10% sackaros, 200 μL värmeinaktiverad FBS, 900 μM rekombinant ATP och 2 ml lämpligt utspädd virusstock med DMEM kompletterat med 2% v/v värmeinaktiverad FBS och 1% (v/v) penicillin- strepto.
  3. Överlägg en standard 3 mL reservoarenhet(Materialtabell) med huden på en oinfekterad mus (andra alternativ inkluderar paraffinfilm, kollagenmembran eller korvhölje).
  4. Placera den täckta behållaren på vita pappershanddukar. Tillsätt ~ 2 ml infektiöst blodmjöl till behållaren 1 ml åt gången. Inspektera handduken under mataren för tecken på läckage. Om det finns läckor, återvinn blodmjölet från matarna och kassera locken. Försegla matarna med pluggar. Bekräfta än en gång att det inte finns några läckor.

3. Backtitration av blodmjöl/plackanalys

  1. Använd den återstående volymen av det beredda blodmjölet och utför en 10x seriell utspädningsserie (dvs. 6 utspädningar, allt från utspädda 10x till 1 000 000x) med DMEM kompletterat med 2% v/v värmeinaktiverad FBS och 1% (v/v) penicillin-streptomycin.
  2. Alikvot 100 μL av utspädningarna i brunnarna på 24 eller 12 brunnsplattor från de mest utspädda till mest koncentrerade.
  3. Inkubera i 1 h i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
  4. I slutet av inkubationsperioden på 1 h, ta plattorna tillbaka till BSC och tillsätt 1 ml eller 2 ml metylcellulosaöverlägg till 24 väl eller 12 brunnsplattor, på motsvarande sätt.
  5. Placera överfyllda plattor tillbaka i en 37 °C, 5% CO2 inkubator och inkubera i 3−7 dagar (virusstamberoende).
  6. Efter inkubation, ta bort plattorna från inkubatorn och ta in i BSC. Kassera metylcellulosaöverlägget i en bricka som innehåller 10% blekmedel eller dubbelt kvartär ammoniumdesinfektionsmedel.
  7. Tvätta varje brunn 2x med PBS, kassera tvätten i en bricka som innehåller 10% blekmedel eller dubbelt kvartär ammonium.
  8. Tillsätt ~1 ml metanol:aceton (1:1 v:v) och låt cellerna fixeras på plattan i minst 30 minuter i BSC vid rumstemperatur (RT). Kassera metanol:aceton enligt institutionell politik för organiskt avfall.
  9. Visualisera ZIKV med en av två metoder som beskrivs nedan.
    1. Efter avlägsnandet av metanol: aceton, fläcka omedelbart med en kristallviolett lösning (0,25% w/v i 30% metanol) i 5 min. Skölj 2x i kranvatten och låt torka, visualisera sedan direkt med öga för tecken på plack eller förstörelse av monoskikt.
    2. Alternativt kan du utföra fokusformningsanalys.
      1. Låt plattorna lufttorka tills inget organiskt fixeringsmedlet återstår.
        OBS: Detta bör ta ~2−3 h utanför BSC men kan påskyndas genom lufttorkning i en BSC eller kemisk rökhuv.
      2. Tvätta varje brunn 3x i 15 min vardera i nonsterile PBS (Mg2+ och Ca2 + fri) på en orbital plate rocker. Ta bort PBS och tillsätt 1 ml blockeringslösning (PBS + 3% FBS) till varje brunn och sten i 15 min vid RT.
      3. Tillsätt 100 μL per brunn av α-ZIKV eller α-flavivirus primär antikropp (t.ex. flavivirusgrupphybridom D1-4G2-4-15 [4G2]) vid en utspädning på 1:2 000 i blockeringslösningen. Inkubera med gungning i minst 4 timmar (helst över natten, högst 18 h) vid RT.
      4. Ta bort den primära antikroppen och tvätta 3x i 15 min vardera med PBS (Mg2+ och Ca2+ fri) på en orbital plattvipp.
      5. Tillsätt 100 μL per brunn av den sekundära antikroppen (get- α mus HRP-märkt) utspädd 1:2 000 i blockerande buffert. Inkubera med gungning i 1 h på RT.
      6. Tvätta 3x i 15 min vardera med PBS (Mg2+ och Ca2+ fri) på en orbital plate rocker.
      7. Alikvot 100 μL reagens för substratutveckling(Tabell över material)per brunn. Stenplattor på RT i 15 min.
      8. Stoppa reaktionen vid utveckling av foci/plack genom att ta bort substratet och skölja plattorna 2x med kranvatten. Häll av kranvatten och låt plattorna lufttorka innan du kvantifierar.
      9. Räkna virala högborgar för att bestämma antalet FFU som finns i det givna provet.

4. Administrering av blodkött

  1. Använd Ae. aegypti myggor 2−4 dagar efter eklosion. Sortera kvinnliga myggor i 0,5 L kartonger med skärmade lock och beröva dem socker (i allmänhet 36−48 h före det infektiösa blodmjölet). Ge ad libitum vatten via vattenmättade bomullsbollar.
  2. Ta bort de vattenmättade bomullsbollarna på morgonen att myggorna kommer att utsättas för det infektiösa blodmjölet.
  3. Fäst reservoarer som innehåller konstgjorda blodmjöl på matningsaggregatsledningar i en klar plasthandskelåda.
  4. Placera en 0,5 L kartong med ett skärmat lock i handskfacket, innehållande 50−100 svältande Ae. aegypti myggor, under matningsenheten som är fäst vid behållaren.
    OBS: Lämpligt svältande myggor kommer i allmänhet att mata inom 20 minuter. Utfodring kan förlängas efter behov för att öka provstorleken i långsammare populationer, även om detta inte bör sträcka sig längre än 60 min, eftersom (ZIKV) viral titer kan minska i mataren efter ~ 60 min.
  5. När utfodringen är klar, ta bort behållaren och sänk ner i nytillverkade 10% blekmedel.
  6. Kallsöt myggor genom inkubation i 30 s vid -20 °C eller i 5 min i kylskåp.
  7. Häll myggorna i en Petri-maträtt på is i handskfacket. Räkna och sortera de engorged honorna från oengorged myggor. Kassera de oengagerade myggorna genom nedsänkning i ett koniskt rör på 50 ml fyllt med 70% etanol. Medan myggorna fortfarande sövs, häll dem tillbaka i kartongen 0,5 L och täck snabbt med skärmen och locket. Trimma överflödigt skärmnät från kartongen och säkra nätet med tejp.
  8. Tillsätt en bomullstuss mättad med steril filtrerad 10% vattenhaltig sackaros på skärmen på varje kartong. Placera alla myggkartonger i en stor sekundär behållare av plast med en fuktig svamp för att bibehålla luftfuktigheten.
  9. Placera sekundär behållare som innehåller kartonger av myggor i en inkubator med en temperatur på 27 ± 1 °C (eller, i förekommande fall för att simulera förhållanden i intresseområde) med 80% ± 10% relativ fuktighet och en 16:8 ljus: mörk cykel). Behåll myggorna med ad libitum tillgång till 10% sackaros tills experimenten är klara.

5. Provförvärv och provbehandling

  1. På angivna dagar eftermatning, aspirera ett förutbestämt antal myggor från lämpliga kartonger med hjälp av en mekanisk aspirator i en handsklåda. Kapa uppsamlingsröret med en bomullsrunda efter att det erforderliga antalet myggor har förvärvats.
  2. Kallsöt myggor genom inkubation i 30 sekunder vid -20 °C eller i 5 minuter vid 4 °C.
  3. Häll myggorna i en Petri-maträtt på is i handskfacket. Använd två par tång, ta bort alla sex av varje myggas ben och placera i ett förmärkt 2 mL runt botten microcentrifuge rör som innehåller ett steriliserat rostfritt stål kullager (7/32") och 500 μL myggsamlingsmedia (MCM) bestående av DMEM, 2% FBS, 1% penicillin-streptomycin och 2,5 μg/mL amphotericin.
  4. Placera försiktigt myggan på en droppe mineralolja för att begränsa den, var noga med att inte tillåta någon kontakt mellan oljan och myggans huvud och proboscis.
  5. För in mygg proboscisen i en 10 μL pipettspets fylld med 10 μL värmeinaktiverad FBS.
    OBS: Alternativt kan pipetten fyllas med sackaros, blod eller mineralolja. Oljan möjliggör direkt visualisering av salivbubblor via lätt mikroskopi.
  6. Låt myggan salivera i 30 min. Mata ut mikropipettspetsen som innehåller FBS + saliv i ett mikrocentrifugerör som innehåller 100 μL MCM och placera sedan slaktkroppen i ett separat 2 ml runt botten microcentrifugerör som innehåller ett steriliserat stålkullager och 500 μL MCM. Se till att rören som används för kropparna, benen och saliven är märkta så att det är klart att alla tre proverna kommer från samma mygga.
  7. Medan myggan eller myggorna saliverar, utför steg 5,3−5,5 på de återstående myggorna.
  8. Transportera rören som innehåller kroppar och ben till en pärlfräsningsvävnad homogeniseringsanordning som finns i en BSC. Triturera alla kropps- och benprover vid 26 Hz i 5 minuter för att frigöra viruspartiklar i supernatanten. Förtydliga alla prover genom centrifugering vid 200 x g i 5 minuter för att pelletera cellulärt skräp.
    OBS: Vid denna tidpunkt kan proverna frysas vid -80 °C, eller analyseras omedelbart.

6. Påvisande av ZIKV genom infektiös analys

  1. I en BSC, förbereda 24 väl vävnad kultur plattor med Vero celler (105 celler per brunn) 24 h före uppkomsten av den infektiösa analysen. Märk varje brunn med identiteten på en enda mygga / prov.
  2. Om proverna frystes vid -80 °C, låt tina.
  3. Ta bort mediet från Veros cellplattor före inokulering med prover en platta i taget.
  4. För prover som innehåller kroppar eller ben, försiktigt alikvot 100 μL klarnad supernatant i varje brunn, var försiktig så att du inte stör myggcellsskräpet från pelleten.
    OBS: Salivprover kan spädas ut 1:1 (v/v) med MCM före inokulering på celler för att vid behov bevara prover för senare titrering.
  5. Flytta plattorna till en 37 °C, 5% CO2 inkubator och inkubera i 1 h.
  6. Sätt tillbaka plattorna till BSC och tillsätt ~ 1 ml metylcellulosaöverlägg till varje brunn. Placera de överfyllda plattorna i en 37 °C, 5% CO2 inkubator och inkubera i 3−7 dagar (virus/stamberoende).
  7. Utför fixering och visualisering enligt beskrivningen i steg 3.6−3.9.
  8. När det gäller poängsättning via en fokusformningsanalys, kvantifiera de positiva brunnarna genom undersökning under ett ljusmikroskop. Påvisande av intracytoplasmisk färgning av celler i en brunn indikerar närvaron av virus. Proverna poängsatts endast som fokuspositiva eller -negativa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre populationer av Ae. aegypti från Amerika (Salvador, Brasilien; Dominikanska republiken; och Rio Grande Valley, TX, USA) utsattes för en utbrottsstam av ZIKV från Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexiko, 2015) över en rad blodmjölstitrar (4, 5 och 6 log10 FFU/mL) presenterade i en tvättad mänsklig erytocyt. Vid dag 2, 4, 7, 10 och 14 postinfection bearbetades undergrupper av myggor för att bestämma infektion, spridning och potentiella överföringshastigheter.

Vid en blodmjöl titer av 4 log10 FFU/mL zikv Mex 1−7, Ae. aegypti från Salvador, Brasilien smittades med hastigheter av 12,5% och 11,1% efter 4 och 14 dagar av extrinsic inkubation, respektive, utan några tecken på spridd infektion observeras i de analyserade benen, och inget virus upptäckt i saliven (figur 1). Att öka titer till 5 log10 FFU/mL resulterade i en marginell ökning av smittsamhet med priser på 22,2%, 33,3% och 22,2% på dag 4, 10 respektive 14 postinfection. I likhet med vad som observerades i kohorten som exponerades för 4 log10 FFU/mL observerades inga spridda infektioner eller överföringskompetens vid någon tidpunkt (figur 1b). Vid den högsta undersökta titer (6 log10 FFU/mL) identifierades inga infektioner efter 2 dagars inkubation, men infektioner observerades vid alla andra tidpunkter, med en topp på 88,9% av 10 dagar av extrinsic inkubation. ZIKV upptäcktes i benen på myggor som undersöktes vid 10 och 14 dagar postinfection (22,2% respektive 66,7%), vilket indikerar att ZIKV hade spridit sig till hemocoel, även om infektiös ZIKV observerades i saliv vid dessa tidpunkter (figur 1c).

Ae. aegypti populationen från Dominikanska republiken visade sig vara den mest mottagliga för ZIKV infektion och var överföring kompetent efter exponering för alla testade blodmjöl titer. En viss infektionsnivå observerades vid alla tidpunkter vid alla tre testade doser, med den lägsta observerade frekvensen 2 dagar efter utstötning vid 4 log10 FFU/mL (25%) (figur 1d). Med blodmjöl titers av 5 log10 och 6 log10 FFU/ mL villkor infektionsfrekvensen toppade på 100%, med 100% infektion observerad så tidigt som 4 dagar postinfektion i populationen av myggor utsatta för 6 log10 FFU / mL ZIKV (Figur 1e,f). Myggor matade alla tre doserna visade spridning med 7 dagar postinfection, topp på 44,4% (4 logg10 FFU/mL, 14 dagar postinfection), 88,9% (5 log10 FFU/mL, 1 och 14 dagar postinfection) och 100% (6 log10 FFU/mL, 10 dagar postinfection). Överföringskompetens observerades efter alla tre doserna (11,1%, 22,2% och 22,2% vid 4, 5 respektive 6 log10 FFU/mL), men först efter en 14 dagars extrinsisk inkubationstid (EIP) (figur 1d−f).

Ae. aegypti befolkningen från Rio Grande Valley, TX, visade sig vara relativt eldfast till infektion med ZIKV. Myggor som exponerades för blodmjöl titers av 4 log10 FFU/mL, smittades så tidigt som 4 dagar postinfection, med infektion priser mellan 22,2% och 44,4%. Med dessa exponeringsförhållanden observerades spridade infektioner vid 14 dagars postinfektion med en hastighet av 11,1%, och ingen överföringskompetens observerades (figur 1g). En tiofaldig ökning av blodmjöl titer gav ett i stort sett liknande resultat, med infektioner observerade från och med 4 dagar postexposure (33,3% och 44,4%), medan spridda infektioner hittades efter 14 dagar av extrinsisk inkubation med en hastighet av 22,2% (figur 1h). Slutligen, i kohorten exponeras för en 6 log10 FFU/mL blodmjöl, observerades infektion med början från 2 dagars postinfection tid punkt (22,2%) och nådde toppar vid 4, 10 och 14 dagar postinfection (66,7%). Spridas infektioner i detta tillstånd började observeras vid 7 dagar postinfection (11,1%) och toppade på 44,4% vid 14 dagar postinfection. Endast en enda mygga (11,1%) observerades vara överföringskompatibla vid 10 dagars postinfektion (figur 1i).

Figure 1
Figur 1: Representativa vektorkompetensdata för olika Ae. aegypti populationer för ZIKV Mex 1−7. (a−c) Vektorkompetens hos Ae. aegypti från Salvador, Brasilien (F2). (d−f) Vektorkompetens hos Ae. aegypti från Dominikanska republiken (F6). (g−i) Vektorkompetens hos Ae. aegypti från Rio Grande Valley, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti exponerad för 4 logg10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. b,e,h) Ae. aegypti exponerad för 5 logg10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti exponerad för 6 logg10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. Vid varje tidpunkt (2, 4, 7, 10 och 14 dagar efterktion) samlades en delmängd myggor in och provtogs. Infektion, spridning och överföringshastigheter presenteras som antalet positiva slaktkropps-/ben-/salivprover över antalet myggor som analyserats vid den tidpunkten. Infektion representeras i blå, spridas infektioner representerade i grönt och överföringshastighet representeras i rött. Uppgifterna i denna siffra ändras från Roundy och Azar etal.32. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoderna som beskrivs här ger ett generaliserat arbetsflöde för att genomföra vektorkompetensanalyser. Som en allmän ram bevaras många av dessa metoder i hela litteraturen. Det finns dock stort utrymme för ändringar (granskas i Azar och Weaver1). Virus (t.ex. virus härstamning, lagring av utmaningsvirus, viral passagehistoria), entomologi (t.ex. laboratoriekolonisering av myggpopulationer, medfödd immunitet, myggmikrobiom/virom) och experimentella variabler (t.ex. blodmjölssammansättning, sekventiell blodmatning och inkubationstemperatur) är alla kända för att påverka vektorkompetensen. Metodvariationer i kompetensstudier har visat sig vara problematiska i samband med ZIKV-utbrottet eftersom det har uteslutit formella metaanalyser1,33.

Inom denna allmänna metodik kan vikten av lämplig svält av myggor och blodmjölsmakeup inte överskattas. Uttorkning är känt för att driva blodmatningsbeteende hos myggor i laboratorieparadigm34, vilket understryker värdet av socker och vattensvält innan de erbjuder ett infektiöst blodsocker. Medan berövande av socker i 36-48 h och vatten i 2-4 h före exponering för blodmjölet tolereras väl av Ae. aegypti, är det värt att notera att dessa myggor är notoriskt lätta att arbeta med i laboratorieförhållanden2. Sådana aggressiva svältregimer kanske inte tolereras lika väl av andra myggarter, vilket kräver en viss grad av intern optimering. På samma sätt kan blodmjölsinnehåll informeras av värdpreferenser. Till exempel, att använda mänskligt blod för att förbereda ett blodmjöl för antropofila myggor som Ae. aegypti är helt lämpligt, men mänskliga blodmjöl gjorda för ornithophilic arter som Culex quinquefasciatus kan visa sig mindre effektiv35. Dessutom, när det gäller blodmjölsmontering, är användningen av relativt färska blodprodukter mycket tillrådligt för att minimera hemolys av erytrocyter.

En av de största begränsningarna för vektorkompetensbedömning som helhet och de förfaranden som beskrivs häri är att dessa studier till stor del är begränsade till att undersöka virus med hjälp av myggor som kan upprätthållas under laboratorieförhållanden. Ae. aegypti, medan en mycket relevant vektor för en mängd patogener av klinisk betydelse, råkar också vara en av de enklaste myggorna att föda upp och underhålla i laboratoriekolonier1,31,36,37. Föga förvånande är Ae. aegypti-populationernas kompetens ofta den bäst karakteriserade bland vanliga vektormyggor2. Detta är särskilt problematiskt i samband med arbovirus som upprätthåller både enzootiska och urbana överföringscykler38,39,40, eftersom vektorkompetens i allmänhet endast utförs i samband med de mer dragbara urbana myggorna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi bekräftar personalen vid World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton och Divya Mirchandani, för deras outtröttliga arbete med att kurera och tillhandahålla många av de virusstammar som används för våra och andra gruppers vektorkompetensexperiment. Det presenterade arbetet finansierades av McLaughlin Fellowship Fund (SRA) och NIH-bidrag ai120942 och AI121452.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Immunologi och infektion nummer 159 mygga vektorkompetens Aedes Aedes aegypti arbovirus Zika
Vektorkompetensanalyser på <em>Aedes aegypti</em> myggor med Zika Virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector… More

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter