Summary
पर्यावरणीय एलर्जी जैसे घर की धूल के कण (एचडीएम) में अक्सर माइक्रोबियल पदार्थ होते हैं जो एलर्जी सूजन को विनियमित करने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एचडीएम एलर्जी में डीएसआरएनए प्रजातियों की पहचान और इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन में उनकी इम्यूनोजेनिक गतिविधियों के लक्षण वर्णन को दर्शाता है।
Abstract
पर्यावरणीय एलर्जी जैसे घर की धूल के कण (एचडीएम) अक्सर जटिल रूपों में होते हैं जिनमें एलर्जी प्रोटीन दोनों होते हैं जो गुमराह प्रकार 2 प्रतिक्रियाओं और माइक्रोबियल पदार्थों को ड्राइव करते हैं जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं। ये एलर्जी से जुड़े माइक्रोबियल घटक एलर्जी अस्थमा जैसी टाइप 2 भड़काऊ स्थितियों के विकास को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अपरिभाषित रहते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल संरचनात्मक विशेषताओं और एलर्जेन से जुड़े इम्यूनोस्टिमुलेटरी आरएनए की वीवो गतिविधि में निर्धारित करता है। विशेष रूप से, सामान्य एलर्जी की जांच डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) प्रजातियों की उपस्थिति के लिए की जाती है जो फेफड़ों में आईएफएन प्रतिक्रियाओं को प्रोत्साहित कर सकती हैं और एचडीएम-प्रेरित एलर्जी अस्थमा के माउस मॉडल में गंभीर फेफड़ों के इओसिनोफिलिया के विकास को नियंत्रित कर सकती हैं। यहां, हमने निम्नलिखित तीन परखों को शामिल किया है: डी डॉट दाग कुल आरएनए में डीएसआरएनए संरचनाओं को दिखाने के लिए एचडीएम प्रजातियों सहित एलर्जी से अलग, आर टी-क्यूपीसीआर में एचडीएम आरएनए की गतिविधियों को मापने के लिए माउस फेफड़ों और FACS विश्लेषण में इंटरफेरॉन उत्तेजक जीन (आईएसजी) अभिव्यक्ति में क्रमशः बाल और फेफड़ों में eosinophils की संख्या पर HDM आरएनए के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए ।
Introduction
मूल रूप से स्ट्रैचन1द्वारा प्रस्तावित स्वच्छता परिकल्पना के आधार पर , एंडोटॉक्सिन जैसे पर्यावरणीय माइक्रोबियल कारकों के लिए बचपन का संपर्क एलर्जी विकारों के विकास से रक्षा कर सकता है2,3. माइक्रोबियल संक्रमण के दौरान, उदाहरण के लिए, वायरल संक्रमण, विदेशी न्यूक्लिक एसिड (आरएनए/डीएनए) का जन्मजात प्रतिरक्षा पहचान मेजबान रक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करता है4,,5,,6। हालांकि, घर के धूल के कण (एचडीएम) या अन्य कीट एलर्जी में लंबे समय तक फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) प्रजातियों जैसे इम्यूनोजेनिक न्यूक्लिक एसिड का अस्तित्व और प्रसार अज्ञात रहता है। यह प्रोटोकॉल यह निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था कि क्या एचडीएम या कीट और गैर-कीट एलर्जी में लंबी डीएसआरएनए प्रजातियां हैं जो एलर्जी अस्थमा के माउस मॉडल में गंभीर इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन के विकास का प्रतिकार करने के लिए एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय कर सकती हैं। यहां, हम एचडीएम टोटल आरएनए में संरचनात्मक निर्धारकों का मूल्यांकन करने के लिए तीन सरल और तेज तरीके प्रदान करते हैं जो एलर्जी-प्रेरित इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन को विनियमित करने के लिए आवश्यक हैं।
म्यूकोसल इम्यून सिस्टम शरीर का सबसे बडा इम्यून ऑर्गन है और माइक्रोबियल इन्फेक्शन और एलर्जिक दोनों के अपमान के खिलाफ मेजबान रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करता है7,8. कई वायरसों के मध्यवर्ती लंबे dsRNA, एक रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न (PAMP) के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है ताकि इंटरफेरॉन उत्तेजित जीन (आईएसजी)9,,11,1210, 11, 12,,13,14की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए रिसेप्टर 3 (टीएलआर3) जैसे टोल के माध्यम से जन्मजात प्रतिक्रियाओं को शक्तिशाली रूप से उत्तेजित किया जा सके।,, हमने हाल ही में दिखाया है कि एचडीएम टोटल आरएनए में डीएसआरएनए संरचनाएं थीं, जिन्होंने आईएसजी की अभिव्यक्ति को बढ़ाया और एचडीएम अर्क15द्वारा प्रेरित एलर्जी अस्थमा के मुरीन मॉडल में इंट्राचेल इंसिलेशन के माध्यम से प्रशासित होने पर गंभीर इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन को कम किया। फेफड़ों की सूजन की गंभीरता का निर्धारण ब्रोंकोलवेओलर लावेज (बाल) और फेफड़ों के ऊतकों में प्रवाह साइटोमेट्री16 , 17 , 18,,19,20,के माध्यम से प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों का विश्लेषण करके कियाजाताहै ।20
इस प्रोटोकॉल में तीन परख शामिल हैं: 1) माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जे 2 का उपयोग करके आरएनए डॉट दाग के साथ डीएसआरएनए संरचनाओं का तेजी से पता लगाना जो विशेष रूप से एक अनुक्रम-स्वतंत्र तरीके से डीएसआरएनए (40bp) से बांधता है; 2) आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके आईएसजी के प्रेरण को मापकर माउस फेफड़ों में इम्यूनोस्टिमुलेटरी आरएनए के वीवो प्रभावों के लिए त्वरित मूल्यांकन; 3) प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके एचडीएम-प्रेरित फेफड़ों की सूजन के संदर्भ में बाल और फेफड़ों में इओसिनोफिल का सटीक मात्राकरण।
उपरोक्त परख का उपयोग न केवल एलर्जी फेफड़ों की बीमारियों, बल्कि श्वसन जीवाणु और वायरल संक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डीएसआरएनए विशिष्ट जे 2 एंटीबॉडी का उपयोग अन्य अनुप्रयोगों जैसे इम्यूनोएफिनिटी क्रोमेटोग्राफी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरेब्रेंट परख (एलिसा) और इम्यूनोस्टेपिंग21,22,,23में भी किया जा सकता है।, इसके अलावा, बाल द्रव संग्रह के डाउनस्ट्रीम कई अनुप्रयोगों का उपयोग एलिसा का उपयोग करके साइटोकिन्स और केमोकिंस जैसी घुलनशील सामग्री की मात्रा निर्धारित करने और वायुमार्ग (उदाहरण के लिए, अल्वेलर मैक्रोफेज) में कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग के लिए किया जा सकता है। यद्यपि फेफड़ों की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए साहित्य में विभिन्न प्रकार के प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल अक्सर लक्ष्य सत्यापन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। यहां वर्णित प्रक्रियाओं को पर्यावरण एलर्जी में घटकों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है जो एलर्जी रोगों के विकास को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
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Protocol
यहां वर्णित प्रायोगिक प्रक्रियाओं को टेक्सास विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य सैन एंटोनियो की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. डॉट दाग HDM कुल आरएनए में dsRNA संरचनाओं की उपस्थिति दिखाने के लिए
- एलर्जी, कीड़े और गैर-कीट एलर्जी से कुल आरएनए अलगाव
- एचडीएम, कीड़े, या गैर-कीट जानवरों को जीवित या व्यावसायिक रूप से 50 एमएल ट्यूबों में एकत्र करें, और तरल-एन2के साथ जल्दी से फ्रीज करें। फिर बाद के कुल आरएनए अलगाव के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: इस प्रयोग में, एचडीएम, कीट और गैर-कीट जानवरों का चयन किया गया था क्योंकि उन्हें एलर्जी के सामान्य स्रोत के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, उनके आरएनए का एक इम्यूनोस्टिमुलेटरी फंक्शन अस्पष्ट बना हुआ है । - एक उचित राशि (मात्रा या उससे कम मात्रा में 100 माइक्रोन के बराबर) एचडीएम, कीड़े या गैर-कीट जानवरों को -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत मोतियों (1.4 मिमी सिरेमिक क्षेत्रों) में स्थानांतरित करें, फिर ~ 10 मिनट के लिए तरल-एन2 कंटेनर में ट्यूबों को फ्रीज करें।
- कुल आरएनए अलगाव के लिए, प्रत्येक ट्यूब में 24 ग्वानिनियम थिओसाइनेट आधारित आरएनए आइसोलेशन के1 मिलियन जोड़ें, फिर कीट और गैर-कीट छोटे जानवरों को 45 एस के लिए अधिकतम गति से उच्च ऊर्जा सेल बाधित करने वाले और बर्फ पर ठंडा करें। इस स्टेप को दो बार दोहराएं।
- समाधान को चरण 1.1.3 से एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रत्येक ट्यूब और भंवर में क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 14 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब।
- एक बार अपकेंद्रित्र पूरा हो जाने के बाद, ऊपरी जलीय चरण (200 माइक्रोल) को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 500 माइक्रोनल आइसोप्रोपेनॉल होता है ताकि आरएनए गोली को कम किया जा सके। इंटरफेज में परेशान न हों। ऊपरी चरण बनाम आइसोप्रोपैनॉल का अनुशंसित मात्रा अनुपात 1:2.5 अनुपात है।
- कोमल भंवर से मिलाएं, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 14 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब।
- सावधानी के साथ सुपरनेट को एस्पिरेट करें फिर आरएनए पेलेट को 75% इथेनॉल के 500 माइक्रोल के साथ धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सावधानी के साथ सभी तरल निकालें, हवा-गोली सूखी और RNase मुक्त एच 2 ओ के 20-50μLके साथ आरएनए गोली भंग ।
- निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग कर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए एकाग्रता को मापें:
- संबंधित सॉफ्टवेयर खोलें और मापने के लिए न्यूक्लिक एसिड के प्रकार का चयन करें। नमूना प्रकार को आरएनए में बदलें।
- RNase-मुक्त एच 2 O के 1-2माइक्रोनके साथ खाली माप करें RNase-मुक्त एच2O को मिटा दें। अब, साधन माप के लिए तैयार है।
- आरएनए नमूने के 1-2 μL लोड और आरएनए एकाग्रता (μg/μL) को मापने।
नोट: ~ 2.0 (1.9-2.2) पर 260 और 280 एनएम (A260/280) पर अवशोषण का अनुपात आम तौर पर आरएनए के लिए "शुद्ध" के रूप में स्वीकार किया जाता है। यदि तुरंत कार्रवाई नहीं की जाती है, तो आरएनए नमूनों को -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और आरएनए को बरकरार रखने के लिए फ्रीज-गल चक्रों से बचें।
- एचडीएम, कीड़े, या गैर-कीट जानवरों को जीवित या व्यावसायिक रूप से 50 एमएल ट्यूबों में एकत्र करें, और तरल-एन2के साथ जल्दी से फ्रीज करें। फिर बाद के कुल आरएनए अलगाव के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- DsRNA विशिष्ट J2 एंटीबॉडी का उपयोग कर कुल आरएनए में DsRNA संरचना का पता लगाना
- आरएनए नमूनों के दो 20 माइक्रोन (200 एनजी/μL) तैयार करें। RNase-III उपचार के साथ एक (1 माइक्रोन आरएनए के लिए 1 माइक्रोन, 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट), और दूसरा आरएनएसई-III उपचार के बिना।
नोट: RNase III यहां विशेष रूप से dsRNA नीचा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक भी फंसे आरएनए25नहीं । - ग्रिड आकर्षित करने के लिए एक पेंसिल का उपयोग करें जहां आरएनए नमूने झिल्ली पर दाग दिए जाएंगे।
- सकारात्मक आवेशित नायलॉन झिल्ली पर आरएनए नमूने के 200 एनजी/μL के स्पॉट 2 μL।
- एक यूवी क्रॉसलिंकर में 1,200 माइक्रोजूल x 100 पर झिल्ली के लिए नमूनों को क्रॉसलिंक करें। नमूना स्थान स्थान पर दो बार 1.2.3 और 1.2.4 बार कदम दोहराएं। इसके परिणामस्वरूप प्रति दाग कुल 0.8 माइक्रोग्राम होगा।
नोट: एक समय में झिल्ली पर आरएनए नमूने के 2 से अधिक माइक्रोन हाजिर न करें। - कमरे के तापमान पर मिलाते हुए 1 घंटे के लिए टीबीएस-टी में 5% दूध के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक करें। स्टेप 1.2.5 से ब्लॉकिंग समाधान निकालें और टीबीएस-टी में 1% दूध में 1:1,000 कमजोर पड़ने पर एंटी-डीएसआरएनए जे2 एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए रात भर इनक्यूबेट करें।
- 5 मिनट के लिए टीबीएस-टी के साथ झिल्ली धोएं और 3 बार के लिए इस कदम को दोहराएं। माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित एंटी-माउस आईजीजी 1% दूध 1:5,000 में पतला) और कमरे के तापमान पर एक शेखर पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए टीबीएस-टी के साथ झिल्ली धोएं और 3x के लिए इस कदम को दोहराएं।
- सब्सट्रेट (बीसीआईपी/एनबीटी) डालें और 5-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि कोई वांछित सिग्नल दिखाई न दे।
- डीडीएच2ओ के साथ झिल्ली को कुल्ला करके प्रतिक्रिया को रोकें।
- ऊतक के कागजों पर झिल्ली को सुखाएं और स्मार्टफोन का उपयोग करके एक तस्वीर लें (एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1में दिखाया गया है)।
- आरएनए नमूनों के दो 20 माइक्रोन (200 एनजी/μL) तैयार करें। RNase-III उपचार के साथ एक (1 माइक्रोन आरएनए के लिए 1 माइक्रोन, 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट), और दूसरा आरएनएसई-III उपचार के बिना।
2. फेफड़ों आईएसजीएस अभिव्यक्ति को उत्तेजित करने में एचडीएम कुल आरएनए की क्षमता को मापने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर
- चूहों फेफड़ों के ऊतकों से आरएनए अलगाव
नोट: चूहों (महिला, 8-12 सप्ताह पुराने, C57BL/6J) विशिष्ट रोगजनक मुक्त शर्तों के तहत बनाए रखा गया ।- संक्षेप में आइसोफ्लुन के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें और आरएनएज़ III के साथ या बिना इलाज किए गए एचडीएम आरएनए के 5 माइक्रोन (80 माइक्रोन पीबीएस में पतला) के साथ इंट्राचेल इन्स्टिलेशन के माध्यम से प्रशासित करें।
- 16-18 एच पोस्ट एचडीएम आरएनए उपचार के बाद, कुछ मिनटों के लिए सीओ2 साँस लेना द्वारा माउस का बलिदान करें। फिर, माउस को एक मंच पर रखें और सुइयों के साथ अंगों को पिन करें।
- माउस को 70% इथेनॉल से कीटाणुरहित करें फिर त्वचा को पेट से गर्दन तक एक निष्फल कैंची से काटें।
- सुइयों के साथ त्वचा को ठीक करें और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए पसलियों को काटें। पूरे फेफड़ों को निकाल कर ठंडे पीबीएस से धो लें। ऊतक के कागजात पर फेफड़ों को रखें और प्रत्येक फेफड़े-पालि का एक छोटा सा टुकड़ा 2 एमएल ट्यूब में रखें जिसमें मोतियों (मात्रा में 200-300 माइक्रोन, 1.4 मिमी सिरेमिक क्षेत्र) होते हैं।
नोट: सिरेमिक मोतियों का उपयोग करने का उद्देश्य पूरे फेफड़ों के ऊतकों को पीसना है - ~ 10 मिनट के लिए एक तरल-एन2 कंटेनर में ट्यूब रखकर फेफड़ों के नमूनों को फ्रीज करें।
- प्रत्येक ट्यूब में ग्वानिनियम थिओसाइनेट-आधारित आरएनए आइसोलेशन रिएजेंट के 500 माइक्रोन जोड़ें और प्रत्येक चरण के बीच बर्फ पर 45 एस ठंडा करने के लिए एक समरूप के साथ फेफड़ों के ऊतकों को तोड़ें। इस स्टेप को दो बार दोहराएं।
- फेफड़ों के आरएनए अलगाव के लिए चरण 1.1.4- 1.1.7 का पालन करें।
- हवा-गोली सूखी और RNase मुक्त एच 2 ओ (~20-30μL) की उचित मात्रा के साथ आरएनए गोली भंग ।
- चरण 1.1.8 में वर्णित आरएनए एकाग्रता को मापें।
- फेफड़ों के जीन अभिव्यक्ति को उत्तेजित करने में एचडीएम आरएनए की क्षमता निर्धारित करने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर।
- टेम्पलेट के रूप में फेफड़ों के ऊतकों से निकाले गए आरएनए के 100 एनजी/μL का उपयोग करना, संदर्भित प्रोटोकॉल26के अनुसार सीडीएनए संश्लेषण करें।
- ऊपर उत्पन्न सीडीएनए और जीन-विशिष्ट प्राइमर जोड़े (तालिका 1 और तालिका 2)का उपयोग करके 384-अच्छी प्लेट के लिए10 माइक्रोल/वेल पर एक आरटी-क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें।
- एक पारदर्शी चिपकने वाली फिल्म के साथ कुओं को कसकर सील करें और 30 एस के लिए प्लेट को भंवर दें। 30 एस के लिए प्लेट को 1,000 x ग्राम पर स्पिन करें ताकि कुओं के तल पर नमूने एकत्र किए जा सके।
- प्लेट को आरटी-क्यूपीसीआर मशीन पर लोड करें और थर्मल साइकिलर प्रोटोकॉल(टेबल 3)का उपयोग करके आरटी-क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया को चलाना शुरू करें।
- परिणामों को स्प्रेडशीट फ़ाइल में निर्यात करें या कार्यक्रम पूरा होने के बाद निर्माण द्वारा प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें (एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2में दिखाया गया है)।
3. बाल और फेफड़ों में eosinophils की घुसपैठ पर HDM आरएनए के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए FACS विश्लेषण
- FACS विश्लेषण के लिए बाल द्रव संग्रह
- इच्छामृत्यु चूहों (महिला, 8-12 सप्ताह पुराने, C57BL/6J) कि HDM एलर्जी अर्क के साथ इलाज किया गया (चित्रा 3Bमें दिखाया प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार) सीओ2 साँस लेना द्वारा ।
- माउस को एक मंच पर रखें और सुइयों के साथ अंगों को पिन करें।
- माउस को 70% इथेनॉल से कीटाणुरहित करें। पेट के ऊपरी हिस्से से गर्दन तक त्वचा को काटने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
- धीरे-धीरे, श्वासनली को बेनकाब करने के लिए संदंश का उपयोग करके लार ग्रंथियों और स्टर्नोयोइड मांसपेशियों को सावधानी से खींचें। संदंश का उपयोग कर श्वासनली के नीचे एक नायलॉन स्ट्रिंग (~ 10 सेमी) रखें।
- एक कैनुला डालने के लिए बस पर्याप्त श्वासनली (गला के नीचे ~ 2 मिमी) में एक चीरा बनाओ। श्वासनली के माध्यम से न काटें। श्वासनली और कैनुला के चारों ओर स्ट्रिंग गाँठ।
- पीबीएस + ईडीटीए के 1 एमएल के साथ सिरिंज लोड करें और इसे कैनुला के अंत तक संलग्न करें। फेफड़ों में पीबीएस + ईडीटीए के 1 एमएल इंजेक्ट करें और समाधान को पूरी तरह से एस्पिरेट करें। कैनुला से सिरिंज को सावधानी से अलग करें और समाधान को बर्फ पर 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- ताजा PBS + EDTA के साथ सिरिंज फिर से लोड और इस कदम 2x दोहराएं ।
- सेंटीफ्यूज पूल्ड बाल युक्त ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मारने के लिए चरण 3.1.7 में प्राप्त की गई। बाल तरल पदार्थ की मात्रा रिकॉर्ड करें फिर गोली को परेशान किए बिना सुपरनैंट को दो 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: बाल के सुपरनैंट को भविष्य के विश्लेषण के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जैसे, एलिसा। - यदि फेफड़ों में गंभीर सूजन के कारण गोली में आरबीसी मौजूद हैं, तो सुपरनेट को हटाने के बाद, आरबीसी लाइसिस बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें और पुनर्स्पिति द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 एक्स ग्राम की गति से 7 मिनट के लिए एक नई 1.5 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में स्थानांतरित करें।
- सुपरनैंट निकालें और 150 माइक्रोन में पेलेट को रीसस्ट करें।
- पुनर्संपित नमूने के 150 माइक्रोन को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 एक्स ग्राम की गति से 7 मिनट के लिए प्लेट को अपकेंद्रित्र करें।
- जल्दी से, कुओं के तल पर रहने वाली कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ऊतक के कागजात पर प्लेट उलटा।
- 2.4G2 अवरुद्ध एंटीबॉडी (2.5 μg/ एक अंधेरे जगह में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट।
- धुंधला होने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मारने के लिए प्लेट को अपकेंद्रित्र करें।
- ऊतक कागज पर थाली उलटा द्वारा धुंधला समाधान निकालें तो FACS बफर के १०० μL के साथ खर्च करके धो । इसके बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर प्लेट को फिर से अपकाइज करें और टिश्यू पेपर पर प्लेट को उलटा करके एफएएफएस बफर को हटा दें।
- नमूनों को 150 माइक्रोन में FACS बफर में स्थानांतरित करें और नमूनों को FACS बफर के 350 माइक्रोन युक्त एफएसीएस ट्यूबों में स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने में मोतियों की गिनती के 25 माइक्रोन जोड़ें। नमूने अब प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार हैं।
नोट: बाल तरल पदार्थ में विभिन्न सेल प्रकारों को एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था जैसा कि संकेत दिया गया था। FACS चलाने से पहले गिनती मोती जोड़ा गया । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण किया गया। गेटिंग रणनीति के लिए चित्रा 3 और तालिका 4 को देखें।
- FACS विश्लेषण के लिए फेफड़ों के ऊतकों पाचन
- चरणों का पालन करें 3.1.1 - 3.1.3.
- त्वचा को पेट से गर्दन तक एक निष्फल कैंची से काटें। सुइयों के साथ त्वचा को ठीक करें और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए पसलियों को काटें।
- पूरे फेफड़ों को निकाल कर ठंडे पीबीएस से धो लें। फेफड़ों के पाचन समाधान के 50 माइक्रोन युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में नमूने रखें।
- फेफड़ों के ऊतकों को घुमावदार कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में कीमा बना लें। फेफड़ों के ऊतकों को 6-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें, फिर फेफड़ों के पाचन समाधान के 8 एमएल जोड़ें। थाली को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक शेकर पर रखें।
- इनक्यूबेशन के बाद, फेफड़ों के ऊतकों को पीसने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब के शीर्ष का उपयोग करें। एक नई 6-वेल प्लेट पर 70 माइक्रोन स्ट्रीपर रखें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से नमूना लागू करें।
- फ़िल्टर किए गए समाधान को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और आरबीसी लाइसिस बफर के 1 एमसीएल में गोली को फिर से खर्च करें और इसे 3 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
- नमूना 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। 2x दोहराएं
- फेफड़ों की कोशिकाओं को 1 एमएल FACS बफर के साथ 2x धोएं। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और लेफेस बफर के 1 एमसीएल में गोली को फिर से खर्च करें, और फिर नमूने के 100 माइक्रोन को 96 वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम की गति से 7 मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रलाइज करें। पचा फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों की कोशिकाओं को दाग करने के लिए FACS विश्लेषण (3.1.13 से 3.1.16) के लिए बाल द्रव संग्रह में वर्णित चरणों का पालन करें।
नोट: फेफड़ों में Eosinophils एंटीबॉडी के साथ लेबल के रूप में संकेत दिया गया था, तो आगे FACS विश्लेषण के लिए मोती गिनती के साथ मिलाया । संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण किया गया। एचडीएम आरएनए-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए चित्रा 3 को देखें।
4. सांख्यिकीय विश्लेषण
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
- दो समूहों की तुलना के लिए बिना पूंछ वाले दो पूंछ वाले छात्र टी परीक्षण द्वारा पी मूल्यों का निर्धारण करें।
- सूत्र का उपयोग कर संदर्भ मोती (शीर्ष पैनल) के आधार पर eosinophils की पूर्ण संख्या की गणना
- दो से अधिक समूहों की तुलना के लिए दो तरह से ANOVA और Sidak के कई तुलना परीक्षण द्वारा पी मूल्यों का निर्धारण करें ।
- सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में 0.05 से छोटे पी मूल्य पर विचार करें। पी मानों को भूखंडों पर *पी एंड एलटी;0.05, **पीएंडटी;0.01, ***पीएंडटी;0.001, और ***** पी एंड एलटी; 0.0001 के रूप में दर्शाया गया है।
नोट: सभी बफर व्यंजनों तालिका 5में प्रदान की जाती हैं ।
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Representative Results
एचडीएम, कीड़े और गैर-कीट छोटे जानवरों में लंबी डीएसआरएनए संरचनाओं की उपस्थिति की जांच डॉट दाग द्वारा एक dsRNA-विशिष्ट माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जे 2 (40bp) का उपयोग करके की गई थी। RNase III का उपयोग DsRNA को 12-15 बीपी डीएसआरएनए टुकड़ों में पचाने के लिए किया गया था, जो J2(चित्र 1)द्वारा अज्ञेय थे।
खुराक-निर्भर तरीके से माउस फेफड़ों में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए एचडीएम कुल आरएनए की क्षमता का विश्लेषण आरटी-क्यूपीसीआर(चित्रा 2,ऊपरी) द्वारा किया गया था। आरएनएनई III उपचार ने एचडीएम टोटल आरएनए की इम्यूनोस्टिमुलेटरी गतिविधि को समाप्त कर दिया, जो यह दर्शाता है कि एचडीएम टोटल आरएनए में डीएसआरएनए संरचनाएं फेफड़ों में जन्मजात प्रतिरक्षा गतिविधि(चित्रा 2, निचले)के लिए आवश्यक हैं।
एक गंभीर प्रकार 2 फेफड़ों की सूजन के विकास पर HDM कुल आरएनए के निरोधात्मक प्रभाव FACS विश्लेषण(चित्रा 3A)के साथ मूल्यांकन किया गया । इस अध्ययन में, इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन को एचडीएम अर्क द्वारा प्रेरित किया गया था, जिसे प्रायोगिक डिजाइन(चित्रा 3B)में चित्रित के रूप में RNase III के साथ या बिना इलाज किया गया था। RNase III उपचार HDM अर्क से लंबी dsRNA प्रजातियों को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, लंबी dsRNA प्रजातियों के क्षरण के परिणामस्वरूप गंभीर प्रकार 2 फेफड़ों की सूजन बाल और फेफड़ों में बढ़ी हुई eosinophils संख्या से परिलक्षित हुई। विशेष रूप से, एचडीएम कुल आरएनए-इलाज समूह में इओसिनोफिल की संख्या मूल एचडीएम अर्क के साथ इलाज किए गए समूह के बराबर है जिसमें अंतर्जात रूप से लंबी डीएसआरएनए प्रजातियां(चित्रा 3 बी)शामिल हैं।
चित्रा 1: डॉट दाग का उपयोग करके डीएसआरएनए विशिष्ट जे 2 एबी द्वारा एचडीएम आरएनए में डीएसआरएनए संरचनाओं का पता लगाना। डर्माटोफेगाइड्स फरीने (डी.एफ.) और डर्माटोफाइड्स पेट्रोनिसिनस (डीपी) सहित विभिन्न एयरोएलरजेन्स से कुल आरएनए को डीएसआरएनए(बाएं पैनल)का पता लगाने के लिए नायलॉन झिल्ली पर दाग दिया गया था। HDM (D.f. और D.p.) आरएनए को अनुपचारित छोड़ दिया गया था (-), RNase III (dsRNA-विशिष्ट नाभिक) और RNase T1 (ssRNA विशिष्ट नाभिक)(दाएं पैनल)के साथ इलाज किया । यह आंकड़ा वह एट अल से फिर से मुद्रितहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एचडीएम (डी.एफ.) से कुल आरएनए द्वारा आईएसजी एमआरएनए अभिव्यक्ति को शामिल करने को आरटी-पीसीआर द्वारा मापा गया था। जब माउस फेफड़ों में वितरित किया जाता है, तो एचडीएम आरएनए खुराक-निर्भर तरीके(ऊपरी पैनल)में आईएसजी की अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने में सक्षम था। RNase III उपचार HDM आरएनए(निचले पैनल)की प्रतिरक्षा उत्तेजक गतिविधि को समाप्त कर दिया । यह आंकड़ा वह एट अल से फिर से मुद्रितहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: वायुमार्ग में विशिष्ट कोशिका प्रकारों का लक्षण वर्णन और बाल द्रव और फेफड़ों के इओसिनोफिल का मूल्यांकन। (क)बाल द्रव से बरामद कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति को कोशिका सतह मार्कर के लिए दाग दिया गया था जैसा कि संकेत दिया गया था । (B)5 μg/माउस (ब्लू बार) बनाम नियंत्रण माउस फेफड़े आरएनए (लाल बार) पर HDM (D.f.) आरएनए का प्रशासन । HDM (D.f.) आरएनए लेकिन DsRNA-समाप्त HDM निकालने दोनों एयरवेज और HDM निकालने के साथ इलाज जानवरों के फेफड़ों में eosinophils की संख्या में कमी आई । यह आंकड़ा वह एट अल से फिर से मुद्रितहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| माउस प्राइमर | अनुक्रम (फॉरवर्ड-रिवर्स, 5'→ 3') | |
| आरपीएल19 | AAATCGCCAATCCAACTC; TCTTCCCCATGCCCATCATATGC |
|
| आईएल1 | TCTATACCTGTCCTTTTAATG; जीसीटीटीजीटीसीटीसीटीजीटीजी |
|
| IFIT3 | TGGCCTACATAAAGCACCTAGATGG; सीजीसीएएएएक्टेटटीसीजीटीसीटी |
|
| ISG15 | GAGCTAGAGCCTGCACAAT; टीटीसीजीजीसीटीसीटीसीटीटीटीटीटीटीटीटीटीटीटीटी |
|
| एमएक्स1 | TCTGAAGAAGAGCCAGACGAT; ACTCTGGTCCCCAATGACAG |
|
| OASL2 | GGATGCCTGGGAAGAATCG; टीसीजीसीसीटीसीटीसीजीएएटीजी |
|
| टीएनएफ α | सीसीटीसीसीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीटीटीटीजीजी; जीजीसीटीसीटीसीजीजीटीसीटीजी |
|
तालिका 1: आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर।
| अभिकर्मकों | वॉल्यूम (10 माइक्रोल) | |
| यूनिवर्सल SYBR ग्रीन सुपरमिक्स (2x) | 5 माइक्रोन | |
| फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर (5 माइक्रोन) | 1 माइक्रोन | |
| सीडीएनए टेम्पलेट | 0.4 माइक्रोन | |
| DNase-और RNase मुक्त H2O | 3.6 माइक्रोन | |
तालिका 2: आरटी-क्यूपीसीआर के लिए मास्टर मिक्स सेटअप।
| चरणों | तापमान | समय |
| चरण 1 | 95 ओसी | 3 मिनट |
| चरण 2 | 95 ओसी | 10 सेकंड |
| चरण 3 | 55 ओसी | 30 सेकंड |
| चरण 4 | 2 चरण पर जाएं, (39 चक्रों के लिए 2-3 दोहराएं) | |
| चरण 5 (पिघल वक्र) | 55 ओसी से 95 ओसी | 0.5 ओसी, वेतन वृद्धि (होल्ड समय 5 सेकंड है) |
तालिका 3: आरटी-क्यूपीसीआर चलाने के लिए कार्यक्रम।
| 1. फॉरवर्ड (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) से बना प्लॉट बनाएं। |
| 2. मोतियों की गिनती के लिए एक छोटा सा भूखंड बनाएं (एफएससी कम, फिटसी उच्च)। |
| 3. BV510 डाई का उपयोग कर मृत कोशिकाओं को छोड़कर जीवित कोशिकाओं के लिए केवल गेट के लिए एक साजिश बनाएं। |
| 4. लाइव कोशिकाओं तो CD11c उच्च और CD11c कम आबादी में अलग किया जा सकता है । |
| 5. मैक्रोफेज (सिग्लेसीएफ हाई एमएचसीआईआई कम) और डीसी (सिग्लेसीएफ कम, एमएचसीआईआई हाई) के लिए CD11c हाई पॉपुलेशन गेट से। |
| 6. टी कोशिकाओं के लिए CD11c कम गेट से (CD3/19 उच्च, MHCII कम), और बी कोशिकाओं (CD3/19 उच्च, MHCII उच्च) । |
| 7. CD11c कम CD3/19null सेल आबादी से, न्यूट्रोफिल के लिए गेट (सीडी 11b उच्च, Ly-6G उच्च) और Eosinophils (CD11b उच्च, Ly-6G कम, SiglecF उच्च) । |
| 8. फेफड़ों के ऊतकों में Eosinophils की गेटिंग रणनीति के लिए, बीवी 510 डाई (सीडी 45, सिग्लेसीएफ, सीडी 11 सी) का उपयोग करके मृत कोशिकाओं को छोड़कर इन मार्कर का उपयोग करें। |
तालिका 4: FACS चल रहा है
| टीबीएस: |
| 20 मिमी ट्राइस-एचसीएल |
| 150 मिमी एनएसीएल |
| पीएच 7.5 |
| टीबीएस-टी: |
| टीबीएस में 0.05% ट्वीन-20 |
| बफर को अवरुद्ध करना |
| टीबीएस-टी में 5% गैर-वसा वाला दूध पतला |
| एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर |
| टीबीएस-टी में पतला 1% गैर वसा वाला दूध |
| पीबीएस+एडटा |
| 1x पीबीएस + 0.1 m EDTA |
| FACS बफर |
| 1x पीबीएस में 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) |
| कुल सेल माध्यम |
| आरपीएमआई 1640, 1X ग्लूटामैक्स, 10% एफसीएस, 50 माइक्रोएम 2-मर्केप्टोथेनॉल और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन। |
| फेफड़ों का पाचन समाधान |
| कुल सेल मीडियम प्लस लाइबेरेस (50 माइक्रोग्राम/एमएल) और डैनैस I (1 माइक्रोन/एमएल) |
तालिका 5: बफ़र्स और समाधान के लिए व्यंजनों
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में एलर्जी से जुड़े माइक्रोबियल आरएनए के इम्यूनोस्टिमुलेटरी गुणों और एलर्जी अस्थमा के माउस मॉडल में इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन के विकास पर उनके प्रभावों का मूल्यांकन कैसे किया जाए। यद्यपि लंबे डीएसआरएनए को कई वायरसों के प्रतिकृति मध्यवर्ती के रूप में जाना जाता है जो स्तनधारी कोशिकाओं में इंटरफेरॉन प्रतिक्रियाओं को शक्तिशाली रूप से सक्रिय कर सकते हैं, एचडीएम एलर्जी में उनकी उपस्थिति हमारे हालिया काम15तक अज्ञात रही है। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत आरएनए डॉट ब्लॉट, आरटी-क्यूपीसीआर और एफएसीएस विश्लेषण का संयोजन पर्यावरण एलर्जी में डीएसआरएनए प्रजातियों जैसे जन्मजात घटकों को विच्छेदन करने के लिए एक अच्छा उदाहरण प्रदान कर सकता है जो एलर्जी-प्रेरित ियोसिनोफिलिक सूजन को विनियमित करने में गंभीर रूप से शामिल हैं।
इस प्रोटोकॉल में, आरएनए डॉट दाग को माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जे 2 का उपयोग करके प्राकृतिक एलर्जी में डीएसआरएनए संरचनाओं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया है, जो विशेष रूप से अनुक्रम से स्वतंत्र डीएसआरएनए (40bp) से बांधता है। यह विधि अत्यधिक विश्वसनीय है क्योंकि J2 एंटीबॉडी अभी भी RNase T1 (एकल फंसे आरएनए-विशिष्ट एंडोन्यूक्लिज) के साथ पूर्व नियोजित dsRNA नमूनों को पहचान सकता है, लेकिन RNase III (एक dsRNA-विशिष्ट एंडोक्यूक्लिज़) के साथ पूर्वउपचारित नमूने नहीं हैं। हालांकि, यह इंगित करने लायक है कि DsRNA, पॉलीनोसिनिक: पॉलीसाइटिडिलिक एसिड [पॉली,(आई:सी)]के व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक एनालॉग को जे 22,22,,2223के बजाय एक और विरोधी डीएसआरएनए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के1 से अनिवार्य रूप से बांधने की सूचना दी गई है। इसलिए, पॉली (आई:सी) का पता लगाने के लिए J2 एंटीबॉडी के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है।
बाल या फेफड़ों के ऊतकों से एकत्र नमूनों पर सेल प्रकार विश्लेषण एलर्जी फेफड़ों की सूजन की प्रगति का आकलन करने के लिए उपयोगी है। हालांकि बाल प्रक्रिया एक आम तकनीक है, परिणाम अनुसंधान प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं। कई कारक इन विविधताओं का कारण बन सकते हैं जैसे कि ब्रोंकोल्वोलार लावाज की मात्रा एकत्र की गई है। 8-12 सप्ताह पुराने चूहों से बरामद बाल की आदर्श मात्रा ~ 3 मिलीलीटर19है। एक अन्य कारक जो प्रजनन क्षमता की कमी में योगदान दे सकता है वह यह है कि कैथेटर को श्वासनली में कितना गहरा डाला जाना चाहिए (~ 0.5 सेमी इष्टतम है) क्योंकि कैथेटर की गहरी प्रविष्टि श्वासनली को नुकसान पहुंचा सकती है। इसके अलावा, शोधकर्ताओं को चूहों की उम्र, तनाव और लिंग जैसे अन्य कारकों पर भी विचार करना चाहिए क्योंकि ये कारक प्रयोग परिणामों को,27, 28,,29को बहुत प्रभावित कर सकते हैं।29
यहां, हम वीट्रो में एचडीएम आरएनए के इम्यूनोमोडुलेटरी प्रभावों की विशेषता और वीवो में आरएनए डॉट दाग, आरटी-क्यूपीसीआर और बाल और फेफड़ों के ऊतकों के एफएसीएस विश्लेषण का उपयोग करके एक तकनीकी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। उचित प्रथाएं इन तकनीकों को निष्पादित करते समय प्राप्त परिणामों की सफल प्रजनन क्षमता सुनिश्चित कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, आरएनए डॉट दाग प्रदर्शन करते समय RNases के प्रदूषण से बचने की कोशिश करें। इसके अलावा, अपकेंद्रित्र गति को ठीक से समायोजित किया जाना चाहिए क्योंकि अनावश्यक उच्च अपकेंद्रित्र गति सेल व्यवहार्यता से समझौता कर सकती है। अंत में, FACS विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं को तय किया जाना चाहिए अगर एक ही दिन का विश्लेषण नहीं किया ।
चूंकि जन्मजात प्रतिरक्षा मेजबान रक्षा और सूजन2,,3में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, इसलिए इस पेपर में वर्णित तकनीकें और विधियां टाइप 2 सूजन के विकास में प्राकृतिक एलर्जी में माइक्रोबियल डीएनए जैसे अन्य सहज प्रतिरक्षा घटकों की इम्यूनोमोडुलेटरी भूमिका का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी होंगी।
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Disclosures
हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम सुश्री कार्ला गोरेना को प्रवाह साइटोमेट्री में तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं । एलएस को चाइना स्कॉलरशिप काउंसिल और हुआन प्रांतीय इनोवेशन फाउंडेशन फॉर पोस्टग्रेजुएट (CX201713068) द्वारा समर्थित किया गया है । H.H.A. नैदानिक प्रयोगशाला विज्ञान विभाग, एप्लाइड मेडिकल साइंसेज के कॉलेज, Jouf विश्वविद्यालय, साका, सऊदी अरब द्वारा समर्थित है । एक्स.डी.एल. यूटी हेल्थ सैन एंटोनियो स्कूल ऑफ मेडिसिन स्टार्टअप फंड और मैक्स एंड मिनेई वोल्कर फंड द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
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